專利名稱：使用抗－α5β1抗體抑制癌細(xì)胞增殖的制作方法
專利說(shuō)明使用抗-α5β1抗體抑制癌細(xì)胞增殖 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明提供了能特異性識(shí)別癌細(xì)胞表面表達(dá)的α5β1整聯(lián)蛋白的抗體，以及利用該抗體抑制癌細(xì)胞增殖的方法。

背景技術(shù)：
α5β1整聯(lián)蛋白與腫瘤血管新生的關(guān)聯(lián)是眾所周知的(例如，參見1999年5月7日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0172675A1，其內(nèi)容被納入本文作為參考)。α5β1是能特異性結(jié)合配體纖連蛋白的異二聚化整聯(lián)蛋白。α5β1在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，介導(dǎo)向纖連蛋白遷移并粘附于纖連蛋白。已發(fā)現(xiàn)α5β1與纖連蛋白間的結(jié)合相互作用對(duì)腫瘤血管新生非常重要。當(dāng)一種或多種促血管新生生長(zhǎng)因子(例如，F(xiàn)GF、VEGF、PDGF等)的釋放局部激活內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，腫瘤內(nèi)開始進(jìn)行血管新生。然后，這些激活的內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)其α5β1整聯(lián)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白結(jié)合，形成新的血管。在體內(nèi)腫瘤模型中，已發(fā)現(xiàn)抗-α5β1抗體能抑制血管新生(例如，參見US2002/0172675A1)。
抗血管新生癌癥治療建立在抑制腫瘤血管形成，從而防止腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)上(例如，參見綜述Marx，“加劇腫瘤饑餓”(A Boost for TumorStarvation)，Science 301，452(2003)；Sato，“腫瘤血管新生的分子診斷與抗血管新生的癌癥治療”(Molecular Diagnosis of Tumor Angiogenesis andAnti-Angiogenic Cancer Therapy)，Int.J.Clin.Oncol.8，200(2003)；Bissachi等，“抗血管新生和阻止新血管形成機(jī)制、問(wèn)題與展望”(Anti-Angiogenesis andAngiopreventionMechanisms，Problems and Perspectives)，Cancer Detec.Prev.27，229(2003))。目前超過(guò)60種基于抗血管新生的療法處于癌癥治療的臨床開發(fā)階段。雖然在一些癌癥中，可通過(guò)阻止腫瘤血管形成而“饑餓”腫瘤，但目前的研究表明，一些癌癥不易受到抗血管新生治療的作用(參見Sato，同上)。例如，抗-VEGF抗體藥物AVASTINTM(貝伐單抗)在結(jié)腸癌的臨床試驗(yàn)中成功，但在乳腺癌中不成功(參見Marx，同上)。此外，基于抗-血管新生的治療方法不大適用于腫瘤血管形成過(guò)程尚未開始時(shí)的早期治療。
由于其在血管新生中的作用，提出將α5β1整聯(lián)蛋白作為多種由血管新生過(guò)程介導(dǎo)的疾病(包括惡性腫瘤生長(zhǎng))的治療靶點(diǎn)。開發(fā)了阻斷與纖連蛋白的特異性結(jié)合的嵌合性和人源化的α5β1抗體。發(fā)現(xiàn)嵌合性α5β1抗體M200(也可稱為其通用名稱，沃羅昔單抗(volociximab))能體外誘導(dǎo)活化的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而與生長(zhǎng)因子刺激無(wú)關(guān)。
因此，仍然需要甚至在腫瘤血管形成過(guò)程開始之前，或當(dāng)證明靶向抗血管新生療法無(wú)效時(shí)，能夠直接殺傷癌細(xì)胞的癌癥療法和早期治療方法。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了利用抗-α5β1抗體殺傷癌細(xì)胞的方法。在一個(gè)一般的實(shí)施方式中，該方法包括將表面表達(dá)α5β1的癌細(xì)胞與抗-α5β1抗體接觸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抑制表面表達(dá)α5β1整聯(lián)蛋白的癌(或腫瘤)細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括將腫瘤細(xì)胞與能結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的α5β1整聯(lián)蛋白的抗體接觸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞來(lái)自難治性實(shí)體瘤患者。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞來(lái)自選自下組的癌膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和脾臟癌。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)表面表達(dá)α5β1整聯(lián)蛋白的腫瘤細(xì)胞死亡的方法，該方法包括將腫瘤細(xì)胞與能結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的α5β1整聯(lián)蛋白的抗體接觸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞來(lái)自難治性實(shí)體瘤患者。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞來(lái)自選自下組的癌膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和脾臟癌。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抑制患者癌細(xì)胞增殖的方法，所述癌細(xì)胞在其表面表達(dá)α5β1整聯(lián)蛋白。在本實(shí)施方式中，所述方法還包括給予患者治療有效量的抗體，所述抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制M200與癌細(xì)胞表面的α5β1整聯(lián)蛋白結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包含氨基酸序列與SEQ ID NO2、4、6和8基本上相同的可變區(qū)。在此方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，給予患者的抗體中和了α5β1整聯(lián)蛋白的至少一種生物學(xué)活性。在另一實(shí)施方式中，給予患者的抗體包含治療效應(yīng)物部分(例如，抗體-藥物偶聯(lián)物)。在所述方法的又一個(gè)實(shí)施方式中，將抗體與另一種化療藥物按順序或一起給予患者。在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將抗體與另一種化療藥物按順序或一起給予難治性實(shí)體瘤患者。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療懷疑發(fā)生細(xì)胞表面表達(dá)α5β1的癌癥的對(duì)象的方法，其中，所述對(duì)象尚未發(fā)生腫瘤，所述方法包括給予患者治療有效量的含可結(jié)合α5β1整聯(lián)蛋白的抗體的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，癌癥選自膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和脾臟癌。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療具有患表達(dá)α5β1的癌癥的遺傳傾向的對(duì)象的方法，其中，所述對(duì)象尚未發(fā)生腫瘤，所述方法包括給予對(duì)象治療有效量的含可結(jié)合α5β1整聯(lián)蛋白的抗體的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，癌癥選自膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和脾臟癌。
可用于本發(fā)明方法的優(yōu)選抗-α5β1抗體包括IIA1、M200、F200以及與IIA1、M200和F200一樣特異性結(jié)合于α5β1上相同表位的抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，可用于本發(fā)明方法的抗-α5β1抗體包括能競(jìng)爭(zhēng)性抑制IIA1和/或M200與腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的α5β1整聯(lián)蛋白的結(jié)合的抗體。
可用于本發(fā)明方法的其它抗體包括具有與SEQ ID NO2、4、6和8基本上相同的可變區(qū)氨基酸序列的抗體。并且，包括具有與SEQ ID NO2、4、6和8至少約90％、95％、98％或優(yōu)選99％或更多相同的可變區(qū)氨基酸序列的抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供配制成藥物組合物的抗-α5β1抗體。這些藥物組合物可用于本文公開的各種本發(fā)明方法。在各種實(shí)施方式中，可通過(guò)多種途徑將治療有效量的抗-α5β1抗體藥物組合物給予對(duì)象，所述途徑包括但不限于口服、皮下、局部、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、眼內(nèi)、心室內(nèi)或鞘內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥物組合物是包含約1.0-15mg/mL的抗-α5β1抗體、約22-27mM檸檬酸鹽、約145-165mM氯化鈉、約0.04-0.06％的聚山梨酯(TWEEN)80，pH約5.5-7.5的液體制劑。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥物組合物是包含約10mg/mL抗-α5β1抗體、約25mM檸檬酸鹽、約150mM氯化鈉、約0.05％聚山梨酯(TWEEN)80，pH約6.5的液體制劑。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥物組合物是包含約10mg/mLM200、約25mM檸檬酸鹽、約150mM氯化鈉、約0.05％聚山梨酯(TWEEN)80，pH約6.5的液體制劑。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文所述各藥物組合物可還包含化療藥物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將含抗-α5β1抗體的藥物組合物與治療有效量的另一種化療藥物一起給予患者。
上述藥物組合物可用于治療診斷患有或懷疑患有選自下組的癌癥的患者的方法中膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和脾臟癌，所述方法包括靜脈內(nèi)給予患者治療有效劑量的包含約1.0-15mg/mL抗-α5β1抗體、約22-27mM檸檬酸鹽、約145-165mM氯化鈉、約0.04-0.06％聚山梨酯(TWEEN)80，pH約5.5-7.5的液體制劑。在治療方法的一個(gè)實(shí)施方式中，給予的治療有效劑量約為10mg/kg。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用藥物組合物治療的患者已被診斷患有或懷疑患有腎細(xì)胞癌或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，治療有效劑量約為10mg/kg。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1描述了(A)IIA1 VH核酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ IDNO2)；(B)IIA1 VL核酸序列(SEQ ID NO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖2描述了(A)M200VH核酸序列(SEQ ID NO5)和氨基酸序列(SEQ IDNO6)；(B)M200VL核酸序列(SEQ ID NO7)和氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
發(fā)明詳述 為了清楚說(shuō)明和理解，下面的描述以示例性實(shí)施方案和例證的方式詳細(xì)闡述了本發(fā)明。本說(shuō)明書所包括的實(shí)施方案和實(shí)施例不是為了限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易明白，可采用等價(jià)材料和/或方法，和/或可對(duì)所述實(shí)施方案和實(shí)施例進(jìn)行任何明顯改變、變化或改進(jìn)，而不背離所附權(quán)利要求書的范圍。
