專利名稱：：人抗表皮生長(zhǎng)因子受體抗體的制作方法人抗表皮生長(zhǎng)因子受體抗體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明關(guān)系到表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)特異的單克隆抗體。這些抗體可以用于治療含腫瘤性疾病和過(guò)度增生性疾病在內(nèi)的疾病。發(fā)明背景正常細(xì)胞的增生是通過(guò)生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶(RTKs)被其各自的配體激活所致，該過(guò)程是高度受控的。雖然肺瘤細(xì)胞的增生也是通過(guò)生長(zhǎng)因子受體激活達(dá)成，但卻失去了對(duì)正常增生的精確控制。許多因素可以導(dǎo)致這種失控，如生長(zhǎng)因子和/或受體的過(guò)度表達(dá)，生長(zhǎng)因子所調(diào)節(jié)的生物化學(xué)通道的自主激活。涉及到腫瘤生成的RTKs的例子有表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGFR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGEF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGEF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。這些生長(zhǎng)因子與其細(xì)胞表面的受體的結(jié)合導(dǎo)致受體被激活，從而激活并改變信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起細(xì)胞增生和分化。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體家族成員為特別重要的與表皮細(xì)胞的腫瘤化有關(guān)的生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶。最早發(fā)現(xiàn)的EGF受體家族成員為在許多類型的腫瘤細(xì)胞上都有表達(dá)的EGFR。EGFR被發(fā)現(xiàn)涉及到調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)、修復(fù)、存活、血管生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。EGFR是一個(gè)170kD的跨膜糖蛋白，有一個(gè)細(xì)胞外配體結(jié)合功能域、穿膜區(qū)段和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶功能域。刺激EGFR的配體包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-oc)、肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(HBGF)、P-cellulin和Cripto-l。配體的特異性結(jié)合引起EGFR自主磷酸化，從而活化細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶功能域并啟動(dòng)調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和存活的多種信號(hào)傳導(dǎo)通路。EGFR通路也影響腫瘤內(nèi)其他血管生成因子，如VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的產(chǎn)生。激活EGFR的生長(zhǎng)因子被認(rèn)為也在腫瘤血管生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。血管生成指從胚胎和成年生物體已有的血管上形成毛細(xì)血管，是已知的腫瘤生長(zhǎng)、存活和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。有報(bào)道稱EGFR介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞刺激導(dǎo)致血管生成因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素-8(IL-8)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá)增強(qiáng)，從而引起腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化。腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激也可通過(guò)腫瘤產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，如TGF-oc和EGF激活自身的EGF受體引起。已有人體腫瘤表達(dá)和過(guò)量表達(dá)EGFR的報(bào)道，EGFR的表達(dá)與不良預(yù)后、j氐存活率和/或高轉(zhuǎn)移率成相關(guān)關(guān)系。EGFR,由于涉及到腫瘤形成，已經(jīng)成為抗胂瘤治療的特異性耙目標(biāo)。這些治療主要包括阻斷配體結(jié)合到受體細(xì)胞外功能域的單克隆抗體或直接作用于細(xì)胞內(nèi)區(qū)段以防止信號(hào)傳導(dǎo)的合成的酪氨酸激酶抑制劑。例如，CetuximabMab(ERBITUX逸)為一種能夠與人EGFR細(xì)胞外功能域特異性結(jié)合的重組人/鼠嵌合的單克隆抗體，Cetuximab是一種阻斷配體與EGFR結(jié)合、防止受體活化，從而抑制表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的EGFR拮抗劑。西妥昔單抗(Cetuximab)已被批準(zhǔn)與依立替康聯(lián)合或單獨(dú)用藥以治療表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體的、對(duì)基于依立替康的化療無(wú)效或不耐受的轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌患者。西妥昔單抗也已顯示出其對(duì)4艮屑病的效果。發(fā)明概述本發(fā)明提供特異于EGFR、優(yōu)選特異于包括選自含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14的一組序列的EGFR細(xì)胞外區(qū)的從1到6的互補(bǔ)決定區(qū)的任何區(qū)域的單克隆抗體或其片段。優(yōu)選抗體為人源性抗體，更優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體或其片段含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6。可選但也是優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體或其片段含有SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14。更為優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體或其片段含有SEQIDNO:8重鏈可變區(qū)和SEQIDNO:16輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明中的這些抗體或其片段具有多種特性，包括中和EGFR及防止EGFR的配體與其受體的結(jié)合的能力。此外，本發(fā)明提供編碼本抗體及其片段的分離的多核苷酸，同時(shí)也提供含有被操作性地連接到表達(dá)序列上的這些多核苷酸序列的表達(dá)載體。本發(fā)明也提供含有表達(dá)載體或其子代的重組宿主細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明中的抗體或其片段。本發(fā)明還提供生產(chǎn)這些抗體或其片段的方法，包括在一定條件下培養(yǎng)細(xì)胞以使抗體或其片段得以表達(dá)，然后從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基中純化獲得抗體或其片段。同時(shí)，本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物體內(nèi)治療腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括給予哺乳動(dòng)物有效劑量的本抗體。本抗體也可同與其他PTKs結(jié)合的抗體一起給藥。本方法也包括給予哺乳動(dòng)物抗腫瘤藥物或抗腫瘤治療，包括例如某種化療藥物和/或放射治療。在某些實(shí)施方案中，肺瘤生長(zhǎng)受到抑制。在優(yōu)選實(shí)施方案中，治療引起腫瘤消退。本發(fā)明還提供治療哺乳動(dòng)物非癌性增生性疾病，即銀屑病的方法，包括給予哺乳動(dòng)物有效劑量的本抗體。附圖簡(jiǎn)述圖1A和圖IB:表達(dá)免疫球蛋白的克隆載體pDFC和pEE12.1L。圖1C:含有全長(zhǎng)單鏈人抗EGFR抗體基因的載體質(zhì)粒pGS-llF8.圖2:pGS-llF8的酶切圖諳。DNA大小標(biāo)記以kb為單位指示在DNA梯上。圖3:ELISA法測(cè)定IMC-C11F8和IMC-C225與EGFR在體外的結(jié)合。圖4:IMC畫11F8和IMC-C225與1251標(biāo)記的EGF在體外與EGFR竟?fàn)幗Y(jié)合的結(jié)果。圖5:IMC-11F8和IMC-C225對(duì)BxPC3細(xì)胞內(nèi)的EGFR磷酸化的效應(yīng)，所用對(duì)照抗體為IMC-lCll。圖6:IMC-11F8和IMC-C225抑制A431細(xì)胞中EGFR磷酸化。圖7:在未刺激的對(duì)照細(xì)胞(l道)、EGF(2道)、IMC-C225(3道)、IMC-11F8(4道)和對(duì)照抗體(5道)存在下的EGFR的磷酸化的Westernblot分析。圖5A:用抗磷酸化酪氨酸抗體顯示的磷酸化的EGFR。圖5B:被刺激細(xì)胞內(nèi)的總EGFR。圖8:各種濃度的IMC-11F8抑制EGF刺激的EGFR磷酸化。圖8A顯示用抗磷酸化酪氨酸抗體對(duì)未刺激對(duì)照細(xì)胞(l道)、未用IMC-11F8抗體處理的刺激細(xì)胞(2道)、15昭/ml(3道)、3|ug/ml(4道)和0.6pg/ml(3道)IMC-11F8中的EGFR進(jìn)行的westernblot分析。圖8B顯示的是總EGFR。圖9:通過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)IMC-11F8、IMC-C225和對(duì)照抗體對(duì)DiFi細(xì)胞增生的抑制。圖10:用IMC-11F8或IMC-C225(ERBITUXTM)處理的51Cr標(biāo)記的DiFi細(xì)胞的特異性裂解。圖11:A431腫瘤細(xì)胞在用IMC-11F8或IMC-C225(Cetuximab)治療的鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。未處理過(guò)的鼠用作腫瘤生長(zhǎng)的3于照。圖12:BxPC3腫瘤細(xì)胞在用IMC-11F8或IMC-C225(Cetuximab)治療的鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。未處理過(guò)的鼠用作肺瘤生長(zhǎng)的對(duì)照。圖13:用生理鹽水或IMC-11F8治療的異種移植人源腫瘤的棵鼠的免疫組化染色。圖A和B:生理鹽水或MC-11F8治療的A431異種移植的凈果鼠；；圖C和D:生理鹽水或IMC-11F8治療的BxPC3異種移植的棵鼠；圖E和F:Ki-67染色的生理鹽水(E)或IMC-11F8(F)治療的A431異種移植的棵鼠。圖14:IMC-11F8聯(lián)合CPT-ll抑制棵鼠體內(nèi)異種移植的人結(jié)腸直腸癌。人直腸癌GEO(圖A)、DLD-1(圖B)、或HT-29(圖C)異種移植的棵鼠，用生理鹽水或0.3mg或l.Omg的IMC-11F8腹膜內(nèi)注射，一周兩次單獨(dú)給藥，或與100mg々^斤、一周一次的CPT-ll聯(lián)合給藥。每周兩次測(cè)定腫瘤的大小。數(shù)據(jù)為各組10只動(dòng)物腫瘤測(cè)定的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。(D)經(jīng)IMC-11F8單獨(dú)給藥或聯(lián)合CPT-ll給藥處理的腫瘤的消退。各處理組含10只載瘤動(dòng)物。發(fā)明詳述本發(fā)明提供特異于EGFR的單克隆抗體和其片段，同時(shí)提供編碼該抗體的分離的或純化的多核苷酸序列。本發(fā)明的抗體優(yōu)選人抗體并能用于腫瘤性疾病，包括實(shí)體或非實(shí)體腫瘤的治療以及過(guò)度增生性疾病的治療。典型的天然抗體具有兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈，兩條輕鏈通過(guò)一個(gè)鏈間二硫鍵聯(lián)接到重鏈上，兩條重鏈進(jìn)一步通過(guò)多個(gè)二硫鍵相互被聯(lián)接到一起。各條鏈能夠折疊成具有相似大小(110-125氨基酸)和結(jié)構(gòu)但功能各異的功能域。輕鏈可含有一個(gè)可變區(qū)(VO和/或一個(gè)恒定區(qū)(CJ。重鏈也可含有一個(gè)可變區(qū)和/或根據(jù)抗體的組或型的不同，含有三個(gè)或四個(gè)恒定區(qū)(Ch1、Ch2、Qj3和Ch4)。在人體，抗體有IgA、IgD、IgE、IgG和IgM型，IgA和IgG進(jìn)一步分為亞組或亞型(IgAw和IgGM)。通常，可變區(qū)的氨基酸序列在不同抗體間有很大變化，尤其是抗原結(jié)合區(qū)。各Vl和VH上有三個(gè)被稱為超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，由序列變化較小的被稱為骨架區(qū)的可變區(qū)域支撐?？