專利名稱：疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及兩種或兩種以上肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)蛋白的組合，其制備方法及其作為疫苗在醫(yī)學中的應用。該組合物尤其對預防嬰兒和老年人鏈球菌感染有效。
背景技術：
肺炎鏈球菌是一種導致很高發(fā)病率和死亡率(特別是年幼者和老年人)的革蘭氏陽性菌，它引起肺炎、菌血癥、腦(脊)膜炎等侵襲性疾病和急性中耳炎等菌群定居(colonisation)相關性疾病。美國60歲以上人群肺炎球菌性肺炎的發(fā)病率為每100,000人中估計有3～8人，其中20％導致菌血癥和其他癥狀，例如腦膜炎，即使用抗生素治療，其死亡率也接近30％。
肺炎球菌被賦予血清型特異性的化學連接的多糖包裹。有90種公知的肺炎雙球菌血清型，莢膜是肺炎雙球菌毒力的主要決定因素，因為莢膜不但保護細菌內表面不受補體影響，其本身也具有弱免疫原性。多糖是T非依賴型抗原，不能被加工或呈遞在MHC分子上，從而不能與T細胞相互作用，但它們能通過一種涉及B細胞表面受體交聯的不同的機制刺激免疫系統。
若干試驗表明侵襲性肺炎雙球菌疾病的預防與莢膜特異性抗體密切相關，且該保護作用具有血清特異性。
肺炎鏈球菌是嬰兒和兒童侵襲性細菌疾病和中耳炎最常見的致病因素。同樣，老年人對肺炎球菌疫苗反應較弱[Roghmann等，(1987)，J.Gerontol.42265-270]，因此在這些人群中細菌性肺炎的發(fā)病率升高[Verghese和Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62271-285]。
23-價非偶聯肺炎球菌疫苗的臨床療效變化幅度大，從0％～81％不等(Fedson等，(1994)Arch Intern Med.1542531-2535)。其療效似乎與正被免疫的危險人群相關，例如老年組、何杰金氏病組、脾切除術組、鐮刀細胞疾病組和無γ球蛋白血癥組(Fine等，(1994)Arch Intern Med.1542666-2677)，此外還與疾病癥狀相關。23-價疫苗對肺炎球菌性肺炎(某些高危組，例如老年組)和中耳炎不顯示預防性。
為克服嬰兒這種缺乏免疫原性所作的策略包括多糖與大分子免疫蛋白的連接，該大分子免疫蛋白提供旁路T細胞輔助，并且對與之結合的多糖抗原引起免疫記憶。
然而，還需要更好的肺炎球菌疫苗組合物，特別是能更有效地預防或改善老年人和兒童肺炎球菌疾病(尤其是肺炎)的肺炎球菌疫苗組合物。
本發(fā)明提供這種更好的疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面是一種免疫原性組合物，該組合物至少包含兩種選自多組氨酸三聯體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、sp125和sp133的肺炎鏈球菌蛋白。一個優(yōu)選實施方案中，一種蛋白質選自多組氨酸三聯體家族(PhtX)。另一個優(yōu)選實施方案中，一種蛋白質選自膽堿結合蛋白家族(CbpX)，或CbpX截短物，或CbpX片段-LytX截短物嵌合蛋白。
本方明一個相關方面提供一種用于治療或改善嬰兒中耳炎或老年人肺炎的疫苗。任選地，該疫苗可以另外包含一種佐劑，優(yōu)選地，該佐劑為TH1應答的誘導物。
本發(fā)明另一相關方面是本發(fā)明疫苗的制備方法，該方法通過選擇和分離兩種不同的肺炎鏈球菌蛋白并將這兩種蛋白與可藥用載體混合。
發(fā)明描述本方明通過依賴基于肺炎球菌蛋白的途徑提供一種用于治療或改善老年人(例如肺炎)和/或嬰兒(例如中耳炎)肺炎球菌感染的改進的疫苗。一個優(yōu)選實施方案中，該疫苗適用于預防和改善老年人肺炎球菌感染。大部分成人都接觸過肺炎鏈球菌，通過服用至少兩種本發(fā)明的肺炎球菌蛋白，該疫苗能激發(fā)成人和老年人的潛在免疫應答至保護水平。該肺炎球菌蛋白在沒有肺炎鏈球菌多糖的條件下服用。
在本發(fā)明的內容中，55歲或55歲以上的人視為老年人，通常為60歲以上，更普遍的為65歲以上。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供一種用于預防老年人肺炎的包含肺炎球菌蛋白的疫苗組合物。
另一實施方案中，本發(fā)明提供一種包含兩種或兩種以上本發(fā)明肺炎球菌蛋白的適用于嬰兒(通常為0～2歲)的疫苗組合物。
本發(fā)明的肺炎球菌蛋白本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白為至少在肺炎球菌生命周期期間暴露的表面，或者是由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。本發(fā)明的蛋白組合優(yōu)選從以下蛋白中選取不同的兩種，例如具有LXXC(X為任何氨基酸，例如多組氨酸三聯體家族(PhtX))II型信號序列基序的蛋白，膽堿結合蛋白(CbpX)，具有I型信號序列基序的蛋白(例如Sp101)，具有LPXTG基序的蛋白(X為任意氨基酸，例如Sp128、Sp130)和毒素(例如Ply)等。上述種類(或基序)的優(yōu)選例為下列蛋白或其免疫功能等效物。
本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少兩種選自多組氨酸三聯體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133的蛋白。但是，如果CbpX為PspC，則第二種蛋白不為PspA或PsaA。優(yōu)選地，該免疫原性組合物包含兩種或兩種以上選自多組氨酸三聯體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128的蛋白。更優(yōu)選地，該免疫原性組合物包含兩種或兩種以上選自多組氨酸三聯體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)和Sp128的蛋白。