本說(shuō)明書所引用的所用文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)都已納入本文作為參考，這就如同將各個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)單獨(dú)列入本文作為參考一樣。
除非另有說(shuō)明，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)的意義都與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的意義一致。
概述 本發(fā)明基于以下意外發(fā)現(xiàn)α5β1整聯(lián)蛋白在多種癌癥的腫瘤上皮細(xì)胞表面上表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)，結(jié)合該表面α5β1的靶向抗體能直接殺傷這些癌細(xì)胞。因?yàn)楣艉蜌兰?xì)胞的方法是直接的，適用于非常早期的治療(即在實(shí)質(zhì)性腫瘤形成之前)。而且，本發(fā)明直接殺傷癌細(xì)胞的方法尤其適用于治療細(xì)胞表面表達(dá)α5β1但未證明易受抗-血管新生方法作用的癌癥。該類癌癥包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。
本發(fā)明提供了采用抗-α5β1抗體殺傷或防止癌細(xì)胞增殖的方法。在其最一般的實(shí)施方式中，所述方法包括將表面表達(dá)α5β1的癌細(xì)胞與抗-α5β1抗體接觸，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡(例如，通過(guò)凋亡)。
可采用本發(fā)明方法在體內(nèi)(例如，在患者體內(nèi))殺傷癌細(xì)胞，從而防止或減緩腫瘤形成和生長(zhǎng)。此外，該方法也可用于治療已形成的腫瘤，可與其它癌癥療法(例如如，化療藥物或其它分子基癌癥治療藥物)聯(lián)用。例如，相繼使用抗體M200制劑和化療化合物如阿霉素來(lái)治療患有惡性腫瘤的患者。因?yàn)镸200是人體內(nèi)毒性較低的嵌合抗體，所以聯(lián)合治療可提供與僅用較高劑量的化療藥物相當(dāng)?shù)陌┘?xì)胞殺傷能力，而沒有伴隨后者的毒副作用。
本發(fā)明提供一種方法，其中，抗-α5β1抗體直接殺傷和/或抑制癌細(xì)胞增殖，即使不存在任何易受這些抗體的抗-血管新生作用的腫瘤血管。因此，該方法尤其適用于預(yù)防或治療表達(dá)α5β1但不形成高度血管化腫瘤、和/或不易受抗-血管新生療法作用的癌癥，例如，胰腺癌、腎癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、肺癌和乳腺癌。
而且，由于M200(和本文所述其它抗-α5β1抗體)的癌細(xì)胞直接殺傷能力，可將這些抗體用于血管化腫瘤形成之前的早期癌癥治療。隨著人類基因組序列中的遺傳標(biāo)記信息的發(fā)展，產(chǎn)生了新的更靈敏的癌癥診斷方法，早期治療方法就顯得尤其重要?？赡茉诜浅Ｔ缙诩茨[瘤前(pretumor)階段來(lái)檢測(cè)和診斷多種普通癌癥，其中，癌細(xì)胞存在于組織和/或循環(huán)系統(tǒng)中，但尚未建立可由敏感性較差的非遺傳診斷方法檢測(cè)的腫瘤結(jié)構(gòu)。在這種早期診斷方案中，當(dāng)腫瘤血管形成尚未建立時(shí)，抗-血管新生療法作用很小或沒有作用，并且一般化療劑毒副作用太大，難以應(yīng)用。因?yàn)楸景l(fā)明方法可抗體-靶向地直接殺傷其表面上表達(dá)α5β1整聯(lián)蛋白的癌細(xì)胞，所以該方法尤其適用于早期預(yù)防性治療。
那些最有可能受益于早期治療方法的對(duì)象包括但不限于1)腫瘤前診斷試驗(yàn)顯示發(fā)生和/或存在腫瘤(或微型腫瘤)的可能性高的對(duì)象；2)暴露于高強(qiáng)度致癌環(huán)境從而非?？赡馨l(fā)生腫瘤的對(duì)象；和3)發(fā)生癌細(xì)胞在其表面表達(dá)α5β1的癌癥的遺傳傾向高的對(duì)象。
抗-α5β1抗體 本發(fā)明方法采用抗-α5β1抗體作為直接殺傷癌細(xì)胞的試劑。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指可特異性結(jié)合特定抗原或能與特定抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白分子，包括多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體和其它修飾形式的抗體，包括但不限于嵌合抗體、人源化的鼠抗體、異源偶聯(lián)抗體(例如，雙特異性抗體、雙體、三體和四體)以及抗體的抗原結(jié)合片段，包括，例如Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段。術(shù)語(yǔ)“scFV”指常規(guī)抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)連接形成一條鏈的單鏈Fv抗體。此外，本發(fā)明描述中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括可與特定抗原反應(yīng)的一種以上抗體的混合物(例如可與α5β1整聯(lián)蛋白反應(yīng)的不同類型單克隆抗體的混合物)。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法中使用的抗-α5β1抗體是單克隆抗體?？刹捎枚喾N本領(lǐng)域已知的技術(shù)包括采用雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)和噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)或它們的組合來(lái)制備本發(fā)明中使用的單克隆抗體，。例如，可采用本領(lǐng)域已知的雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，例如，參見Harlow & Lane，《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies，A Laboratory Manual)(1988)；Hammerling等，《單克隆抗體與T-細(xì)胞雜交瘤》(″Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)″，Elsevier，New York(1981)，第563-681頁(yè)(這兩份文獻(xiàn)的內(nèi)容被納入本文作為參考)?？赏ㄟ^(guò)篩選重組抗體噬菌體文庫(kù)或類似載體文庫(kù)來(lái)制備抗體，例如，參見Huse等，Science2461275-1281(1989)；Ward等，Nature 341544-546(1989)；以及Vaughan等，Nature Biotech.14309-314(1996)，或者用抗原或編碼抗原的DNA免疫動(dòng)物來(lái)制備抗體。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可采用過(guò)去已鑒定的抗-α5β1抗體、IIA1、M200或F200實(shí)施本發(fā)明直接殺傷癌細(xì)胞的方法。IIA1是親代小鼠IgG1類抗體，已表明它能抑制α5β1整聯(lián)蛋白與纖連蛋白的結(jié)合(例如，參見1999年5月7日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0172675 A1，其內(nèi)容被納入本文作為參考)。M200是來(lái)源于IIA1的嵌合IgG4抗體。F200是來(lái)源于M200的Fab片段。在2003年11月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/724,274和2004年4月23日提交的10/830,956中描述了這些抗體的產(chǎn)生、功能鑒定及其具體的氨基酸序列，其內(nèi)容被納入本文作為參考。在猴眼和兔眼模型中已表明，M200和F200都具有體內(nèi)抗-血管新生效力(參見2003年11月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/724,274，和2004年4月23日提交的10/830,956)。
本發(fā)明中使用的抗體還包括與IIA1、M200和F200一樣特異性結(jié)合于α5β1上相同表位的抗體。“表位”(或“抗原決定簇”)指抗原上的抗體結(jié)合位點(diǎn)。表位可由連續(xù)氨基酸或通過(guò)蛋白質(zhì)三級(jí)折疊并列的不連續(xù)氨基酸形成。例如，α5β1整聯(lián)蛋白上表位可包括構(gòu)成異源二聚體結(jié)構(gòu)的各α和β多肽鏈上的氨基酸。連續(xù)氨基酸形成的表位用變性溶劑處理時(shí)通?？梢员Ａ?，而通過(guò)三級(jí)折疊形成的表位在用變性溶劑處理時(shí)通常會(huì)消失。表位一般至少包括具有獨(dú)特的空間構(gòu)象的至少3個(gè)、更常見至少5個(gè)或6-10個(gè)氨基酸。確定表位空間構(gòu)象的方法包括(例如)x射線晶體衍射和二維核磁共振。例如，參見《分子生物學(xué)方法中的表位作圖指南》(Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology)，第66卷，Glenn E.Morris編(1996)。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中降低或消除一種抗體結(jié)合的氨基酸突變也可降低或消除另一種抗體的結(jié)合時(shí)，認(rèn)為兩種抗體結(jié)合相同的蛋白質(zhì)表位。并且，當(dāng)兩種抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合某蛋白，即一種抗體與蛋白質(zhì)的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制、降低或消除另一種抗體的結(jié)合時(shí)，認(rèn)為兩種抗體結(jié)合相同的表位。因此，可采用已確定可競(jìng)爭(zhēng)性抑制IIA1、M200(沃羅昔單抗)或F200與癌細(xì)胞表面表達(dá)的α5β1整聯(lián)蛋白的結(jié)合的抗體來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法。
可用于本發(fā)明方法的抗-α5β1抗體并不限于IIA1、M200和F200，而是包括具有與IIA1、M200和F200基本上相同的可變區(qū)、框架區(qū)或CDR氨基酸序列的抗體?？勺儏^(qū)、框架區(qū)和CDR的長(zhǎng)度是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的(例如，參見Kabat等，《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列》(″Sequences of Proteins ofImmunological Interest″)，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。如本文所用，抗體重鏈可變區(qū)(“VH”或“VH”)或輕鏈可變區(qū)(“VL”或“VL”)，包括重鏈或輕鏈抗原結(jié)合片段，例如Fv、scFv、dsFv或Fab。抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)還包含四個(gè)被三個(gè)超變區(qū)間隔開的“框架”區(qū)，也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”。CDR主要負(fù)責(zé)與抗原表位的結(jié)合。
“基本上相同的”可變區(qū)、恒定區(qū)、框架區(qū)或CDR指至少約85-90％，優(yōu)選至少95％的氨基酸序列與天然或未改變的抗體可變區(qū)或恒定區(qū)相同的抗體區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“相同的”或“相同性”百分?jǐn)?shù)當(dāng)用于比較兩個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸序列時(shí)是指兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列相同，或者其特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同(即，當(dāng)比較和比對(duì)的比較窗或指定區(qū)內(nèi)的最大一致性時(shí)，特定區(qū)域上具有約60％的相同性，優(yōu)選70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的相同性)，可利用BLAST或BLAST 2.0序列比較算法確定相同性，默認(rèn)參數(shù)如下所述，或者通過(guò)人工比對(duì)和目測(cè)確定相同性(例如，參見國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，網(wǎng)址www.ncbi.nlm.nih.gov中關(guān)于BLAST的描述)。
相同或基本上相同的序列包括含有缺失和/或加入的序列、具有取代的序列、以及天然產(chǎn)生的變體如多態(tài)性或等位基因變體和人工變體如保守修飾的變體。測(cè)定序列相同性的公知算法考慮到缺口等。優(yōu)選地，相同性存在于至少長(zhǎng)約為25個(gè)氨基酸或核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)約50-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。
