專利名稱：應(yīng)用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑治療癌癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的活性劑、特別是其抑制劑的應(yīng)用。更具體地講，本發(fā)明涉及應(yīng)用這類藥物治療癌癥、尤其是癌癥侵入。
正如所知道的，胞外基質(zhì)的降解是一個非常復(fù)雜的過程并且它是許多病理和生理過程的一部分。因此，胞外基質(zhì)的蛋白酶降解在癌癥侵入方面起關(guān)鍵作用，在非腫瘤組織重建過程中也起關(guān)鍵作用。癌癥的侵襲表型主要取決于若干蛋白酶的活性和表達(dá)。已充分確定基質(zhì)金屬蛋白酶在這種腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的胞外基質(zhì)蛋白水解中的作用。這些基質(zhì)金屬蛋白酶之一是MR92,000 IV型膠原蛋白酶(MMP-9)。MMP-9降解一種主要由IV型膠原蛋白組成的結(jié)構(gòu)—基底膜，基底膜通常將上皮與基質(zhì)區(qū)室分隔開(1，2)。許多生長因子通過與跨膜酪氨酸受體結(jié)合、進而激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)MMP-9和其它蛋白酶的表達(dá)(3，4)。然而，某些細(xì)胞系甚至在缺乏這類生長因子時也產(chǎn)生大量的蛋白酶，提示信號級聯(lián)的組成型激活是一種基礎(chǔ)機制(5)。事實上，有關(guān)腎細(xì)胞癌、白血病以及多種其它癌癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成型激活已有描述。這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成型激活的參考文獻(xiàn)參見H.Oka等和S.C.Kim等的出版物(6，7)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的是，脅迫活化蛋白激酶和促分裂原活化蛋白激酶(SAPK和MAPK)在信號途徑中起關(guān)鍵作用。有三個主要的亞家族，包括p38/RK、JNK/SAPK和p42/p44 MAPK’s/ERK’s。一般而言，促細(xì)胞分裂原和分化因子刺激ERK’s，而JNK和p38不僅被諸如紫外線的環(huán)境脅迫、滲透脅迫激活，而且被炎性細(xì)胞因子激活。所有三個亞家族都調(diào)控細(xì)胞凋亡，ERK’s是負(fù)調(diào)節(jié)劑，而JNK’s和p38’s是正調(diào)節(jié)劑(8)。迄今為止，p38的4種人類同種型已被克隆p38α(9)、p38β(10)、p38γ(11)(也被稱為SAPK3或ERK6)和p38δ(12)(也被稱為SAPK4)。所述α和β同種型主要參與介導(dǎo)發(fā)至細(xì)胞核的促炎信號且調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡(8)。已經(jīng)暗示p38γ在肌肉發(fā)育和對低氧脅迫應(yīng)答方面起作用(13，14)。p38α和p38β廣泛分布于人體組織中，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在腦和心臟中是最豐富的(10)。SAPK3主要存在于骨骼肌中(15，16)。關(guān)于SAPK4的功能知之甚少。發(fā)現(xiàn)在唾液、垂體和腎上腺組織中有高水平表達(dá)(12)。p38同種型重要的上游調(diào)節(jié)劑包括蛋白激酶MKK6和MKK3。
迄今為止，關(guān)于基質(zhì)金屬蛋白酶參與癌癥侵入和轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)和研究集中于各種基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的功能及其與抑制劑結(jié)構(gòu)域的相互作用。例如，已知參與胞外基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶的蛋白水解活性必須準(zhǔn)確地被其內(nèi)源蛋白抑制劑—金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)調(diào)節(jié)。這些金屬蛋白酶組織抑制劑在腫瘤細(xì)胞降解基質(zhì)時也起重要的作用。分析了幾種癌中例如腎細(xì)胞癌以及胃癌中TIMP和MMP的活性。有關(guān)這些研究的參考文獻(xiàn)參見A.Kugler和G.I.Murray等的出版物(17，18)。這些金屬蛋白酶組織抑制劑是一個在調(diào)節(jié)分泌型金屬蛋白酶活性方面起關(guān)鍵作用的分泌型蛋白質(zhì)家族。迄今為止，其中三個已被表征(TIMP1、TIMP2和TIMP3)。它們影響金屬蛋白酶原(prometalloprotease)的激活并且用來調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的蛋白水解，重要的是在組織重建和炎癥過程中起作用。有關(guān)這些金屬蛋白酶組織抑制劑的特征參見D.T.Denhardt等的出版物(19)。也存在合成基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑如marimastat(BB-2516)，這是一種IC50值在微摩爾濃度范圍內(nèi)的丁二酰胺(butanediamid)衍生物。C.Simon等(20)證明，在用乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)治療后，在人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(UM-SCC-1)中增強的MMP-9分泌和體外侵襲力可以通過應(yīng)用通用p38抑制劑SB203580而被抑制，PMA是一種廣泛用于研究皮膚癌發(fā)生的已知腫瘤促進劑(綜述參見(21))。
現(xiàn)在意外地發(fā)現(xiàn)，p38以及MKK6和/或MKK3途徑的組成型活性在癌細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)MMP-9方面起關(guān)鍵作用。由于這些意外發(fā)現(xiàn)，使得有可能應(yīng)用靶向/針對MMP-9表達(dá)的下游調(diào)節(jié)劑的活性劑來治療癌癥、尤其是癌癥侵入。
