專利名稱：使用喹唑啉酮類化合物的方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為有絲分裂驅(qū)動蛋白KSP之抑制劑的喹唑啉酮衍生物，其可用于治療細胞增殖性疾病，如癌癥、增生、再狹窄、心肥大、免疫疾病、以及炎癥。
背景技術(shù)：
隨著20世紀50年代早期由一種以抗瘧性質(zhì)而為人所熟知的亞洲植物中分離出的喹唑啉生物堿--3-[β-酮基-γ-(3-羥基-2-哌啶基)-丙基]-4-喹唑酮結(jié)構(gòu)的闡明，刺激了喹唑啉衍生物的醫(yī)藥化學的發(fā)展。在尋求其他抗瘧藥的過程中，已合成了各種經(jīng)取代的喹唑啉類化合物。其中特別重要的是合成了2-甲基-3-鄰甲苯基-4-(3H)-喹唑啉酮衍生物。該化合物也稱為甲喹酮，雖然對原蟲無效，但發(fā)現(xiàn)是一種強效的安眠藥。
因為甲喹酮的引入以及其作為安眠藥的發(fā)現(xiàn)，人們已經(jīng)開始研究喹唑啉酮及其相關(guān)化合物的藥理活性?，F(xiàn)已知喹唑啉酮及其衍生物具有廣泛的不同生理性質(zhì)，其中包括安眠、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗痙攣、鎮(zhèn)咳、以及抗炎活性。
已被描述有具體的生物應用的喹唑啉酮衍生物包括第5,147,875號美國專利，其公開了具有支氣管擴張活性的2-(取代苯基)-4-氧代喹唑啉。第3,723,432、3,740,442和3,925,548號美國專利描述了一類可用作抗炎藥物的1-取代-4-芳基-2(1H)-喹唑啉酮衍生物。歐洲專利公布EP 0 056 637 B1公開了一類用于治療高血壓的4(3H)-喹唑啉酮衍生物。歐洲專利公布EP 0 884 319 A1描述了喹唑啉-4-酮衍生物的藥物組合物，其可用于治療神經(jīng)變性疾病、精神性疾病、以及藥物和酒精誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
喹唑啉酮類藥物是用于治療細胞增殖性疾病(包括癌癥)的眾多藥物中的一種。例如，PCT WO96/06616公開了包含喹唑啉酮衍生物的藥物組合物，其用于抑制血管平滑肌細胞增殖。PCT WO 96/19224使用了該相同的喹唑啉酮衍生物來抑制mesengial細胞增殖。第4,981,856、5,081,124和5,280,027號美國專利描述了喹唑啉酮衍生物抑制胸苷酸合成酶的應用，所述酶催化脫氧尿苷單磷酸的甲基化，產(chǎn)生DNA合成所必需的胸腺嘧啶核苷單磷酸。第5,747,498和5,773,476號美國專利描述了用于治療以酪氨酸受體激酶之過度活性或者不適當活性為特征的癌癥的喹唑啉酮衍生物。第5,037,829號美國專利公開了(1H-吡咯-1-基甲基)取代的喹唑啉化合物，其用于治療在上皮細胞中發(fā)生的癌。PCT WO98/34613描述了包含喹唑啉酮衍生物的組合物，其用于減弱新血管形成以及治療惡性腫瘤。第5,187,167號美國專利公開了包含喹唑啉-4-酮衍生物的藥物組合物，其具有抗腫瘤活性。
其他用于治療癌癥的治療劑包括紫杉烷和長春花生物堿。紫杉烷和長春花生物堿作用在微管上，該微管存在于各種細胞結(jié)構(gòu)中。微管是有絲分裂紡錘體的初級結(jié)構(gòu)成分。有絲分裂紡錘體負責基因組的復制模板向細胞分裂所產(chǎn)生的兩個子細胞之一中的分布。假設(shè)這些藥物對有絲分裂紡錘體的破壞導致對癌細胞分裂的抑制，并誘發(fā)癌細胞死亡。然而，微管形成其他類型的細胞結(jié)構(gòu)，包括用于神經(jīng)過程的細胞內(nèi)輸送的軌道。因為這些藥物不會特異性地靶向有絲分裂紡錘體，所以也產(chǎn)生一些副作用，限制了它們的應用。
提高癌癥治療藥物的特異性是相當令人感興趣的，這是因為如果能夠降低與給藥這些藥物相關(guān)的副作用，可實現(xiàn)更高的治療益處。傳統(tǒng)上，癌癥治療中的巨大提高是與鑒別出通過新機理作用的治療劑有關(guān)的。這其中的例子不僅包括紫杉烷，而且還包括作為拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的喜樹堿類藥物。由這兩類藥物來看，有絲分裂驅(qū)動蛋白對于新的抗癌藥物是非常有吸引力的。
有絲分裂驅(qū)動蛋白是有絲分裂紡錘體形成及功能所必需的酶，但通常并不是其他微管結(jié)構(gòu)的一部分，例如在神經(jīng)過程中。有絲分裂驅(qū)動蛋白在有絲分裂的所有階段都起到基本的作用。這些酶是將ATP水解所釋放的能量轉(zhuǎn)化為驅(qū)動細胞貨位沿微管方向移動的機械力的“分子發(fā)動機”。足以完成該任務的催化域是一個約340個氨基酸的緊密結(jié)構(gòu)。在有絲分裂期間，驅(qū)動蛋白將微管組裝成有絲分裂紡錘體的雙極結(jié)構(gòu)。驅(qū)動蛋白介導染色體沿紡錘體微管的移動，以及有絲分裂紡錘體中與有絲分裂特殊階段相關(guān)的結(jié)構(gòu)變化。有絲分裂驅(qū)動蛋白功能的實驗干擾導致有絲分裂紡錘體的畸形或者功能障礙，經(jīng)常使細胞休止和細胞死亡。