本發(fā)明方法中使用的抗-α5β1抗體的氨基酸序列并不限于天然抗體中發(fā)現(xiàn)的序列；可采用公知的重組DNA技術(shù)重新設(shè)計(jì)抗體，以獲得所需特征。這種“遺傳上改變的抗體”包括那些氨基酸序列與親代(即未改變)抗體不同的抗體。可能的變異包括從僅僅一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的改變到完全重新設(shè)計(jì)(例如)可變區(qū)或恒定區(qū)。在恒定區(qū)中可通過(guò)定點(diǎn)突變導(dǎo)致改變，以改進(jìn)或改變治療性抗體的功能特征，例如免疫原性、藥代動(dòng)力學(xué)特征(例如血清半衰期)、補(bǔ)體固定、與膜的相互作用以及其它效應(yīng)子功能。通常，可改變抗體可變區(qū)，以改進(jìn)抗原結(jié)合特征。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的直接殺傷癌細(xì)胞方法中可采用嵌合抗體M200。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指一種免疫球蛋白分子，其中(a)恒定區(qū)或其一部分被改變、取代或交換，使得抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接于類別、效應(yīng)功能和/或物種不同或改變的恒定區(qū)、或者連接于可賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等；或者(b)用具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、取代或交換可變區(qū)或其一部分。制備嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。例如，參見Morrison等，Science 2291202-1207(1985)；Oi等，BioTechniques 4214-221(1986)；Gillies等，J.Immunol.Methods 125191-202(1989)；和美國(guó)專利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其內(nèi)容被納入本文作為參考。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明直接殺傷癌細(xì)胞的方法采用人源化抗-α5β1抗體。當(dāng)用于人體治療時(shí)，人源化的抗體中添加的人序列可進(jìn)一步降低抗體可能的免疫原性。IIA1的人源化類型參見2003年11月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/724,274，和2004年4月23日提交的10/830,956中的描述，其內(nèi)容被納入本文作為參考。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指含有人框架、至少一個(gè)且優(yōu)選所有CDR來(lái)自非人抗體的免疫球蛋白分子，其中，存在的任何恒定區(qū)與人免疫球蛋白恒定區(qū)基本上相同，即至少約85-90％，優(yōu)選至少95％相同。因此，除CDR以外，人源化的免疫球蛋白的所有部分與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的對(duì)應(yīng)部分基本上相同。因此，這種人源化抗體是嵌合抗體，其中，大大小于完整的人可變區(qū)被非人可變區(qū)的相應(yīng)序列取代。人框架區(qū)的框架殘基可被來(lái)自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基取代，以改變、優(yōu)選改進(jìn)抗原結(jié)合(性能)。這些框架取代部分可由本領(lǐng)域公知的方法鑒定，例如，通過(guò)建立CDR與框架殘基相互作用的模型來(lái)鑒定對(duì)抗原結(jié)合重要的框架殘基，以及建立序列比較的模型來(lái)鑒定特定位置的非常規(guī)框架殘基。例如，參見Queen等，美國(guó)專利5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370(本文都已完整納入作為參考)。可采用本領(lǐng)域公知的各種方法來(lái)人源化抗體，例如，CDR-嫁接(EP 239,400；PCT專利公開號(hào)WO 91/09967；美國(guó)專利5,225,539；5,530,101和5,585,089)、貼面(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Mol.Immunol.，28489-498(1991)；Studnicka等，Prot.Eng.7805-814(1994)；Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci.91969-973(1994)，以及鏈改組(美國(guó)專利No.5,565,332)，這些都已完整納入本文作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明方法，可利用人α5β1抗體(即包含人可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體)來(lái)治療人患者?？衫帽绢I(lǐng)域已知的多種方法制備或獲得人抗體，包括利用來(lái)源于人免疫球蛋白序列的抗體文庫(kù)的上述噬菌體展示法。見美國(guó)專利4,444,887和4,716,111；PCT公開號(hào)WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735和WO 91/10741，這些都已完整納入本文作為參考。也可利用不能表達(dá)有功能的內(nèi)源性免疫球蛋白、而可表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人抗體。生產(chǎn)人抗體的技術(shù)的一般介紹參見Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93(1995)。制備人抗體和人單克隆抗體的技術(shù)和制備這些抗體的方案的詳細(xì)描述參見，例如，PCT公開WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；歐洲專利0598877；美國(guó)專利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，這些都已完整納入本文作為參考。也可采用稱為“導(dǎo)向選擇”的技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別選定表位的完整人抗體。在這種技術(shù)中，使用選定的非人單克隆抗體如小鼠抗體，來(lái)指導(dǎo)識(shí)別相同表位的完整人抗體的選擇(Jespers等，Biotechnology 12899-903(1988)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明方法，可采用靈長(zhǎng)動(dòng)物源化(primatized)抗體(即包含猴可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體)進(jìn)行治療。制備靈長(zhǎng)動(dòng)物源化抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，參見美國(guó)專利5,658,570；5,681,722；和5,693,780，這些都已完整納入本文作為參考。
抗體功能 本發(fā)明方法采用能特異性結(jié)合α5β1整聯(lián)蛋白的功能性抗體?？贵w特異性結(jié)合抗原的親合力試驗(yàn)使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定出能特異性識(shí)別α5β1整聯(lián)蛋白的一個(gè)或多個(gè)表位的抗體。如果發(fā)生下列情況則認(rèn)為抗體的結(jié)合是特異性的1)顯示出結(jié)合活性的閾值水平，和/或2)抗體不與相關(guān)的多肽分子發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)。
首先，如果本文所述抗-α5β1抗體與α5β1整聯(lián)蛋白多肽、肽或表位的結(jié)合親和力(Ka)達(dá)到106mol-1或更高、優(yōu)選107mol-1或更高、更優(yōu)選108mol-1或更高、最優(yōu)選109mol-1或更高，則本發(fā)明方法所用抗-α5β1抗體發(fā)生特異性結(jié)合(或“特異性反應(yīng)”或“特異性免疫反應(yīng)”)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51660-72，1949)或利用BIAcore通過(guò)表面等離子共振很容易確定抗體的結(jié)合親和力?？捎糜阼b定抗-α5β1抗體的各種抗體結(jié)合試驗(yàn)參見2003年11月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/724,274，和2003年4月23日提交的10/830,956，其內(nèi)容被納入本文作為參考。
第二，抗體如果不與相關(guān)多肽發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)則抗體進(jìn)行特異性結(jié)合。如果采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡分析(例如，參見《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等編，1995)只檢測(cè)到α5β1整聯(lián)蛋白多肽而檢測(cè)不到已知的相關(guān)多肽，則抗體不與相關(guān)的多肽分子發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)。已知的相關(guān)多肽的例子包括直向同源物、整聯(lián)蛋白蛋白家族成員中同一物種來(lái)源的蛋白、或突變改變了抗-α5β1表位的突變的α5β1整聯(lián)蛋白多肽。另外，可以用已知的相關(guān)多肽“篩選”抗體，以分離出可與α5β1整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合的抗體群體。例如，將用人α5β1整聯(lián)蛋白多肽產(chǎn)生的抗體吸附到粘附于不溶性基質(zhì)的相關(guān)多肽上；在合適的緩沖液條件下使人α5β1整聯(lián)蛋白多肽的特異性抗體流出該基質(zhì)。這種篩選可以分離出與緊密相關(guān)多肽無(wú)交叉反應(yīng)性的多克隆和單克隆抗體(《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(AntibodiesA LaboratoryManual)，Harlow和Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Immunology)，Cooligan等(編)，NationalInstitutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995)。特異性抗體的篩選和分離方法是本領(lǐng)域所公知的(見《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(Fundamental Immunology)，Paul編)，Raven Press，1993；Getzoff等，Adv.in Immunol.431-98，1988；《單克隆抗體原理與實(shí)踐》(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice)，Goding，J.W.(編)，Academic Press Ltd.，1996，Benjamin等，Ann.Rev.Immunol.267-101，1984)。這種分析方法的典型例子包括并行免疫電泳、放射性免疫分析、放射性免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、點(diǎn)印跡或蛋白印跡分析、抑制性或競(jìng)爭(zhēng)性分析以及夾心分析。免疫學(xué)方法和免疫分析方法的綜述見《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)》(Basic and Clinical Immunology)，(Stites & Terr編，第7版，1991)。