贵w上組成為Vl和Vn區(qū)的部分被稱為Fv(可變片段)并構(gòu)成抗原結(jié)合位點(diǎn)，單鏈Fy(scFv)為在一條多肽鏈上含有V^和Vh的抗體片段，其中一個(gè)區(qū)的N端與另一個(gè)區(qū)的C端通過(guò)一個(gè)柔性接頭(flexiblelinker)相連(參見，例。美國(guó)專利號(hào)4946778(Ladner等)；WO88/09344,(Huston等)；WO92/01047(Mccafferty等)描述了將scFv片段展示在可溶性重組基因展示包裝如噬菌體表面上。用于產(chǎn)生單鏈抗體的肽接頭可以是柔性肽，選來(lái)確保Vl和VH的正確的三維折疊能夠形成。接頭通常為10到15個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為10到30個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選的為12到30個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選的接頭為15到25個(gè)氨基酸殘基，這些接頭肽的一個(gè)例子包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQIDNO:19)。區(qū)，這樣，它們就能避免全抗體使用時(shí)出現(xiàn)的某些問題。例如，單鏈抗體一般沒有某些重鏈恒定區(qū)與其他生物分子之間的不期望發(fā)生的相互作用。此外，單鏈抗體比全抗體小很多，比全抗體更易于滲透，因而能夠更有效地定位并結(jié)合到靶抗原結(jié)合位點(diǎn)上去。再者，單鏈抗體相對(duì)小的體積使它們與全抗體相比不易在受試者體內(nèi)引起不必要的免疫反應(yīng)?！?032]多單鏈抗體，通過(guò)第一個(gè)肽接頭將一個(gè)Vl和Vh區(qū)共價(jià)相連的各單鏈，可以通過(guò)至少一個(gè)或多個(gè)肽接頭共價(jià)連接形成多價(jià)單鏈抗體，它可以是單特異性或多特異性的。多價(jià)單鏈抗體的各鏈包括一個(gè)可變輕鏈片段和一個(gè)可變重鏈片段，通過(guò)一個(gè)肽接頭連接到至少一個(gè)其他鏈上。肽接頭至少含有15個(gè)氨基酸殘基，氨基酸殘基最多為100左右。兩個(gè)單鏈抗體可以結(jié)合形成一個(gè)雙抗體，也被稱為二^h二聚體。雙抗體有兩條鏈和兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，可以是多特異性的或雙特異性的。雙抗體的各鏈包括一個(gè)連接到一個(gè)Vl區(qū)的Vh區(qū)。這些功能區(qū)通過(guò)很短的接頭連接以避免同一條鏈上的功能區(qū)發(fā)生配對(duì)，這樣，促使不同鏈上的互補(bǔ)區(qū)發(fā)生配對(duì)形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。三個(gè)單鏈抗體可結(jié)合形成三抗體，被稱為三價(jià)三聚體。三抗體通過(guò)將一個(gè)Vl區(qū)或VH區(qū)的氨基端直接連接到一個(gè)Vl區(qū)或VH區(qū)的羧基端構(gòu)成，即沒有任何接頭序列。三抗體有三個(gè)Fv頭，多肽以環(huán)狀、頭尾融合模式排列。一種可能的三抗體構(gòu)型為一個(gè)平面，三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)在該平面上相互間成1加°的角度。三抗體可以是單特異性、雙特異性或三特異性的。Fab(抗原結(jié)合片段(Fragment,antigenbinding))指組成為Vl、Vh和Ch1區(qū)的抗體片段。那些經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶水解產(chǎn)生的片段被稱為Fab,它們不含重鏈絞鏈區(qū)。經(jīng)胃蛋白酶水解后，形成含有重鏈絞鏈區(qū)的Fabs。那些帶有完整鏈間二硫鍵的雙價(jià)片段被稱為F(ab，)2，當(dāng)二硫鍵未能保留時(shí)形成單價(jià)的Fab，。F(ab，)2較Fab，對(duì)抗原有更高的親合力。Fc(可結(jié)晶段(Fragmentcrystallization))是指含有配對(duì)的重鏈恒定區(qū)的抗體部分或片段。對(duì)IgG抗體來(lái)說(shuō)，例如，F(xiàn)c段含(^2和CH3區(qū)，IgA和IgM的Fc段進(jìn)一步含有區(qū)。Fc段關(guān)系到與Fc受體的結(jié)合，激活補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和抗體依賴的細(xì)胞毒性反應(yīng)(ADCC)。IgA和IgM這樣的抗體，是多個(gè)IgG樣蛋白的復(fù)合物，復(fù)合物的形成需要Fc段的恒定區(qū)。最后，絞鏈區(qū)將抗體的Fab和Fc段分開，并賦予Fabs與Fabs之間和Fabs與Fc之間的活動(dòng)性，同時(shí)含有將兩條重鏈連接起來(lái)的多個(gè)二硫鍵。這樣，本發(fā)明的抗體包括，但不限于與抗原特異性結(jié)合的天然抗體、二價(jià)片段如F(ab，)2、單價(jià)片段如Fab、單鏈抗體、單鏈Fv(scFv)、單功能區(qū)抗體、多價(jià)單鏈抗體、雙抗體、三抗體及其他與抗原特異性結(jié)合的類似物。本發(fā)明中的抗體或其片段特異于EGFR?？贵w特異性指抗體選擇性地識(shí)別一個(gè)特殊的抗原表位。本發(fā)明中的抗體或其片段，例如，可以是單一特異性的或雙特異性的。雙特異性抗體(BsAbs)為有兩種不同的抗原結(jié)合特異性或位點(diǎn)的抗體。當(dāng)抗體具有一個(gè)以上的特異性時(shí)，被識(shí)別的表位可以涉及到單個(gè)抗原或一個(gè)以上的抗原。因此，本發(fā)明提供能結(jié)合到兩個(gè)不同的抗原，其中至少一個(gè)為EGFR特異的雙特異性抗體或其片段。本發(fā)明中的抗體或其片段對(duì)EGFR的特異性可以根據(jù)其親和力(affmity)和/或親合力(avidity)來(lái)確定。代表一種抗原和一種抗體的離解平衡常數(shù)的親和力(affinity)測(cè)定的是抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合強(qiáng)度。親合力測(cè)定的是抗體與其抗原間的結(jié)合強(qiáng)度。親合力(Avidity)既關(guān)系到一個(gè)表位與其抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)的親和力(affmity)，又關(guān)系到抗體的價(jià)位，即針對(duì)一個(gè)特殊表位的抗原結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量?？贵w結(jié)合的典型離解常數(shù)(Kd)為10-5到10-"升/mo1。任何離解常數(shù)小于10"4的結(jié)合通常被認(rèn)為是非特異性結(jié)合。Kd值越小，抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)間的結(jié)合強(qiáng)度越強(qiáng)。這里所使用的"抗體"和"抗體片段"包括保留了對(duì)EGF受體特異性的經(jīng)過(guò)修飾的產(chǎn)物。這些修飾產(chǎn)物包括但不限于與一個(gè)效應(yīng)分子，如化學(xué)治療藥物(如順鉑、taxol、阿霉素)或細(xì)胞毒素(如一種蛋白或非蛋白的有機(jī)化學(xué)治療藥物)的結(jié)合?？贵w還可以通過(guò)與可檢測(cè)的報(bào)告分子連接進(jìn)行修飾。另外修飾也包括對(duì)抗體的非結(jié)合特性，如半衰期的修改。蛋白和非蛋白藥物可以通過(guò)本領(lǐng)域所知的方法連接到抗體上。連接方法包括直接連接、通過(guò)共價(jià)連接接頭連接和配對(duì)特異性連接(如親和素-生物素)。這些方法包括Greenfield等在CancerResearch50,6600-6667(1990)所描述的連接阿霉素的方法和Arnon等在Adv.Exp.Med.Biol.303,79-90(1991)、Kiseleva等在Mol.Biol.(USSR)25,508-514(1991)上所描迷的連接鉑化合物的方法。本發(fā)明中的抗體或其片段的同類物也包括其氨基酸序列與這里公開的全長(zhǎng)抗EGFR抗體的可變或超變區(qū)的氨基酸序列基本相同的多肽?；鞠嗤陌被嵝蛄羞@里被定義為至少70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選為90%的同源性，正如按照Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,2444-8)的方法通過(guò)FASTA搜尋確定的包括至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選為至少90%的相同的序列。這些抗體具有與本發(fā)明的含有SEQIDNO:8和SEQIDNO:16的抗體相同的或相似的結(jié)合、配體阻斷和受體中和活性，特別是其中具有保守氨基酸取代。保守氨基酸取代被定義為通過(guò)在肽、多肽或蛋白或其片段上改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸而引起的氨基酸組成的改變，取代物通常為具有相似特性(例如酸性、堿性、芳香族、大小、正電或負(fù)電、極性、非極性)的氨基酸以使取代不會(huì)在本質(zhì)上改變相關(guān)的肽、多肽或蛋白的特性(如電荷、等電點(diǎn)、親和力、親合力、構(gòu)型、溶解性)或活性。典型的保守取代物在同組氨基酸內(nèi)選擇，這些組包括但不限于(1)疏水氨基酸曱硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)(2)親水氨基酸胱氨酸(C)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)(3)酸性氨基酸天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)(4)堿性氨基酸組氨酸(H)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)(5)芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(6)影響鏈方向的殘基gly、pro。本發(fā)明的抗體進(jìn)一步包括那些通過(guò)直接突變、親和力成熟、噬菌體展示或鏈改組方法改進(jìn)了結(jié)合特性的抗體。通過(guò)CDRs突變和篩選具有期望特性的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以改變或改進(jìn)親和力和特異性(參見，例如，yang等，J.Mol.Biol.，254:392-403(1995)。許多方法可使CDRs突變，一個(gè)方法是隨機(jī)化單個(gè)殘基或殘基的組合，以使在一組其它都相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)上，所有20個(gè)氨基酸在特殊的位置出現(xiàn)?；蛘撸蛔兛梢酝ㄟ^(guò)易錯(cuò)PCR法導(dǎo)入各種CDR殘基(參見，例如，Hawkins等，J.Mol.Biol,226:889-896(1992))。例如，含有重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的噬菌體展示載體可以在大腸桿菌的突變抹中擴(kuò)增(參見，例如，Low等，J遍遍,250:359曙368(1992))。這些致突變方法是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多方法的說(shuō)明。本發(fā)明的抗體的各功能區(qū)可以是完整的免疫球蛋白功能區(qū)(例如，重鏈或輕鏈可變區(qū)或恒定區(qū))，或者是天然功能區(qū)的功能性等同物或突變體或衍生體，或者是，例如，用W093/11236(Griffiths等)中描述的技術(shù)在體外構(gòu)建合成的功能區(qū)。例如，將對(duì)應(yīng)于抗體可變區(qū)的、其中至少有一個(gè)氨基酸缺失的各功能區(qū)連接在一起是可能的?？贵w的特征性本質(zhì)是有抗原結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)可變重鏈和輕鏈片段不應(yīng)該被理解為不包括那些在特異性上沒有實(shí)際影響的變異體。本發(fā)明中的抗體或其片段為人抗體，有一、二、三、四、五和/或六個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，選自一組由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14組成的序列。優(yōu)選本發(fā)明的抗體(或其片段)的CDRs為SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6序列，可選但也優(yōu)選的，本抗體或其片段的CDRs為SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14序列。這些CDRs的M酸序列列在表1中。表l重鏈CDR1SGDYYWSSEQIDNO:2CDR2YIYYSGSTDYNPSLKSSEQIDNO:4CDR3YSIFGVGTFDYSEQIDNO:6輕鏈CDR1RASQSVSSYLASEQIDNO:10CDR2DASNRATSEQE)NO:12CDR3HQYGSTPLTSEQIDNO:14在一個(gè)實(shí)施方案中，本抗體或其片段可以具有SEQIDNO:8的重鏈可變區(qū)和/或SEQIDNO:16的輕鏈可變區(qū)。IMC-11F8是本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的抗體。該抗體具有人Vh和Vl的框架區(qū)和CDRs。IMC-11F8的Vh可交區(qū)(SEQIDNO:8)有3個(gè)CDRs(SEQIDNO:2、4、6)和4個(gè)框架區(qū)，其Vt可變區(qū)(SEQIDNO:16)有3個(gè)CDRs(SEQIDNO:IO、12、14)和4個(gè)框架區(qū)。