Pht家族(多組氨酸三聯體)包含PhtA、PhtB、PhtD和PhtE蛋白。該家族的特點是脂質化序列，兩個功能區(qū)被脯氨酸富集區(qū)和數個組氨酸三聯體分隔，可能涉及金屬或核苷的結合或酶活性，(3-5)卷曲的螺旋區(qū)域，一個保守的N-末端和一個異源的C-末端。它出現在所有受檢肺炎雙球菌菌株中。其它鏈球菌和奈瑟菌屬中也發(fā)現有同源蛋白。優(yōu)選該家族成員包含PhtA、PhtB和PhtD，更優(yōu)選包含PhtA或PhtD。但是，應該理解PhtA、B、D和E是指具有公開于下述引文序列的蛋白質以及具有與參考蛋白至少90％序列同源性的其天然(和人工)變體，優(yōu)選與參考蛋白至少95％相同，最優(yōu)選97％相同。
PhtX蛋白中，PhtA公開于WO98/18930，也被稱為Sp36。如上所述，PhtA來自多組氨酸三聯體家族，具有II型LXXC信號基序。
PhtD公開于WO00/37105，也被稱為Sp036D。如上所述，PhtD也來自多組氨酸三聯體家族，具有II型LXXC信號基序。
PhtB公開于WO00/37105，也被稱為Sp036B。PhtB家族的另一成員是C3降解的多肽，公開于WO00/17370。該蛋白也來自多組氨酸三聯體家族，具有II型LXXC信號基序。優(yōu)選免疫功能等效物為WO98/18930中公開的Sp42。PhtB截短物(約為79kD)公開于WO99/15675，也被視為PhtX家族成員之一。
PhtE公開于WO00/30299中，也被稱為BVH-3。
膽堿結合蛋白家族(CbpX)成員最初被視為能用膽堿親和層析純化的肺炎球菌蛋白。所有膽堿結合蛋白都非共價結合于細胞壁磷壁酸和膜結合脂磷壁酸的磷酸膽堿部分。雖然該蛋白質的確切性質(氨基酸序列、長度等)可以不同，但整個家族具有數個在結構上相同的區(qū)域。一般來說，膽堿結合蛋白包含N-末端區(qū)域(N)，保守重復區(qū)域(R1和/或R2)，脯氨酸富集區(qū)域(P)和保守的膽堿結合區(qū)域(C)，該膽堿結合區(qū)由多個重復單元組成，約占該蛋白的一半。本申請中所用的術語“膽堿結合蛋白家族(CbpX)”選自WO97/41151中所鑒定的膽堿結合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公開于WO97/41151，CbpD和CbpG公開于WO00/29434，PspC公開于WO97/09994，PbcA公開于WO98/21337，SpsA是WO98/39450中公開的膽堿結合蛋白。該膽堿結合蛋白優(yōu)選選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
另一優(yōu)選方案是CbpX截短物，其中“CbpX”如上述定義，“截短物”指缺省50％或更多膽堿結合區(qū)域(C)的CbpX蛋白。優(yōu)選這樣的蛋白質缺省整個膽堿結合區(qū)域。更優(yōu)選這樣的蛋白質截短物缺省(i)膽堿結合區(qū)域和(ii)該蛋白質的N-末端一半的一部分，但至少保留一個重復區(qū)域(R1或R2)。更優(yōu)選地，該截短物具有兩個重復區(qū)域(R1和R2)。該優(yōu)選實施方案的例子是在WO99/51266或WO99/51188中舉例說明的NR1xR2和R1xR2，但其它缺乏相似膽堿結合區(qū)域的膽堿結合蛋白也納入本發(fā)明的考慮范圍。
LytX家族是與細胞溶解有關的膜相關蛋白(membrane associatedproteins)。N-末端區(qū)域包含膽堿結合區(qū)域，但是，LytX家族并不具有在上述CbpA家族中發(fā)現的所有特征，因此，對于本發(fā)明來說，LytX家族不同于CbpX家族。與CbpX家族相比，LytX的C-末端區(qū)域包含LytX蛋白家族的催化區(qū)域。該家族包含LytA、B和C。LytX家族中，LytA公開于Ronda等，Eur J Biochem，164621-624(1987)。LytB公開于WO98/18930，也被稱為Sp46。LytC也公開于WO98/18930，也被稱為Sp91。該家族的優(yōu)選成員是LytC。
另一優(yōu)選方案是LytX截短物，其中“LytX”如上述說明，“截短物”指缺省50％或50％以上膽堿結合區(qū)域的LytX蛋白。優(yōu)選這樣的蛋白質缺省整個膽堿結合區(qū)域。這樣的截短物例子可在本發(fā)明的實施例部分找到。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案是CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)。優(yōu)選該蛋白包含CbpX的NR1xR2(或R1xR2)和LytX的C-末端部分(Cterm，即缺省膽堿結合區(qū)域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更優(yōu)選CbpX選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC，其中更優(yōu)選CbpX為CbpA。優(yōu)選LytX為LytC(也被稱為Sp91)。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案是PspA或PsaA截短物，該截短物缺省膽堿結合區(qū)域(C)，并且表達為帶LytX的融合蛋白，優(yōu)選LytX為LytC。