因此，本發(fā)明制備用來治療癌癥的有效活性劑的問題通過按照權(quán)利要求1和2的應(yīng)用而得以解決。優(yōu)選的實施方案在所附權(quán)利要求3-17中給出。所有這些權(quán)利要求書的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本發(fā)明的說明書中。
按照本發(fā)明，使用至少一種活性劑來影響、特別是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶在真核細(xì)胞中的表達(dá)，從而治療癌癥。這尤其還包括應(yīng)用這種活性劑生產(chǎn)相應(yīng)的藥物或相應(yīng)的藥用組合物。按照本發(fā)明，所述活性劑可以任選以其藥學(xué)上可接受的鹽形式以及任選與藥學(xué)上可接受的載體一起使用。
按照本發(fā)明使用的活性劑是最好影響、特別是抑制參與癌癥、最好是癌癥侵入的上述基質(zhì)金屬蛋白酶的那些活性劑。按照本發(fā)明，一種參與癌癥侵入的優(yōu)選基質(zhì)金屬蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶9。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所用的活性劑最好靶向基質(zhì)金屬蛋白酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的至少一個成員、特別是靶向MMP-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一個成員。這種MMP-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一個優(yōu)選成員是所謂的p38蛋白質(zhì)家族。在按照本發(fā)明應(yīng)用時，這些p38蛋白之一是p38β蛋白，按照本發(fā)明應(yīng)用的另一個優(yōu)選成員是p38γ(SAPK3或PRK6)蛋白。按照本發(fā)明的活性劑的另一優(yōu)選靶是促分裂原活化激酶激酶家族。該促分裂原活化激酶激酶家族的兩個優(yōu)選成員是促分裂原活化激酶激酶6(MKK6)和促分裂原活化激酶激酶3(MKK3)。在按照本發(fā)明應(yīng)用時，MMP-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一個成員可以單獨地被所述活性劑所靶向，但也有可能是被所述活性劑所靶向的MMP-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的兩個或三個或甚至更多個不同成員的隨機組合。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，也有可能任選的是所述基質(zhì)金屬蛋白酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、最好是MM-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物學(xué)前體被所述活性劑所靶向和/或影響。這些激活劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物學(xué)前體可以是例如已知參與調(diào)節(jié)蛋白酶酶活性、轉(zhuǎn)錄因子如AP-1和負(fù)責(zé)蛋白酶表達(dá)水平的其它因子的激酶；負(fù)責(zé)激活金屬蛋白酶原或組織抑制劑的蛋白酶；或者甚至可以被所述活性劑影響的迄今為止未知的化合物。
按照本發(fā)明，應(yīng)用已知活性劑或者新型活性劑是可行的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述活性劑是一種針對基質(zhì)金屬蛋白酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、最好是MMP-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的至少一個成員具有特異性抑制能力的化合物。該活性劑最好是一種分子量(MW)低、尤其是MW＜1000的相對小的分子。如果這種活性劑是咪唑衍生物，則它是更優(yōu)選的。已知這類咪唑衍生物如SB203580(MW377，4)或SB202190(MW331，3)(兩者均可得自Calbiochem，San Diego，Ca，USA)是有效的激酶表達(dá)抑制劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述活性劑是p38蛋白抑制劑。這可以是p38蛋白的已知抑制劑或者也可以是又一種新型抑制劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述活性劑是促分裂原活化激酶激酶家族的抑制劑。該抑制劑可以是所述促分裂原活化激酶激酶家族，如用本說明書中所用的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的激酶死亡突變體的肽類抑制劑，或者也可以是一種新型抑制劑化合物。數(shù)種抑制劑是已知的，人們可以在Y.Fukami等、J.C.Lee等和D.Fabbro等的出版物中找到其中的幾種(22-24)。
在按照本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述活性劑是所述基質(zhì)金屬蛋白酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物學(xué)前體的抑制劑，所述抑制劑可以是激酶抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子抑制劑例如AP-1抑制劑、組織抑制劑、蛋白酶抑制劑以及基質(zhì)金屬蛋白酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的其它已知抑制劑或新型抑制劑。
在按照本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述活性劑是編碼抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)、最好是抑制p38和/或促分裂原活化激酶激酶活性的肽或多肽的多核苷酸。該肽可以是例如p38激酶缺陷型突變體、促分裂原活化激酶激酶死亡突變體和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它肽。