KSP是已鑒別出的有絲分裂驅(qū)動蛋白中的一種。KSP屬于進化保守型驅(qū)動蛋白亞族的正端方向(plus end-directed)的微管運動原，其組裝成由反平行同型二聚體組成的雙極同型四聚體。在有絲分裂期間，KSP與有絲分裂紡錘體的微管結(jié)合。在人細胞中微量注射針對KSP的抗體，可在細胞分裂的前中期期間防止紡錘極分開，產(chǎn)生單極紡錘體，而且導致有絲分裂停止，并誘發(fā)程序細胞死亡。KSP以及相關(guān)的驅(qū)動蛋白在其他非人類的生物中使反平行的微管成束，并使它們相互之間滑動，由此迫使兩個紡錘極分開。KSP也可介導分裂后期B紡錘體的拉長以及紡錘極處微管的聚焦。
已有人描述了人KSP(也稱為HsEg5)[Blangy等人，Cell，831159-69(1995)；Whitehead等人，Arthritis Rheum.，391635-42(1996)；Galgio等人，J.Cell Biol.，135339-414(1996)；Blangy等人，J.Biol.Chem.，27219418-24(1997)；Blangy等人，Cell Motil Cytoskeleton，40174-82(1998)；Whitehead和Rattner，J.Cell Sci.，1112551-61(1998)；Kaiser等人，JBC 27418925-31(1999)；GenBank accession numbersX85137，NM004523和U37426]，以及KSP基因的片段(TRIP5)[Lee等人，Mol Endocrinol.，9243-54(1995)；GenBank accession number L40372]。已有人描述了非洲爪蟾屬KSP同系物(Eg5)、以及果蠅屬KLP61F/KRP130。
有絲分裂驅(qū)動蛋白是發(fā)現(xiàn)和研制新型有絲分裂化學治療劑的有用目標。因此，本發(fā)明的目的是提供用于抑制有絲分裂驅(qū)動蛋白KSP的方法及組合物。
發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)如上所述的目的，本發(fā)明提供可用于治療細胞增殖性疾病的組合物及方法。該組合物是KSP抑制劑、特別是人KSP抑制劑。
在一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療細胞增殖性疾病、治療與KSP驅(qū)動蛋白活性相關(guān)的疾病、以及抑制KSP驅(qū)動蛋白的方法。該方法使用選自于以下組中的化合物
其中R1選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、以及取代烷基雜芳基；R2和R2′獨立地選自于氫、烷基、氧雜烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、以及取代烷基雜芳基；或者R2和R2′一起形成3-7元環(huán)；R3選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、氧雜烷基、氧雜烷基芳基、取代氧雜烷基芳基、氧雜烷基雜芳基、取代氧雜烷基雜芳基、R15O-和R15-NH-；R3′選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、和R15-NH-；Rx3″選自于烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、和取代烷基雜芳基；R4選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、和R16-亞烷基；R5、R6、R7和R8獨立地選自于氫、烷基、烷氧基、鹵素、氟代烷基、硝基、氰基、二烷基氨基、烷基磺?；?、烷基氨磺?；被酋；榛被酋；蓟?、烷硫基、羧基烷基、羧酰胺基、氨基羰基、芳基和雜芳基；R15選自于烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、和取代烷基雜芳基；R16選自于烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、N-雜環(huán)基、以及取代N-雜環(huán)基。
可用本發(fā)明的化合物治療的疾病包括癌癥、增生、再狹窄、心肥大、免疫疾病和炎癥，特別是癌癥、增生、再狹窄、和心肥大，尤其是癌癥。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于抑制KSP驅(qū)動蛋白的化合物。該化合物具有如上所示的結(jié)構(gòu)。
另外，本發(fā)明還提供用于篩選結(jié)合KSP驅(qū)動蛋白的化合物的方法，例如替換本發(fā)明化合物的結(jié)合或者與本發(fā)明的化合物的結(jié)合進行競爭的化合物。該方法包括混合本發(fā)明的化合物、KSP驅(qū)動蛋白、以及至少一種候選藥物，然后測定候選生物活性藥物對KSP驅(qū)動蛋白的結(jié)合。
在又一個方面中，本發(fā)明提供用于篩選KSP驅(qū)動蛋白活性調(diào)節(jié)劑的方法。該方法包括混合本發(fā)明的化合物、KSP驅(qū)動蛋白、以及至少一種候選藥物，然后測定候選生物活性藥物對KSP驅(qū)動蛋白活性的作用。
圖1描述了本發(fā)明化合物的總合成方法。
圖2描述了喹唑啉酮KSP抑制劑的合成路線。
圖3描述了喹唑啉酮KSP抑制劑的代表性化學結(jié)構(gòu)。
圖4描述了基本上純的單一對映體的合成路線。