優(yōu)選的，本發(fā)明中的抗體或其片段能中和EGFR。配體，如EGF或TGF-oc與EGFR的外段，即細(xì)胞外功能區(qū)結(jié)合，刺激受體二聚化，EGFR發(fā)生自主磷酸化，激活受體的內(nèi)段，即細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域，啟動(dòng)涉及到調(diào)節(jié)DNA合成(基因活化)和細(xì)胞周期進(jìn)展和分裂的多種信號(hào)傳導(dǎo)和處理通路。另外，優(yōu)選本發(fā)明中的抗EGFR抗體(或其片段)對(duì)EGFR細(xì)胞外功能區(qū)特異。進(jìn)而優(yōu)選本抗體或其片段阻止EGFR配體與其受體結(jié)合。在這個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中的抗體或其片段與EGFR的結(jié)合強(qiáng)度至少等于天然配體(EGF和TGF-oc)與EGFR的結(jié)合強(qiáng)度。中和EGFR包括抑制、減少、失活和/或石皮壞一個(gè)或多個(gè)正常情況下與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的這些活性。因此，中和EGFR具有多種效應(yīng)，包括抑制、減少、失活和/或破壞生長(zhǎng)(增殖和分化)、血管生成(血管募集、浸潤(rùn)和遷移)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移(細(xì)胞粘附和浸潤(rùn))。測(cè)定中和EGFR的一個(gè)方法是抑制受體的酪氨酸激酶活性，酪氨酸激酶抑制可以用已知的方法來(lái)確定，例如，通過(guò)測(cè)定重組激酶受體的自主磷酸化水平、和/或天然或合成的底物的磷酸化。因此，磷酸化測(cè)試在本發(fā)明的文中用于確定中和抗體。例如，用特異于石粦酸化酪氨酸激酶的抗體通過(guò)Elisa或Westernblot方法，可以檢測(cè)磷酸化。一些酪氨酸激酶的活性的測(cè)試方法Panek等在J.Pharmacol.Exp.Thera.283:1433-44上和Batley等在LifeSci.62:143-50(1998)上有描述。此外，檢測(cè)蛋白表達(dá)的方法也可用于確定EGFR中和作用，其中被檢測(cè)的蛋白或蛋白活性或活性狀態(tài)受EGFR酪氨酸激酶活性調(diào)節(jié)。這些方法包括免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)蛋白表達(dá)、熒光原位雜交檢測(cè)基因擴(kuò)增、放射性配體竟?fàn)幗Y(jié)合試驗(yàn)、固相印跡技術(shù)，如Northern和Southern印跡、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和ELISA。參見，如，Grandis等Cancer,78:1284-92(1996);Shimizu等，JapanJ.CancerRes"85:567-71(1994);Sauter等Am.J.Path"148:1047-53(1996);Collins,Glia,15:289-96(1995);Radinskyetal.,Clin.CancerRes"1:19-31(1995);Petrides等，CancerRes.,50:3934-39(1990);Hoffmann等，AnticancerRes"17:4419-26(1997);Wikstrand等，CancerRes.，55:3140-48(1995)。體內(nèi)試驗(yàn)也可用于確定EGFR中和作用。例如，受體酪氨酸激酶抑制可以通過(guò)在有或無(wú)抑制劑存在的條件下，用受體的配體刺激細(xì)胞系的促分裂試驗(yàn)來(lái)觀察。例如，用EGF刺激A431細(xì)胞(美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD)可以用于檢測(cè)EGFR抑制。另一個(gè)方法涉及到測(cè)試表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，例如，將腫瘤細(xì)胞注射入小鼠體內(nèi)。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)6365157(Rockwel1等)。本發(fā)明不受限于任何EGFR中和的特殊機(jī)制。本發(fā)明的抗EGFR抗體在外部與EGF的細(xì)胞表面受體結(jié)合，阻斷配體的結(jié)合(如EGF或TGF-oc)，繼之通過(guò)受體相關(guān)的酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，防止EGFR和信號(hào)傳導(dǎo)連鎖反應(yīng)的其他下游蛋白的磷酸化。受體-抗體復(fù)合物也可以被內(nèi)化和降解，引起細(xì)胞表面受體的下調(diào)。本發(fā)明中的抗體也可下調(diào)在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起作用的基質(zhì)金屬蛋白酶。此外，本發(fā)明中的抗體可能對(duì)生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生和血管生成有抑制作用。抗體片段可以通過(guò)切割完整抗體而得，也可以通過(guò)表達(dá)編碼片段的DNA而得。抗體片段可以通過(guò)Lamoyi等在J.Immunol.Methods，56:235-243(1983)和Parham,zJ.ImmunoU31:2895-2902(1983)上描述的方法制備。這些片段可以含有一個(gè)或兩個(gè)Fab片段或F(ab，)2片段。這些片段也可以含有單鏈可變區(qū)片段的抗體，如scFv,雙抗體或其他抗體片段。制備這些功能性等同體的方法在PCT申請(qǐng)?zhí)朩093/21319,歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P239400;PCT申請(qǐng)?zhí)朩O89/09622;歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P338745和歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?32424上有公開。優(yōu)選的用于轉(zhuǎn)化載體并表達(dá)本發(fā)明的受體拮抗劑的宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，COS-7細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和淋巴來(lái)源的細(xì)胞系，如淋巴瘤、骨髓瘤(如NSO)或雜交瘤細(xì)胞。其他真核宿主，如酵母，也可以選擇性使用。當(dāng)希望用酵母來(lái)表達(dá)基因構(gòu)建體時(shí)，合適的選擇性基因?yàn)閠rpl,存在于酵母質(zhì)粒載體Yrp7中。Stinchcomb等Nature,282:39(1997);Kingsman等，Gene，7:141(1997)。Trpl基因?yàn)椴荒茉谟猩彼釛l件下生長(zhǎng)的酵母突變林提供了一個(gè)選擇性標(biāo)記，例如，ATCC號(hào)44076或PEP隱4。Jones,Genetics,85:12(1977)。酵母宿主細(xì)胞染色體的trpl損傷的存在通過(guò)在無(wú)色氨酸的條件下生長(zhǎng)而提供了一個(gè)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似，Leu2缺陷酵母林(ATCC20,622或38,626)可以通過(guò)已知含有Leu2基因的質(zhì)粒來(lái)彌補(bǔ)。轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞用本領(lǐng)域所知的方法培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有可同化的碳源(碳水化合物，如葡萄糖或乳糖)、氮(氨基酸、肽、蛋白或它們的降解產(chǎn)物，如蛋白胨，銨鹽等)、無(wú)機(jī)鹽(硫酸鹽、磷酸鹽和/或碳酸鈉、鉀、鎂和鈣)。培養(yǎng)基進(jìn)一步含有，例如，促生長(zhǎng)物質(zhì)，如微量元素，如鐵、鋅、鎂等。正如以下實(shí)例中所描述，根據(jù)本發(fā)明，高親和力的抗EGFR抗體可以從一個(gè)通過(guò)人的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因構(gòu)建成的噬菌體展示文庫(kù)中分離得到。例如，本發(fā)明的可變區(qū)可以從含有重排后的可變區(qū)基因的外周血淋巴細(xì)胞中獲得。可選性地，可變區(qū)部分，如CDR和FW區(qū)可以從不同的人源序列獲得。超過(guò)90%的經(jīng)過(guò)三輪篩選后收獲的克隆是EGFR特異的。篩選得到的Fabs與EGFR結(jié)合的親和力在nM范圍，它們與通過(guò)雜交技術(shù)獲得的幾個(gè)二價(jià)的抗EGFR單克隆抗體的親和力一致。本發(fā)明的抗體和抗體片段可以獲取自，例如天然抗體，或Fab或scFv噬菌體展示文庫(kù)。大家都很清楚，為了從含有VH和Vl的抗體獲得單功能區(qū)抗體，某些CDRs外的氨基酸需要被取代，期待以此達(dá)到增強(qiáng)結(jié)合、表達(dá)或可溶性的目的，例如，希望對(duì)有可能埋藏于V『Vl界面的氨基酸殘基進(jìn)行修飾。此外，本發(fā)明的抗體和抗體片段可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(Harlow&lane,ed.,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,211-213(1998),其內(nèi)容通過(guò)引用整體結(jié)合于此)，用產(chǎn)生人免疫球蛋白y重鏈和k輕鏈的轉(zhuǎn)基因鼠(如來(lái)自MedarexSanJose，Calif的KM小鼠)獲得。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，人抗體產(chǎn)生基因組的主要部分被插入小鼠基因組中，使內(nèi)源性鼠抗體的產(chǎn)生發(fā)生缺陷，這些小鼠可用KDR(VEGFR-2)與完全福氏佐劑混合后皮下免疫。用于鑒定本發(fā)明的EGFR結(jié)合抗體的蛋白優(yōu)選EGFR,更優(yōu)選的是EGFR的細(xì)胞外功能區(qū)。EGFR細(xì)胞外功能區(qū)可以是游離的，也可以結(jié)合到另一個(gè)分子上。本發(fā)明還提供編碼前述抗體或其片段的分離的多核苦酸，本發(fā)明包括具有編碼一、二、三、四、五和/或六個(gè)CDRs的序列的核酸。核酸序列列于表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>編碼人抗體的DNA可以通過(guò)對(duì)基本或完全提取自相應(yīng)的人抗體區(qū)段的編碼人恒定區(qū)和可變區(qū)而不是CDRs的DNA與提取自人的編碼CDRs的DNA(SEQIDNO:1、3、5為重鏈可變區(qū)CDRs;SEQIDN0:9、11、13為輕鏈可變區(qū)CDRs)進(jìn)行重組來(lái)制備。編碼抗體片段的DNA的合適來(lái)源包括任何細(xì)胞，如表達(dá)全長(zhǎng)抗體的雜交瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞。如前所述這些片段自身可以用作抗體等同物，或可以被重組入等同物。本節(jié)所描述的DNA刪除和重組可以用已知的方法來(lái)進(jìn)行，如以上列出的那些關(guān)于抗體等同物的文獻(xiàn)所描述的方法和/或以下描述的那些標(biāo)準(zhǔn)DNA重組:技術(shù)。DNAs的另一個(gè)來(lái)源，正如本領(lǐng)域所知道的那樣，是從噬菌體展示文庫(kù)產(chǎn)生的單鏈抗體。此外，本發(fā)明提供含有操作性地連接到一個(gè)表達(dá)序列的前述多核苷酸序列，即啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的表達(dá)載體。各種各樣的在原核如細(xì)菌和包括但不限于酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的真核系統(tǒng)中高效合成抗體多肽的表達(dá)載體已經(jīng)被構(gòu)建出來(lái)。本發(fā)明中的載體可以含有染色體、非染色體片段和合成的DNA序列。任何合適的表達(dá)載體都能使用，例如，原核克隆載體包括大腸桿菌質(zhì)粒，如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核栽體還包括噬菌體DNA衍生物，如M13和其他絲狀單鏈DNA噬菌體。用于酵母的載體的一個(gè)例子為2p質(zhì)粒。在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的合適載體包括大家熟知的SV40衍生物、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源的DNA序列和來(lái)源于功能性哺乳動(dòng)物載體的組合的穿梭質(zhì)粒，正如以上所述的那些，以及功能性質(zhì)粒和p藍(lán)菌體DNA。其他真核表達(dá)載體為本領(lǐng)域所知(如，PJ.Southern和P.Berg,丄Mol.Appl.Genet.，13327-341(1982);Subramani等.，Mol.Cell.Biol.,1:854-864(1981);Kaufmann和Sha卬，"AmplificationAndExpressionofSequencesCotransfectedwithaModularDihydrofolateReductaseComplementaryDNAGene,"丄Mol.Biol.159,601-621(1982);Kaufinann和Sharp,Mol.Cell.Biol.159,601-664(1982);Scahill等，"ExpressionAndCharacterizationOfTheProductOfAHumanImmuneInterferonDNAGenehiChineseHamsterOvaryCells,"Proc.Nat'lAcad.Sci.USA80,4654-4659(1983);Urlaub和Chasin,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA77,4216-4220,(1980)。