本發(fā)明可以用來治療所有種類的癌癥、尤其是具有基質(zhì)金屬蛋白酶過量表達(dá)并且因此具有高侵襲力和轉(zhuǎn)移力的癌癥。據(jù)報道MMP-9在頭、頸、皮膚和胃的鱗狀上皮癌中以及在胃纖維肉瘤中過量表達(dá)。也發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、乳癌和肝細(xì)胞癌患者血清中MMP-9水平增加。因此，在可治療的疾病中，具體參考上述癌癥。眾所周知轉(zhuǎn)移性疾病(而且通常也是侵襲性腫瘤生長本身)限制癌癥患者的壽命。癌癥中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成型激活的原因迄今為止尚未了解。它可能是由于生長因子受體基因突變諸如基因擴增或自分泌環(huán)即相同組織中配體和受體的表達(dá)所致。上述癌癥是按照本發(fā)明活性劑的良好靶，因為癌癥侵入是這些癌癥中一個爭論不休的問題。
按照本發(fā)明，有可能選擇所述活性劑的給藥形式。使這種形式可適用于患者的年齡、性別或其它特征、癌癥的嚴(yán)重程度和其它參數(shù)。可以存在常規(guī)藥用載體、稀釋劑或常規(guī)添加劑。
劑量可以隨臨床情況和患者病癥而隨意選擇。
最后，本發(fā)明包括用于治療癌癥的藥用組合物或藥物，所述藥用組合物或藥物含有至少一種影響、特別是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶在真核細(xì)胞中表達(dá)的活性劑。有關(guān)這種組合物或藥物各種特征的參考文獻(xiàn)參見上述相應(yīng)的說明書正文。
本發(fā)明的所述特征和其它特征可以根據(jù)以下優(yōu)選實施方案的說明以及權(quán)利要求書加以總結(jié)。個別特征可以分別實現(xiàn)或以亞組合形式實現(xiàn)。材料和方法載體按照其它文獻(xiàn)(31-33)所述，通過絲氨酸207和蘇氨酸211被谷氨酸取代，產(chǎn)生MKK-6的組成型活性突變體；通過絲氨酸207和蘇氨酸211被丙氨酸取代，產(chǎn)生顯性失活MKK-6表型(34)；以及通過在p38激酶的典型TGY序列中蘇氨酸被丙氨酸取代以及酪氨酸被苯丙氨酸取代，產(chǎn)生激酶缺陷型p38突變體；按照其它文獻(xiàn)(11，35，36)所述，將所有產(chǎn)生的c-DNA亞克隆到哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3中。由MMP-9啟動子的5’缺失型片段或突變型啟動子(-79 AG-1 mt)驅(qū)動的CAT報道構(gòu)建體在其它文獻(xiàn)中已有描述(37)。TAM-67構(gòu)建體編碼缺失氨基酸3-122的突變型c-jun蛋白(38)。*5AP-1 pBLCAT構(gòu)建體由前接5個AP-1重復(fù)序列的最小胸苷激酶啟動子CAT報道構(gòu)建體組成(39)。
組織培養(yǎng)和材料。UM-SCC-1細(xì)胞(技術(shù)人員已知的，可得自Thomas Carey博士，University of Michigan，Ann Arbor，MI)、Hlac82(技術(shù)人員已知的，可得自Hans Peter Zenner博士，University of Tübingen，德國)和NIH 3T3細(xì)胞(幾乎由每個細(xì)胞生物學(xué)實驗室保持，也可得自Hans Peter Zenner博士，參見上文)，在補充10％胎牛血清(FBS，GibcoLife Technologies，Karlsruhe，德國)的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中保持。為了收集條件培養(yǎng)基供酶譜分析(zymography)和蛋白質(zhì)印跡法用，將80％匯合的UM-SCC-1、H1a82和NIH 3T3細(xì)胞分別在無血清培養(yǎng)基(McCoy’s 5A培養(yǎng)基，其組分對于技術(shù)人員是已知的，可得自Gibco LifeTechnologies，Karlsruhe，德國)中孵育48小時，而同時指示加入或不加入SB203580(Calbiochem，San Diego，CA)或載體(DMSO)時。下文“無血清培養(yǎng)基”也被縮寫為“SFM”。收集所述培養(yǎng)基，在將細(xì)胞在0.2mg/ml MTT-活體染料中孵育并且通過分光光度法于570nm讀出等份的DMSO溶解的甲晶體后，測定增殖。生長曲線的產(chǎn)生如(25)所述，在含血清和無血清條件下，采用在允許細(xì)胞附著12小時(第0天)后和此后至多4天(第1-4天)的同時加入各種量的SB203580。
酶譜分析。完全如(20，25)所述，采用含有0.1％(wt/vol)明膠的SDS-PAGE凝膠測定MMP-9，進行酶譜分析。依賴MMP的蛋白水解檢測為暗視野中的白色區(qū)。
蛋白質(zhì)印跡法。為了檢測條件培養(yǎng)基中的MMP-9，使來自相等細(xì)胞數(shù)的培養(yǎng)基在無還原劑的情況下變性，蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移至硝化纖維素濾膜。所述濾膜用3％BSA封閉，與抗基質(zhì)金屬蛋白酶的小鼠單克隆抗體(#IM37L Oncogene Research Products，Calbiochem，Cambridge，MA)一起保溫。接下來，將印跡與辣根過氧化物酶綴合的抗兔IgG一起保溫，通過市售免疫印跡檢測系統(tǒng)ECL(增強化學(xué)發(fā)光)如生產(chǎn)商(Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)所述來顯現(xiàn)免疫反應(yīng)性條帶。采用同時識別磷酸-p38和去磷酸-p38的單克隆抗體(sc-535-G和sc-6023，Santa Cruz，Santa Cruz，CA)，檢測p38α和SAPK3蛋白。簡而言之，細(xì)胞在含有PMSF(100mg/ml)和原釩酸鈉(1mM)的RIPA緩沖液中提取。用SDS-PAGE分離在變性條件提取的蛋白質(zhì)。濾膜用3％BSA封閉，隨后與第一抗體一起保溫過夜。為了顯現(xiàn)免疫反應(yīng)性條帶，再次使用ECL系統(tǒng)。