圖5描述了磺酰胺(5a)、氨基甲酸酯(5b)、脲(5c)和胺(5d)的合成路線。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及一類新的化合物，其基于喹唑啉酮結(jié)構(gòu)母核，而且是有絲分裂驅(qū)動蛋白的調(diào)節(jié)劑。通過抑制或者調(diào)節(jié)有絲分裂驅(qū)動蛋白，但不是其他的驅(qū)動蛋白(如轉(zhuǎn)運驅(qū)動蛋白)，可以實現(xiàn)對細胞增殖的特異性抑制作用。因此，本發(fā)明就是利用了以下發(fā)現(xiàn)干擾有絲分裂驅(qū)動蛋白的功能可導致有絲分裂紡錘體的畸形或者功能障礙，通常導致細胞周期休止和細胞死亡。抑制人KSP驅(qū)動蛋白的方法包括使本發(fā)明的抑制劑與KSP驅(qū)動蛋白接觸、特別是人KSP驅(qū)動蛋白，包括KSP的片段和變體。該抑制作用可以是KSP驅(qū)動蛋白的ATP水解活性和/或有絲分裂紡錘體形成活性中的一個，使得有絲分裂紡錘體被破壞。減數(shù)分裂紡錘體也可被破壞。
本發(fā)明的目的是研制出有絲分裂驅(qū)動蛋白、特別是KSP的抑制劑和調(diào)節(jié)劑，以治療與細胞增殖作用有關(guān)的疾病。傳統(tǒng)上，癌癥(一種細胞增殖性疾病)治療中的巨大提高是與鑒別出通過新機理作用的治療劑有關(guān)的。這其中的例子不僅包括似乎對微管形成產(chǎn)生作用的紫杉烷，而且還包括作為拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的喜樹堿類藥物。本發(fā)明的化合物和方法的區(qū)別在于它們的選擇性，而且優(yōu)選用于治療增殖細胞的疾病，包括但不限于癌癥、增生、再狹窄、心肥大、免疫疾病、以及炎癥。
因此，本發(fā)明涉及使用以下式之喹唑啉酮衍生物的方法，式1a的喹唑啉酮酰胺 式1b的喹唑啉酮磺酰胺
式1c和1d的喹唑啉酮胺 其中R1選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、以及取代烷基雜芳基；R2和R2′獨立地選自于氫、烷基、氧雜烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、以及取代烷基雜芳基；或者R2和R2′一起形成3-7元環(huán)；R3選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、氧雜烷基、氧雜烷基芳基、取代氧雜烷基芳基、氧雜烷基雜芳基、取代氧雜烷基雜芳基、R15O-和R15-NH-；R3′選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、和R15-NH-；R3″選自于烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、和取代烷基雜芳基；R4選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、和R16-亞烷基；R5、R6、R7和R8獨立地選自于氫、烷基、烷氧基、鹵素、氟代烷基、硝基、氰基、二烷基氨基、烷基磺酰基、烷基氨磺酰基、氨磺?；榛?、氨磺?；蓟?、烷硫基、羧基烷基、羧酰胺基、氨基羰基、芳基和雜芳基；R15選自于烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、和取代烷基雜芳基；R16選自于烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、N-雜環(huán)基、以及取代N-雜環(huán)基。
以上的所有化合物都可用作驅(qū)動蛋白抑制劑，但并不是所有的化合物都是新的。具體而言，某些脲(如其中R3是R15-NH的化合物)公開在第5,756,502號美國專利中作為改變縮膽囊素作用的藥物。權(quán)利要求書中具體的例外反映了申請人希望避免要求保護那些雖然在功能上是本發(fā)明概念的一部分，但由于不關(guān)本發(fā)明的范圍而不能授予專利的主題。
定義術(shù)語“任選”或“任選地”是指隨后描述的事件或者情況有可能發(fā)生或者也可能不發(fā)生，而且該描述包括所述事件或情況發(fā)生以及不發(fā)生兩種情形。例如，“任選取代的烷基”如以下所述，是指“烷基”或者“取代烷基”。對于任何包含一個或者多個取代基的基團，本領(lǐng)域技術(shù)人員應認識到此等基團并不希望引入任何立體上和/或合成中都不可行取代基或者取代模式(如取代烷基包括任選取代的環(huán)烷基，該基團又潛在地包括任選取代的烷基)。
烷基包括線性、分枝或者環(huán)狀烴結(jié)構(gòu)以及它們的組合。低級烷基是指具有1-5個碳原子的烷基。低級烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基和叔丁基等。優(yōu)選的烷基是C20或者更低級的烷基。更優(yōu)選的烷基是C13或者更低級的烷基。環(huán)烷基是烷基以下的概念，并包括3-13個碳原子的環(huán)狀烴基。環(huán)烷基的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、降冰片基、金剛烷基等。在本發(fā)明中，烷基是指鏈烷基以及不飽和的鏈烯基和鏈炔基，其包括環(huán)己基甲基、乙烯基、烯丙基、異戊二烯基等。亞烷基是指與烷基相同但有兩個連接點的基團。亞烷基的例子包括亞乙基(-CH2CH2-)、1，3-亞丙基(-CH2CH2CH2-)、二甲基-1，3-亞丙基(-CH2C(CH3)2CH2-)、以及環(huán)己基-1，3-亞丙基(-CH2CH2CH(C6H13)-)。當烷基具有具體數(shù)目的碳原子時，也包括具有相同數(shù)目碳原子的所有幾何異構(gòu)體；因此，例如“丁基”就包括正丁基、仲丁基、異丁基、和叔丁基；“丙基”包括正丙基和異丙基(即、i-丙基)。