本發(fā)明中使用的表達(dá)載體含有至少一個(gè)操作性地連接到要表達(dá)的DNA序列或片段的表達(dá)控制序列，為了控制和調(diào)節(jié)被克隆的DNA序列的表達(dá)該控制序列被插入載體。所用表達(dá)控制序列的例子有l(wèi)ac系統(tǒng)、tip系統(tǒng)、tac系統(tǒng)、trc系統(tǒng)、噬菌體lambda的主要才喿縱子和啟動(dòng)子區(qū)、fdcoat蛋白的控制區(qū)、酵母糖酵解啟動(dòng)子，如3-磷酸甘油激酶啟動(dòng)子、酵母酸性磷酸酶啟動(dòng)子，如Pho5、酵母alpha-mating因子啟動(dòng)子和來(lái)源于多瘤病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和猴病毒，如SV40的早期和晚期啟動(dòng)子和其他已知在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞及其病毒或其聯(lián)合中控制基因表達(dá)的序列。本發(fā)明也提供含有前述表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明中的抗體可以在非雜交瘤的細(xì)胞系中表達(dá)。含有編碼對(duì)應(yīng)于本發(fā)明最適細(xì)胞系以高水平、持續(xù)表達(dá)目的基因，且伴有最小的宿主細(xì)胞蛋白的污染為基礎(chǔ)加以選擇?？捎玫挠糜诒磉_(dá)宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系為本領(lǐng)域所知，包括許多永生細(xì)胞系，正如但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)和許多其他細(xì)胞。合適的其他真核細(xì)胞包括酵母和其他真菌?？捎玫脑怂拗靼?，例如，E.coli,如E.coliSG-936、E.coliHB101、E.coliW3110、E.coliX1776、E.coliX2282、E.coliDHI和E.coliMRC1、假單胞菌、芽苞桿菌，如枯草桿菌和鏈霉菌。通過(guò)在允許表達(dá)抗體或其片段和從宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中純化抗體或其片段的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)抗體或其片段。為使重組宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)抗體或其片段能夠被分泌，可以在目的抗體編碼基因的5'端插入一個(gè)信號(hào)或分泌前導(dǎo)肽編碼序列(參見，Shokri等，ApplMicrobiolBiotechnol.60(6):654-64(2003),Nielsen等，Prot.Eng.10:1-6(1997)和vonHeinje等，Nucl.AcidsRes.14:4683-4690(1986))。這些分泌前導(dǎo)肽可以來(lái)自原核或真核細(xì)胞序列。因此，使用分泌前導(dǎo)肽，即連接到多肽的N末端的氨基酸序列，指導(dǎo)多肽從細(xì)胞胞質(zhì)移出并分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明中的抗體可以與另外的氨基酸殘基融合，這些氨基酸殘基可以是肽標(biāo)記物，用于幫助分離。其他用于幫助抗體到達(dá)特異性組織和器官的氨基酸殘基也可被考慮。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體通過(guò)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)編碼本抗體的核酸而制備，這樣，抗體可以表達(dá)并能夠被收獲。例如，抗體可以以組織特異性的方式表達(dá)，這樣可以方j(luò)更收獲和純化。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明中的抗體表達(dá)于乳腺中，在泌乳過(guò)程中分泌。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括但不限于鼠、羊和兔。通過(guò)給予哺乳動(dòng)物有效劑量的前述抗體以治療腫瘤生長(zhǎng)的方法在本發(fā)明中也有提供。適于根據(jù)本發(fā)明被治療的腫瘤以表達(dá)EGFR的腫瘤為優(yōu)選。在不意味著受限于任何特殊機(jī)理的情況下，能通過(guò)本方法治療的疾病和狀況包括，例如，那些腫瘤生長(zhǎng)或病理性血管生成是通過(guò)EGFR的旁分泌和/或自分泌環(huán)路刺激的疾病。也即是說(shuō)，EGFR表達(dá)腫瘤特征性地對(duì)存在于環(huán)境中的EGF敏感，能夠進(jìn)一步產(chǎn)生并被自分泌刺激環(huán)路中的EGF和TGF-oc刺激。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)這些腫瘤的治療包括部分或完全抑制腫瘤生長(zhǎng)，值得注意的是，在某些實(shí)施方案中，抑制進(jìn)一步包括腫瘤消退。在體外和體內(nèi)均觀察到多種腫瘤都有EGFR表達(dá)，'不同類型的肺瘤EGFR的表達(dá)水平相差很大。EGFR在很大比例的人腫瘤細(xì)胞表面都有不同程度的表達(dá)，結(jié)腸直腸癌、頭頸癌(鱗狀細(xì)胞)、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和腎細(xì)胞癌，還有膠母細(xì)胞瘤。在某些類腫瘤中，EGFR的表達(dá)很常見(如35%到70%的卵巢癌和接近25%到77%的結(jié)腸直腸癌)。EGFR的高水平表達(dá)可與受體配體的產(chǎn)生呈相關(guān)關(guān)系(如EGF、TGF-oc)。EGFR的表達(dá)還與對(duì)某些化療藥物和放射性治療的抗性提高相關(guān)。在某些類型的腫瘤中，EGFR的表達(dá)也可以用于判斷預(yù)后的預(yù)后因子，因?yàn)樗c存活降低、預(yù)后不良和/或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)聯(lián)。此外，在許多類型腫瘤中EGFR的表達(dá)升高。被治療的腫瘤包括原發(fā)性肺瘤和轉(zhuǎn)移瘤，也包括難治性腫瘤。難治性腫瘤包括那些對(duì)化療藥物治療、抗體治療、放射治療即它們的聯(lián)合治療無(wú)反應(yīng)或有抗性的肺瘤。難治性腫瘤還包括那些表面上被這些治療藥抑制，但停止治療5年后，有時(shí)10年或更長(zhǎng)時(shí)間后復(fù)發(fā)的腫瘤。能被本發(fā)明中的抗體治療的腫瘤包括那些未血管化、尚未實(shí)質(zhì)血管化的腫瘤和血管化的腫瘤。能被如此治療的實(shí)體瘤的例子包括乳腺癌、肺癌、直腸結(jié)腸癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤。這些腫瘤的例子包括表皮腫瘤、鱗癌，如頭頸部肺瘤、直腸結(jié)腸腫瘤、前列腺腫瘤、肺部胂瘤，包括小細(xì)胞和非小細(xì)胞腫瘤、胰腺腫瘤、胸^^胂瘤、卵巢腫瘤和肝腫瘤。其他例子包括Kaposi肉瘤、CNS瘤、毛細(xì)血管母細(xì)胞瘤、腦膜瘤、腦轉(zhuǎn)移癌、黑色素瘤、胃腸道和腎癌和肉瘤、橫紋肌肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，優(yōu)選多型性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、以及平滑肌肉瘤。本發(fā)明的另一個(gè)方面，抗EGFR抗體抑制肺瘤相關(guān)的血管生成。EGFR對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激關(guān)系到肺瘤的血管化。通常血,管內(nèi)皮被其他來(lái)源的(如，腫瘤細(xì)胞)EGF和/或TGF-a通過(guò)旁分泌的方式刺激。因此，人抗EGFR抗體對(duì)治療患有血管化胂瘤、腫瘤或血管發(fā)生性疾病的受試者有效。這些腫瘤或癌瘤包括，例如，惡性腫瘤和癌瘤，如母細(xì)胞瘤、癌和肉瘤，以及高度血管化的腫瘤和癌瘤。能夠用本發(fā)明的方法治療的癌包括，例如，腦癌、泌尿生殖道癌、淋巴系統(tǒng)癌、胃癌、腎癌、直腸癌、喉癌、肺癌和骨癌。非限制性的例子進(jìn)一步包括表皮腫瘤、鱗癌，如頭頸癌、直腸結(jié)腸腫瘤、前列腺肺瘤、乳腺胂瘤、肺腫瘤，包括肺腺癌、小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌、胰腺腫瘤、胸腺腫瘤、卵巢腫瘤和肝腫瘤。本方法也被用于治療血管化的皮膚癌，包括鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌和那些能通過(guò)抑制惡性角質(zhì)細(xì)胞，如人惡性角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)治療的皮膚癌。其他能被治療的癌包括Kaposi氏肉瘤、CNS腫瘤？(神經(jīng)母細(xì)胞瘤、毛細(xì)血管母細(xì)胞瘤、腦膜瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤)、黑色素瘤、胃腸道和腎癌和肉瘤、橫紋肌肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、優(yōu)選多型性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，包括多型性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、以及平滑肌肉瘤。本發(fā)明也提供給予哺乳動(dòng)物有效劑量的本發(fā)明中的抗體以治療非癌性過(guò)度增生性疾病的治療方法。正如這里所述，"過(guò)度增生性疾病"被定義為表達(dá)EGFR家族受體成員的非癌性細(xì)胞超量生長(zhǎng)的引起的情況。增生性疾病產(chǎn)生的過(guò)量細(xì)胞可以正常水平表達(dá)EGFR或過(guò)量表達(dá)EGFR。根據(jù)本發(fā)明能夠被治療的增生性疾病可以是任何被EGFR的配體或這些配體的突變體所刺激的增生性疾病。增生性疾病的例子包括銀屑病、光化性角化病、皮脂性角化病、疣、瘢痕疙瘩和濕滲。也包括病毒感染引起的過(guò)度增生性疾病，如乳頭狀瘤病毒感染。例如銀屑病有多種類型，嚴(yán)重程度也不相同。不同類型的銀屑病呈現(xiàn)膿樣水皰(膿庖性4艮屑病)、皮膚嚴(yán)重腐爛(紅皮性4艮屑病)、水滴樣點(diǎn)(滴狀銀屑病)和平滑炎性損傷(皮皺性銀屑病)的特征。各種類型的銀屑病(如尋常性銀屑病、膿庖樣銀屑病、紅皮性銀屑病、關(guān)節(jié)性銀屑病、副銀屑病和掌拓4艮屑病)的治療均在本發(fā)明的考慮之中。在本發(fā)明的方法中，治療有效劑量的本發(fā)明中的抗體被給藥予需要用藥的哺乳動(dòng)物。這里所用的給藥指通過(guò)任何可以達(dá)到應(yīng)有效果的方法將本發(fā)明中的抗體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)，例如，靜脈給藥或肌肉內(nèi)給藥。雖然本發(fā)明中的人抗體特別適用于人體，但也可用于其他哺乳動(dòng)物。這里所用的術(shù)語(yǔ)哺乳動(dòng)物包括，但不限于人、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、家養(yǎng)寵物和農(nóng)場(chǎng)牲畜。治療有效劑量指給藥給哺乳動(dòng)物時(shí)，能產(chǎn)生期望的治療效果，如抑制激酶活性或抑制腫瘤生長(zhǎng)的本發(fā)明中的抗體的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力和知識(shí)對(duì)這樣的疾病進(jìn)行鑒別，例如，哪些患有臨床顯著的腫瘤性或血管性疾病或有出現(xiàn)顯著臨床癥狀危險(xiǎn)的患者適宜用本發(fā)明中的EGFR抗體治療。如通過(guò)臨床檢測(cè)、體檢和詢問就診史/家族史，一個(gè)臨床工作者應(yīng)該能夠很快決定是否一個(gè)個(gè)體是該治療的候選者。本抗EGFR抗體以足以預(yù)防、抑制或降低腫瘤或病理狀況的進(jìn)展的量給藥，用于治療患有腫瘤或病理狀態(tài)相關(guān)的血管生成的病人。進(jìn)展包括，如，胂瘤或病理狀況的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā)。能夠達(dá)到這些目的的合適劑量被定義為治療有效劑量。使用的有效劑量取決于疾病的嚴(yán)重程度和病人免疫系統(tǒng)的一般狀況。用藥計(jì)劃也將隨疾病程度和病人的狀況而變化，通?？梢栽诿刻靻我粍┝坑盟幓虺掷m(xù)滴注到多次給藥(如每4到6小時(shí))的范圍內(nèi)變化，或者根據(jù)醫(yī)生和病人的情況而定。應(yīng)該注意的是，本發(fā)明不限于任何特殊劑量。EGFR拮抗劑的雞尾酒療法，如，單克隆抗體，提供了抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特別有效的治療。雞尾酒療法可以包括非抗體類EGFR拮抗劑，并且可以含有少至1、3、4個(gè)和多至6、8、10的受體拮抗劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體可以與一種或多種抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥。聯(lián)合用藥的例子參見美國(guó)專利號(hào)6,217,866(Schlessinger等)(Anti-EGFRantibodiesincombinationwithanti-neoplasticagents);WO99/60023(Waksal等)(Anti-EGFRantibodiesincombinationwithradiation)。任4可合適的抗月中瘤藥物都肯g使用，如化療藥物、放射療法或其聯(lián)合。抗腫瘤藥物可以是烷基化類藥物或抗代謝藥物。烷基化類藥物的例子包括但不限于順鉬、環(huán)磷酰胺、美法侖和達(dá)卡巴嗪?？勾x類藥物包括但不限于阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、依立替康(CPT-11)和托泊替康。當(dāng)抗腫瘤劑為放射療法時(shí)，放射源可以在被治療的病人的外部(外部照射放射治療-EBRT)或內(nèi)部(近程治療-BT)?？鼓[瘤藥物的給藥劑量取決與許多因素，包括，例如藥物的類型、被治療的腫瘤的類型、嚴(yán)重程度和給藥途徑。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是本發(fā)明不限于任何具體劑量。對(duì)于過(guò)度增生性疾病的治療，以上描述的本發(fā)明的抗體可以與任何常規(guī)治療藥物聯(lián)合應(yīng)用。例如，增生性疾病為銀屑病時(shí)，各種系統(tǒng)的和局部的常規(guī)治療藥物可被使用。銀屑病的系統(tǒng)治療藥物包括甲氨蝶呤和口服類視色素，如阿維A、阿維A酯和異類—見色素。銀屑病的其他系統(tǒng)治療藥物包括羥基脲、NSAJDS、柳氮磺吡啶和6-巰基鳥噪呤?？股睾涂购生物藥物可以用于治療和預(yù)防導(dǎo)致銀屑病加重和惡化的感染。銀屑病的局部用藥包括蒽三酚、卡泊三烯、煤焦油、類固醇、類碎見色素、軟曱液(keretolytics)和他扎羅汀。輕度和中度銀屑病最常用的處方是局部使用類固醇，局部類固醇可涂于皮膚表面，但有些也注射入銀屑病損傷處。增生性疾病的治療進(jìn)一步包括抗EGFR抗體與光學(xué)療法的聯(lián)合。光學(xué)療法包括給予可減輕增生性疾病癥狀的任何波長(zhǎng)光線和化療藥物的光作用(光化學(xué)療法)。其他有關(guān)增生性疾病的治療，參見WO02/11677(Teufel等(Treatmentofhyperproliferativediseaseswithepidermalgrowthfactorreceptorantagonists)。本發(fā)明中的抗EGFR抗體可以與EGFR拮抗劑和/或其他PTKs的拮抗劑，如阻斷PTK配體的抗體或中和PTK的抗體一同給藥。EGFR配體包括EGF、TGF-a、人雙調(diào)蛋白、肝素結(jié)合EGF(HB-EGF)和P細(xì)胞素。EGF和TGF-oc被認(rèn)為是主要的引起EGFR介導(dǎo)的刺激的內(nèi)源性配體，盡管TGF-a顯示出更強(qiáng)的促血管生成活性。因此，EGFR拮抗劑包括與這些配體結(jié)合從而阻斷它們結(jié)合并激活EGFR的抗體。另一個(gè)PTK的例子是VEGFR。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體與VEGFR拮抗劑聯(lián)合使用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體與特異性結(jié)合VEGFR-2/KDR受體的受體拮抗劑聯(lián)合使用(PCT/US92/01300,filedFeb.20,1992;Terman等，Oncogene6:1677-1683(1991))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體與特異性結(jié)合VEGFR-1/Flt受體的受體拮抗劑聯(lián)合使用(Shibuya等.，Oncogene5，519-524(1990》。特別優(yōu)選的是與VEGFR-1或VEGFR-2的細(xì)胞外區(qū)結(jié)合從而阻斷配體(VEGF或P1GF)與其結(jié)合，和/或中和VEGF或PIGF誘導(dǎo)的活化的抗原結(jié)合蛋白。例如，MabIMC-1121與可溶性的及細(xì)胞表面表達(dá)的KDR結(jié)合，IMC-1121含有來(lái)自人Fab嗟菌體展示文庫(kù)的Vh和Vt功能區(qū)(參見WO03/075840)。另一個(gè)例子ScFv6.12與可溶性的和細(xì)胞表面表達(dá)的Fit結(jié)合。ScFv6.12含有鼠單克隆抗體Mab6.12的Vh和V^功能區(qū)。一個(gè)產(chǎn)生Mab6.12的雜交瘤細(xì)胞系已經(jīng)被ATCC保藏，保藏號(hào)為PTA-3344。另一個(gè)這樣的PTK例子為胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)。在某些胂瘤細(xì)胞中，EGFR功能的抑制可以通過(guò)上調(diào)信號(hào)通路上的其他生長(zhǎng)因子受體而得到補(bǔ)償，特別是通過(guò)IGFR刺激。此外，抑制IGFR信號(hào)使肺瘤細(xì)胞對(duì)某些化療藥物的敏感性升高。EGFR或IGFR的刺激均引起共同的下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的磷酸化，包括Akt和P44/42,盡管程度有所不同。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，IGFR拮抗劑(如結(jié)合IGF或IGFR和中和受體的抗體)與本發(fā)明中的抗體共同給藥，從而阻斷進(jìn)入共同下游信號(hào)通路的笫二個(gè)信號(hào)(如抑制Akt和P44/42的激活)。特異于IGFR的人抗體的例子是IMC-A12(參見WO2005/016970)。其他涉及的肺瘤生成的生長(zhǎng)因子受體的例子有血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。[Q094]抗EGFR抗體也可以與抑制涉及到腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤相關(guān)的血管生成的RTKs或它們相關(guān)的下游信號(hào)元件的細(xì)胞內(nèi)RTK拮抗劑共同給藥。細(xì)胞內(nèi)RTK拮抗劑優(yōu)選小分子。這些小分子的例子包括有機(jī)化合物、有機(jī)金屬化合物、有機(jī)和有機(jī)金屬化合物的鹽類和無(wú)機(jī)化合物。小分子內(nèi)的原子通過(guò)共價(jià)鍵和離子鍵結(jié)合在一起；前者通常存在于如小分子酪氨酸激酶抑制劑這樣的小有機(jī)化合物，后者通常存在于小無(wú)機(jī)化合物。原子在小有機(jī)分子中的排列可以呈鏈狀，如碳-碳鏈、或碳-雜原子鏈或可以呈含碳原子的環(huán)狀，如苯環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)，或碳和雜原子的聯(lián)合，即雜環(huán)，如嘧啶或會(huì)唑啉。盡管小分子可以是任何分子量，但它們通常包括那些分子量不超過(guò)650D,因而不被稱為生物分子的分子。小分子包括天然的化合物，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、核苷酸、氨基酸、糖、脂和它們的衍生物，也包括通過(guò)傳統(tǒng)的有機(jī)合成、生物介導(dǎo)的合成，或它們的聯(lián)合而合成的化合物。參見，如Ganesan,DrugDoscov.Today7(1):47-55(Jan.2002);Lou,DrugDiscov.Today,6(24):1288-1294(Dec.2001)。根據(jù)本發(fā)明，更優(yōu)選的被用作細(xì)胞內(nèi)RTK拮抗劑的小分子為與ATP竟?fàn)幗Y(jié)合到具有激酶功能域的EGFR的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合區(qū)或結(jié)合到涉及到EGFR的激活的信號(hào)傳導(dǎo)通路的蛋白的細(xì)胞內(nèi)EGFR拮抗劑。這樣的信號(hào)傳導(dǎo)通路的例子包括ms-有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路、磷酸肌醇-3激酶(P13K)-Akt通路、應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)通路和轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子(STAT)通路。涉及到這些通路的蛋白非限制性例子(根據(jù)本發(fā)明小分子EGFR拮抗劑能夠結(jié)合到其上的)包括GRB-2，SOS,Ras,Raf,MEK,MAPK和基質(zhì)金屬蛋白酶?！獋€(gè)小分子EGFR拮抗劑的例子是IRESSA(ZD1939),它是一個(gè)具有ATP-模仿功能的抑制EGFR的p奎啉唑衍生物。參見美國(guó)專利號(hào)5,616,582(ZenecaLimited);WO96/33980(ZenecaLimited)笫4頁(yè)；也見Rowinsky等，摘要5提供在2001年5月12-15曰的ASCO笫37屆年會(huì)上，SanFrancisco,CA,;Anido等摘要1712提供在2001年5月12-15日的ASCO第37屆年會(huì)，SanFrancisco,CA。另一個(gè)小分子EGFR拮抗劑的例子是TARCEVATM(OSI-774),為4-(取代苯基氨基)喹啉唑衍生物[6,7-雙(2-曱氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基〗-(3-乙炔基-苯基)胺鹽酸鹽]EGFR抑制劑。見WO96/30347(PfizerInc.)例如第2頁(yè)，12行到第4頁(yè)，第34行和第19頁(yè)，笫14-17行。也見Moyer等，CancerRes,，57:4838-48(1997);Pollack等，丄Pharmacol,291:739-48(1999)。TARCEVAtm可能在抑制EGFR和它的下游PI3/Akt和MAP(有絲分裂原激活蛋白)激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路的磷酸化方面發(fā)揮作用，引起P27介導(dǎo)的細(xì)胞周期停頓。見Hidalgoetah,摘要281提供在2001年5月12-15日的ASCO第37屆年會(huì)，SanFmncisco，CA。其他小分子也據(jù)報(bào)道有抑制EGFR作用，它們中的許多被認(rèn)為是結(jié)合到EGFR的酪氨酸激酶功能區(qū)。這些小分子EGFR拮抗劑的一些例子在WO91/116051,WO96/30347,WO96/33980，WO97/27199(ZenecaLimited),WO97/30034(ZenecaLimited),WO97/42187(ZenecaLimited),WO97/49688(PfizerInc.)，WO98/33798(WarnerLambertCompany),WO00/18761(AmericanCyanamidCompany)和WO00/31048(WarnerLambertCompany)上有描述。特殊的小分子EGFR拮抗劑的例子包括C1-1033(Pfizer),為喹唑啉(N-[4-(3-氯_4_氟-苯基氨基)-7-(3-嗎啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺)酪氨酸激酶、特別是EGFR的抑制劑，在WO00/31048笫8頁(yè)，22-6行上有描述。PKI166(Novartis)，為吡咯并嘧啶EGFR抑制劑，在WO97/27199第10-12頁(yè)上有描述。GW2016(GlaxoSm池Kline)為EGFR和HER2抑制劑；EKB569(Wyeth)，據(jù)報(bào)道在體外和體內(nèi)抑制表達(dá)EGFR或HER2的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；AG-1478(Tryphostin),為抑制來(lái)自EGFR和erbB-2信號(hào)的會(huì)唑啉小分子；AG-1478(Sugen)也為抑制蛋白激酶CK2的雙底物抑制劑；PD153035(Parke-Davis)據(jù)報(bào)道抑制EGFR激酶活性和腫瘤生長(zhǎng)，在培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和加強(qiáng)細(xì)胞毒性藥物的細(xì)胞毒性作用；SPM-924(SchwarzPharma),為用于前列腺癌治療的酪氨酸激酶抑制劑；CP-546,989(OSIPharmaceuticals),據(jù)寺艮道為治療實(shí)體瘤的血管生成的抑制劑；ADL-681，為用于癌癥治療的EGFR激酶抑制劑；PD158780,為吡咬并嘧啶，據(jù)報(bào)道可抑制A4431在鼠體異種移植的腫瘤生長(zhǎng)率；CP-358,774,為喹唑啉，據(jù)報(bào)道可抑制HN5在鼠體內(nèi)異種移植的自主磷酸化；ZD1839,為喹唑啉，據(jù)報(bào)道在異種移植模型，包括外陰癌、NSCLC、前列腺癌、卵巢癌和直腸結(jié)腸癌的小鼠模型上有抗癌活性；CGP59326A,為吡咯并嘧啶，據(jù)報(bào)道可以抑制鼠體內(nèi)EGFR陽(yáng)性的異種移植的生長(zhǎng)；PD165557(Pfizer);CGP54211和CGP53353(Novartis),為二苯胺基鄰苯二曱酰亞胺。自然來(lái)源的EGFR酪氨酸激酶抑制劑包括金雀異黃素、除莠霉素A、槲皮苷和erbstatin。其他據(jù)報(bào)道有抑制EGFR作用、因而在本發(fā)明的范圍內(nèi)的小分子為正如在美國(guó)專利號(hào)5,679,683中描述的化合物那樣的三環(huán)化合物；在美國(guó)專利號(hào)5,616,582中描述的唾唑啉衍生物；在美國(guó)專利號(hào)5,196,446中描述的p引咮化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR拮抗劑可以與一種或多種合適的佐劑聯(lián)合給藥，如，例如細(xì)胞因子IL-10和IL-13或其他免疫刺激劑，正如，但不限于趨化因子、腫瘤相關(guān)抗原和肽，見，如Larrivee等，supra。然而應(yīng)該看到，以有效治療的方式單獨(dú)使用抗-EGFR抗體足以預(yù)防、抑制或減緩腫瘤的進(jìn)展。