肺炎球菌溶血素是一種具有明顯溶細胞(溶血)作用和補體活化作用的多功能毒素(Rubins等，Am.Respi.Cit Care Med，1531339-1346(1996))。該毒素不由肺炎雙球菌分泌，但它在肺炎雙球菌受自溶素的影響而裂解時被釋放。它的作用包括例如刺激人體單核細胞產生炎性細胞因子，抑制人體呼吸上皮纖毛顫動，降低嗜中性粒細胞的殺菌活性和遷移性。肺炎球菌溶血素最明顯的作用是在裂解紅細胞方面的作用，該作用涉及與膽固醇結合。由于肺炎球菌溶血素是一種毒素，因此在體內給藥前必須脫毒(即用于預防的該藥的劑量對人體是無毒的)。該領域中已知野生型或天然肺炎球菌溶血素的表達和克隆，參見例如Walker等(Infect Immun，551184-1189(1987))，Mitchell等(Biochim Biophys Acta，100767-72(1989)和Mitchell等(NAR，184010(1990))。Ply的脫毒可以用化學方法，例如用福爾馬林或戊二醛或二者的組合進行處理，這樣的方法在許多毒素脫毒技術中公知?；蛘?，ply可以用基因方法脫毒。因此，本發(fā)明包括肺炎球菌蛋白衍生物，該衍生物可能是例如突變蛋白。此處所用的術語“突變”是指用公知的定點誘變技術或其它常規(guī)方法使分子缺失、增加或取代一個或多個氨基酸。例如如上所述，突變型ply蛋白可以被改變，以使其失去生物學活性但仍保持其致免疫表位，參見例如WO90/06951，Berry等，(Infect Imun，67981-985(1999))和WO99/03884。
此處所用的術語“Ply”是指適于醫(yī)用(即無毒的)的突變或脫毒的肺炎球菌溶血素。
PsaA和PspA在本領域公知。例如Berry & Paton，Infect Immun 1996Dec；64(12)5255-62中描述了PsaA和其跨膜缺失變體(transmembranedeletion variants)。PspA和其跨膜缺失變體公開于例如US5804193，WO92/14488和WO99/53940。
Sp128和Sp130公開于WO00/76540。
Sp125是帶有LPXTG(其中X為任何氨基酸)細胞壁錨定基序的肺炎球菌表面蛋白的例子。在本發(fā)明的發(fā)明內容中發(fā)現具有此基序的這類肺炎球菌表面蛋白中的任何蛋白都有用，因此將其視為本發(fā)明的另一種蛋白。Sp125本身公開于WO98/18930，也稱為ZmpB，即鋅金屬蛋白酶。
Sp101公開于WO98/06734(其中它參考#y85993)，其特征是I型信號序列。
Sp133公開于WO98/06734(其中它參考#y85992)，其特征是I型信號序列。
本發(fā)明的蛋白也可以進行有益的組合，優(yōu)選組合物包括但不限于PhtD+NR1xR2、PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NR1xR2、PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NR1xR2+LytC、NR1xR2+PspA、NR1xR2+PsaA、NR1xR2+Sp128、R1xR2+LytC、R1xR2+PspA、R1xR2+PsaA、R1xR2+Sp128、R1xR2+PhtD、R1xR2+PhtA。優(yōu)選NR1xR2(或R1xR2)來自CbpA或PspC，更優(yōu)選來自CbpA。
特別優(yōu)選的肺炎球菌蛋白的組合包含Ply(或其截短物或免疫功能等效物)+PhtD(或其截短物或免疫功能等效物)+NR1xR2(或R1xR2)。優(yōu)選NR1xR2(或R1xR2)來自CbpA或PspC，更優(yōu)選來自CbpA。
本發(fā)明也包括本發(fā)明蛋白的“免疫功能等效物”。“免疫功能等效物”定義為包含至少一種來自本發(fā)明蛋白的保護性表位的肽或蛋白質。這些表位的特征是表面暴露，高度保守，能引起宿主的殺菌抗體應答或預防毒性作用。優(yōu)選地，該功能等效物至少含有15個，優(yōu)選30個或30個以上來自本發(fā)明蛋白質的連續(xù)的氨基酸，前提是其能產生與天然蛋白基本相同的免疫應答。聯合運用2D-結構預測和抗原指數預測兩種方法鑒定表面暴露且具有抗原性的肽，由此可以迅速確定蛋白質序列中潛在的B-細胞表位的位置。用PSIPRED程序能進行2D-結構預測(來自David Jones，BrunelBioinforrnatics Group，Dept.Biological Sciences，Brunel University，UxbridgeUB8 3PH，UK)。可以在Jameson和Wolf(CABIOS4181-186)說明的方法基礎上計算抗原指數。
本發(fā)明在下述方面優(yōu)于肺炎鏈球菌多糖疫苗本發(fā)明的復合肺炎鏈球菌蛋白(免疫原性的)組合物可能包括對多種血清型的更大的交叉保護作用，能進一步抑制粘著和集落形成，還能潛在地增加能夠中和病原體毒性/酶作用的抗體。而且，另外的表面抗原還提供一種進一步刺激調理吞噬的方式。