供p38α活性和SAPK3活性測定用的凝膠內(nèi)(in-gel)激酶測定。如(20)所述進行p38α活性的激酶測定。簡而言之，細(xì)胞用緩沖液A[1％NP40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、25mM Tris-HCl(pH7.4)、25mMNaCl、1mM釩酸鈉、10mM NaF、10nM焦磷酸鈉、10nM岡田酸、0.5mM EGTA和1mM苯甲基磺酰氯]提取。將提取的蛋白質(zhì)與2μg與人和小鼠p38α有免疫反應(yīng)性的抗p38α抗體(sc-535-G，Santa Cruz，Santa Cruz，CA)和A蛋白瓊脂糖微珠(2mg)一起保溫以進行免疫沉淀。微珠用緩沖液A洗滌，重懸于2X樣品緩沖液中，免疫復(fù)合物在含有髓鞘堿性蛋白的聚丙烯酰胺凝膠中電泳。凝膠順序用含20％2-丙醇、5mM 2-疏基乙醇、6M鹽酸胍和0.04％Tween 40-5mM 2-疏基乙醇的緩沖液處理。然后將凝膠與10μM ATP和25μCi[32P]ATP在含有2mM二硫蘇糖醇-0.1mM EGTA-5mM MgCl2的緩沖液中于25℃保溫1小時，在含有5％三氯乙酸和1％焦磷酸鈉的溶液中洗滌，干燥，然后放射自顯影。對于SAPK3活性，細(xì)胞在緩沖液A中提取，將提取的蛋白質(zhì)與2μg與人和小鼠SAPK3有免疫反應(yīng)性的抗SAPK3抗體(06-603，Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY，USA)和G蛋白瓊脂糖微珠一起孵育。微珠在緩沖液A和激酶緩沖液(50mM HEPES、0.1mMEDTA、0.0001％Brij35、0.0001％β-疏基乙醇、150mM NaCl、O1mg/ml牛血清白蛋白)中洗滌，然后與作為底物的1μg ATF2(sc-4007，SantaCruz，Santa Cruz，CA，USA)在40μl反應(yīng)緩沖液(激酶緩沖液，0.3mMATP，0.4M MgCl2)中于30℃進行激酶反應(yīng)30分鐘。通過加入2X還原樣品緩沖液且加熱至100℃達(dá)5分鐘而終止反應(yīng)。通過離心除去微珠。如上所述，用抗磷酸-ATF2-抗體對上清液進行免疫印跡分析。采用ECL系統(tǒng)顯現(xiàn)免疫反應(yīng)性條帶。
體外侵入測定。如(20，25)所述，采用用1/3稀釋的Matrigel/SFM(Becton Dickinson，Bedford，MA)包被的8μm孔徑濾膜進行侵入測定。將細(xì)胞以相似濃度平板接種到含有SB203580或DMSO的SFM、SB203580載體中。對于使用小鼠單克隆MMP-9抗體(#IM09L，OncogeneResearch Products，Cambridge，MA)(0.5μg/ml、1μg/ml和10μg/ml)的實驗，將細(xì)胞平板接種到SFM加上SFM的抗體加上相似量的免疫前血清中。侵入量基于濾膜下表面上的MTT活性來測定，以室中總活性的百分比表示。
瞬時轉(zhuǎn)染與后續(xù)CAT-ELISA。采用供瞬時轉(zhuǎn)染用的Lipofectamin(GIBCO，Life Technologies，Karlsruhe，德國)如生產(chǎn)商所述進行瞬時轉(zhuǎn)染。將UM-SCC-1和NIH3T3細(xì)胞在70％匯合時用下述構(gòu)建體或突變體一起進行共轉(zhuǎn)染含有670bp包括轉(zhuǎn)錄起始位點的MMP9野生型啟動子的CAT報道構(gòu)建體或無啟動子的CAT構(gòu)建體(SV0)(3μg)以及如(26)所述的pCDNA3-MKK-6或pCDNA3-MKK-3組成型活性突變體(0.03-3μg)或顯性失活p38α、p38β、SAPK3、SAPK4或MKK-6突變體與1倍或2倍摩爾過量的所述啟動子構(gòu)建體(由J.Han博士，ScrippsResearch Institute，La Jolla，CA友好提供)。采用模擬對照載體(pCDNA3)，使每個樣品中經(jīng)轉(zhuǎn)染的DNA量相等。按照生產(chǎn)商的說明(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)進行CAT ELISA，從而測量CAT蛋白表達(dá)。
·圖2在不同的細(xì)胞系中體外侵入對MMP-9分泌的需求(A)、MMP-9在不同細(xì)胞系中的表達(dá)(B)和在與抗MMP-9抗體一起孵育后的體外侵入百分率(C)。
·圖3在用顯性失活p38同種型蛋白處理后對MMP-9啟動子活性的影響(A)以及p38α和p38γ在兩種不同細(xì)胞系中的表達(dá)(B-E)。
·圖4MMP-9在兩種不同細(xì)胞系中的表達(dá)(A)，在用激酶缺陷型MKK6(B)和組成型活性MKK6和MKK3(C)突變體處理后對MMP-9啟動子活性的影響。
·圖5MMP-9啟動子活性被MKK-6誘導(dǎo)(A)以及AP-1基序中的點突變對MKK-6依賴性啟動子激活的影響(B)。
·圖6組成型活化MKK-6對CAT-報道分子的影響(A)以及在用不同載體處理后的MKK-6依賴性MMP-9啟動子激活(B)。
實驗1UM-SCC-1細(xì)胞平板接種于補充10％胎牛血清(FBS，Gibco LifeTechnologies，Karlsruhe，德國)的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中，次日再補充含SB 203580(10μM，Calbiochem，San Diego，CA)或載體(二甲亞砜DMSO，0.01％)的無血清培養(yǎng)基。48小時后，收獲條件培養(yǎng)基，用溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)測定增殖率。根據(jù)增殖差異標(biāo)準(zhǔn)化的等份條件培養(yǎng)基采用單克隆抗MMP-9抗體進行免疫印跡分析。接下來，將印跡與辣根過氧化物酶綴合的抗兔IgG一起孵育，如生產(chǎn)商(Amersham，Arlington Heights，IL)所述，通過ECL顯現(xiàn)免疫反應(yīng)性條帶。按照光密度測定法觀察到蛋白質(zhì)表達(dá)降低70％。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。
實驗1結(jié)果示于

圖1中。
圖1A顯示組成型產(chǎn)生大量MMP-9且表現(xiàn)出體外和體內(nèi)侵襲表型的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系UM-SCC-1受咪唑衍生物SB203580處理影響。如免疫印跡分析證明，SB203580降低MMP-9蛋白表達(dá)，于濃度10μM時降低約70％。