烷氧基是指通過氧原子連接在母體結(jié)構(gòu)上并具有1-8個碳原子的直鏈、支鏈、或者環(huán)狀構(gòu)型以及它們的組合。其例子包括甲氧基、乙氧基、異丙氧基、環(huán)丙基氧基、環(huán)己基氧基等。低級烷氧基是指包含1-4個碳原子的基團。
?；侵竿ㄟ^羰基官能團連接在母體結(jié)構(gòu)上并具有1-8個碳原子的直鏈、支鏈、或者環(huán)狀構(gòu)型以及它們的組合，可以是飽和、不飽和及芳香性的。?；械囊粋€或者多個碳原子可被氮、氧或硫置換，只要與母體結(jié)構(gòu)的連接點是羰基即可。其例子包括乙?；?、苯甲?；?、丙酰基、異丁酰基、叔丁氧基羰基、芐基氧基羰基等。低級?；侵赴?-4個碳原子的?；?。
芳基和雜芳基是指包含0-3個選自于O、N或S的雜原子的5-6元芳香環(huán)或者雜芳香環(huán)；包含0-3個選自于O、N或S的雜原子的9-10元二環(huán)芳香環(huán)系或者雜芳香環(huán)系；或者包含0-3個選自于O、N或S的13-14元三環(huán)芳香環(huán)系或者雜芳香環(huán)系。6-14元芳香碳環(huán)環(huán)系包括苯、萘、茚滿、1，2，3，4-四氫化萘、以及芴等。5-10元芳香雜環(huán)包括例如咪唑、吡啶、吲哚、噻吩、苯并吡喃酮、噻唑、呋喃、苯并咪唑、喹啉、異喹啉、喹喔啉、嘧啶、吡嗪、四唑和吡唑。
烷基芳基是指其中芳基通過烷基連接在母體結(jié)構(gòu)上的基團。其例子包括芐基、苯乙基、苯基乙烯基、苯基烯丙基等。氧雜烷基和氧雜烷基芳基是指其中一個或者多個亞甲基被氧置換的烷基和烷基芳基。氧雜烷基和氧雜烷基芳基的例子包括乙氧基乙氧基乙基(3，6-二氧雜辛基)、芐氧基甲基和苯氧基甲基；通常情況下，二醇醚如聚乙二醇也包括在該基團的范圍內(nèi)。烷基雜芳基是指其中雜芳基通過烷基連接在母體結(jié)構(gòu)上的基團。其例子包括呋喃基甲基、吡啶基甲基、嘧啶基甲基等。
雜環(huán)是指其中1-4個碳原子被諸如氧、氮或硫的雜原子置換的環(huán)烷基或者芳基。本發(fā)明范圍中包括的雜環(huán)的例子是咪唑啉、吡咯烷、吡唑、吡咯、吲哚、喹啉、異喹啉、四氫異喹啉、苯并呋喃、苯并二惡烷、苯并間二氧雜環(huán)戊烯(當作為取代基時，通常稱為亞甲二氧基苯基)、四唑、嗎啉、噻唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噻吩、呋喃、惡唑、惡唑啉、異惡唑、二惡烷、四氫呋喃等?！癗-雜環(huán)基”是指包含氮原子的雜環(huán)取代基。術(shù)語雜環(huán)基包括雜芳基，其是雜環(huán)基的下位概念。N-雜環(huán)基的例子包括4-嗎啉基、4-硫代嗎啉基、1-哌啶基、1-吡咯烷基、3-噻唑烷基、哌嗪基、和4-(3，4-二氫苯并惡嗪基)。取代雜環(huán)基的例子包括4-甲基-1-哌嗪基和4-芐基-1-哌啶基。
取代烷基、芳基和雜芳基是指其中一個或者多個氫原子被以下基團取代的烷基、芳基或雜芳基烷基、鹵素、羥基、烷氧基、亞烷基二氧基(如亞甲二氧基)、氟烷基、羧基(-COOH)、烷羰氧基(如?；趸鵕C(O)O-)、羧基烷基(如酯-C(O)OR)、羧酰胺基、氨磺?；榛?、氨磺?；蓟被驶?、芐氧基羰基氨基(CBZ-氨基)、氰基、羰基、硝基、伯氨基、仲氨基和叔氨基(如烷基氨基和二烷基氨基)和氨基亞烷基(aminoaklylene)、烷硫基、烷基亞硫酰基、烷基磺?；?、烷基氨磺?；⒎蓟蚧?、芳基亞硫?；?、芳基磺?；?、脒基、芳基(如苯基和芐基)、雜芳基、雜環(huán)基、苯氧基、芐氧基、或者雜芳基氧基。對于本發(fā)明，取代烷基還包括氧雜烷基，如其中一個或者多個碳已被氧置換的烷基。取代烷基芳基和取代氧雜烷基芳基是指其中亞烷基和芳基之一被取代或者兩者都被取代的基團。取代烷基雜芳基和取代氧雜烷基雜芳基是指其中亞烷基和雜芳基之一被取代或者兩者都被取代的基團。另外應注意的是，某些位置可包含兩個或者甚至三個取代基--R、R′和R″(如二乙基氨基和三氟甲基)。
鹵素是指氟、氯、溴或碘。氟、氯和溴是優(yōu)選的。二鹵代芳基、二鹵代烷基、三鹵代芳基等是指被多個但不一定是相同的鹵素取代的芳基和烷基，因此，4-氯-3-氟苯基也在二鹵代芳基的范圍中。
本發(fā)明的化合物大多數(shù)都包含一個或者多個不對稱中心(如連接在R2和R2′上的碳原子)，而且由此可產(chǎn)生對映體、非對映異構(gòu)體、以及可根據(jù)絕對立體化學定義的其他立體異構(gòu)體形式，如(R)-或(S)-。本發(fā)明包括所有可能的異構(gòu)體，包括外消旋混合物、光學純形式以及中間體混合物。旋光性(R)-和(S)-異構(gòu)體可通過使用手性合成子或者手性試劑來制備，或者通過使用常規(guī)技術(shù)來拆分。當本發(fā)明的化合物包含烯屬雙鍵或者其他幾何非對稱性中心時，除非另有說明，本發(fā)明的化合物應包括E和Z幾何異構(gòu)體。同樣，所有的互變異構(gòu)體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