可通過(guò)α5β1結(jié)合的選擇過(guò)程制備本發(fā)明方法中使用的特異性結(jié)合的抗-α5β1抗體。通常，可選擇能特異性結(jié)合特定蛋白、或其多態(tài)性變體、等位基因、直向同源物、保守修飾變體、剪接變體的多克隆抗體，以獲得只與選定蛋白(例如α5β1整聯(lián)蛋白)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而不與其他蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的多克隆抗體。通過(guò)消減與其它分子交叉反應(yīng)的抗體，實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合的選擇?？刹捎枚喾N免疫分析模式來(lái)選擇與α5β1整聯(lián)蛋白多肽特異性反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫分析可用于選擇能與蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體(例如，參見Harlow & Lane，《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies，A LaboratoryManual)(1988)所描述的用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫分析形式和條件)。
抗體藥物偶聯(lián)物 在一些實(shí)施方式中，殺傷癌細(xì)胞的方法中可采用與效應(yīng)子部分偶聯(lián)的抗-α5β1抗體。效應(yīng)子部分可以是任何數(shù)量的分子，包括標(biāo)記部分如放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記，或優(yōu)選是治療性部分。效應(yīng)子部分(或“效應(yīng)子組分”)可與抗-5β1抗體通過(guò)接頭或化學(xué)鍵共價(jià)結(jié)合(或連接、偶聯(lián))，或通過(guò)離子鍵、范德華力、靜電作用或氫鍵非共價(jià)結(jié)合。
一方面，治療性部分是調(diào)節(jié)α5β1整聯(lián)蛋白活性的小分子。另一方面，治療性部分了影響與α5β1整聯(lián)蛋白結(jié)合或鄰近該整聯(lián)蛋白的分子或細(xì)胞的活性。例如，治療性部分可以是細(xì)胞毒劑。本文所用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”指能抑制或阻礙細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)包括放射性同位素(例如，I131、I125、Y90和Re186)，化療劑，毒素如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素或其片段。合適的毒素及其相應(yīng)片段包括白喉毒素A鏈、外毒素A鏈、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、依諾霉素、耳抑素(auristatin)(例如，耳抑素E或耳抑素F)等。使治療性部分靶向癌細(xì)胞表面表達(dá)的α5β1整聯(lián)蛋白不僅可以增加治療性部分在癌患區(qū)域的局部濃度，而且可以降低與這些治療性部分有關(guān)的不良副作用。
可用作本發(fā)明抗-α5β1抗體的治療性部分的化療劑的例子包括但不限于多柔比星、阿霉素、鹽酸阿霉素脂質(zhì)體(doxil)、表柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、環(huán)磷酰胺、塞替派、白消安、細(xì)胞毒素(cytoxin)、紫杉醇類如紫杉醇(TAXONTM，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多塞泰素(doxetaxel)(TAXOTERETM，Rhone-Poulenc Rorer)、泰索米(toxotere)、甲氨蝶呤、順鉑、美法侖、長(zhǎng)春堿、博來(lái)霉素、依托泊甙、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、卡鉑、替尼泊苷、柔紅霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、更生霉素、絲裂霉素、艾普霉素(esperamicins)(見美國(guó)專利4,675,187)、5-FU、6-硫鳥嘌呤、6-巰嘌呤、放線菌素D、VP-16、苯丁酸氮芥、美法侖以及其它有相關(guān)氮芥類。定義中還包括可用于調(diào)節(jié)或抑制腫瘤上激素作用的激素類藥，例如他莫昔芬和奧那司酮。
或者，可將上述化療劑與抗-α5β1抗體在同一制劑中(非偶聯(lián))一起給予患者，來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法。
癌癥適應(yīng)癥 本發(fā)明涉及通過(guò)用抗體靶向癌細(xì)胞表面上的α5β1整聯(lián)蛋白來(lái)殺傷癌細(xì)胞、抑制癌細(xì)胞增殖和/或代謝的方法。癌癥是一種生理疾病，一般特征為細(xì)胞不受調(diào)控地生長(zhǎng)。癌癥包括所有惡性腫瘤，包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病?？刹捎帽景l(fā)明方法靶向的細(xì)胞表面表達(dá)α5β1的癌癥的更多具體例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和脾臟癌。
腫瘤是缺乏正常生長(zhǎng)調(diào)控的細(xì)胞增殖物。腫瘤可以是良性或惡性的，可包括癌前細(xì)胞和組織、或癌性細(xì)胞和組織。癌細(xì)胞通常隨癌癥進(jìn)程而形成腫瘤。腫瘤生長(zhǎng)伴隨著血管密度增加。腫瘤新生血管提供腫瘤生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)。抗-血管新生抗體治療劑抗-α5β1和抗-VEGF(VEGF＝血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)在多種癌癥模型中具有阻礙腫瘤生長(zhǎng)的功效(例如，參見Kim等，J Clin Invest.，110(7)933-41(2002)；Ferrara，Nat Rev Cancer，2(10)795-803(2002))。體外試驗(yàn)及血管新生性眼病(例如，晚期黃斑變性；見2003年11月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/724,274，和2004年4月23日提交的10/830,956，其各自的內(nèi)容被納入本文作為參考)的兔和猴模型的體內(nèi)試驗(yàn)表明，抗-α5β1抗體M200能抑制血管新生。
本發(fā)明基于以下意外發(fā)現(xiàn)對(duì)于許多癌癥類型來(lái)說(shuō)，α5β1整聯(lián)蛋白在腫瘤上皮細(xì)胞表面表達(dá)(除腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞外)，抗體與該表面α5β1的靶向結(jié)合導(dǎo)致直接殺傷癌細(xì)胞。因此，即使不形成任何腫瘤血管，也可用抗-α5β1抗體治療和/或靶向特征為表達(dá)α5β1的上皮細(xì)胞增殖的癌癥。因?yàn)楣艉蜌┘?xì)胞的方法是直接的，所以適用于非常早期的治療(即實(shí)質(zhì)性腫瘤形成之前)。
那些最有可能受益于早期治療方法的患者包括但不限于1)腫瘤前診斷試驗(yàn)顯示發(fā)生和/或存在腫瘤(或微型腫瘤)的可能性高的患者；2)暴露于高強(qiáng)度致癌環(huán)境從而非?？赡馨l(fā)生腫瘤的患者；和3)發(fā)生癌細(xì)胞在其表面表達(dá)α5β1的癌癥的遺傳傾向高的對(duì)象。例如，具有乳腺癌遺傳傾向的患者(例如，BRCA基因陽(yáng)性)，或檢測(cè)到一些腫瘤前癌癥標(biāo)記的患者(例如，PCR檢測(cè)到微小轉(zhuǎn)移)將尤其適合于早期預(yù)防性直接殺傷癌細(xì)胞的方法，所述方法給予抗-α5β1抗體的藥物組合物。
表示癌癥遺傳傾向增加的基因，以及表示腫瘤發(fā)生可能性的腫瘤標(biāo)記見于癌癥生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中也列出了可大大增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)的致癌物及其暴露水平。普通技術(shù)人員可利用這些文獻(xiàn)資源以及與下述檢測(cè)癌細(xì)胞上α5β1整聯(lián)蛋白表達(dá)的公知方法來(lái)確定對(duì)象是否適用于本發(fā)明早期癌癥治療方法。如下面的實(shí)施例2所述，流式細(xì)胞術(shù)分析表明，α5β1整聯(lián)蛋白至少在來(lái)源于以下癌癥的細(xì)胞系表面表達(dá)膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和腎細(xì)胞癌。
而且，本發(fā)明直接殺傷癌細(xì)胞的方法尤其適用于治療表達(dá)α5β1但未證明易受抗-血管生成方法作用的癌癥。該類癌癥的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、纖維肉瘤、腎癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法可用于治療任何上述癌癥，其中，患者表現(xiàn)為難治性實(shí)體瘤?？?α5β1抗體M200(沃羅昔單抗)在患有各種表現(xiàn)為難治性實(shí)體瘤的人患者的治療中顯示一定效力，包括結(jié)腸直腸癌(CRC)、黑色素瘤(MEL)、腎細(xì)胞癌(RCC)、肝細(xì)胞癌(HCC)、肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腮腺癌(PARO)和乳腺癌(BC)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫組化法，利用抗-α5β1抗體(例如，IIA1或M200)探測(cè)腫瘤活檢樣品，以確定腫瘤上皮細(xì)胞表面表達(dá)α5β1的癌癥。如下面的實(shí)施例1所述，取自黑色素瘤、肺癌、腎癌、胰腺癌和乳腺癌患者的腫瘤活檢樣品的免疫組化(IHC)分析都表明，α5β1整聯(lián)蛋白在腫瘤上皮細(xì)胞上表達(dá)。合理地預(yù)測(cè)，利用IHC(或其它方法)可發(fā)現(xiàn)也有其它癌癥的腫瘤上皮細(xì)胞表面表達(dá)α5β1，認(rèn)為這些癌癥易受本發(fā)明直接殺傷癌細(xì)胞方法的作用。
除腫瘤樣品的IHC以外，還可利用抗-α5β1抗體及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)篩選細(xì)胞表面表達(dá)α5β1的癌細(xì)胞株。如下面的實(shí)施例2中所述，流式細(xì)胞術(shù)篩選揭示，21株公知的癌細(xì)胞株表面表達(dá)α5β1?；谏鲜鼋Y(jié)果，這些細(xì)胞株易受本發(fā)明方法用抗-α5β1抗體直接殺傷細(xì)胞的作用。而且，當(dāng)確定癌細(xì)胞株在其表面表達(dá)α5β1，且細(xì)胞株對(duì)應(yīng)于、來(lái)源于或衍生自癌癥患者的癌細(xì)胞時(shí)，那么可用本發(fā)明方法治療該患者。例如，實(shí)施例2中發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于乳腺癌腫瘤的NW231細(xì)胞株在其表面表達(dá)α5β1整聯(lián)蛋白。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可立即確認(rèn)，可根據(jù)本發(fā)明方法使用抗-α5β1抗體治療乳腺癌患者。
抗體的組合物、制劑和給藥 本發(fā)明方法中使用的抗-α5β1抗體可以分離或純化的形式應(yīng)用，并且與癌細(xì)胞或腫瘤直接接觸。純化抗-α5β1抗體(例如，IIA1、M200和F200)的方法公開于2003年11月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/724,274和2004年4月23日提交的10/830,956，其各自的內(nèi)容被納入本文作為參考。F200也可以是根據(jù)2004年6月5日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)60/583,127所述方法制備的Fab′-NAC片段，該申請(qǐng)的內(nèi)容被納入本文作為參考。F200-Fab′-NAC在抗體的液體制劑或凍干制劑中穩(wěn)定性增加。采用標(biāo)準(zhǔn)分析化學(xué)技術(shù)如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法確定純度和均一度。認(rèn)為占制劑絕大部分的抗體是基本純的。例如，在電泳凝膠中主要顯示一條帶的抗體溶液是基本純的。優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物中使用的抗體的純度至少為85％，更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少99％。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，實(shí)施直接殺傷癌細(xì)胞的方法，所述方法包括將純化的抗-α5β1抗體配制成藥物組合物，將治療有效量的該藥物組合物給予對(duì)象。本文所用“治療有效量”指足以治愈、緩解、減緩或至少部分阻滯癌癥和/或其癥狀和/或并發(fā)癥的藥物制劑或組合物的用量。確定用于治療癌癥的抗-α5β1抗體的治療有效量的臨床方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，可采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)測(cè)定。例如，在癌癥的治療過(guò)程中，“治療有效量”是能夠引起以下一種或多種效果的量(1)在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)，包括減緩生長(zhǎng)和完全阻滯生長(zhǎng)；(2)減少癌細(xì)胞的數(shù)量；(3)減小腫瘤大小；(4)抑制(即降低、減緩或完全阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)周圍器官；(5)抑制(即降低、減緩或完全阻止)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；(6)增強(qiáng)抗癌免疫反應(yīng)，可以但不一定能夠?qū)е履[瘤消退或退化；和/或(7)在一定程度上緩解疾病相關(guān)的一種或多種癥狀。