在一個(gè)聯(lián)合療法中，抗-EGFR抗體可以在給予其他治療藥物的之前、之中或之后給藥，也可以是它們的聯(lián)合，即在開始抗腫瘤藥物治療的之前和之中，之前和之后，之中和之后，或之前、之中和之后。例如抗-EGFR抗體可以在開始放射治療的1到30天之間，優(yōu)選3到20天，更優(yōu)選5到12天給藥。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，同時(shí)給予化療藥物或更優(yōu)選地，在抗體治療以后給予。在本發(fā)明中，任何合適的方法和途徑均可用于本發(fā)明中的抗-EGFR抗體的給藥和可選性地，用于與抗腫瘤藥物和/或其他受體拮抗劑的共同給藥。本發(fā)明所用的抗胂瘤藥物治療方案，包括任何被認(rèn)為是治療病人肺瘤狀況的最佳治療方案。不同的腫瘤要求使用特殊的抗腫瘤抗體和特殊的抗腫瘤藥物，這將根據(jù)一個(gè)個(gè)病人來(lái)決定。給藥途徑包括，例如，口服、靜脈、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)給藥。拮抗劑的給藥劑量取決于許多因素，包括，例如拮抗劑的類型、被治療的腫瘤的類型和嚴(yán)重程度和拮抗劑給藥的途徑。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明不限于任何具體的給藥方法和途徑。值得注意的是，本發(fā)明中的抗-EGFR抗體能用作綴合物給藥，其特異性結(jié)合到受體上，通過(guò)配體-毒素內(nèi)化將致死量毒素導(dǎo)入細(xì)胞，抗體-藥物/小分子綴合物可以相互間直接相連或通過(guò)肽或非肽接頭相連。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗-EGFR抗體可以以化學(xué)或生物合成的方法連接到一個(gè)或多個(gè)抗腫瘤或抗血管生長(zhǎng)藥物上。本發(fā)明進(jìn)一步精心設(shè)計(jì)將靶或報(bào)告組成成分與抗-EGFR抗體相連。靶組成成分為結(jié)合對(duì)子的第一個(gè)成員。抗腫瘤藥物，例如被連接到這種結(jié)合對(duì)子的笫二個(gè)成員上，這樣藥物就可以被帶到抗-EGFR抗體要到達(dá)的地方。這種結(jié)合對(duì)常見的例子為親和素和生物素，在一個(gè)實(shí)施方案中，生物素被結(jié)合到抗-EGFR抗體上，因此，為結(jié)合到親和素或鏈霉親和素的抗腫瘤藥物和其他組成成分提供了一個(gè)把目標(biāo)?；蛘?，生物素或其他這樣的組成成分可被連接到本發(fā)明的抗-EGFR抗體上，用作報(bào)告分子，例如，在一個(gè)診斷系統(tǒng)中，可檢測(cè)的信號(hào)產(chǎn)生藥物被綴合到了親和素或鏈霉親和素上。應(yīng)該清楚，本發(fā)明中的抗-EGFR抗體，當(dāng)用于對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行預(yù)防和治療的目的時(shí)，將會(huì)以還含有藥學(xué)上可接受的載體的組合物形式給藥。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括，例如，一種或多種水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、甘油、酒精等，以及它們的聯(lián)合。藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)一步含有少量輔助物質(zhì)，如用于增強(qiáng)結(jié)合蛋白的保存期和有效性的增濕劑或乳化劑、保存劑或緩沖劑。注射組合物，正如本領(lǐng)域所熟知，可以被制成在給藥予哺乳動(dòng)物后提供快速、持久或緩慢釋放活性成分的制劑。本發(fā)明還包括含有治療有效劑量的人抗EGFR抗體的抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或肺瘤相關(guān)血管生成的試劑盒，該試劑盒可含有任何合適的，例如，其他涉及到胂瘤生成或血管生成的生長(zhǎng)因子受體(如以上描述的VEGFR國(guó)l/Flt-l,VEGFR畫2，PDGFR,IGFR,NGFR,FGFR)的拮抗劑。任選性的或附加的，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步含有抗肺瘤藥物，本發(fā)明背景下合適的抗腫瘤藥物的例子已經(jīng)被描述。本發(fā)明的試劑盒還可進(jìn)一步含有佐劑，其例子也已經(jīng)被描述。此外，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有本領(lǐng)域所熟知的本抗體用于體內(nèi)和體外研究和診斷的方法，該診斷方法包括含有本發(fā)明抗體的試劑盒。因此，本受體拮抗劑可以用于本領(lǐng)域所熟知的體內(nèi)和體外研究、診斷、預(yù)防和治療的方法。當(dāng)然，應(yīng)該明白和預(yù)料到這里所公開的發(fā)明原則可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員改變，這里有意將這些改變包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。EGFR活性增強(qiáng)有時(shí)關(guān)系到與本發(fā)明要治療的情況。較高水平的配體、EGFR基因擴(kuò)增、受體的轉(zhuǎn)錄增高或引起非調(diào)節(jié)性受體信號(hào)的突變均導(dǎo)致EGFR活性增強(qiáng)。編碼EGFR的基因擴(kuò)增也引起與EGFR結(jié)合的配體數(shù)目增力。，這樣可以進(jìn)一步刺激細(xì)胞增生。EGFR可在無(wú)基因擴(kuò)增的情況下過(guò)度表達(dá)，推測(cè)是通過(guò)突變?cè)鰪?qiáng)了EGFR的轉(zhuǎn)錄、mRNA的翻譯或蛋白的穩(wěn)定性。EGFR突變體已在含有組成型活化酪氨酸激酶的的神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，提示高水平EGFR活性在這些腫瘤中發(fā)揮了作用而不是EGFR的過(guò)度表達(dá)。參見，如Pedersen等，Ann.Oncol.，12(6):745-60(2001).(TypeIIIEGFRmutation-variouslynamedEGFRvIII,de2-7EGFRorAEGFR-lacksaportionoftheextracellularligandbindingdomainencodedbyexons2-7.);也見Wikstrand等，CancerRes.,55:3140-3148(1995)。實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明了本發(fā)明，但不應(yīng)該被視為對(duì)本發(fā)明的范圍在任何方面的限制。那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)粒、將編碼多肽的基因插入這樣的載體和質(zhì)粒、將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞和基因和基因產(chǎn)物的表達(dá)和鑒定的常規(guī)方法的詳細(xì)描述可以從各種出版物上獲4尋,'包4舌Sambrook,J.等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989).所有這里提到的參考資料被整體結(jié)合于此。實(shí)施例l-抗-EGFR抗體的分離簡(jiǎn)單地講，該人抗體從人幼稚(naive)Fab噬菌體文庫(kù)，通過(guò)與從EGFR陽(yáng)性胂瘤中分離到的可溶性人EGFR的生物淘選得到，文庫(kù)從Dyax,Cambridge,MA獲得。該含有人細(xì)胞(夕卜周B淋巴細(xì)胞)產(chǎn)生的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的幼稚Fab噬菌體文庫(kù)構(gòu)建自幼稚型未免疫的人的、無(wú)腫瘤的脾細(xì)胞，細(xì)胞取自一個(gè)胃癌病人。通過(guò)使用V基因特異的順行和逆行引物進(jìn)行首輪擴(kuò)增，并將這些VH和VL基因克隆入不同的載體中(WO00/70023)。將該Fab文庫(kù)原種培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，用M13K07輔助噬菌體挽救，在2YTAK培養(yǎng)基(2YT含100貼/ml氨千青霉素和50昭/ml卡拉霉素)中，30。C溫度下，擴(kuò)增過(guò)夜。噬菌體制備物用4%PEG/0.5MNaCl沉淀，并重懸于3。/。脫脂奶/PBS中以封閉非特異性結(jié)合。接近11012pfo預(yù)封閉的噬菌體與1(^EGFR過(guò)度表達(dá)的A431細(xì)胞在lml平面DMEM培養(yǎng)基中4。C孵育1小時(shí)。繼后，細(xì)胞用PBS洗5遍，結(jié)合的噬菌體通過(guò)在含有0.5mg/ml的IMC-C225的PBS中室溫孵育30分鐘以洗脫。洗脫的噬菌體與10ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的TG1細(xì)胞37。C靜止孵育30分鐘再搖動(dòng)孵育30分鐘。感染后的TGI細(xì)胞沉淀后，再涂布到幾個(gè)大2YTAG培養(yǎng)皿上，30°C過(guò)夜培養(yǎng)。將所有的克隆刮下，置于3-5ml混合有甘油(甘油的終濃度為10%)的2YTA培養(yǎng)基中，分裝并保存于-7(TC。對(duì)下一輪篩選，100pl噬菌體原種加入25ml的2YTAG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。培養(yǎng)物用M13K07輔助噬菌體挽救、擴(kuò)增、沉淀并用于以上描述的過(guò)程后的篩選。隨機(jī)挑選各輪篩選后收獲的單個(gè)TG1克隆，在96孔板中37°C溫度下培養(yǎng)，如以上描述的那樣用M13K07輔助噬菌體挽救。該噬菌體制備物用1/6體積的18%奶/PBS室溫封閉1小時(shí)，再加到包被有重組EGFR(lpg/mlx100m!)的Maxi-sorp96孔微量滴定板(Nunc)中。室溫孵育1小時(shí)后，用PBST洗板3次，再與鼠抗M13噬菌體-HRP綴合物(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)粹育。洗板5次，加入TMB過(guò)氧化物酶底物(KPL,Gaithersburg,MD)，用孩i:孔板讀數(shù)4義(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)在450nm吸收波長(zhǎng)下讀板。確認(rèn)的克隆進(jìn)一步進(jìn)行阻斷EGF結(jié)合的測(cè)試，各克隆的DNA指紋用于區(qū)別不同克隆，各酶切圖譜的代表性克隆被選出用于DNA序列測(cè)定。實(shí)施例2-可溶性Fab片段的表達(dá)和純化含有編碼11F8Fab的基因的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化非抑制子E.coli宿主HB2151，F(xiàn)ab片段在HB2151中的表達(dá)通過(guò)在含有l(wèi)mM異丙基-l-硫代-P-D-吡喃半乳糖苷(IPTG,Sigma)的2YTA培養(yǎng)基中，30°C溫度條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過(guò)將細(xì)胞沉淀物重懸于含有20。/。(w/v)蔗糖、200mMNaCl、ImMEDTA和1mMPMSF的25mMTris(pH7.5)中，繼而4°C輕搖培養(yǎng)1小時(shí)，制備出細(xì)胞周質(zhì)提取物。經(jīng)離心，根據(jù)廠家(AmershamPharmaciaBiotech)的方法，通過(guò)用蛋白G柱親和層析將可溶性Fab蛋白純化出來(lái)。實(shí)施例3-人抗EGFRIgGl抗體的構(gòu)建人抗-EGFRFab被構(gòu)建入一個(gè)完整的IgGl中。從人幼稚噬菌體展示文庫(kù)中確認(rèn)選出的Fab候選者，C11F8,對(duì)人EGFR(ErbB)有高親和力結(jié)合和配體阻斷活性。編碼11F8Fab輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:lS)和重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:"的基因通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，并被克隆進(jìn)用谷氨酰胺酶表達(dá)系統(tǒng)的含有人IgGl恒定區(qū)的表達(dá)載體中，該系統(tǒng)乂人LonzaBiologies,Inc獲得。根據(jù)廠家的說(shuō)明，通過(guò)列于表3中的引物，用ExpandPCR試劑盒(BoehringerMannheim,Inc.)進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增。表3.PCR擴(kuò)增引物引物_核苷酸序列_SBQ歸O:C11F8HF5'TCCTrnTCTAOTAGCAACTGCAACTGGACTACATTC人CAGGTOCAGCTGCAOAA-3'20C11F8HR5'-CGAGCTAGC<3CTrOAOACaGTGACCAG<30TO-3,21C11F8LF5'-TCCnTrTCTAOTAOCAACTOCAACTGGAGTACATTCAGAAATT。TGATOACACA-3'22C11F8LRy-COATCTAOAACTCACOTrTQATCTCCGCCTroOTC-3,■23■OSIF5'"GAGAAGCTroCCGCCACCATOGGATOGTCATOTATCATCCTnTTCTAOTAGC-3'24簡(jiǎn)而言之，重鏈和輕鏈的PCR產(chǎn)物以C11F8Fab質(zhì)粒為模板，用重鏈順行和逆行引物(C11F8HF和C11F8HR)和輕鏈的順行反應(yīng)物中，按表4中列出的循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>得到的PCR產(chǎn)物在免疫球蛋白基因的5'端加入了一個(gè)57bp的編碼19個(gè)氨基酸的鼠重鏈基因信號(hào)序列((MGWSCHLFLVATATGVHS,SBQIDNO:25),)，該序列使免疫球蛋白能夠有效地加工和分泌。