在圖1B中，將UM-SCC-1細(xì)胞平板接種于預(yù)先用Matrigel包被的在無血清培養(yǎng)基中的濾膜上，然后與不同量的SB203580一起孵育60小時，以測定體外侵入。將載體(DMSO)濃度保持在0.1％。侵入以侵入通過Matrigel的細(xì)胞百分率表示。用不同濃度的SB 203580處理后的侵入以平均百分?jǐn)?shù)+/-S.E.表示，代表每組3個平皿。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。圖1B顯示，采用濃度5μM和10μM，體外侵入有分別為43+/-9％和69+/-8％的劑量依賴性降低。
圖1C顯示將UM-SCC-1細(xì)胞暴露于5-和10-所述p38抑制劑至多5天，不影響細(xì)胞生長，從而排除了所述化合物有引起對體外侵入的抑制效應(yīng)的抗有絲分裂效應(yīng)。各種p38同種型在其對SB203580的敏感性方面有所不同。對于p38α報道的IC50為0.1μM，而對于p38β報道的IC50為5-10μM。p38γ和p38δ不被所述咪唑衍生物抑制(27)。因此，降低MMP-9表達(dá)和UM-SCC-1細(xì)胞的體外侵入所需的SB 203580濃度與p38β的IC50接近一致。在該實驗中，讓所述細(xì)胞在含有10％FBS、加入各種量的SB 203580的培養(yǎng)基中生長5天。在指定天數(shù)用0.2mg/ml MTT-活體染料并且通過分光光度法于570nm連續(xù)讀出DMSO溶解的甲晶體來測定活細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)點代表三個重復(fù)實驗。
因此，實驗1和相關(guān)的圖1表明，p38 SAPK抑制劑SB 203580降低MMP-9的高水平表達(dá)和UM-SCC-1細(xì)胞的體外侵入，但對細(xì)胞生長無任何影響。實驗2在該實驗中，將不同的細(xì)胞系平板接種于預(yù)先用Matrigel包被的在無血清培養(yǎng)基中的濾膜上并進行孵育。侵入以平均百分?jǐn)?shù)+/-S.E.表示，代表每組3個平皿。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。為了解決UM-SCC-1細(xì)胞的體外侵入是否需要MMP-9的問題，首先使三個不同細(xì)胞系(UM-SCC-1、NIH3T3、Hlac82)的表達(dá)水平與其體外侵入行為相關(guān)聯(lián)。圖2A顯示條件培養(yǎng)基中的MMP-9量幾乎與所述細(xì)胞系的侵襲力平行。UM-SCC-1細(xì)胞產(chǎn)生最大量蛋白酶且表現(xiàn)出最大侵襲表型，而不分泌任何可檢測MMP-9的NIH3T3細(xì)胞在Matrigel包被的濾膜上的侵襲力要小得多。有趣的是，在MMP-2分泌和被測細(xì)胞系侵襲力之間并無相關(guān)性。這可能是由于MMP-2的活化需要不同膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT-MM)所致(21)，該蛋白在NIH3T3細(xì)胞上可能并被表達(dá)。
按照圖2B，給不同細(xì)胞系更換為無血清培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)48小時。收獲條件培養(yǎng)基，采用MTT測定細(xì)胞數(shù)。如(20，25)所述和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酶譜分析，測定根據(jù)細(xì)胞數(shù)差異校正的等份條件培養(yǎng)基的MMP-9活性。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。只有表達(dá)最高量MMP-9的細(xì)胞系在酶譜分析中才顯示出清晰的條帶。
為了最終證實UM-SCC-1細(xì)胞的體外侵襲表型需要MMP-9活性，在圖2C中，將UM-SCC-1細(xì)胞平板接種于預(yù)先用Matrigel包被的在無血清培養(yǎng)基中的濾膜上，然后與各種量的抗MMP-9抗體(0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)或等量的所述生產(chǎn)商提供的免疫前血清一起孵育60小時。侵入以細(xì)胞侵入通過Matrigel的百分率表示。在用不同濃度的識別活性形式和潛伏形式的MMP-9的抗體或由所述生產(chǎn)商提供的免疫前血清處理后，侵入以平均百分?jǐn)?shù)+/-S.E.表示，代表每組3個平皿。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。圖2C顯示體外侵入隨抗體濃度增加的劑量依賴性降低。
因此，實驗2和相關(guān)的圖2表明，所述細(xì)胞系的體外侵入需要MMP-9分泌到UM-SCC-1細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中。因此，可以得出的結(jié)論是，SB203580通過降低通過p38信號途徑的MMP-9表達(dá)，抑制UM-SCC-1細(xì)胞的體外侵入。實驗3由于MMP-9的表達(dá)幾乎只在啟動子水平上受調(diào)控(28，29)，并且為了進一步表征不同p38同種型在調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)中的作用，所以采用Lipofectamin(Gibco Life Technologies，Karlsruhe，德國)如生產(chǎn)商所述以及用由野生型MMP-9啟動子驅(qū)動的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報道分子或無啟動子的CAT構(gòu)建體(SV0)和指定量的(其中2是效應(yīng)子質(zhì)粒相對于所述報道構(gòu)建體2倍摩爾過量)包括顯性失活p38α、p38β、p38γ和p38δ的表達(dá)載體或空載體(pCDNA3)，瞬時轉(zhuǎn)染UM-SCC-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染DNA量的差異用空載體歸一化。采用CAT-ELISA按照生產(chǎn)商所述方法(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)，測定根據(jù)蛋白質(zhì)量差異標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞提取物的CAT表達(dá)。數(shù)據(jù)以對照平均百分?jǐn)?shù)+/-S.E.表示，代表每組2個平皿，以3個獨立的實驗進行。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，在p38激酶的典型TGY序列中通過蘇氨酸被丙氨酸取代和酪氨酸被苯丙氨酸取代，產(chǎn)生激酶缺陷型突變體，然后將所有產(chǎn)生的cDNA克隆到哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3中。