給予的藥物組合物通常包含溶解于藥學(xué)上可接受的載體或輔料，優(yōu)選水性載體中的抗-α5β1抗體。藥物組合物所用的可接受的載體、輔料或穩(wěn)定劑以使用劑量和濃度暴露于細(xì)胞或哺乳動(dòng)物時(shí)無(wú)毒性。生理學(xué)上可接受的載體的例子包括緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇和山梨糖醇；成鹽反離子，如鈉；和/或非離子表面活性劑，如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM?？墒褂枚喾N水性載體，例如，緩沖鹽水等。這些溶液應(yīng)無(wú)菌且通常不含不需要的物質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)公知滅菌技術(shù)滅菌藥物組合物。
藥物組合物也可按需包含藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以調(diào)節(jié)生理?xiàng)l件，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉和其它藥學(xué)上可接受的鹽，包括酸和堿加成鹽。藥物組合物還可包含一種或多種以下物質(zhì)載體蛋白，例如血清白蛋白；緩沖劑；填充劑，例如微晶纖維素、乳糖、玉米淀粉和其它淀粉；粘合劑；甜味劑和其它調(diào)味劑；著色劑；和聚乙二醇。這些制劑中抗體的濃度可顯著不同，主要根據(jù)所選擇的具體給藥模式和患者需要，基于液體體積、粘度、體重等進(jìn)行選擇(例如，《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Science)(第15版，1980)和Goodman &Gillman，《藥物的藥理學(xué)基礎(chǔ)》(The Pharmacologial Basis ofTherapeutics)(Hardman等編，1996))。
在本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方式中，將抗-α5β1抗體配制成藥物組合物，所述藥物組合物包含約1.0-15.0mg/mL抗體、約22-28mM檸檬酸鹽、約135-165mM氯化鈉、0.04％-0.06％聚山梨酯(TWEEN)80，pH5.5-7.5的溶液。優(yōu)選地，液體制劑的pH范圍約為pH6.0-7.0，最優(yōu)選約為pH6.3-6.7。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥物組合物包含約10.0mg/mL抗體、約25mM檸檬酸鹽、約150mM氯化鈉、約0.05％聚山梨酯(TWEEN)80，pH約6.5的溶液。在其它實(shí)施方式中，上述抗-α5β1抗體藥物組合物還包含化療劑，或與治療有效量的另一種化療劑一起給予患者。
優(yōu)選地，藥物組合物液體制劑是穩(wěn)定、無(wú)色或澄清-稍呈乳光的溶液，SEC-HPLC測(cè)定顯示不多于10％、優(yōu)選5％或更少的降解抗體單體。優(yōu)選地，觀察到不大于10％，優(yōu)選5％或更少的水解斷裂(clipping)，形成不大于10％，優(yōu)選5％或更少的抗體聚集體。優(yōu)選地，制劑的濃度、pH和滲透壓的改變不大于10％。效力為對(duì)照的70-130％，優(yōu)選80-120％。
可以多種方式將含抗-α5β1抗體的藥物組合物給予對(duì)象，包括但不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、局部、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、眼內(nèi)、心室內(nèi)或鞘內(nèi)。眾所周知，口服給藥時(shí)應(yīng)保護(hù)抗體以免消化。這通?？赏ㄟ^(guò)將分子與組合物復(fù)合以使其耐受酸和酶的水解作用，或通過(guò)將分子包封在合適的耐受載體如脂質(zhì)體或保護(hù)屏障中來(lái)實(shí)現(xiàn)。保護(hù)試劑以免消化的方式是本領(lǐng)域所公知的。
根據(jù)給藥方法，可以多種單位劑量形式給予藥物組合物。例如，適用于口服的單位劑量形式包括但不限于粉末劑、片劑、丸劑、膠囊和錠劑。
本發(fā)明方法的具體實(shí)施方式
中所采用的確切劑型取決于治療目的，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)公知技術(shù)確定(例如，Ansel等，“藥物劑型與藥物遞送(″Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery″)；Lieberman，“藥物劑型”(″Pharmaceutical Dosage Forms″)(第1-3卷，1992)，Dekker，ISBN0824770846，082476918X，0824712692，0824716981；Lloyd，“藥物化合物的領(lǐng)域、科學(xué)與技術(shù)”(″The Art，Science and Technology of PharmaceuticalCompounding″)(1999)；以及Pickar，“劑型計(jì)算”(″Dosage Calculations″)(1999))，如本領(lǐng)域所知，調(diào)節(jié)癌癥降級(jí)(degradation)、全身與局部遞送、新蛋白酶合成的速率、以及年齡、體重、總健康情況、性別、飲食、給藥時(shí)間、藥物相互作用和疾病嚴(yán)重性可能是(確定確切劑量)必需的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法確定它們。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，以每(kg)患者體重的抗體重量(mg)計(jì)，將含抗-α5β1抗體的藥物組合物給予患者。因此，優(yōu)選的劑量水平包括至少約0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg和15mg/kg。優(yōu)選地，將該劑量在1小時(shí)內(nèi)靜脈輸注給患者?？稍谘娱L(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)給予患者額外劑量，以在患者中建立穩(wěn)態(tài)血清濃度。例如，可在一年療程中每周給予10mg/kg輸液。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇抗-α5β1抗體劑量水平和方案，以確保該劑量產(chǎn)生的最大血清濃度低于猴(例如，短尾猴)中進(jìn)行的藥動(dòng)學(xué)研究所顯示的安全平均血清峰濃度。例如，在短尾猴中，50mg/kg劑量下，每周給藥4次后，M200的平均峰濃度為1862μg/mL(范圍1000-2606μg/mL)。在該血清濃度下未顯示對(duì)猴的毒性。此外，或者可選擇劑量，以使血清谷濃度大于＞1μg/mL，體外活性試驗(yàn)中，該濃度對(duì)α5β1與纖連蛋白結(jié)合的產(chǎn)生80％抑制。
根據(jù)本發(fā)明治療性殺傷癌細(xì)胞方法的一個(gè)實(shí)施方式，將含抗-α5β1抗體的藥物組合物以固定劑量，通常約為0.1-10毫克/患者/天靜脈內(nèi)給予患者。在將藥物組合物給予獨(dú)立(secluded)部位如體腔或器官內(nèi)腔而不是血流的實(shí)施方式中，可采用的固定劑量從0.1毫克直到約100毫克/患者/天。當(dāng)需要局部給藥時(shí)，劑量可能高得多。制備胃腸外給藥的組合物的實(shí)際方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Science)和Goodman&Gillman，《藥物的藥理學(xué)基礎(chǔ)》(The Pharmacologial Basis ofTherapeutics)，同上。
可給予本發(fā)明殺傷癌細(xì)胞方法中所采用的藥物組合物，作為治療或預(yù)防性治療的一部分。在治療性方法中，將藥物組合物給予已患有癌癥的患者，給予的量足以治愈、或至少部分地阻滯疾病及其并發(fā)癥的進(jìn)程。通常，在治療性治療過(guò)程中，可以腫瘤大小的減小或腫瘤生長(zhǎng)速率的降低來(lái)監(jiān)測(cè)治療過(guò)程。足以實(shí)現(xiàn)該作用的量被定義為“治療有效劑量”。對(duì)于此用途有效的量取決于癌癥的嚴(yán)重性和患者健康的總狀態(tài)。可根據(jù)劑型和患者耐受的頻率單次或多次給予藥物組合物。
早期治療方法涉及在懷疑發(fā)生癌癥的對(duì)象或在非常早期的癌癥患者中阻滯或減緩癌癥進(jìn)程。早期治療所需的具體劑量取決于患者的患病狀況和病史、要預(yù)防的具體癌癥、以及其它因素如年齡、體重、性別、給藥途徑、效率等。早期治療方法也可用作預(yù)防性治療，例如在以前患有癌癥的患者中防止癌癥復(fù)發(fā)，或在懷疑很可能發(fā)生癌癥的患者中用作預(yù)防性治療。例如，已檢測(cè)到一些腫瘤前癌癥標(biāo)記(例如，PCR檢測(cè)到微小轉(zhuǎn)移)、具有乳腺癌遺傳傾向的患者將尤其適用于早期治療方法。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可實(shí)施直接殺傷癌細(xì)胞的方法，其中除抗-α5β1抗體外，還給予化療劑。該實(shí)施方式中使用的典型的化療劑如上所述。這種組合療法尤其適用于當(dāng)患者沒有完全發(fā)病的癥狀時(shí)作早期、或預(yù)防性治療。在早期治療，或預(yù)防性治療中，許多患者可能無(wú)法忍受單獨(dú)使用標(biāo)準(zhǔn)化療劑時(shí)伴有的毒副作用。通過(guò)給予較低劑量標(biāo)準(zhǔn)化療劑與相對(duì)無(wú)毒的抗-α5β1抗體，可預(yù)防性或在非常早期治療癌癥，該給藥發(fā)案有效且患者更加耐受。
下面的實(shí)施例是為了解釋而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例 實(shí)施例1IHC檢測(cè)腫瘤樣品上的α5β1表達(dá) 免疫組化(IHC)測(cè)定取自黑色素瘤、肺癌、腎癌、胰腺癌和乳腺癌患者的腫瘤活檢樣品中α5β1整聯(lián)蛋白的表達(dá)。
材料與方法 將冷凍組織樣品(得自Mayo Clinic或Cleveland Clinic)冷凍在最佳切片溫度(OCT)化合物中，儲(chǔ)存于-70℃。將低溫恒溫組織切片(7μm)固定在75％丙酮/25％乙醇中1分鐘。將樣品與抗-α5β1小鼠抗體IIA1(5μg/ml)或?qū)φ招∈驣gG1(抗-三硝基苯基，ATCC雜交瘤克隆1B7.11)孵育30分鐘。采用生物素化第二抗體，山羊-抗-小鼠IgG(3μg/ml，30分鐘；Jackson ImmunoResearch)檢測(cè)抗體結(jié)合，并用Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Laboratories)和穩(wěn)定的DAB(二氨基聯(lián)苯胺和H2O2；Research Genetics)發(fā)色。在室溫下用DAKOAutostainer進(jìn)行染色。
結(jié)果 如表1所示，幾乎所有分析的腫瘤切片都對(duì)腫瘤血管上α5β1呈陽(yáng)性染色。令人驚訝的是，相當(dāng)比例的腫瘤樣品還顯示對(duì)腫瘤上皮本身上α5β1整聯(lián)蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性染色。這些結(jié)果表明，除侵入新生血管外，抗-α5β1抗體還可直接靶向癌細(xì)胞。
表1抗-α5β1抗體IIA1染色的腫瘤樣品的IHC結(jié)果 實(shí)施例2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)癌細(xì)胞系上的α5β1表達(dá) 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定24種癌細(xì)胞株中α5β1整聯(lián)蛋白的表達(dá)。如表2所示，24種細(xì)胞株來(lái)源于多種不同癌癥，包括膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎癌和脾臟癌。
材料與方法 用5mM EDTA的Tris-HCl(pH8.0)溶液取出細(xì)胞，在含3％熱滅活FBS、1％普通山羊血清(Sigma)和1％BSA的Hank平衡鹽溶液中4℃下離心5分鐘，以收集細(xì)胞。將細(xì)胞與小鼠抗-α5β1抗體、IIA1(10μg/ml)的FACS緩沖液(含0.1％BSA的PBS)在4℃下孵育30-60分鐘。離心除去過(guò)量的單克隆抗體，用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，然后重懸于PE-抗-小鼠IgG(H+L)抗體(SouthernBiotech，1∶400稀釋)中，4℃下保持30-60分鐘。洗滌后，將細(xì)胞重懸于含碘化丙錠(propidium iodide)(1μg/ml)的FACS緩沖液中。在FACSCalibur(BectonDickinson)上測(cè)定平均熒光強(qiáng)度(MFI)。背景MFI約為5。