為有效啟動(dòng)基因在哺乳動(dòng)物內(nèi)的翻"^f,通過(guò)在笫二增將共有序列"Kozak"(J.Mol.Biol.196:947)加入。該P(yáng)CR產(chǎn)物還含有方便將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)合適表達(dá)載體的5'HindIII的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。瓊脂糖膠純化的HindIII-NheI重鏈片段被克隆進(jìn)CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的載體pDFc(圖IA)以產(chǎn)生連貫的編碼可變區(qū)和恒定區(qū)DNA序列的cDNA。HindIII-XbaI輕鏈片段被克隆進(jìn)第二個(gè)CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的載體p12.IL(圖IB),得到的構(gòu)建體含有一個(gè)可從新生RNA轉(zhuǎn)錄物上被有效剪切的分隔可變區(qū)和kappa恒定區(qū)的單一內(nèi)含子。該重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli，選擇到的質(zhì)粒分離體在COS細(xì)胞中進(jìn)行暫時(shí)性共表達(dá)重鏈和輕鏈篩選。實(shí)施例4-人抗EGFR抗體的表達(dá)為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，將含有CMV啟動(dòng)子的重鏈表達(dá)盒的NotI-SalI片段克隆進(jìn)含輕鏈的p12.IL載體，得到的質(zhì)粒載體pGS-11F8進(jìn)行了限制性酶切位點(diǎn)定位分析(見圖1C)。其酶切分析結(jié)果在圖2顯示。用于產(chǎn)生11F8單克隆抗體的重組細(xì)胞系來(lái)源于非分泌的鼠骨髓瘤細(xì)胞系NSO(參見Barnes等，Cytotechnology32:109(2000》。NSO細(xì)胞系從LonzaBiologies,Inc.(Slough,Berkshire,UK)獲得。通過(guò)電穿孔的方法將pGS-llF8轉(zhuǎn)化進(jìn)入骨髓瘤細(xì)胞系NSO,用BioRadGenePulserII,在250V電壓、400iuFd電容和9.0msec的觀察時(shí)間常數(shù)條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將經(jīng)過(guò)電穿孔后的細(xì)胞重懸于含10%的透析過(guò)的胎牛血清dFCS(HyClone,Logan,UT)和2mM谷氨酰胺(InVitrogen/LifeTechnologies,Paisley,PA)的DMEM中。50jxl重懸的細(xì)胞以5,000-10,000細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，谷氨酰胺合成酶(GS)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)染子通過(guò)加入含10%dFCS無(wú)谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)補(bǔ)充1xGS(JRHBiosciences,Inc.)進(jìn)行篩選。在37°C,5%C02條件下培養(yǎng)細(xì)胞2到4周，以使細(xì)胞在篩選抗體表達(dá)克隆前得到生長(zhǎng)和擴(kuò)增。表達(dá)抗EGFR抗體的克隆用基于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人Fc(gamma)抗體的ELISA方法進(jìn)行篩選，在A45Qnm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)3到5天培養(yǎng)后進(jìn)行再檢測(cè)。強(qiáng)陽(yáng)性克隆(抗體產(chǎn)生為25pL/mg或更多)經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行進(jìn)一步分析?；诳贵w249路/mL的批產(chǎn)量，克隆#34被挑選出進(jìn)行有限稀釋法亞克隆和再測(cè)試。克隆34-5基于恒定的和與父輩細(xì)胞(批產(chǎn)量-310pg/mL,補(bǔ)料分批產(chǎn)量=0.75-0.8g/L)相同或更高的產(chǎn)出水平被挑選出?？寺?34-5-3在經(jīng)過(guò)第二輪亞克隆后被分離出，分析結(jié)果顯示克隆#34_5_3產(chǎn)生高水平的抗體(批產(chǎn)量=324pg/mL，補(bǔ)料分批產(chǎn)量=1.0-1.2g/L),對(duì)這一克隆的進(jìn)一步鑒定在以下實(shí)施例中進(jìn)行。0130]實(shí)施例5-抗體與EGFR的體外結(jié)合通過(guò)固相ELISA法對(duì)比IMC-11F8和IMC-C225的結(jié)合特征進(jìn)行抗體篩選。96孔;(^孔板用1昭/mL碳酸鹽緩沖液4。C包被過(guò)夜。孩￡孔板用含10。/。新生牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)37。C封閉1小時(shí)。各種不同量的IMC-11F8或MC-C225被加入板中，再室溫孵育60分鐘，繼之用PBS洗板。加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合標(biāo)記的鼠抗人Fc抗體，室溫孵育60分鐘，繼之用大量PBS洗板。然后，加入HRP底物孵育30秒到2分鐘，用0.1MH2S04終止反應(yīng)。用ELISA讀板儀在OD450nm下讀板。圖3顯示IMC-11F8和IMC-C225抗體與EGFR結(jié)合。IMC-11j"8和MC-C225二者對(duì)EGFR的結(jié)合相當(dāng)。實(shí)施例6-抗EGFR抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)IMC-11F8和MC-C225IgG抗體和它們各自的Fab片段的結(jié)合動(dòng)力學(xué)用BIAcore傳感器(PharmaciaBiosensor,)測(cè)定。EGFR-AP融合蛋白被固化到傳感器芯片上，可溶性IMC-11F8和IMC-C225抗體以1.5nM-100nM的濃度注入。各濃度條件下所得到的傳感圖用BIAEvaluation2.0,—種確定率常數(shù)k加和k。ff的程序進(jìn)行分析，親和常數(shù)Kd根據(jù)率常數(shù)k。n和k必進(jìn)行計(jì)算。本抗EGFR抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)在表5中顯示，結(jié)果表明兩個(gè)IgG抗體有著相當(dāng)?shù)膶?duì)EGFR的結(jié)合動(dòng)力。表5抗體形式ko"103MV)IMC-11F8Fab22.9±9.936.7±8.51.78±0.5MC-11F8IgG18.6±7.75,8土2.20,32土0.06IMC-C225Fab23.1±4.811.7±3.40.53±0.17IMC-C225IgG21.3±7.35.4±1.00.3±0.2實(shí)施例7-抗EGFR的特異性抗體與EGFR的結(jié)合用125I-EGF竟?fàn)幵囼?yàn)來(lái)評(píng)估。HT29細(xì)胞在含1.5mML-谷氨酰胺，10%CS和抗生素的McCoy's5a培養(yǎng)基中，以2x104細(xì)胞/孔的密度，37。C條件下接種24孔COSTAL板(FisherScientific,U.S.A.),單層細(xì)胞在混合有各種不同量的未標(biāo)記EGF、11F8或MC-C225的各種濃度的125I-EGF存在的條件下室溫孵育1小時(shí)，然后用冷PBS洗細(xì)胞，細(xì)胞相關(guān)的放射性用y計(jì)數(shù)儀來(lái)測(cè)定。圖4顯示125I-EGF與HT29細(xì)胞上的EGFR的結(jié)合被抑制。在濃度10-lOOnM之間，IMC-11F8和IMC-C225在抑制125I-EGF與HT29細(xì)胞上的EGFR的結(jié)合上同樣有效。兩個(gè)抗體的竟?fàn)幗Y(jié)合效果都優(yōu)于EGFR的天然配體，EGF。在抑制125I-EGF與A431細(xì)胞上的EGFR的結(jié)合試驗(yàn)中也觀察到了相似的結(jié)果。01391實(shí)施例8-EGFR活化簡(jiǎn)而言之，用BxPC3或A431細(xì)胞進(jìn)行激酶受體活化試驗(yàn)(KIRAassay)或磷酸化試驗(yàn)。細(xì)胞先在補(bǔ)加有4mML-谷氨酰胺，另含有1.5g/L碳酸氫鈉和4.5g/L葡萄糖，10%CS的DME中，37°C培養(yǎng)至90%融匯度。試驗(yàn)進(jìn)行前，細(xì)胞在補(bǔ)加有0.5%CS的DME中饑餓24小時(shí)，為了評(píng)價(jià)抗體的效果，即IMC-11F8、IMC-C225和IMC-1C11對(duì)EGF誘導(dǎo)的EGFR活化的效果，各種濃度的抗體在室溫下預(yù)結(jié)合30分鐘，然后用8ng/mL的EGF刺激15分鐘，繼刺激之后，單層細(xì)胞用;水冷的含有1mM正釩酸鈉的PBS洗滌。用裂解緩沖液[20mMTric誦HCl,pH.7.4、1%TritonX-100、137mMNaCl、10%甘油、10mMEDTA、2mM正釩酸鈉、100mMNaF、100mM焦磷酸鈉、5mMPEFABLOCSC(BoehringerMannheimBiochemicals,Indianapolis,IN)、100嗎蛋白酶抑制劑和100pg/mL亮抑酶肽]裂解細(xì)胞，并在14，000xg條件下離心10分鐘。澄清的細(xì)胞裂解液被加入到包被有抗EGFR多克隆抗體的96孔板中，然后洗板以去除非特異性結(jié)合的蛋白，加入抗磷酸化酪氨酸抗體來(lái)檢測(cè)EGFR的磷酸化水平。經(jīng)徹底洗板后，用ELISA讀板4義在OD450nm波長(zhǎng)下測(cè)定結(jié)合的抗磷酸化酪氨酸抗體的量。結(jié)果顯示，與對(duì)照抗體IMC-ICll相比，IMC-11F8在BxPC3(圖》和A431(圖6)細(xì)胞中均能明顯降低EGFR的磷酸化。抑制EGF刺激的EGFR磷酸化的作用進(jìn)一步用免疫沉淀的EGFR的Western免疫印跡來(lái)分析。如前所述，A431細(xì)胞與抗體預(yù)結(jié)合后用EGF刺激。一個(gè)與EGFR結(jié)合但不抑制EGFR的磷酸化的抗體用作對(duì)照。用抗EGFR的多克隆抗體，繼之用蛋白A瓊脂糖珠將蛋白(EGFR)從澄清的裂解液中免疫沉淀出來(lái)。結(jié)合的瓊脂糖珠用0.2%TritonX-IOO，10mMTris-HCl，pH8.0,150mMNaCl,2mMEDTA(BufferA)洗滌一次，再用含500mMNaCl的緩沖液A洗兩次，并用Tris-HCl,pH8.0洗兩次。去除液體的瓊脂糖珠與30|tiL2XSDS上樣緩沖液混合、煮沸，將其上清用于SDS-PAGE電泳。在電泳分離開蛋白條帶后，蛋白條帶被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，用于Western印跡分析。濾膜在50mMTris-HCl,pH7.4,150mMNaCl(TBS)含5%牛血清白蛋白和10%脫脂奶的封閉緩沖液中封閉過(guò)夜。為了檢測(cè)磷酸化的受體，印跡膜用含于封閉緩沖液中的抗磷酸化酪氨酸抗體在室溫下孵育1小時(shí),用含0.1%Tween-20(TBS-T)的0.5xTBS徹底洗滌，再與HRP綴合標(biāo)記的羊抗鼠Ig(Amersham,LittleChalfont,U.K.)孵育，用TBS洗膜，再與化學(xué)發(fā)光試劑(ECL,Amersham,LittleChalfont,U.K.)孵育1分鐘。通過(guò)曝光于高效應(yīng)光學(xué)檢測(cè)膠片(Hyperfilm-ECL,Amersham,LittleChalfont,U.K.)0.5到10分鐘，來(lái)檢測(cè)與磷酸化蛋白作用的抗磷酸化酪氨酸。圖7A的Western印跡分析顯示IMC-11F8,同IMC-C225一樣，抑制EGFR磷酸化。EGF抗體和對(duì)照抗體處理的細(xì)胞都不能完全抑制EGFR的磷酸化。圖7B顯示加入抗體到細(xì)胞中對(duì)EGFR的合成無(wú)抑制作用。圖8顯示EGFR的磷酸化被IMC-11F8抑制。在最低抗體試驗(yàn)濃度(0.8nM)時(shí)，在3種不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系(A431,BxPC3，HT-29)中均觀察到大于70%的抑制。IMC-11F8對(duì)EGFR下游的主要信號(hào)分子MAP激酶p44/p42的效應(yīng)也被檢驗(yàn)。MC-11F8阻斷A431、BxPC3和HT畫29細(xì)胞內(nèi)繼EGF刺激后的p44/42MAP激酶的磷酸化，且阻斷呈劑量依賴性方式(Fig.4)。f0145j實(shí)施例9_抑制細(xì)胞增殖MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)是通過(guò)黃色的四唑鎖MTT(3-(4,5-二曱噻唑基-2)-2,5-苯基四唑錨溴化物)被代謝活躍的細(xì)胞還原為細(xì)胞內(nèi)紫色的可溶曱臘(formazan)產(chǎn)物，再用光譜檢測(cè)的方法對(duì)其進(jìn)行定量從而進(jìn)行比色測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，DiFi細(xì)胞在含10%CSDMEM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜?？贵wIMC-11F8、IMC-C225或IMC-IC11被一式三份加入孔中，在37。