本發(fā)明也考慮預防一系列不同病原體的組合疫苗。目前許多兒科疫苗以組合疫苗的形式給予，以減少兒童的注射次數。因此對于兒科疫苗來說，來自其它病原體的其它抗原可以與本發(fā)明的疫苗一起制備。例如本發(fā)明的疫苗可以用公知的“三價”組合疫苗配制(或同一時間分別服用)，該三價組合疫苗包含白喉類毒素(DT)，破傷風類毒素(TT)和百日咳成分[通常是脫毒的百日咳類毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，任選pertactin(PRN)和/或凝集素1+2]，例如市售疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeecham Biologicals)包含DT、TT、PT、FHA和PRN抗原，或帶有完整百日咳細胞成分，例如SmithKlineBeecham Biologicals s.a.銷售的TritanrixTM。該組合疫苗也可以包含其它抗原，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰質炎病毒抗原(例如滅活的三價脊髓灰質炎病毒-IPV)、卡他莫拉菌(Moraxella Catarrhalis)外膜蛋白、非典型流感嗜血桿菌蛋白、腦膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白。
可以包含在組合疫苗中(特別是用于預防中耳炎)的卡他莫拉菌蛋白抗原的優(yōu)選實例為OMP106[WO 97/41731(Antex)和WO 96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO 98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO 97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME，等，(1993)Infect.Immun.612003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO 93/03761(University ofTexas)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB 9917977.2)；lipo10(GB 9918208.1)；lipo11(GB 9918302.2)；lipo18(GB 9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)和OmpE?？梢园诮M合疫苗中(特別是用于預防中耳炎)的非典型流感嗜血桿菌抗原優(yōu)選實例為Fimbrin蛋白[(US 5766608-OhioState Research Foundation)]和含來自該蛋白的肽的融合體[例如LB1(f)肽融合體；US 5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)；P6[EP281673(State University of New York)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；蛋白質D(EP594610)；P2和P5(WO94/26304)。
另一實施方案中，以上引用的多種抗原可以包含在本發(fā)明的免疫原性組合物中，作為抗原出現在由細菌制成的外膜囊(泡)的表面。
其它考慮的組合物是本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白與病毒抗原的組合，所述病毒抗原例如來自流感病毒(減毒的、解體的(split)或其亞單位)[例如表面糖蛋白神經氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，參見例如Chaloupka I.等，Eur.Journal Clin.Microbiol.Infect.Dis.1996，15121-127]，RSV(例如F和G抗原或F/G融合體，參見例如Schmidt A.C.等，J Virol，May 2001，p4594-4603)，PIV3(例如HN和F蛋白，參見Schmidt等，同上)，水痘病毒(例如減毒的，糖蛋白I-V等)和MMR(麻疹，流行性腮腺炎，風疹)的任意(或全部)組分。
本發(fā)明的多糖抗原本申請也考慮帶有兩種或兩種以上肺炎鏈球菌蛋白的組合疫苗，該肺炎鏈球菌蛋白與肺炎鏈球菌以外的多糖組合。這樣的多糖可以從例如流感嗜血桿菌，流感嗜血桿菌B型(Hib)，腦膜炎奈瑟氏球菌A、C、W、Y族(group)，肺炎鏈球菌以外的鏈球菌(例如B族鏈球菌，釀膿鏈球菌(S.pyrogenes)等)，葡萄球菌屬(例如金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌)，大腸桿菌，腸球菌屬(例如糞腸球菌(E.faecalis)屎腸球菌(E.faecium))等。優(yōu)選多糖選自流感嗜血桿菌B型(Hib)，和/或腦膜炎奈瑟氏球菌A、C、W135和/或Y族。
如上所述，用于接種的多糖的問題是多糖本身為弱免疫原。為克服此問題，可以將多糖與提供旁路T細胞輔助的蛋白載體結合。因此優(yōu)選將本發(fā)明所用多糖與這樣的蛋白載體結合，目前常用于生產多糖免疫原的此種蛋白載體的例子包括白喉和破傷風類毒素(分別為DT、DT CRM197、其它DT突變體例如第148位Glu的突變體等[參見例如US4,709,017，WO93/25210，WO95/33481等]和TT(和TT截短物C))，匙孔血藍蛋白(KLH)，來自腦膜炎奈瑟氏球菌的OMPC和結核菌素的純蛋白衍生物(PPD)。
另一種用于基于多糖的免疫原性組合物(或疫苗)的載體是來自于流感嗜血桿菌(EP 594610-B)的蛋白D或其片段。適用的片段包括包含T-輔助細胞表位的那些片段。具體是蛋白D片段優(yōu)選包含該蛋白N-末端的1/3。
可以利用任何公知的方法將該多糖連接到載體蛋白上(例如用Likhite，美國專利號4,372,945和Armor等，美國專利號4,474,757)。優(yōu)選執(zhí)行CDAP偶聯(WO 95/08348)。為增強免疫原性，可以控制多糖分子大小(解聚)，加入佐劑，冷凍干燥或連接到不同的載體蛋白上。