結(jié)果 如表2所示，24種評(píng)價(jià)的細(xì)胞株中有21種觀察到明顯可檢測(cè)的α5β1整聯(lián)蛋白在表面表達(dá)。三株癌細(xì)胞株CHL-1、COLO 357和C32的MFI值非常接近背景，表明很少有或沒有α5β1整聯(lián)蛋白在表面表達(dá)。這21種表面表達(dá)α5β1整聯(lián)蛋白的細(xì)胞株易受抗-α5β1抗體的直接細(xì)胞殺傷作用。此外，衍生這些細(xì)胞株的癌癥也易受抗-α5β1抗體治療的作用。
表2用IIA1對(duì)多種癌細(xì)胞株進(jìn)行FACS分析的結(jié)果，以及用M200進(jìn)行體外增殖試驗(yàn)的結(jié)果。
nd1＝未檢測(cè) 22天而不是4天試驗(yàn)測(cè)定的生長(zhǎng)抑制百分比值 實(shí)施例3M200的體外癌細(xì)胞增殖抑制 在細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，在存在或不存在血清的情況下，評(píng)價(jià)28種癌細(xì)胞株對(duì)嵌合的抗-α5β1抗體M200的敏感性。
材料與方法 將癌細(xì)胞以密度2500細(xì)胞/孔接種于96-孔板中補(bǔ)充有或沒有10％FBS的IMDM中。種板時(shí)，用多種濃度的M200或非-功能阻斷(blocking)抗-α5抗體VC5刺激細(xì)胞。四天后，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，用CellTiter 96水性非放射性細(xì)胞增殖試驗(yàn)(Promega)評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。所有生長(zhǎng)研究以三復(fù)孔進(jìn)行至少3次。
結(jié)果 如表2所示，無(wú)血清情況下，M200抑制13種癌細(xì)胞株生長(zhǎng)，有血清情況下，抑制兩種細(xì)胞株。發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否有血清，兩種細(xì)胞株LOX和NW231對(duì)M200都敏感?；谶@些結(jié)果，產(chǎn)生這些細(xì)胞株的癌癥(黑色素瘤和乳腺癌)可能對(duì)M200治療有反應(yīng)。
實(shí)施例4在NW231和LOX異種移植模型中，體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞增殖 在SCID小鼠中，NW231和LOX細(xì)胞生長(zhǎng)為正位異種移植物，用抗-α5β1抗體M200和IIA1的腹膜內(nèi)注射刺激小鼠。
材料與方法 免疫缺陷小鼠CB-17SCID(C.B-Ighl/IcrTac-Prkdc品系)得自TaconicFarms(Germantown，NY)。采用6-10周齡雌性小鼠(體重約20克)開始研究。在將NW231(1×107細(xì)胞的IMDM懸液)接種于乳房脂肪墊1小時(shí)之前，腹膜內(nèi)注射10mg/kg M200、IIA1或?qū)φ誌gG以預(yù)處理動(dòng)物。以3次/周的頻率繼續(xù)給藥3周，劑量為10mg/kg。每周用卡尺測(cè)定腫瘤體積兩次，由π/6×長(zhǎng)×寬×高計(jì)算體積。根據(jù)IACUC規(guī)定，每天觀察臨床表現(xiàn)和死亡率。
結(jié)果 在該模型中，發(fā)現(xiàn)IIA1可重現(xiàn)性地抑制NW231和LOX異種移植瘤生長(zhǎng)。在這些模型中，未發(fā)現(xiàn)M200能重現(xiàn)性地抑制腫瘤生長(zhǎng)。由于IIA1不識(shí)別抑制異種移植瘤血管系統(tǒng)中的小鼠α5β1，IIA1對(duì)腫瘤的全部抑制作用可歸功于對(duì)腫瘤癌細(xì)胞的直接抗-增殖作用。
實(shí)施例5在NW231體內(nèi)異種移植模型中，聯(lián)用IIA1與DOXIL來(lái)防止腫瘤形成 進(jìn)行以下試驗(yàn)，來(lái)確定抗-α5β1整聯(lián)蛋白抗體IIA1與化療劑DOXIL聯(lián)用在體內(nèi)防止人NW231腫瘤形成中的效力。DOXIL是鹽酸阿霉素的脂質(zhì)體封裝制劑，鹽酸阿霉素是從波賽鏈霉菌(Streptomyces peucetius)分離得到的細(xì)胞毒性蒽環(huán)類抗生素。NW231細(xì)胞株來(lái)源于乳腺癌，認(rèn)為是研究乳腺癌治療的良好模型。
材料與方法 4-6周齡雌性SCID小鼠得自Taconic Farms并飼養(yǎng)在小型隔離籠中，將1×107NW231細(xì)胞接種于這些小鼠的乳房脂肪墊中。在腫瘤細(xì)胞接種時(shí)，第一次給動(dòng)物注射5mg/kg的TIB對(duì)照(n＝20)或M200(n＝20)。后續(xù)治療為每次注射0.7mg/kg。腫瘤細(xì)胞接種后5天開始DOXIL治療。第一次注射的化療劑劑量為4mg/kg，后續(xù)注射為2mg/kg。通過(guò)腹膜內(nèi)注射遞送試劑四次。每周測(cè)定腫瘤體積兩次，根據(jù)IACUC規(guī)定，每天觀察臨床表現(xiàn)和死亡率。
結(jié)果 小鼠中，IIA1治療顯示減緩NW231腫瘤形成的顯著療效。植入NW-231腫瘤24天后，對(duì)照TIB處理的異種移植瘤平均腫瘤體積以指數(shù)形式增加至約425立方毫米，而IIA1處理的異種移植瘤增加至平均體積約175立方毫米。
DOXIL治療本身也具有防止腫瘤形成的顯著療效。對(duì)于僅用DOXIL治療異種移植瘤來(lái)說(shuō)，在移植后最初45天期間，平均腫瘤體積起初僅增加至約25立方毫米，到74天時(shí)，逐漸增加至高達(dá)約275立方毫米。
與單獨(dú)治療相比，IIA1與doxil聯(lián)用治療小鼠對(duì)腫瘤形成速率的抑制作用甚至更高。對(duì)于IIA1加DOXIL治療的異種移植瘤來(lái)說(shuō)，54天時(shí)平均腫瘤體積保持約為0，74天時(shí)逐漸增加至僅僅約125立方毫米。這些結(jié)果表明，聯(lián)用抗-α5β1抗體IIA1和化療劑DOXIL的體內(nèi)療效(即，協(xié)同的腫瘤抑制作用)提高。
實(shí)施例6在VX2兔腫瘤模型中測(cè)定M200的效力 雖然M200不會(huì)與小鼠或大鼠α5β1整聯(lián)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，但它能識(shí)別兔中發(fā)現(xiàn)的α5β1整聯(lián)蛋白。因此，兔VX2癌可能是確定M200體內(nèi)直接殺傷癌細(xì)胞效力的優(yōu)良模型。VX2是用于研究各種部位原發(fā)性腫瘤治療的廣泛接受的兔模型(例如，參見Chen JG等，Lab Anim.2004年1月；38(1)79-84；Purdie，TG等，Phys Med Biol.2001年12月；46(12)3161-75)；Geschwind，JH等，CancerRes.2002年7月；62(1)3909-3913)。
A.M200VX2預(yù)試驗(yàn) 進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以確定在兔VX2腫瘤模型中進(jìn)行M200效力研究的一般參數(shù)。
腫瘤接種 第0天，用細(xì)胞懸浮液(100μl)皮下(左后肢)接種兔，以約3毫米的深度肌內(nèi)(右后肢)接種兔。肌內(nèi)接種過(guò)程如下所述。用氯胺酮/異氟烷麻醉兔子，在股骨軸的前側(cè)和外側(cè)(lateral aspect)上，離開股骨-骨盆(臀部)關(guān)節(jié)約1/3總股骨長(zhǎng)度，沿右股骨用解剖刀作約2厘米的切口。分離肌肉群，產(chǎn)生約0.5厘米深的洞。將來(lái)自供體動(dòng)物的一個(gè)VX2腫瘤片段置入該洞內(nèi)。用無(wú)菌外科肘釘(staple)或縫線牢固地閉合皮膚，并在傷口部位局部應(yīng)用抗生素。
腫瘤測(cè)定 第5天開始，通過(guò)連接便攜式計(jì)算機(jī)的電子游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤大小(長(zhǎng)、寬和高)，以毫米表示，最少每周測(cè)定兩次。為了一致，整個(gè)研究過(guò)程中由同一個(gè)受過(guò)訓(xùn)練的技術(shù)人員進(jìn)行腫瘤測(cè)定。采用公式長(zhǎng)×寬×高×0.52計(jì)算腫瘤體積。處死動(dòng)物后，小心地切下腫瘤，修剪并稱重。此外，動(dòng)物最少每周稱重一次。將各個(gè)腫瘤的代表性樣品保存于裝有福爾馬林或OCT的樣品盒中，快速冷凍在液氮中。
VX2腫瘤的體內(nèi)傳代 通過(guò)每月體內(nèi)傳代，維持預(yù)試驗(yàn)和M200效力研究中所用VX2腫瘤。各后肢肌內(nèi)接種細(xì)胞懸液(100μl)或腫瘤塊(約5-10立方毫米)。肉眼監(jiān)測(cè)動(dòng)物和腫瘤，在腫瘤直徑達(dá)到2厘米之前切除腫瘤，用于體內(nèi)傳代。通過(guò)處死動(dòng)物，取出腫瘤，加工成5-10立方毫米塊，以進(jìn)行體內(nèi)傳代。然后，將腫瘤塊重新植入下一組2只兔子中。
IHC分析M200處理兔的VX2腫瘤 以10mg/kg的劑量，將M200靜脈內(nèi)給予荷瘤兔，1小時(shí)后切下腫瘤。用以下物質(zhì)染色腫瘤切片(i)對(duì)腫瘤結(jié)合的M200特異的抗-人二抗；(ii)IIA1，然后是抗-小鼠二抗，以測(cè)定總的α5β1；或(iii)對(duì)照IgG和抗-小鼠二抗。
結(jié)果 通過(guò)IHC評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)靜脈內(nèi)注射M200可到達(dá)皮下腫瘤和肌內(nèi)腫瘤。染色切片的IHC分析表明，VX2腫瘤細(xì)胞和兔腫瘤血管系統(tǒng)中都存在高水平的α5β1表達(dá)。
B.M200VX2效力試驗(yàn) 基于預(yù)試驗(yàn)的IHC結(jié)果，使用VX2兔模型評(píng)價(jià)M200體內(nèi)效果。
方法 用VX2細(xì)胞懸液(100μl)或腫瘤塊(約5-10立方毫米)皮下或肌內(nèi)接種兔(共30只)。用10mg/kg的M200靜脈內(nèi)處理20只動(dòng)物的試驗(yàn)組，每周2次，持續(xù)3周。以與M200相同的方法遞送，用對(duì)照IgG處理10只動(dòng)物的對(duì)照組。根據(jù)上述預(yù)試驗(yàn)的方法，進(jìn)行腫瘤測(cè)定、終止、稱重、腫瘤保存和實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間。此外，每周從耳緣靜脈取1mL血液，用于血清分析。
結(jié)果 觀察到腫瘤生長(zhǎng)抑制與動(dòng)物中M200循環(huán)水平之間存在強(qiáng)相關(guān)性。通常，當(dāng)M200水平維持在50μg/mL或更高時(shí)，可抑制腫瘤生長(zhǎng)。由于M200對(duì)兔有免疫原性，早在給予M200后兩周時(shí)，一些試驗(yàn)組中的兔子就對(duì)M200發(fā)生免疫應(yīng)答，最終發(fā)現(xiàn)所有的動(dòng)物都發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。在產(chǎn)生抗-獨(dú)特型應(yīng)答導(dǎo)致M200清除(即第14天，M200＜50μg/mL)的試驗(yàn)組動(dòng)物中，觀察到腫瘤生長(zhǎng)得較大。因此，VX2癌模型觀察到的結(jié)果表明，在強(qiáng)效體內(nèi)腫瘤模型中，M200能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。
實(shí)施例7M200和IIA1在SCID小鼠VX2異種移植模型中的效力 如實(shí)施例6所述，M200在兔VX2癌模型中有效。在SCID小鼠VX2異種移植模型中進(jìn)一步測(cè)定M200和IIA1直接殺傷癌細(xì)胞的能力。因?yàn)镸200和IIA1不識(shí)別VX2移植瘤血管上的小鼠α5β1整聯(lián)蛋白，所以對(duì)VX2異種移植瘤生長(zhǎng)的任何抑制作用可歸功于M200和IIA1對(duì)VX2癌細(xì)胞的直接抗增殖作用。
材料與方法 免疫缺陷小鼠CB-17SCID(C.B-Ighl/IcrTac-Prkdc品系)得自TaconicFarms(Germantown，NY)。采用6-10周齡的雌性小鼠(體重約20克)進(jìn)行研究。在將VX2(1×107細(xì)胞的IMDM(Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基)懸液)接種于乳房脂肪墊1小時(shí)之前，腹膜內(nèi)注射10mg/kg M200、IIA1或?qū)φ誌gG預(yù)處理動(dòng)物。以3次/周的頻率繼續(xù)給藥3周，劑量為10mg/kg。每周用卡尺測(cè)定腫瘤體積兩次，由π/6×長(zhǎng)×寬×高計(jì)算。根據(jù)IACUC規(guī)定，每天觀察臨床表現(xiàn)和死亡率。
結(jié)果 與給予對(duì)照IgG的小鼠相比，M200或IIA1的劑量與VX2腫瘤生長(zhǎng)速率的降低或總的腫瘤大小縮小無(wú)關(guān)。這些結(jié)果提示，在小鼠異種移植瘤模型中，M200或IIA1都不能直接殺傷VX2細(xì)胞。