當需要時，R-和S-異構(gòu)體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來拆分，例如形成可例如通過結(jié)晶分離的非對映異構(gòu)體鹽或者可絡合物；形成可例如通過結(jié)晶、氣—液或者液相色譜法分離的非對映異構(gòu)體衍生物；一種對映體與對映體特異性試劑的選擇性反應，例如酶氧化或者還原反應，然后分離改性或者未改性的對映體；在手性環(huán)境如在手性載體(如與手性配體結(jié)合的硅膠)上或者在手性溶劑存在下用氣—液或者液相色譜法?？梢岳斫獾氖?，當通過如上所述的分離方法之一將所需要的對映體轉(zhuǎn)化為其他化學物質(zhì)時，有可能需要其他的步驟以釋放所希望的對映體形式。或者，通過使用旋光試劑、底物、催化劑或者溶劑的非對稱性合成，或者通過非對稱轉(zhuǎn)化將一種對映體轉(zhuǎn)化為另一種對映體，可合成特異性對映體。由旋光性起始物進行合成的例子示于圖4中。
在一個實施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，兩個相鄰的R2基團可稠合在一起形成環(huán)結(jié)構(gòu)。而且，稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)可包含雜原子，并可被一個或者多個取代基“R”取代。另外應注意的是，對于環(huán)烷基(如飽和的環(huán)結(jié)構(gòu))，每個位置可包含兩個取代基--R和R′。
優(yōu)選實施方案對于結(jié)構(gòu)1a、1b、1c和1d，但主要是1a，在優(yōu)選的實施方案中，R1選自于氫、烷基、芳基、取代烷基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、烷基芳基和取代烷基芳基。
在更優(yōu)選的實施方案中，R1選自于氫、低級烷基、取代的低級烷基、芐基、取代芐基、苯基、萘基、和取代苯基。
在最優(yōu)選的實施方案中，R1選自于氫、乙基、丙基、甲氧基乙基、萘基、苯基、溴苯基、氯苯基、甲氧基苯基、乙氧基苯基、甲苯基、二甲基苯基、氯氟苯基、甲基氯苯基、乙基苯基、苯乙基、芐基、氯芐基、甲基芐基、甲氧基芐基、氰基芐基、羥基芐基、四氫呋喃基甲基和(乙氧基羰基)乙基。
在優(yōu)選的實施方案中，R2選自于氫、烷基、環(huán)烷基或者取代烷基。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解的是，結(jié)構(gòu)1a、1b、1c和1d在R2所連接的碳原子處具有潛在的手性中心。因此，R2位置可包含兩個取代基R2和R2′。R2和R2′基團可相同或者不同；如果不同，則化合物是手性的。當R2和R2′不同時，優(yōu)選的實施方案僅利用單個非氫R2。本發(fā)明包括使用純的對映體以及對映體的混合物，包括外消旋混合物，但在通常的情況下使用基本上光學純的對映體也是優(yōu)選的，特別是R對映體。
在更優(yōu)選的實施方案中，R2選自于氫、低級烷基和取代的低級烷基，而R2′是氫。在更優(yōu)選的實施方案中，R2選自于氫、甲基、乙基、丙基(特別是i-丙基)、丁基(特別是叔丁基)、甲硫基乙基、氨基丁基、(CBZ)氨基丁基、環(huán)己基甲基、芐氧基甲基、甲基亞硫?；一?、甲基亞硫?；谆⒘u甲基、芐基和吲哚基甲基。特別優(yōu)選的是其中R2為異丙基的R對映體。
在優(yōu)選的實施方案中，R3選自于烷基、取代烷基、烷基芳基、雜芳基、芳基、取代芳基、取代氧雜烷基芳基、R15O-和R15-NH-，而R15選自于烷基、芳基和取代芳基。
在更優(yōu)選的實施方案中，如果R3不是R15NH，則R3選自于C1-C13烷基；取代的低級烷基；芳基，包括苯基、聯(lián)苯基和萘基；被一個或者多個鹵素、低級烷基、低級烷氧基、硝基、羧基、亞甲二氧基或者三氟甲基取代的芳基(包括苯基)；芐基；苯氧基甲基；鹵代苯氧基甲基；苯基乙烯基；雜芳基；被低級烷基取代的雜芳基；以及芐氧基甲基。
在最優(yōu)選的實施方案中，如果R3不是R15NH，則R3選自于乙基、丙基、氯丙基、丁氧基、庚基、丁基、辛基、十三烷基、(乙氧基羰基)乙基、二甲基氨基乙基、二甲基氨基甲基、苯基、萘基、鹵代苯基、二鹵代苯基、氰基苯基、鹵(三氟甲基)苯基、氯苯氧基甲基、甲氧基苯基、羧基苯基、乙基苯基、甲苯基、聯(lián)苯基、亞甲二氧基苯基、甲基磺酰基苯基、甲氧基氯苯基、氯萘基、甲基鹵代苯基、三氟甲基苯基、丁基苯基、戊基苯基、甲基硝基苯基、苯氧基甲基、二甲氧基苯基、苯乙烯基、硝基氯苯基、硝基苯基、二硝基苯基、二(三氟甲基)苯基、芐氧基甲基、芐基、呋喃基、苯并呋喃基、吡啶基、吲哚基、甲基吡啶基、吡啶甲基、喹啉基、吡唑基、和咪唑基。
在更優(yōu)選的實施方案中，如果R3是R15NH-，則R15選自于低級烷基；環(huán)己基；苯基；以及被鹵素、低級烷基、低級烷氧基或者低級烷硫基取代的苯基。
在最優(yōu)選的實施方案中，如果R3是R15NH-，則R15是異丙基、丁基、環(huán)己基、苯基、溴苯基、二氯苯基、甲氧基苯基、乙基苯基、甲苯基、三氟甲基苯基或者甲硫基苯基。
在優(yōu)選的實施方案中，R4選自于烷基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、和R16-亞烷基，而R16選自于烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和N-雜環(huán)基。