按照圖3A，發(fā)現(xiàn)SB203580敏感性同種型突變體p38β阻抑MMP-9啟動子驅(qū)動的CAT報道分子的活性，在2倍摩爾過量時阻抑62+/-20％，相比之下，p38α突變體僅降低MMP-9啟動子活性21+/-20％。p38δ突變體抑制MMP-9啟動子55+/-9％。用p38γ突變體轉(zhuǎn)染，實際上使MMP-9啟動子沉默，即啟動子活性被阻抑99.9+/-0.5％。在無啟動子的CAT構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后，沒有觀察到顯著的CAT表達(dá)。
圖3A顯示，除p38β和p38δ之外，是p38γ而非p38α顯性失活表達(dá)構(gòu)建體降低MMP-9啟動子活性。該實驗進一步支持是p38β而不是p38α參與MMP-9啟動子組成型激活，另外，它們有力地表明p38δ和最重要的是p38γ在MMP-9啟動子組成型激活中的作用。
在圖3B-E中，將UM-SCC-1細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞保持在含有10％FBS的培養(yǎng)基中。蛋白提取物(相等蛋白)和凝膠內(nèi)激酶測定如上所述制備，然后或者采用多克隆抗p38α抗體或多克隆抗SAPK3抗體進行免疫印跡(B)和(D)，或者采用MBP為底物進行凝膠內(nèi)激酶測定(C)，或者采用重組ATF2為底物進行免疫激酶反應(yīng)(E)。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。根據(jù)這些實驗，可以排除的是，在p38α被激酶缺陷型突變體抑制后觀察到的MMP-9啟動子活性適度降低也可能是由于缺乏所述激酶的表達(dá)和/或活性所致。為此，測定UM-SCC-1細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞(陰性對照)中p38α的活性和表達(dá)。也通過用多克隆SAPK3抗體免疫沉淀，和隨后在相似的實驗中的激酶反應(yīng)，分析p38γ的活性和表達(dá)。
可以根據(jù)圖3B-E來推斷，注意到在兩種細(xì)胞系中均存在p38α和p38γ兩種蛋白質(zhì)(圖3B和3C)。然而，發(fā)現(xiàn)兩種p38同種型的酶活性在UM-SCC-1細(xì)胞中高，與NIH3T3細(xì)胞中不可檢測相反。因此，在UM-SCC-1細(xì)胞中存在p38α和p38γ且是組成型活性的。實驗4在此將UM-SCC-1細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞更換為無血清培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)48小時。收獲條件培養(yǎng)基，采用MTT測定細(xì)胞數(shù)。通過酶譜分析測定根據(jù)細(xì)胞數(shù)差異校正的等份條件培養(yǎng)中的MMP-9活性。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。
圖4A顯示，是UM-SCC-1細(xì)胞而非NIH3T3細(xì)胞，表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)。
由于MKK6蛋白激酶廣泛激活p38同種型(與MKK3相反，它作為p38α和SAPK4/p38δ同種型的相當(dāng)特異性的激活劑起作用)(26，30)，因此為了測定MKK6在調(diào)節(jié)MMP-9中的作用，在圖4B中，采用由野生型MMP-9啟動子驅(qū)動的CAT報道分子或無啟動子的CAT構(gòu)建體(SV0)和指定量的(其中2是效應(yīng)子質(zhì)粒相對于所述報道構(gòu)建體2倍摩爾過量)編碼激酶死亡MKK6突變體的表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染UM-SCC-1細(xì)胞。按照上述出版物(26)，通過用丙氨酸取代絲氨酸151和蘇氨酸155產(chǎn)生所述激酶死亡表型。觀察到強降低MMP-9啟動子活性99+/-0.5％。這些數(shù)據(jù)說明，MKK6激酶缺陷型突變體阻抑UM-SCC-1細(xì)胞中的MMP-9啟動子活性，并且MKK6是MMP-9的上游調(diào)節(jié)物，MMP-9可能通過p38同種型發(fā)送信號。
為了進一步表征MKK6在調(diào)節(jié)MMP-9啟動子中的作用，檢查MKK6激酶組成型激活的效應(yīng)。在圖4C中，采用由野生型MMP-9啟動子驅(qū)動的CAT報道分子或無啟動子的CAT構(gòu)建體(SV0)和指定量的(其中2是效應(yīng)子質(zhì)粒相對于所述報道構(gòu)建體2倍摩爾過量)編碼組成型活化MKK6和MKK3蛋白的表達(dá)載體或所述空載體，瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染DNA量的差異用空載體歸一化。采用CAT-ELISA，測定根據(jù)蛋白質(zhì)量差異標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞提取物的CAT表達(dá)。數(shù)據(jù)以對照平均百分?jǐn)?shù)+/-S.E.表示，代表每組2個平皿，以3個獨立的實驗進行。按照J(rèn).Hahn等的出版物(26)，絲氨酸151和蘇氨酸155被谷氨酸取代，實現(xiàn)MKK6的組成型活化。為了避免內(nèi)源刺激物干擾所述啟動子的激活，利用不表達(dá)內(nèi)源MMP-9的NIH3T3細(xì)胞(圖4A)。在用CAT報道分子和1倍摩爾過量的MKK6突變體共轉(zhuǎn)染后，觀察到5倍的MMP-9啟動子激活。用相似構(gòu)建的MKK3突變體重復(fù)相同實驗。以相似的摩爾過量，僅觀察到2.8倍啟動子誘導(dǎo)。