實(shí)施例8在患有難治性實(shí)體瘤的人患者中M200劑量逐步增加的I期臨床研究 A.概述 進(jìn)行兩部分開放式標(biāo)記的I期臨床試驗(yàn)，以在21位患有各種難治性實(shí)體瘤的人患者中確定用多達(dá)6種劑量水平(從0.5mg/kg到15.0mg/kg)的M200(沃羅昔單抗)的療效。第一部分總的治療持續(xù)時(shí)間為6周，最后一次給藥后進(jìn)行45天健康評(píng)價(jià)。第二部分是擴(kuò)展研究，對(duì)11位患者中在第一部分中顯示穩(wěn)定疾病響應(yīng)的6位患者繼續(xù)給予M200，長(zhǎng)達(dá)52周。
B.研究參數(shù)和方案 1.患者的選擇 選擇符合以下納入/排除標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行研究 a.常規(guī)計(jì)算機(jī)化斷層成像(CT)或磁共振成像(MRI)上具有至少一個(gè)可測(cè)定的損傷； b.估計(jì)生存期＞3個(gè)月；東部協(xié)作癌癥研究組(Eastern CollaborativeOncology Group)(ECOG)性能狀態(tài)＜2； c.無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤或轉(zhuǎn)移(頭部成像篩選記錄)； d.進(jìn)入前4周內(nèi)沒有進(jìn)行重大的外科手術(shù)； e.進(jìn)入前一周內(nèi)沒有進(jìn)行小型外科手術(shù)；進(jìn)入前4周內(nèi)沒有進(jìn)行化療、免疫治療或放療； f.無(wú)主動(dòng)出血障礙或血栓形成； g.無(wú)其它臨床上明顯或不穩(wěn)定的醫(yī)學(xué)病癥； h.過(guò)去已接受鼠或嵌合mAb治療的患者在抗-M200抗體(即交叉反應(yīng)性人-抗-鼠-抗體[HAMA]或人-抗-嵌合抗體[HACA])的篩選試驗(yàn)中應(yīng)為陰性。
共招募了22位患者進(jìn)行試驗(yàn)。這22位患者的腫瘤類型包括結(jié)腸直腸癌(4位患者；CRC)、黑色素瘤(4位患者；MEL)、腎細(xì)胞癌(3位患者；RCC)、食道癌(2位患者；EC)、肝細(xì)胞癌(2位患者；HCC)、肺癌(1位患者；NSCLC)、前列腺癌(1位患者；PRO)、甲狀腺癌(1位患者；THY)、胰腺癌(2位患者；PC)、腮腺癌(1位患者；PARO)和乳腺癌(1位患者；BC)。治療22位患者中的21位，21位治療患者中20位完成了所有5次給藥，以及隨訪至第45天。21位治療患者(12位男性，9位女性)的中位年齡為59歲(范圍29-81)，東部協(xié)作癌癥研究組(Eastern Collaborative Oncology Group)(ECOG)平均評(píng)分為1(范圍0-2)。
2.選擇M200劑量水平和方案 選擇劑量水平和方案，以確保最高劑量(15.0mg/kg)產(chǎn)生的最大血清濃度低于短尾猴顯示的安全的平均血清峰濃度，并且，劑量≥1.0mg/kg時(shí)血清谷水平的血清濃度＞1μg/mL，體外活性試驗(yàn)中該濃度可產(chǎn)生對(duì)α5β1與纖連蛋白結(jié)合的80％抑制。
本研究中采用的劑量水平和方案如下所述。第1、15、22、29和36天將M200給予21位患者。劑量水平和每個(gè)水平的患者數(shù)量為0.5mg/kg(1位患者)、1.0mg/kg(2位患者)、2.5mg/kg(3位患者)、5.0mg/kg(3位患者)、10.0mg/kg(6位患者)和15mg/kg(6位患者)。1小時(shí)內(nèi)以靜脈輸液形式給予上述劑量。第一和第二給藥間隔兩周，以獲得單劑量藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)的樣品。第一劑量后進(jìn)行實(shí)時(shí)PK測(cè)定，用于預(yù)測(cè)各患者在第五次給藥后的血清峰濃度。如果預(yù)測(cè)第五次給藥后血清峰濃度小于750μg/mL，則患者接受所有5次劑量的M200。剩下的3次給藥每周一次，然后進(jìn)行45-天評(píng)價(jià)。
基于上述給藥方案預(yù)測(cè)M200的人血清濃度，施用與短尾猴中觀察到的相同變化區(qū)間(即平均值的54％-140％)。人體中，最高劑量(15.0mg/kg)時(shí)，預(yù)測(cè)5次給藥后的平均峰濃度為592μg/mL，預(yù)測(cè)變化區(qū)間為320-829μg/mL。表3羅列了來(lái)自猴研究的PK數(shù)據(jù)，以預(yù)測(cè)人體中各劑量水平下，各劑量的血清峰濃度和谷濃度(分別為Cmax和Cmin)。
表3估計(jì)M200在人體中的血清峰濃度和谷濃度 a以μg/mL表示的值。
b計(jì)算第一次給藥后1周預(yù)測(cè)的值 根據(jù)上表，預(yù)測(cè)15.0mg/kg的最終半衰期約為13天，較低劑量的半衰期更短。預(yù)計(jì)劑量水平≥5.0mg/kg時(shí)，M200的血清蓄積顯著，劑量＜10.0mg/kg時(shí)，4周內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度，劑量＞10.0mg/kg時(shí)，5周內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度。
3.M200制劑與給藥 根據(jù)現(xiàn)行藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(current Good Manufacturing Practices(cGMP))制備生物試劑M200。本研究中使用的M200制劑組合物為10mg/mL M200、25mM檸檬酸鹽、150mM氯化鈉、0.05％聚山梨酯(TWEEN)80，pH6.5。該制劑是無(wú)菌、無(wú)色、澄清-稍呈乳光、不含防腐劑的液體，適合靜脈內(nèi)使用。填充每個(gè)20mL單次使用的小管，以遞送15mL 10.0mg/mL的M200。填充每個(gè)10mL一次性小管，以遞送10mL 10.0mg/mL的M200。將完整的小管儲(chǔ)存在2-8℃(36-46°F)的冰箱中，維持不凍結(jié)或搖動(dòng)。
制備后，如果在室溫下(25℃)儲(chǔ)存則6小時(shí)內(nèi)給予M200，如果在冰箱中(2-8℃)儲(chǔ)存則48小時(shí)內(nèi)給予。超過(guò)上述時(shí)間，則丟棄制備的溶液。
將患者體重(kg)乘以患者合適的劑量水平(mg/kg)，計(jì)算適合給予患者的M200劑量。采用患者在試驗(yàn)第1天給藥前的體重計(jì)算整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中的劑量。對(duì)于0.5mg/kg-10.0mg/kg劑量組的患者，以及15.0mg/kg劑量組中體重≤80kg的患者來(lái)說(shuō)，1小時(shí)內(nèi)以固定總體積120mL給藥。
雖然給予患者120mL稀釋的試驗(yàn)藥物，制備的輸液袋包含共150mL體積。另外30mL用于啟動(dòng)(prime)輸液線，而不是給予患者。因此，置于輸液袋中的試驗(yàn)藥物總劑量為患者劑量(即患者體重(kg)×劑量水平[mg/kg]×1.25)。通過(guò)加入注射用氯化鈉，USP(0.9％)，使輸液袋的總體積為150mL。
對(duì)于15.0mg/kg劑量組中體重＞80kg的患者來(lái)說(shuō)，1小時(shí)內(nèi)以固定總體積180mL給藥。雖然給予患者180mL稀釋的試驗(yàn)藥物，制備的輸液袋包含共210mL體積。另外30mL用于啟動(dòng)輸液線，而不是給予患者。因此，置于輸液袋中的試驗(yàn)藥物的總劑量為患者劑量(即患者體重(kg)×劑量水平[mg/kg]×1.167)。通過(guò)加入注射用氯化鈉，USP(0.9％)，使輸液袋的總體積為210mL。
預(yù)填充的輸液線直接連接患者靜脈入口(例如，肝素鎖(heparin lock))。采用輸液泵，1小時(shí)內(nèi)，以2mL/分鐘(或者，對(duì)于患者體重＞80kg的15.0mg/kg試驗(yàn)組來(lái)說(shuō)，速率為3mL/分鐘)的速率給患者輸液。
4.初步終點(diǎn)(Primary Endpoints)與副作用 研究終點(diǎn)包括最大耐受劑量、劑量-限制性毒性、安全性、免疫原性、藥動(dòng)學(xué)(PK)、單核細(xì)胞飽合(單核細(xì)胞表達(dá)α5β1受體)以及基于實(shí)體瘤響應(yīng)評(píng)價(jià)(RECIST)標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤響應(yīng)(見Therasse P等，“評(píng)價(jià)實(shí)體瘤治療響應(yīng)的新方法”(New guidelines to evaluate the response to treatment in solidtumors)，Journal ofthe National Carcer Institute，92(3)205-216(2000)，其內(nèi)容被納入本文作為參考)。
采用美國(guó)國(guó)立癌癥研究所(NCI)副作用的普通專業(yè)術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)(CommonTerminology Criteria)(CTCAE)，3.0版，進(jìn)行副作用分級(jí)。劑量-限制性毒性被定義為3級(jí)或4級(jí)副作用，排除預(yù)定住院治療和選擇的外科治療影響。合適地按照醫(yī)療監(jiān)測(cè)者和管理機(jī)構(gòu)的審查時(shí)，排除認(rèn)為與M200無(wú)關(guān)的3級(jí)或4級(jí)副作用。
研究期間的患者評(píng)價(jià)包括 a.篩選(進(jìn)入研究14天內(nèi))患者病史和身體檢查、ECOG性能狀態(tài)、常規(guī)化學(xué)情況(panel)、差異和血小板的全血計(jì)數(shù)(CBC)、敏感的C-反應(yīng)性蛋白(CRP)、用顯微鏡分析進(jìn)行尿液分析(UA/顯微)、心電圖(ECG)、胸部放射成像(CXR)、導(dǎo)向疾病的身體CT或MRI、給藥前48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行尿妊娠試驗(yàn)、凝血試驗(yàn)(凝血酶原[PT]和部分促凝血酶原激酶時(shí)間[PTT])、對(duì)已給予鼠抗體或嵌合抗體的患者檢測(cè)抗-M200抗體(即，檢測(cè)交叉反應(yīng)性HAMA或HACA)、對(duì)患有通常轉(zhuǎn)移至腦或CNS的腫瘤患者進(jìn)行頭部CT，以及，在一些患者中，進(jìn)行活組織檢查以評(píng)價(jià)腫瘤血管形成。
b.試驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)常規(guī)化學(xué)情況、尿酸鹽、血清淀粉酶、差異和血小板的CBC、UA/顯微。
c.根據(jù)一維(uni-dimensional)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，在用M200治療之前和之后，采用常規(guī)疾病導(dǎo)向的放射成像(例如，CT掃描)來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤響應(yīng)。根據(jù)其大小(具有最大直徑(LD)的病灶)以及對(duì)精確重復(fù)測(cè)定(通過(guò)成像技術(shù)或臨床觀察)的適用性來(lái)選擇靶病灶。對(duì)所有靶病灶的LD進(jìn)行加合計(jì)算，表示為基線總LD。使用基線總LD作為參照，以表征目標(biāo)腫瘤響應(yīng)。采用以下靶病灶的響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)估計(jì)最佳總響應(yīng) 完全響應(yīng)(CR)第一次記錄CR之后25-28天重復(fù)成像，證實(shí)所有靶病灶消失。
部分響應(yīng)(PR)第一次記錄PR之后25-28天重復(fù)成像，以基線總LD作為參照，證實(shí)靶病灶的總LD至少降低30％。
穩(wěn)定疾病(SD)以最小的總LD作為參照，既沒有滿足PR的足量縮小也沒有滿足PD的足量增大。
進(jìn)行性疾病(PD)以治療開始后記錄的最小總LD為參照，靶病灶的總LD增加至少20％或出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)新生病灶。
d.取血進(jìn)行血清PK測(cè)定、免疫原性分析(抗-M200抗體)、血管生長(zhǎng)因子、以及測(cè)定外周血單核細(xì)胞上結(jié)合和未結(jié)合的α5β1。
e.最后一次用M200治療后，從同意進(jìn)行此過(guò)程的患者(招募時(shí)不是必須同意)獲取3-毫米淺表腫瘤轉(zhuǎn)移的鉆孔活檢樣品并冷凍。采用該活檢標(biāo)本來(lái)評(píng)價(jià)M200治療后的腫瘤血管生成情況。
5.藥動(dòng)學(xué)測(cè)定 采用低濃度下第一個(gè)人的PK數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)高濃度下的人血清水平(如上所述)。正好在第一次給藥之前和之后、以及完成第一次給藥后4、24、48和168小時(shí)時(shí)，獲取用于測(cè)定M200濃度的血清。也可正好在每次后續(xù)輸液之前、結(jié)束時(shí)、完成后4小時(shí)獲取用于測(cè)定M200濃度的血清樣品。在下一次給藥之前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分離并等分分析這些樣品第一次給藥結(jié)束時(shí)、第一次給藥后168小時(shí)、正好在第2次、第3次、第4次、第5次給藥前(谷濃度)和給藥后(峰濃度)。ELISA測(cè)定M200血清水平。