在更優(yōu)選的實施方案中，R4選自于低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)己基；被羥基、低級烷氧基或者低級烷基取代的苯基；芐基；雜芳基甲基；雜芳基乙基；雜芳基丙基和R16-亞烷基，其中R16是氨基、低級烷基氨基、二(低級烷基)氨基、低級烷氧基、或者N-雜環(huán)基。
在最優(yōu)選的實施方案中，R4選自于甲基、乙基、丙基、丁基、環(huán)己基、羧基乙基、羧基甲基、甲氧基乙基、羥基乙基、羥基丙基、二甲基氨基乙基、二甲基氨基丙基、二乙基氨基乙基、二乙基氨基丙基、氨基丙基、甲基氨基丙基、2，2-二甲基-3-(二甲基氨基)丙基、1-環(huán)己基-4-(二乙基氨基)丁基、氨基乙基、氨基丁基、氨基戊基、氨基己基、氨基乙氧基乙基、異丙基氨基丙基、二異丙基氨基乙基、1-甲基-4-(二乙基氨基)丁基、(t-Boc)氨基丙基、羥基苯基、芐基、甲氧基苯基、甲基甲氧基苯基、二甲基苯基、甲苯基、乙基苯基、(氧代吡咯烷基)丙基、(甲氧基羰基)乙基、芐基哌啶基、吡啶基乙基、吡啶基甲基、嗎啉基乙基、嗎啉基丙基、哌啶基、氮雜環(huán)丁烷基甲基、氮雜環(huán)丁烷基丙基、吡咯烷基乙基、吡咯烷基丙基、哌啶基甲基、哌啶基乙基、咪唑基丙基、咪唑基乙基、(乙基吡咯烷基)甲基、(甲基吡咯烷基)乙基、(甲基吡咯烷基)丙基、(甲基哌嗪基)丙基、呋喃基甲基和吲哚基乙基。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，R5、R6、R7和R8選自于氫，鹵素(特別是氯和氟)，低級烷基(特別是甲基)，取代低級烷基(特別是三氟甲基)，低級烷氧基(特別是甲氧基)和氰基；更優(yōu)選是選自于氫和鹵素。對于各具體的取代基，進一步優(yōu)選的是R5是氫或者鹵素；R6是氫、甲基或者鹵素；R7是氫、鹵素、烷基(特別是甲基)、烷氧基(特別是甲氧基)或氰基；而R8是氫或者鹵素。進一步優(yōu)選的化合物是R5、R6、R7和R8中僅有一個不是氫，特別是R7。
在特別優(yōu)選的實施方案中，R1是芐基或者鹵代芐基；R2選自于乙基和丙基；R2′是氫；R3(或R3′或R3″)是取代苯基；R4是-(CH)mOH(其中m是2或3)或者-(CH2)p-R16(其中p是1-3，R16選自于氨基、丙基氨基、和氮雜環(huán)丁烷基)；R5是氫；R6是氫；R7是鹵素；R8是氫；而。
當主要考慮結(jié)構(gòu)1b的磺酰胺時，R1優(yōu)選選自于氫、低級烷基、取代的低級烷基、芐基、取代芐基、苯基和取代苯基；R2選自于氫和低級烷基，而R2′是氫；R3′選自于C1-C13烷基、苯基、萘基、被鹵素、低級烷基、低級烷氧基、硝基、亞甲二氧基或者三氟甲基取代的苯基、聯(lián)苯基和雜芳基；而R4選自于低級烷基、環(huán)己基、被羥基、低級烷氧基或者低級烷基取代的苯基、芐基、雜芳基甲基、雜芳基乙基、雜芳基丙基、雜芳基乙基、雜芳基丙基和R16-亞烷基，其中R16選自于二(低級烷基)氨基、(低級烷基)氨基、氨基、低級烷氧基、或者N-雜環(huán)基，特別是吡咯烷基、哌啶基或者咪唑基。
當主要考慮結(jié)構(gòu)1b的磺酰胺時，R1最優(yōu)選選自于低級烷基、芐基、取代芐基、和取代苯基；R2是氫或者低級烷基；R2′是氫；R3選自于取代苯基和萘基；R4是R16-亞烷基；R7是氫、氟、甲基或氯；R5、R6和R8是氫；而R16選自于二(低級烷基)氨基、(低級烷基)氨基、氨基、吡咯烷基、哌啶基、咪唑基和嗎啉基。
當主要考慮結(jié)構(gòu)1c和1d的胺時，R1優(yōu)選選自于氫、低級烷基、取代的低級烷基、芐基、取代芐基、苯基、萘基和取代苯基；R2選自于氫、低級烷基和取代的低級烷基；R2′是氫；R3″選自于C1-C13烷基、取代的低級烷基、苯基、萘基、被鹵素、低級烷基、低級烷氧基、硝基、亞甲二氧基或者三氟甲基取代的苯基、聯(lián)苯基、芐基和雜環(huán)基；而R4選自于低級烷基、環(huán)己基、被羥基、低級烷氧基或者低級烷基取代的苯基、芐基、取代芐基、雜環(huán)基、雜芳基甲基、雜芳基乙基、雜芳基丙基和R16-亞烷基，其中R16選自于二(低級烷基)氨基、(低級烷基)氨基、氨基、低級烷氧基、或者N-雜環(huán)基。
當主要考慮結(jié)構(gòu)1c和1d的胺時，R1最優(yōu)選選自于低級烷基、芐基、取代芐基和取代苯基；R2是氫或者低級烷基；R2′是氫；R3″選自于取代苯基、雜環(huán)基和萘基；R4選自于取代芐基、雜環(huán)基和R16-亞烷基；R6和R7選自于氫和鹵素；R5和R8是氫；而R16選自于二(低級烷基)氨基、(低級烷基)氨基、氨基、吡咯烷基、哌啶基、咪唑基和嗎啉基。當存在R3″(如在1d中)時，其最優(yōu)選選自于鹵代苯基、多鹵代苯基、甲苯基、二甲基苯基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、氰基苯基、三氟甲基苯基、三氟甲氧基苯基、二(三氟甲基)苯基、羧基苯基、叔丁基苯基、甲氧基羰基苯基、哌啶基和萘基。
鑒于以上所述，特別是在考慮到以下的測試數(shù)據(jù)時，本發(fā)明優(yōu)選的化合物、藥物組合物、制備方法及應用是以下取代基的組合排列(按優(yōu)選順序向下排列)1、式1a、1b、1c和1d(優(yōu)選式1a或1d)中，R1是氫、低級烷基、取代低級烷基、烷基芳基或者取代烷基芳基(優(yōu)選芐基或取代芐基)a、特別是R2和R2′所連接的立體中心是R構(gòu)型的，而且R2′是氫。