圖4C說明，MKK6對所有p38同種型(包括p38γ)多少有些非特異性活化，而MKK3更窄地靶向p38α和p38δ。這些結(jié)果支持p38γ在調(diào)節(jié)MMP-9中的作用。實驗5在該實驗中，NIH3T3細(xì)胞用由野生型MMP-9啟動子5’側(cè)翼區(qū)驅(qū)動的CAT報道分子(3μg)和編碼組成型活化MKK-6蛋白(MKK6(Glu))的表達(dá)載體(0.4μg)以0.1∶1的效應(yīng)子質(zhì)粒相對于所述670 bp-CAT報道分子的摩爾比來瞬時轉(zhuǎn)染。采用CAT-ELISA，測定根據(jù)蛋白質(zhì)量差異標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞提取物的CAT表達(dá)。數(shù)據(jù)以相對于對照(MMP-9 670bp-CAT構(gòu)建體)的平均誘導(dǎo)倍數(shù)±SE表示，代表3個獨立的實驗(圖5A)。在圖5B中，NIH3T3細(xì)胞用由野生型MMP-9啟動子驅(qū)動的或含有在AP-1基序列中位于-79點突變的MMP-9啟動子驅(qū)動的CAT報道分子(3μg)和組成型活化MKK-6構(gòu)建體(MKK-6(Glu))(0.4μg)以0.1∶1的效應(yīng)子質(zhì)粒相對于CAT構(gòu)建體的摩爾比瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染DNA量的差異用空載體歸一化。采用CAT-ELISA，測定根據(jù)蛋白質(zhì)量差異標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞提取物的CAT表達(dá)。顯示相對于對照(MMP-9 670bp-CAT構(gòu)建體)的CAT表達(dá)平均誘導(dǎo)倍數(shù)±SE，數(shù)據(jù)代表3個獨立的實驗。
為了測定被特異性p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活劑MKK-6刺激所需的啟動子區(qū)，將NIH3T3細(xì)胞用由92-kDa膠原蛋白酶野生型啟動子5’缺失型片段驅(qū)動的CAT報道分子共轉(zhuǎn)染。包括MMP-9啟動子的144-bp片段在內(nèi)的所有被測構(gòu)建體被MKK-6類似激活(在MKK-6構(gòu)建體相對于MMP-9啟動子構(gòu)建體的摩爾比為0.1時，為3.5倍)。相反，如果使用由90bp或73bp的5’側(cè)翼序列驅(qū)動的CAT報道構(gòu)建體，即使有刺激，也是很少的，提示在-144和轉(zhuǎn)錄起始位點之間區(qū)域中的某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是MKK-6依賴性MMP-9啟動子激活所需的(圖5A)。搜索該部分的序列表明，在-79存在一個AP-1(活化轉(zhuǎn)錄激活因子1)結(jié)合位點(37)。AP-1是由Fos(c-Fos、FosB、Fra1、Fra2)和Jun(c-Jun、JunD、JunB)家族成員組成的蛋白二聚體。所產(chǎn)生的復(fù)合物與稱為AP-1位點或十四烷酰佛波醇(TPA)效應(yīng)元件(TRE)的特定DNA序列結(jié)合。該術(shù)語是指TPA由于增加蛋白表達(dá)和磷酸化而有效刺激AP-1的DNA結(jié)合(40)。MMP-9啟動子含有這類TRE元件。發(fā)現(xiàn)一個AP-1位點位于-79，第二個位于離開主要轉(zhuǎn)錄起始位點的-540(37，41)。然后測定該TRE元件在MMP-9啟動子被MKK-6激活中的作用。在AP-1位點(-79)中引入點突變(TGAGTCA→TTTGTCA)(37)完全消除了MMK-6對全長野生型MMP-9啟動子的誘導(dǎo)性。這表明，MKK-6依賴性反式激活需要該MMP-9啟動子區(qū)(圖5B)，所述區(qū)包含在MMP-9啟動子的近端144bp 5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)。實驗6在該實驗中，用編碼組成型活化MKK-6突變蛋白(MKK6(Glu))的構(gòu)建體(1μg)、由含最小胸苷激酶啟動子和5個AP-1基序重復(fù)序列(5*AP-1)構(gòu)成的啟動子驅(qū)動的CAT報道分子(1μg)和編碼激酶缺陷型p38蛋白同種型突變體(p38α、p38β、p38γ、p38δ)的載體(2μg)，瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。為了檢驗5*AP-1構(gòu)建體中最小胸苷激酶啟動子的效應(yīng)，使用相似量的缺乏AP-1重復(fù)序列的質(zhì)粒(1μg，pBLCAT)。轉(zhuǎn)染DNA量的差異用空載體(pcDNA3)歸一化。采用CAT-ELISA，測定根據(jù)蛋白質(zhì)量差異標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞提取物的CAT表達(dá)。數(shù)據(jù)以相對于對照(5*AP-1CAT報道分子)的CAT表達(dá)誘導(dǎo)倍數(shù)表示，數(shù)據(jù)代表2個獨立的實驗(圖6A)。在圖6B中，用編碼組成型活化MKK-6突變蛋白(MKK6(Glu))的構(gòu)建體(4μg)、由670bp野生型MMP-9啟動子驅(qū)動的CAT報道分子(3μg)和編碼缺乏反式激活結(jié)構(gòu)域的c-jun蛋白的載體(TAM67)(2μg)，瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染DNA量的差異用空載體(分別為pcDNA3、CMV5)歸一化。采用CAT-ELISA，測定根據(jù)蛋白質(zhì)量差異標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞提取物的CAT表達(dá)。數(shù)據(jù)以相對于對照(MMP-9野生型啟動子CAT構(gòu)建體)的CAT表達(dá)誘導(dǎo)倍數(shù)表示，實驗代表2個獨立的實驗。
MKK-6依賴性誘導(dǎo)需要在MMP-9野生型啟動子的近端區(qū)中AP-1的存在和完整性，這表明MKK-6是AP-1依賴性轉(zhuǎn)錄的激活劑。因此，將組成型活性MKK-6構(gòu)建體與由后接最小胸苷激酶啟動子的5次重復(fù)的AP-1共有位點驅(qū)動的CAT報道分子一起共轉(zhuǎn)染到NIH 3T3細(xì)胞中。發(fā)現(xiàn)MKK-6強激活5*AP-1CAT報道構(gòu)建體。該激活或者通過從所述啟動子中去除AP-1重復(fù)序列，或者通過任一種p38同種型顯性失活突變體的共轉(zhuǎn)染而被消除。因此，MKK-6確實可以通過需要p38激酶活性的途徑來激活A(yù)P-1依賴性轉(zhuǎn)錄(圖6A)。