對(duì)每位患者的M200血漿濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行PK分析。計(jì)算中包括以下參數(shù)峰濃度(Cmax)和谷濃度(Cmin)、末期半衰期(T1/2β)、血漿濃度時(shí)間曲線下面積(AUC)、清除率(CL)、分布容積(V)。對(duì)每個(gè)試驗(yàn)組的患者計(jì)算小結(jié)參數(shù)。還計(jì)算PK參數(shù)變化與給藥和時(shí)間的函數(shù)。
6.免疫原性 通過(guò)雙抗原橋接ELISA分析測(cè)定M200的免疫原性。治療前、第二次給藥之前、試驗(yàn)結(jié)束時(shí)、M200最后一次給藥后45天，從患者獲取抗-M200抗體的血清樣品。此外，如果給藥間隔≥2周，獲取抗-M200抗體的血清。儲(chǔ)存樣品并在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)測(cè)定M200抗體陽(yáng)性的樣品再次測(cè)定其中和M200抗體(的能力)。第一次給予M200之前，在已知暴露于鼠或嵌合單克隆抗體的患者中篩選存在抗-M200抗體的患者。
7.流式細(xì)胞術(shù)分析 外周血單核細(xì)胞上也表達(dá)整聯(lián)蛋白α5β1。為測(cè)定這些循環(huán)細(xì)胞上的α5β1位點(diǎn)被M200飽合時(shí)的劑量，在試驗(yàn)第1天第一次給藥之前、試驗(yàn)第2天、第8天、剛好在每次后續(xù)給藥之前、以及試驗(yàn)第43天，取外周血樣品。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定單核細(xì)胞上α5β1位點(diǎn)的飽合情況。利用CD14抗體鑒定單核細(xì)胞。通過(guò)加入標(biāo)記的抗-人IgG4，檢測(cè)單核細(xì)胞表面結(jié)合的M200。通過(guò)加入標(biāo)記的IIA1，檢測(cè)細(xì)胞上未占據(jù)(游離)的α5β1。還評(píng)價(jià)了表達(dá)α5β1的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比。
C.結(jié)果-劑量遞增試驗(yàn) 劑量高達(dá)15mg/kg時(shí)，患者能很好地耐受M200，且沒有觀察到劑量-限制性M200毒性。該試驗(yàn)的總響應(yīng)結(jié)果為11位患者是穩(wěn)定疾病(SD)，10位患者是進(jìn)行性疾病(PD)。表4顯示了根據(jù)劑量和患者腫瘤類型分類的響應(yīng)結(jié)果。
表4劑量與腫瘤類型的響應(yīng)結(jié)果 縮寫CRC＝結(jié)腸直腸癌；MEL＝黑色素瘤；RCC＝腎癌；EC＝食道癌；HCC＝肝細(xì)胞癌；NSCLC＝肺癌；PRO＝前列腺癌；THY＝甲狀腺癌；PC＝胰腺癌；PARO＝腮腺癌；BC＝乳腺癌；SD＝穩(wěn)定疾病；PD＝進(jìn)行性疾病 副作用的強(qiáng)度通常為輕度到中度，包括疲勞、惡心、便秘、頭痛和食欲減退。不存在劑量限制性嚴(yán)重副作用，或觀察者未發(fā)現(xiàn)與M200相關(guān)的嚴(yán)重副作用。發(fā)現(xiàn)0.5mg/kg和1.0mg/kg劑量水平下3位患者為抗-M200抗體陽(yáng)性，但不存在明顯的相關(guān)副作用。在較高劑量組中沒有患者為抗-M200陽(yáng)性。接受0.5mg/kg的那一位患者在第一次給藥后發(fā)熱，記錄為輸液反應(yīng)。然而，該患者能夠完成5次M200給藥，而沒有后續(xù)的發(fā)熱現(xiàn)象或其它輸液反應(yīng)跡象。
研究數(shù)據(jù)表明，M200具有非線性藥代動(dòng)力學(xué)。較高濃度下觀察到較慢的清除率，10mg/kg劑量水平下T1/2＝15.7天。此外，10mg/kg劑量下單核細(xì)胞飽合，第一次給藥2周后的平均谷濃度為82μg/mL，高于體外最低有效濃度2-3μg/mL。
D.結(jié)果-擴(kuò)展研究 11位產(chǎn)生穩(wěn)定疾病響應(yīng)或更好響應(yīng)的患者中6位參與了擴(kuò)展研究并繼續(xù)給藥。如下表5所示，6位患者中5位產(chǎn)生穩(wěn)定疾病(SD)響應(yīng)或更好響應(yīng)。15.0mg/kg劑量組中一位腎細(xì)胞癌(RCC)患者產(chǎn)生部分響應(yīng)。
表5擴(kuò)展研究結(jié)果 *包括劑量遞增研究的43天和擴(kuò)展研究的天數(shù)。
SD定義為穩(wěn)定≥16周(112天) 實(shí)施例9患有轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的人患者中，M200的開放性標(biāo)記II期臨床研究 A.概述 基于實(shí)施例8的I期臨床試驗(yàn)所顯示的M200的效力，進(jìn)行M200在治療人類患者中的效力的開放性標(biāo)記、多中心、單臂、2-階段研究。本研究的主要目的是評(píng)價(jià)M200在患有轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(RCC)患者中的效力(腫瘤響應(yīng))，如采用實(shí)體瘤響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)所定義(見上述實(shí)施例8的RECIST)。本研究的第二個(gè)目的是評(píng)價(jià)其它效力指標(biāo)(即，至疾病進(jìn)展時(shí)間和響應(yīng)持續(xù)時(shí)間)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)實(shí)施例8的I期臨床試驗(yàn)中初步評(píng)價(jià)的M200的安全性、免疫原性和PK參數(shù)。另一個(gè)探索性目的是測(cè)定血清和血漿中的可檢測(cè)生物標(biāo)記物。本研究在多達(dá)8個(gè)研究地點(diǎn)招募了多達(dá)40位患者。20位患者進(jìn)入該研究的階段1。如果證實(shí)4個(gè)月(16周)內(nèi)能夠觀察到一例完全響應(yīng)(CR)或部分響應(yīng)(PR)，或4個(gè)月時(shí)觀察到一例穩(wěn)定疾病(SD)，則招募另外20位患者(階段2)。30分鐘內(nèi)所有患者靜脈內(nèi)輸注給予M200(10mg/kg)，每隔一周一次，持續(xù)52周或直到疾病進(jìn)展(以先發(fā)生的為準(zhǔn))。最后一次給藥后45天或患者不能返回而導(dǎo)致提早結(jié)束時(shí)，該研究退出隨訪(exit visit)。最后一次給藥后3個(gè)月進(jìn)行隨訪。如果隨訪不可行，也可電話隨訪。最后一次給藥后6個(gè)月進(jìn)行長(zhǎng)期電話隨訪。
B.研究參數(shù)與方案 根據(jù)表6所列參數(shù)和方案進(jìn)行II期臨床研究 表6轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者中，II期臨床研究的參數(shù) 應(yīng)理解，上述實(shí)施例絕非用于限制本發(fā)明的范圍，而是示例性的目的。本說(shuō)明書所引用的所有出版物、登錄號(hào)序列和專利申請(qǐng)包括在此作為參考，如同各個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體且獨(dú)立地包括在此作為參考那樣。
權(quán)利要求
1.一種在患者中抑制癌細(xì)胞增殖的方法，其中，所述癌細(xì)胞在其表面表達(dá)α5β1整聯(lián)蛋白，所述方法包括給予患者治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括含有以下成分的液體制劑
約1.0-15mg/mL抗-α5β1抗體；
約22-27mM檸檬酸鹽；
約145-165mM氯化鈉；
約0.04-0.06％聚山梨酯(TWEEN)80；
且pH約為5.5-7.5。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體中和α5β1整聯(lián)蛋白的至少一種生物學(xué)活性。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗-α5β1抗體與M200抗體結(jié)合相同的α5β1整聯(lián)蛋白表位。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗-α5β1抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制M200與細(xì)胞表面表達(dá)的α5β1整聯(lián)蛋白的結(jié)合。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗-α5β1抗體選自M200、F200和IIA1。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制第二抗體與癌細(xì)胞表面上α5β1整聯(lián)蛋白的結(jié)合，其中，所述第二抗體包含選自SEQ IDNO2、4、6和8的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療有效量約為10mg/kg。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞選自乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和腎細(xì)胞癌細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌癥是腎細(xì)胞癌或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括將化療藥與所述抗體按順序或一起給予患者。
11.一種治療對(duì)象的表達(dá)α5β1的癌癥的方法，其中，所述對(duì)象還未發(fā)展成腫瘤，所述方法包括給予該對(duì)象治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括含有以下成分的液體制劑
約1.0-15mg/mL抗-α5β1抗體；
約22-27mM檸檬酸鹽；
約145-165mM氯化鈉；
約0.04-0.06％聚山梨酯(TWEEN)80；
且pH約為5.5-7.5。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗體與M200結(jié)合相同的α5β1整聯(lián)蛋白表位。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制M200與癌細(xì)胞表面表達(dá)的α5β1整聯(lián)蛋白的結(jié)合。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、纖維肉瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和脾臟癌。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌癥是腎細(xì)胞癌或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述治療有效量約為10mg/kg。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，還包括將化療劑與所述抗體按順序或一起給予患者。
18.一種包括含有以下成分的液體制劑的藥物組合物
約1.0-15mg/mL抗-α5β1抗體；
約22-27mM檸檬酸鹽；
約145-165mM氯化鈉；
約0.04-0.06％聚山梨酯(TWEEN)80；
且pH約為5.5-7.5。
19.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其特征在于，所述抗-α5β1抗體的濃度約為10mg/mL。
20.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其特征在于，所述抗-α5β11抗體是M200。
21.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其特征在于，所述抗-α5β1抗體是M200。
22.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物還包含化療劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了采用抗－α5β1抗體直接殺傷癌細(xì)胞的方法。通常，該方法包括將在其表面表達(dá)α5β1的癌細(xì)胞與抗－α5β1抗體接觸，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。本發(fā)明方法可用于癌癥發(fā)生早期的患者，以防止腫瘤形成。此外，該方法還可用于治療已形成的腫瘤，尤其是尚未證實(shí)易受抗－血管新生療法作用的癌癥?？梢钥梗?β1抗體與癌癥化療劑或其它分子基癌癥治療劑的聯(lián)合療法的形式應(yīng)用該方法。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1933851SQ20058000946
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者V·蘭馬克里斯南, V·巴斯卡, S·侯, R·默里, D·勞 申請(qǐng)人:Pdl生物制藥股份有限公司