本發(fā)明的TH1佐劑本發(fā)明疫苗優(yōu)選配有佐劑。合適的佐劑包括鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，也可以是鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或也可以是酰化酪氨酸不溶性懸浮液，或酰化糖，陽離子或陰離子衍生多糖，或聚磷腈。
優(yōu)選地，該佐劑是誘導TH1型應答的優(yōu)先誘導物。如此高水平的Th1型細胞因子有助于誘導對給定的細胞介導的免疫應答，而高水平的Th2型細胞因子有助于誘導對該抗原的體液免疫應答。
Th1型免疫應答和Th2型免疫應答的區(qū)別不是絕對的，記住這一點很重要。現實中，個體可能表現為以Th1為主或以Th2為主的免疫應答，但是通常用Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T細胞克隆中所描述的來考慮該細胞因子家族比較方便(Mosmann，T.R和Coffman，R.L(1989)TH1 andTH2 cellsdifferent patterns of lymphokine secretion lead to different functionalproperties.Annual Review of Immunology，7，p145-173)。Th1型應答與T淋巴細胞產生INF-γ和IL-2細胞因子有關。通常與Th1型免疫應答誘導直接有關的其它細胞因子不由T細胞產生，例如IL-12。比較而言，Th2型應答與II-4，IL-5，IL-6和IL-10的分泌有關。激發(fā)以TH1應答為主的應答的合適佐劑系統包括單磷酰脂A或其衍生物，特別是3-去氧酰化單磷酰脂A(3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A)(3D-MPL)(其制備參見GB2220211A)；和單磷酰脂A的組合，優(yōu)選3-去氧?；瘑瘟柞Ｖ珹與鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油型乳劑組合。在這樣的組合中，抗原和3D-MPL被包含在同一顆粒結構中，允許抗原和免疫刺激信號更有效地傳遞。研究表明3D-MPL能進一步加強明礬吸附抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine(1998)16708-14；EP 689454-B1]。
強化系統包括單磷酰脂A和皂苷(saponin)衍生物的組合，特別是WO94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或WO 96/33739中公開的反應原性稍弱的組合，其中QS21用膽固醇猝滅。
特別有效的佐劑制劑包括QS21，3D-MPL和生育酚的水包油型乳劑，公開于WO 95/17210，并且為優(yōu)選制劑。
疫苗優(yōu)選含有皂苷，更優(yōu)選QS21。該制劑也可以含有水包油型乳劑和生育酚(WO 95/17210)。
本發(fā)明還提供一種疫苗制劑的制備方法，該方法包括將本發(fā)明的一種蛋白與可藥用賦形劑例如3D-MPL的混合。
包含寡核苷酸的非甲基化CpG(WO 96/02555)也是誘導TH1應答的優(yōu)先誘導物，并且適用于本發(fā)明。
本發(fā)明另一方面提供一種醫(yī)用疫苗。一個實施方案中提供了一種預防或改善老年人肺炎的方法，包括給所述老年患者服用安全而有效劑量的本發(fā)明疫苗，且任選服用一種Th1佐劑。
另一實施方案提供了一種預防或改善嬰兒(24個月以下)或幼兒(24個月～5歲)中耳炎的方法，包括給所述嬰兒或幼兒服用安全而有效劑量的疫苗，該疫苗包含本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白，且任選服用一種Th1佐劑。
本發(fā)明的疫苗制品本發(fā)明的疫苗制劑可以用于預防或治療哺乳動物(優(yōu)選人類患者)的感染，其方法是通過全身或粘膜給藥途徑給予所述疫苗。給藥方式包括肌肉注射、腹膜內注射、皮內注射或皮下注射，或口腔/消化道、呼吸道和泌尿生殖道粘膜給藥。治療肺炎或中耳炎優(yōu)選鼻內給與疫苗(由于能更有效地阻止肺炎雙球菌的鼻咽運送，因此能在最早期階段減弱感染)。本發(fā)明的疫苗可以單劑給藥，其組分也可以同時或不同時聯合服用(例如如果疫苗中有多糖，則多糖可以與細菌蛋白組合物在同一時間分開服用，或在服用細菌蛋白組合物后1～2周服用，以使二者發(fā)揮最佳免疫應答協同作用)。除單一給藥途徑之外，還能采用兩種不同的給藥途徑。例如病毒抗原能以ID(皮內)方式給藥，而細菌蛋白能以IM(肌肉)或IN(鼻內)方式給藥。如果有多糖，則多糖能以IM(或ID)方式給藥，細菌蛋白能以IN(或ID)方式給藥。另外，本發(fā)明的疫苗能以IM方式給予初次免疫、以IN方式給予加強免疫。
單劑疫苗劑量中偶聯物抗原的量是能誘導免疫保護應答，但在通常的疫苗中又無明顯副作用的量，此量隨特異性免疫原的使用及其被呈遞的方式而改變。蛋白抗原在疫苗中的通常含量范圍為1～100μg，優(yōu)選5～50μg，最常見的范圍為5～25μg。如果含有多糖，預計一般單劑包含0.1～100μg多糖，優(yōu)選0.1～50μg，更優(yōu)選0.1～10μg，其中1～5μg為最優(yōu)選范圍。
特殊抗原中各成分的最佳量可以通過標準試驗確定，包括觀察受試者適當的免疫應答。初次接種后，患者可以在適當的時間間隔內接受一次或多次加強性免疫接種。通常，疫苗包含抗原(蛋白)、佐劑、賦形劑或可藥用載體。