i、特別是R2為低級烷基(優(yōu)選乙基、異丙基、環(huán)丙基或叔丁基)。
1、最優(yōu)選地，R2是異丙基。
b、特別是R4為取代烷基(優(yōu)選伯氨基、仲氨基或叔氨基取代的低級烷基)。
i、最優(yōu)選地，R4為伯氨基低級烷基。
c、特別是R5、R6、R7和R8選自于氫、鹵素、低級烷基(優(yōu)選甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(優(yōu)選甲氧基)、和氰基。
i、優(yōu)選地，R5、R6和R8為氫。
1、更優(yōu)選地，R7是鹵素或氰基，特別是氟或氯，并最優(yōu)選為氯。
d、對于式1a和1d，特別是R3和R3″是芳基(優(yōu)選苯基)、取代芳基(優(yōu)選低級烷基或低級烷氧基取代的苯基)、烷基芳基(優(yōu)選芐基和苯基乙烯基)、烷基雜芳基、氧雜烷基芳基(優(yōu)選苯氧基低級烷基)、氧雜烷基雜芳基、取代烷基芳基(優(yōu)選取代芐基和取代苯基乙烯基)、取代烷基雜芳基、取代氧雜烷基芳基(優(yōu)選取代苯氧基低級烷基)、或者取代氧雜烷基雜芳基。
i、最優(yōu)選地，R3和R3″是芳基、取代芳基、低級烷基芳基或者取代低級烷基芳基。
2、式1a、1b、1c和1d中，R2和R2′所連接的立體中心是R構(gòu)型的，而且R2′是氫a、特別是R2為低級烷基(優(yōu)選乙基、異丙基、環(huán)丙基或叔丁基)。
i、最優(yōu)選地，R2是異丙基b、特別是R4為取代烷基(優(yōu)選伯氨基、仲氨基或叔氨基取代的低級烷基)。
i、最優(yōu)選地，R4為伯氨基低級烷基。
c、特別是R5、R6和R8為氫。
i、最優(yōu)選地，R7為氫、鹵素(特別是氯或氟)、低級烷基(特別是甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(特別是甲氧基)、或者氰基。
1、特別地，R7為氯。
3、式1a、1b、1c和1d中，R7為氫、鹵素(特別是氯或氟)、低級烷基(特別是甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(特別是甲氧基)、或者氰基。
a、特別地，R7為鹵素或氰基。
b、特別地，R5、R6和R8為氫i、最優(yōu)選地，R7為氯。
4、式1b或1c中，R4為取代烷基(優(yōu)選伯氨基、仲氨基或叔氨基取代的低級烷基，特別是伯氨基低級烷基)。
a、特別是R2和R2′所連接的立體中心為R構(gòu)型的，而且R2′是氫i、特別是R2為低級烷基(優(yōu)選乙基、異丙基、環(huán)丙基或叔丁基)。
1、最優(yōu)選地，R2是異丙基b、特別是R5、R6和R8為氫。
i、最優(yōu)選地，R7為氫、鹵素(特別是氯或氟)、低級烷基(特別是甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(特別是甲氧基)、或者氰基。
1、特別地，R7為氯。
本發(fā)明最優(yōu)選的化合物、藥物組合物、制備方法及應用是以下取代基的組合排列(按優(yōu)選順序向下排列)1、R1是烷基芳基或者取代烷基芳基(優(yōu)選芐基或取代芐基，最優(yōu)選芐基)a、特別是R2和R2′所連接的立體中心是R構(gòu)型的，而且R2′是氫。
i、特別是R2為低級烷基(優(yōu)選乙基、異丙基、環(huán)丙基或叔丁基)。
1、最優(yōu)選地，R2是異丙基。
b、特別地，R3是芳基(優(yōu)選苯基)、取代芳基(優(yōu)選低級烷基、低級烷氧基和/或鹵素取代的苯基)、烷基芳基(優(yōu)選芐基和苯基乙烯基)、烷基雜芳基、氧雜烷基芳基(優(yōu)選苯氧基低級烷基)、氧雜烷基雜芳基、取代烷基芳基(優(yōu)選取代芐基和取代苯基乙烯基)、取代烷基雜芳基、取代氧雜烷基芳基(優(yōu)選取代苯氧基低級烷基)、或者取代氧雜烷基雜芳基。
i、特別地，R3是芳基、取代芳基、低級烷基芳基、取代低級烷基芳基、氧雜(低級)烷基芳基1、最優(yōu)選的，R3是甲基和/或鹵素取代的苯基。
c、特別是R4為取代烷基(優(yōu)選伯氨基、仲氨基或叔氨基取代的低級烷基)。
i、特別地，R4為伯氨基低級烷基。
1、最優(yōu)選地，R4是3-氨基-正丙基。
d、特別是R5、R6、R7和R8選自于氫、鹵素(優(yōu)選氯和氟)、低級烷基(優(yōu)選甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(優(yōu)選甲氧基)、和氰基。
i、優(yōu)選地，R5、R6、R7和R8為氫、鹵素、低級烷基或氰基。
1、最優(yōu)選地，R5、R6和R8為氫a、更優(yōu)選地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
2、特別地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
2、R2和R2′所連接的立體中心是R構(gòu)型的，而且R2′是氫a、特別是R2為低級烷基(優(yōu)選乙基、異丙基、環(huán)丙基或叔丁基)。