C,5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。為了測(cè)定細(xì)胞增殖，加入20pL分裝的四唑輸染料于各孔中，37。C孵育3小時(shí)。當(dāng)在顯微鏡下能清楚看到紫色沉淀時(shí)，加入100pi去污劑以裂解細(xì)胞，在OD570nm測(cè)定曱臢產(chǎn)物的吸光度來(lái)定量增殖。如圖9所示，與對(duì)照抗體IMC-IC11不同，IMC-11F8與IMC-C225—樣是細(xì)胞增殖的強(qiáng)抑制劑。01481實(shí)施例10-抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)活性—種測(cè)定細(xì)胞死亡的方法是通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)或ADCC來(lái)進(jìn)行的，它通常使用放射性51Cr。用51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞與抗體混合，殺傷程度通過(guò)51Cr的釋放來(lái)檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，接近3x106DiFi細(xì)胞懸于0.5pl培養(yǎng)基中，加入0.5mCi的Na51Cr04,將該混合物在37'C孵育1小時(shí)并不時(shí)搖動(dòng)，然后細(xì)胞用冷培養(yǎng)基洗3遍。標(biāo)記好的細(xì)胞被懸于100^tl含有不同濃度的抗EGFR抗體(IMC-11F8或MC-C225)的培養(yǎng)基中，4'C將育30分鐘。然后細(xì)胞用培養(yǎng)基離心洗滌3次，加入兔補(bǔ)體，在37。C繼續(xù)與處理過(guò)的細(xì)胞孵育1小時(shí)，再加入50^冷培養(yǎng)基并離心。移出上清，細(xì)胞釋放到上清中的放射性用gamma計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)定。加入1%TritonX到耙細(xì)胞得到放射性的最大釋放，細(xì)胞毒性的百分比用實(shí)驗(yàn)釋放cpm減去背景cpm乘以100%,然后除以(最大釋放cpm減背景cpm)來(lái)計(jì)算。圖10顯示通過(guò)IMC-11F8和IMC-C225(或ERBITUX)經(jīng)抗體依賴的細(xì)胞毒性或ADCC活性介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。實(shí)施例U-小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的體內(nèi)抑制體內(nèi)抗腫瘤研究被設(shè)計(jì)來(lái)確定IMC-11F8是否阻斷異種移植-漠型上腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。無(wú)胸腺的小鼠(nu/nu;CharlesRiverLab,Wilmington,MA)脅腹皮下注射1-2百萬(wàn)A431或BxPC-3細(xì)胞，抗EGFR抗體(IMC-11F8和IMC-C225)或?qū)φ湛贵w以1mg/劑量或0.3mg/劑量腹膜內(nèi)注射，每周3次。腫瘤大小每周用卡鉗測(cè)量3次并計(jì)算腫瘤的體積(參見Baselga等，JNatl.CancerInst.(1993)85:1327-1333)。[OIW]圖11顯示IMC-11F8在A431異種移植模型中的抗腫瘤活性。1mg劑量時(shí)(圖11,右圖)與對(duì)照動(dòng)物相比，IMC-11F8在阻止和抑制腫瘤生長(zhǎng)方面與IMC-C225(CETUXIMAB)—樣有效，在4交低劑量，0.3mg時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)展受阻。類似，圖12顯示了IMC-11F8和IMC-C225在第二個(gè)肺瘤模型上的效果(BxPC-3異種移植)。BxPC3腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)與在A431腫瘤模型上觀察到的類似。在1.0mg/小鼠/注射劑量水平，IMC-11F8導(dǎo)致8只A413載瘤動(dòng)物中的6只腫瘤消退，8只BxPC3載瘤動(dòng)物中的5只胂瘤消退。A431和BxPC3異種移植的免疫組化染色顯示，IMC-11F8處理明顯降低肺瘤細(xì)胞的密度并增加瘤體內(nèi)無(wú)細(xì)胞性壞死殘片區(qū)域(圖13)。此外IMC國(guó)11F8降低整個(gè)腫瘤切片中的Ki陽(yáng)67陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，表明瘤內(nèi)細(xì)胞的增殖降低(圖13)。用0.3mg或1.0mg/注射的IMC-11F8,給異種移植了人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞GEO、DLD-I或HT-29，瘤體積接近200-300mm3的棵鼠，每周2次腹膜內(nèi)注射，單獨(dú)用藥或聯(lián)合使用伊立替康(CPT-11)，劑量100mg々〉斤，每周1次。每周兩次測(cè)量腫瘤大小。用0.3mg或1.0mg/鼠/注射IMC-11F8T明顯抑制3種結(jié)腸直腸癌(GEO或DLD-I或HT-29;圖14A-C)異種移植的生長(zhǎng)。當(dāng)給GEO異種移植的載瘤小鼠聯(lián)合CPT-ll給藥時(shí)，IMC-11F8明顯增強(qiáng)了單用CPT-ll時(shí)對(duì)腫瘤的抑制(圖14A;兩個(gè)劑量的IMC-11F8pO.Ol)。更為明顯的是，當(dāng)單用CPT-ll時(shí)在;^f莫型上不引起腫瘤的消退，但分別與0.3mg或1.0mg/鼠/注射的IMC-11F8聯(lián)合用藥后，10只中的4只和10只中的9只出現(xiàn)了肺瘤的消退(分別p=0.004和pO.OOOl)。類似的聯(lián)合抗腫瘤效果在兩個(gè)其他異種抑制模型，DLD-I(圖14B)和HT-29(圖14C)中也觀察到，高劑量組(l.Omg)的胂瘤消退有相同的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖14D顯示當(dāng)CPT-11聯(lián)合IMC-11F8用藥后，在3個(gè)結(jié)腸直腸癌異種移植模型中觀察到的腫瘤消退明顯增加。在食蟹猴體內(nèi)對(duì)IMC-11F8的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究并與IMC-C225進(jìn)行了對(duì)比。用單一劑量的、20.5mg/kg1251-標(biāo)記的MC-11F8和TMC-C225分別靜脈注射于猴體，同日取血確定滯留于動(dòng)物血漿中的抗體水平。表6提供了在食蟹猴體內(nèi)IMC-11F8和IMC-C225的藥物動(dòng)力學(xué)對(duì)比。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)這里公開的發(fā)明原則的可能改動(dòng)是可以理解和可以預(yù)期的，這里有意將這樣的改動(dòng)包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種分離的人抗體或抗體片段，含有選自CDRH1上的SEQIDNO2；CDRH2上的SEQIDNO4；CDRH3上的SEQIDNO6；CDRL1上的SEQIDNO10；CDRL2上的SEQIDNO12和CDRL3上的SEQIDNO14的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)。2.權(quán)利要求1中的抗體或抗體片段，含有CDRH1上的SEQIDNO:2;CDRH2上的SEQIDNO:4;CDRH3上的SEQIDNO:6。3.權(quán)利要求1中的抗體或抗體片段，含有SEQIDNO:8。4.權(quán)利要求1中的抗體或抗體片段，含有CDRLl上的SEQIDNO:10;CDRL2上的SEQIDNO:12;和CDRL3上的SEQIDNO:14。5.權(quán)利要求1中的抗體或抗體片段，含有SEQIDNO:166.權(quán)利要求1中的抗體或抗體片段，含有CDRH1上的SEQIDNO:2;CDRH2上的SEQIDNO:4;CDRH3上的SEQIDNO:6;CDRLl上的SEQIDNO:10;CDRL2上的SEQIDNO:12;和CDRL3上的SEQIDNO:14。7.權(quán)利要求1中的抗體或抗體片段，含有SEQIDNO:8和SEQIDNO:16。8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或抗體片段，選擇性地與EGFR結(jié)合。9.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或抗體片段，抑制EGFR與EGFR配體的結(jié)合。10.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或抗體片段，中和EGFR。11.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體片段，選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。12.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的綴合物。13.權(quán)利要求12中的綴合物，含有抗腫瘤藥物、靶組成部分或^^艮告組成部分。14.一種分離的編碼抗體或抗體片段的多核苷酸，含有選自CDRH1上的SEQIDNO:1;CDRH2上的SEQIDNO:3;CDRH3上的SEQIDNO:5;CDRLl上的SEQIDNO:9;CDRL2上的SEQIDNO:ll;和CDRL3上的SEQIDNO:13的一個(gè)或多個(gè)核苦酸序列。15.權(quán)利要求14中的分離的多核苷酸，含有SEQIDNO:7。16.權(quán)利要求14中的分離的多核苷酸，含有SEQIDNO:15。17.—種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)的多核苷酸。18.—種重組宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求17中的表達(dá)栽體。19.權(quán)利要求18中的重組宿主細(xì)胞，產(chǎn)生含有SEQIDNO:8的多肽和含有SEQIDNO:16的多肽。20.權(quán)利要求18中的重組宿主細(xì)胞，產(chǎn)生含有SEQIDNO:8和SEQIDNO:16的多肽。21，一種在哺乳動(dòng)物體抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)抗體。22.權(quán)利要求21中的方法，其中腫瘤表達(dá)EGFR。23.權(quán)利要求21中的方法，其中腫瘤過(guò)度表達(dá)EGFR。24.權(quán)利要求21中的方法，其中腫瘤為原發(fā)性腫瘤。25.權(quán)利要求21中的方法，其中腫瘤為轉(zhuǎn)移性腫瘤。26.權(quán)利要求21中的方法，其中腫瘤為難治性腫瘤。27.權(quán)利要求21中的方法，其中腫瘤為血管化腫瘤。28.權(quán)利要求21中的方法，其中腫瘤選自結(jié)腸直腸腫瘤、頭頸部腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、乳腺腫瘤、腎細(xì)胞癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。29.權(quán)利要求21中的方法，其中抗體或抗體片段與抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥。30.權(quán)利要求29中的方法，其中抗腫瘤藥物為化療藥物。31.權(quán)利要求29中的方法，其中抗腫瘤藥物為依立替康(CPT-32.權(quán)利要求29中的方法，其中抗腫瘤藥物為放射線。33.權(quán)利要求21中的方法，其中抗體或抗體片段與EGFR拮抗劑聯(lián)合用藥。34.權(quán)利要求33中的方法，其中EGFR拮抗劑是細(xì)胞內(nèi)EGFR拮抗劑。35.權(quán)利要求21中的方法，進(jìn)一步包括給予治療有效量的血管內(nèi)皮因子受體(VEGFR)拮抗劑。36.權(quán)利要求21中的方法，進(jìn)一步包括給予治療有效量的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)拮抗劑。37.—種治療過(guò)度增生性疾病的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的抗體。38.權(quán)利要求37中的方法，其中過(guò)度增生性疾病為銀屑病。39.權(quán)利要求38中的方法，其中抗體或抗體片段與銀屑病的局部或系統(tǒng)治療藥物聯(lián)合用藥。40.權(quán)利要求38中的方法，其中抗體或抗體片段與皮質(zhì)類固醇聯(lián)合用藥。41.權(quán)利要求38中的方法，其中抗體或抗體片段與類視色素聯(lián)合用藥。全文摘要本發(fā)明提供了全長(zhǎng)人抗體，其與人EGFR的結(jié)合親和力高于IMC-C225，并能中和EGFR活性。該抗體包括完整免疫球蛋白、單價(jià)Fab和單鏈抗體、多價(jià)單鏈抗體、雙抗體、三抗體和單區(qū)域抗體。本發(fā)明還提供編碼并表達(dá)這些抗體的核酸、宿主細(xì)胞和動(dòng)物。本發(fā)明進(jìn)一步提供單用或與其它藥物聯(lián)用該抗體中和EGFR活性、治療哺乳動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)和非癌性過(guò)度增生疾病的方法。文檔編號(hào)A61K39/395GK101233155SQ200580015481公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2005年3月21日優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日發(fā)明者M(jìn)·劉,Z·朱申請(qǐng)人:伊姆克羅尼系統(tǒng)公司