疫苗制劑通常公開于Vaccine Design(″The subunit and adiuvantapproach″(Powell M.F.和Newman M.J.編)(1995)Plenum Press New York)。脂質體膠囊公開于Fullerton的美國專利4,235,877。
雖然本發(fā)明的疫苗能以任何途徑給藥，所述疫苗皮內給藥(ID)構成了本發(fā)明的一個實施例。人的皮膚包含一層外部“角質”表皮層，稱之為角質層，它覆蓋了表皮。此表皮下是真皮層，真皮層依次覆蓋了皮下組織。研究者們已發(fā)現皮內注射，特別是真皮內注射疫苗能刺激免疫應答，還伴隨其它好處。此處所述的皮內接種疫苗構成了本發(fā)明的一個優(yōu)選特征。
皮內注射的常規(guī)技術“芒圖操作(mantoux procedure)”包括下述步驟清洗皮膚，伸出一只手，然后使小號針的斜面朝上(26～31號)，以10-15°的角度將針插入。一旦針斜面被插入后，針筒下降，施予輕微壓力進一步推進，使其在皮下抬起。然后液體緩慢注入，導致皮膚表面形成包或隆起，最后緩慢抽出針。
近來，皮內或通過皮膚給與液體制劑的特定裝置已被公開，例如該裝置公開于WO 99/34850和EP 1092444，噴射注射裝置公開于WO 01/13977，US 5,480,381，US 5,599,302，US 5,334,144，US 5,993,412，US 5,649,912，US5,569,189，US 5,704,911，US 5,383,851，US 5,893,397，US 5,466,220，US5,339,163，US 5,312,335，US 5,503,627，US 5,064,413，US 5,520,639，US4,596,556，US 4,790,824，US 4,941,880，US 4,940,460，WO 97/37705和WO97/13537。該疫苗制劑的真皮內給藥替代方法包括常規(guī)注射器和針，或固體疫苗的彈道式給藥裝置(WO 99/27961)，或經皮貼劑(WO 97/48440；WO98/28037)；或皮膚表面給藥(經皮的給藥WO 98/20734；WO 98/28037)。
當本發(fā)明的疫苗是給至皮膚時，更具體地說是真皮時，給與小體積量的疫苗，具體地說大約為0.05ml和0.2ml。
本發(fā)明皮膚或皮內疫苗中抗原含量可以類似于肌內疫苗所用的常規(guī)劑量。因此，皮內疫苗中的蛋白抗原含量范圍可以為1～100μg，優(yōu)選5～50μg。同樣，如果有多糖偶聯物抗原，則預計其在單劑疫苗中的含量通常為0.1～100μg多糖，優(yōu)選0.1～50μg，更優(yōu)選0.1～10μg，可以為1～5μg。但是，皮膚或皮內疫苗的一個特點是其制劑可以為“低劑量”。因此，“低劑量”疫苗中的蛋白抗原含量則為每劑0.1～10μg，優(yōu)選0.1～5μg；如果有多糖偶聯物抗原，則其在單劑疫苗中的含量范圍通常為0.01～1μg多糖，優(yōu)選0.01～0.5μg。
此處所用的術語“皮內給藥”是指將疫苗給至皮膚的真皮區(qū)域，但疫苗不一定僅存在于真皮內。真皮層是距離人體皮膚表面約1.0mm和約2.0mm的皮層，但個體之間和同一個體的不同部位之間存在差異。一般地，預計疫苗可以通過距離表面皮膚1.5mm的深度達到真皮層。真皮上面為角質層和表皮，下面為皮下層。通過設計給藥模式，可以使該疫苗最終僅存在于或主要存在于真皮內，或最終分布于表皮和真皮。
本發(fā)明另一方面可以包含編碼一個或多個肺炎鏈球菌蛋白的DNA，以便在原位產生蛋白質。該DNA可以包含在本領域常規(guī)技術中公知的任何給藥系統中，包括核酸表達系統，細菌和病毒表達系統。本領域中許多基因給藥技術已公知，例如Rolland，(Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems15143-198，1998)中所描述的及本文參考文獻中所引用的。合適的核酸表達系統包含在患者體內表達所必需的DNA表達序列(如適當的啟動子和終止信號)。當表達系統為活體重組微生物時，例如病毒或細菌，目的基因可以插入活的重組的病毒或細菌基因組中。用此活載體進行接種和體內感染會導致抗原體內表達和誘導免疫應答。用于此目的的病毒和細菌包括痘病毒(例如牛痘(caccima)，鳥痘(fowlpox)和金絲雀痘病毒(canarypox))，甲病毒(alphaviruses)(辛德畢斯病毒(Sindbis virus)，塞姆利基森林病毒(SemlidiForest virus)，委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelian Equine Enecphalitis Virus)，腺病毒，腺相關病毒，微小RNA病毒(picomavimses)(脊髓灰質炎病毒，鼻病毒)，皰疹病毒(水痘-帶狀皰疹病毒等)，李司忒菌屬(Listeria)，沙門菌屬(Salmonella)，志賀菌屬(Shigella)，奈瑟菌屬(Neisseria)和BCG。上述病毒和細菌可以具有毒性，或通過多種途徑減毒以獲得活疫苗。這樣的活疫苗也構成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明另一方面提供一種制備此處說明的疫苗制劑的方法，根據本發(fā)明，該方法包括混合要進行組合的蛋白。
含有上文所述多糖的抗原性組合物(和疫苗)使用前優(yōu)選一直是冷凍的，使用時用稀釋劑臨時配制。更優(yōu)選地，在3D-MPL存在的條件下冷凍，用鹽溶液臨時配制。
疫苗冷凍在本領域已公知。通常，液體疫苗在抗結塊劑，例如蔗糖或乳糖等糖類(起始濃度為10～200mg/mL)存在的條件下凍干。冷凍包含一系列典型步驟，例如-69℃開始循環(huán)，再逐漸升溫至-24℃，升溫時間為3小時，保持此溫度18小時。再逐漸升溫至-16℃，升溫時間為1小時，保持此溫度6小時。然后逐漸升溫至+34℃，升溫時間為3小時，最后保持此溫度9小時。