缺乏其反式激活結(jié)構(gòu)域的c-jun(TAM67)的表達(dá)，消除MKK-6依賴性MMP-9啟動子的激活。這表明MKK-6依賴性MMP-9啟動子的反式激活需要近端TRE元件(-79)和MKK-6激活通過若干個p38激酶同種型的AP-1依賴性轉(zhuǎn)錄的能力。因此，顯然MKK-6通過活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1誘導(dǎo)MMP-9野生型啟動子活性。為了證明這一點，將由此作為顯性失活A(yù)P-1突變體的缺乏其反式激活結(jié)構(gòu)域(42)的c-jun蛋白與活化MKK-6突變體一起共轉(zhuǎn)染到NH 3T3細(xì)胞中。瞬時表達(dá)的蛋白與fos結(jié)合且產(chǎn)生反式激活缺陷型AP-1復(fù)合體，與完整AP-1競爭與MMP-9啟動子中的所述TRE元件結(jié)合。該突變蛋白的表達(dá)引起幾乎完全抑制MKK-6依賴性MMP-9啟動子的激活，而與相對于全長MMP-9啟動子CAT報道分子量的摩爾比已經(jīng)為0.5∶1時的對照(空載體)相反，證明所推定的MKK-6依賴性MMP-9啟動子的反式激活需要AP-1復(fù)合體(圖6B)。
實驗5和實驗6的結(jié)果表明，MKK-6可以誘導(dǎo)AP-1依賴性轉(zhuǎn)錄活性，而這是MMP-9啟動子的誘導(dǎo)所需的，并且MKK-6介導(dǎo)的激活需要MMP-9啟動子中的近端AP-1位點。
所有實驗結(jié)果清楚地表明，按照本發(fā)明，通過給予影響、特別是抑制MMP-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游調(diào)節(jié)劑的活性劑，將正面影響癌癥、最好是癌癥轉(zhuǎn)移的侵襲力。
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1.一種用于影響、特別是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶在真核細(xì)胞中表達(dá)的活性劑在制備治療癌癥的藥物或藥用組合物方面的應(yīng)用。
2.治療癌癥的方法，其特征在于真核細(xì)胞用影響、特別是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的活性劑來治療。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用或方法，其特征在于所述基質(zhì)金屬蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)。
4.任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用或方法，其特征在于所述活性劑靶向所述基質(zhì)金屬蛋白酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的至少一個成員。
5.權(quán)利要求4的應(yīng)用或方法，其特征在于所述成員是p38蛋白質(zhì)家族的一個成員。
6.權(quán)利要求5的應(yīng)用或方法，其特征在于所述p38蛋白是p38β蛋白。
7.權(quán)利要求5的應(yīng)用或方法，其特征在于所述p38蛋白是p38γ(SAPK3或ERK6)蛋白。
8.權(quán)利要求4的應(yīng)用或方法，其特征在于所述成員是促分裂原活化激酶激酶家族的一個成員。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用或方法，其特征在于所述促分裂原活化激酶激酶是促分裂原活化激酶激酶6(MKK6)或促分裂原活化激酶激酶3(MKK3)。
10.任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用或方法，其特征在于所述活性劑靶向所述基質(zhì)金屬蛋白酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物學(xué)前體。
11.任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用或方法，其特征在于所述活性劑是一種小分子化合物，最好是一種分子量(MW)＜1000的小分子化合物。
12.權(quán)利要求11的應(yīng)用或方法，其特征在于所述小分子化合物是一種咪唑衍生物，其中所述咪唑衍生物最好是SB203580或SB202190。
13.任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用或方法，其特征在于所述活性劑是一種編碼影響、最好是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的肽、最好是多肽的多核苷酸。
14.任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用或方法，其特征在于所述癌癥具有侵襲表型。
15.任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用或方法，其特征在于所述癌癥是a)鱗狀上皮癌，最好是頭、頸、皮膚或胃的鱗狀上皮癌，或者b)結(jié)腸癌、乳癌或肝細(xì)胞癌，或者c)胃纖維肉瘤。
16.藥用組合物，所述藥用組合物包含適合量的至少一種活性劑并且任選還包含一種藥學(xué)上可接受的載體，其中所述活性劑影響、最好是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
17.權(quán)利要求16的藥用組合物，其進一步的特征為權(quán)利要求4-13中任一項限定的活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用活性劑、特別是抑制劑通過影響、最好是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)來治療癌癥。該活性劑的靶尤其可以涉及基質(zhì)金屬蛋白酶－9(MMP－9)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游調(diào)節(jié)劑。按照本發(fā)明，尤其可以應(yīng)用p38β和p38γ以及促分裂原活化激酶激酶6(MKK6)或促分裂原活化激酶激酶3(MKK3)的抑制劑。
文檔編號A61K45/00GK1458841SQ01815690
公開日2003年11月26日 申請日期2001年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月17日
發(fā)明者克里斯蒂安·西蒙, 漢斯－彼得·曾納 申請人:克里斯蒂安·西蒙, 漢斯－彼得·曾納