本發(fā)明的免疫組合物和疫苗可以用多種動物模型或人血清進行評價。例如下列動物模型可以用于評價肺炎球菌感染，皮下給與以50μl CFA為佐劑的15μg蛋白免疫C3H/HeJ小鼠(6～8周大小)，隨后3～4周用帶IFA的15μg蛋白加強免疫。為證明小鼠對系統感染的被動和主動防護，腹腔注射15～90 LD50的肺炎雙球菌進行攻擊之前，可以在8～10周腹腔給與小鼠免疫血清或蛋白。另外，蛋白質可以用小鼠鼻咽部菌群定居模型進行檢測(Wu等Microbial Pathogenesis 1997；23127-137)。
除小鼠外，大鼠幼鼠對肺炎鏈球菌的定居和感染敏感。在被動保護試驗中，2～5天大小的大鼠幼鼠在鼻腔給與肺炎鏈球菌(10μl)進行攻擊前，可以給與小鼠免疫血清(100μl i.p.或10μl i.n.)?？梢杂帽橇鞒鑫锏匿伆迮囵B(yǎng)(20～40μl輸入，10μl流出)確定菌群定居。
組合疫苗中的蛋白成分間的有利相互作用可以通過每次給與疫苗中的一種蛋白來證明，該疫苗作為單價疫苗具有亞保護性。組合疫苗的預防效力較單價疫苗升高，這歸結于各成分之間的有利相互作用。
本發(fā)明用下列附加實施例用來舉例說明。除另有詳細說明外，用本領域技術中公知和常規(guī)的標準技術實施實施例。實施例僅用于舉例說明，但不限制本發(fā)明。
實施例實施例1 抗原的構建和表達NR1xR2CbpA是一種由若干區(qū)域組成的74kDa的表面暴露蛋白。其N-末端區(qū)域包含兩個高度保守的重復單元(R1和R2)，C-末端區(qū)域包含10個串聯的具有20個氨基酸的直接重復序列。制備CbpA截短物用于產生NR1XR2(沒有膽堿結合區(qū)域)。
NR1XR2基因是從來自肺炎鏈球菌血清型4菌株的DNA通過PCR擴增而來的(參見例如WO97/41157或WO99/51266)。用Expand High FidelityPCR系統或Hi-Fi(Roche)進行PCR。所述系統由包含Taq聚合酶和校正性的聚合酶的混合物組成。由于固有的3’-5’核酸外切酶校正活性，用Hi-Fi使DNA合成的忠實性比用Taq聚合酶提高3倍。
PCR片段被克隆到來自pGEM-T Vector Systems(Promega)的pGEM-T載體中，這一步對用限制性內切酶消化PCR片段以進行進一步的連接來說是必需的。pGEM-T載體為線性的，并且包含3’-T突出端。這些突出端促進耐熱聚合酶產生的PCR產物插入，該耐熱聚合酶以不依賴于模板的方式添加單個脫氧腺苷至擴增片段的3’末端。
根據Benore-Parsons等的文章(Nucletic Acids research，23，4926-4927，1995)，將所述片段和載體在酶消化后純化(NdeI和Xbal消化)。3～4小時內將瓊脂糖薄片完全凍干。把1∶1的乙醇-TE溶液加入凍干凝膠中。樣品輕微混合一小時，壓緊瓊脂糖，然后通過離心沉淀完全除去。用乙醇沉淀方法從洗脫液中回收DNA。
編碼NR1xR2的DNA克隆到包含噬菌體λ的長啟動子L的載體中。當出現在AR58大腸桿菌菌株中時，目的蛋白能被熱誘導，或出現在AR120大腸桿菌菌株中時，能被萘啶酮酸誘導。
在30℃進行細菌隔夜預培養(yǎng)，將該預培養(yǎng)液稀釋約40倍，至總體積為20ml，30℃下放置至O.D.為0.4-0.6，然后在42℃下進行熱誘導。分別在不同時間點取樣，1ml培養(yǎng)液以7000rpm的轉速離心5分鐘。培養(yǎng)物上清液在-20℃下存放，沉淀物(全部提取物)重新懸浮在500μl樣品緩沖液(蛋白印跡或十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳分析)或500μl裂解緩沖液中，37℃下溫育30分鐘(ELISA)。裂解緩沖液的組分為十二烷基硫酸鈉0.1％，去氧膽酸鹽0.1％，枸櫞酸鈉0.015M。
樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳，上樣至4～20％的凝膠上(Novex Invitrogen)，200V下進行遷移。用考馬斯藍染色。上樣至4～20％的凝膠上(Novex，Invitrogen)進行蛋白印跡，200V下進行遷移。將凝膠轉移到硝酸纖維上，用兔α-NR1XR2多克隆抗體(第一抗體)和與堿性磷酸酯酶偶聯的α-兔抗體(第二抗體)進行顯影。
在十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳分析中發(fā)現一條約為55kDa的帶。在十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳分析分析基礎上選擇一個28B2克隆并轉移后進行發(fā)酵。該克隆被測序且其序列得到確認(第39(即信號序列之后)～446位的氨基酸＝406個氨基酸)。
對隔夜誘導的細菌進行裂解，然后離心，進行NR1XR2可溶性研究。再進行SDS-PAGE分析和ELISA試驗，NR1XR2似乎主要(＞95％)回收自可溶性組分。
R1xR2，PhtD，Sp91，(N)R1xR2-Sp91[C-末端區(qū)域]和Ply上述基因也以與NR1xR2相似的方式克隆、測序和表達。R1xR2包含CbpA(肺炎鏈球菌血清型4N)的第177～443位的氨基酸，PhtD包含第21位(即信號序列之后)至末端(肺炎鏈球菌血清型4N的第839位氨基酸)的氨基酸，Sp91以第20位的氨基酸(VAA)開始直至末端。對于融合體蛋白，R1xR2-Sp91Cterm包含CbpA的第177～443位氨基酸和翻譯終點之前的271個氨基酸。對于兩種融合蛋白，(N)R1xR2和Sp91Cterm序列之間發(fā)現兩個附加的氨基酸(GS)。對于所有結構，ATG引入基因起始的5’端以允許轉錄和翻譯，這就意味著上述各序列前面都有一個附加的N-末端蛋氨酸。
實施例2 血清學使用來自臨床研究的血清，對肺炎鏈球菌蛋白自然產生的抗體應答進行ELISA檢測。
2.1實驗步驟血清采樣當嬰兒為2～4個月和6～12個月大小時分別收集兩份血清(N＝20，研究DTPa HBV)。
～20歲成人血清(N＝50)。
65歲以上老年人血清(N＝140)。
ELISA步驟4℃下各種蛋白均以1μg/ml覆蓋免疫反應板，放置過夜。連續(xù)兩倍稀釋的血清(從1/10th的稀釋液開始)在室溫(RT)下振蕩溫育一小時。用稀釋了4000倍的過氧化物酶偶聯的抗人IgG單克隆抗體(Strateck，HP6043)，在RT下振蕩溫育30分鐘進行免疫檢測。顯色后用SoftMaxPro算出中點滴度。滴度≥10的血清視為陽性。用幾何平均值計算，滴度為5的(截留值的一半)被主觀定為陰性血清。
通過比較樣品光密度(OD)和生色IgG純品(chromopure IgG)(Jackson)的OD曲線，確定IgG濃度(表示為μg/ml)。該IgG純品被多克隆抗人IgG羊抗體捕獲到反應板中，然后用與上述相同的過氧化物酶標記的抗體進行顯色。
2.2結果2.2.1嬰兒鏈球菌蛋白血清學受檢的2～4個月嬰兒血清中，PhtD，PsaA，Sp128和NR1xR2的抗體滴度和血清陽性反應率最高，Sp91和Ply次之。Sp101和Sp130無應答或有低應答。Sp46和PhtA未檢測(材料獲得性問題)。
相同受試者在6～12個月時收集的血清中抗體應答總體下降，這表明上述高滴度主要由被動轉移的母體抗體所導致。
但是，某些嬰兒對相同蛋白質的免疫應答隨年齡增加，可能是自然暴露于肺炎雙球菌的結果。主要與此血清轉變相關的抗原確定為PsaA。有些受試者對PhtD，NR1xR2，Sp128，Sp91和Ply的抗體水平也增加，對Sp101和Sp130的體液應答僅發(fā)現有微弱變化。(參見

圖1和2)。
2.2.2年輕成人鏈球菌蛋白血清學根據滴度的幾何平均值可知，被評價的年輕成人群體中，PhtD，PhtA和NR1xR2是最具免疫原性的蛋白，Sp128，Ply和Sp91次之。所有受試者都能檢測到對這些蛋白質的抗體。對Sp46，特別是對Sp130和Sp101的應答較弱。PsaA未檢測(血清不夠)。(參見圖3和4)。
2.2.3老年人鏈球菌蛋白血清學老年人鏈球菌蛋白的抗體水平比年輕成人明顯降低。老年人最好的免疫原為PhtD，其次為Sp128、NR1xR2、Sp91、Ply和PsaA。Sp130和Sp101僅有微弱應答。Sp46和PhtA未檢測(材料獲得性問題)。(參見圖5和6)。
表1 老年人的IgG幾何平均濃度(GMC)(μg/ml)
此說明書中引用的所有出版物包括但不限于專利和專利申請在此引入作為參考，就如同各個出版物全文內容在此引入并全部公開。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案已經在上文中作了舉例說明，應該理解本發(fā)明不限于此處公開的精確教導，本發(fā)明權利要求的范圍包括對上述說明作出的所有改變。
權利要求
1.一種免疫原性組合物，含有至少兩種肺炎鏈球菌蛋白，所述蛋白選自多組氨酸三聯體家族(PhtX)，膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白，肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133的肺炎鏈球菌蛋白。
2.權利要求1的免疫原性組合物，含有一種源自多組氨酸三聯體家族(PhtX)的蛋白和另一種選自膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白，肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133的蛋白。
3.權利要求1的免疫原性組合物，含有一種選自膽堿結合蛋白家族(CbpX)，CbpX截短物和CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白的蛋白和另一種選自多組氨酸三聯體家族(PhtX)，LytX家族，肺炎球菌溶血素(Ply)，PspA，PsaA，Sp128，Sp101，Sp130，Sp125和Sp133的蛋白。
4.權利要求1～3的免疫原性組合物，其中PhtX為PhtA、PhtB或PhtD。
5.權利要求1～4的免疫原性組合物，其中CbpX為CbpA或PspC。
6.權利要求1～5的免疫原性組合物，其還含有佐劑。
7.一種含有權利要求6的免疫原性組合物的疫苗。
8.一種引發(fā)免疫應答的方法，其通過用權利要求1～6的免疫原性組合物免疫哺乳動物。
9.一種預防或改善55歲以上患者鏈球菌感染的方法，包括給與所述患者安全且有效量的權利要求7的疫苗。
10.權利要求7的疫苗在制備預防55歲以上患者肺炎的藥物中的應用。
11.一種預防或改善嬰兒中耳炎的方法，包括給與所述患者安全且有效量的權利要求7的疫苗。
12.一種制備權利要求7的疫苗的方法，包括下述步驟選擇和分離兩種不同的肺炎鏈球菌蛋白，然后將所述蛋白與可藥用載體混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩種或更多種肺炎鏈球菌蛋白的組合，它們的制備以及它們作為疫苗在醫(yī)學中的用途。這樣的組合尤其可保護嬰幼兒和老年人抗御鏈球菌感染。
文檔編號A61P27/16GK1694723SQ01815746
公開日2005年11月9日 申請日期2001年9月12日 優(yōu)先權日2000年9月15日
發(fā)明者菲利普·赫曼德, 克雷格·A·J·拉弗里爾, 伊維斯·洛貝特, 簡·普爾曼 申請人:史密斯克萊·比奇曼生物公司