i、最優(yōu)選地，R2是異丙基b、特別地，R3是芳基(優(yōu)選苯基)、取代芳基(優(yōu)選低級烷基、低級烷氧基和/或鹵素取代的苯基)、烷基芳基(優(yōu)選芐基和苯基乙烯基)、烷基雜芳基、氧雜烷基芳基(優(yōu)選苯氧基低級烷基)、氧雜烷基雜芳基、取代烷基芳基(優(yōu)選取代芐基和取代苯基乙烯基)、取代烷基雜芳基、取代氧雜烷基芳基(優(yōu)選取代苯氧基低級烷基)、或者取代氧雜烷基雜芳基。
i、特別地，R3是芳基、取代芳基、低級烷基芳基、取代低級烷基芳基、氧雜(低級)烷基芳基1、最優(yōu)選的，R3是甲基和/或鹵素取代的苯基。
c、特別是R4為取代烷基(優(yōu)選伯氨基、仲氨基或叔氨基取代的低級烷基)。
i、特別地，R4為伯氨基低級烷基。
1、最優(yōu)選地，R4是3-氨基-正丙基。
d、特別是R5、R6、R7和R8選自于氫、鹵素(優(yōu)選氯和氟)、低級烷基(優(yōu)選甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(優(yōu)選甲氧基)、和氰基。
i、優(yōu)選地，R5、R6、R7和R8為氫、鹵素、或低級烷基。
1、最優(yōu)選地，R5、R6和R8為氫a、更優(yōu)選地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
2、特別地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
3、R3是芳基(優(yōu)選苯基)、取代芳基(優(yōu)選低級烷基、低級烷氧基和/或鹵素取代的苯基)、烷基芳基(優(yōu)選芐基和苯基乙烯基)、烷基雜芳基、氧雜烷基芳基(優(yōu)選苯氧基低級烷基)、氧雜烷基雜芳基、取代烷基芳基(優(yōu)選取代芐基和取代苯基乙烯基)、取代烷基雜芳基、取代氧雜烷基芳基(優(yōu)選取代苯氧基低級烷基)、或者取代氧雜烷基雜芳基。
a、特別地，R3是芳基、取代芳基、低級烷基芳基、取代低級烷基芳基、氧雜(低級)烷基芳基i、最優(yōu)選的，R3是甲基和/或鹵素取代的苯基。
b、特別是R4為取代烷基(優(yōu)選伯氨基、仲氨基或叔氨基取代的低級烷基)。
i、特別地，R4為伯氨基低級烷基。
1、最優(yōu)選地，R4是3-氨基-正丙基。
c、特別是R5、R6、R7和R8選自于氫、鹵素(優(yōu)選氯和氟)、低級烷基(優(yōu)選甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(優(yōu)選甲氧基)、和氰基。
i、優(yōu)選地，R5、R6、R7和R8為氫、鹵素、低級烷基或氰基。
1、最優(yōu)選地，R5、R6和R8為氫a、更優(yōu)選地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
2、特別地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
4、R4為取代烷基(優(yōu)選伯氨基、仲氨基或叔氨基取代的低級烷基)。
a、特別地，R4為伯氨基低級烷基。
i、最優(yōu)選地，R4是3-氨基-正丙基。
b、特別是R5、R6、R7和R8選自于氫、鹵素(優(yōu)選氯和氟)、低級烷基(優(yōu)選甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(優(yōu)選甲氧基)、和氰基。
i、優(yōu)選地，R5、R6、R7和R8為氫、鹵素、低級烷基或氰基。
1、最優(yōu)選地，R5、R6和R8為氫a、更優(yōu)選地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
2、特別地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
5、特別是R5、R6、R7和R8選自于氫、鹵素(優(yōu)選氯和氟)、低級烷基(優(yōu)選甲基)、取代低級烷基、低級烷氧基(優(yōu)選甲氧基)、和氰基。
a、優(yōu)選地，R5、R6、R7和R8為氫、鹵素、低級烷基或氰基。
i、最優(yōu)選地，R5、R6和R8為氫1、更優(yōu)選地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
ii、特別地，R7是鹵素或氰基(最優(yōu)選是氯)。
本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物、藥物組合物、制備方法及應用是以下的式1a，其中R1是烷基芳基或取代烷基芳基(特別是芐基或取代芐基)，R2是低級烷基(特別是異丙基)，R2′是氫，R3是取代芳基(特別是甲基和/或鹵素取代的苯基)，R4是取代烷基(特別是3-氨基-正丙基)，R5、R6和R8是氫，R7是鹵素或氰基(特別是氯)，而且R2和R2′所連接的立體中心是R構(gòu)型的。
合成、測試及應用本發(fā)明的化合物如以下所示進行合成，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。例如，在Ager等人，J.of Med.Chem.，20379-386(1977)中描述的方法(該文獻在此并入作為參考)，喹唑啉酮類化合物可通過N-?；彴被郊姿崤c芳香伯胺的酸催化縮合反應來得到。制備喹唑啉酮類化合物的其他方法描述在第5,783,577、5,922,866和5,187,167號美國專利中，這些文獻的內(nèi)容在此并入作為參考。
本發(fā)明的化合物可如圖1、2、4和5中所示的方法來制備。式1d的化合物按照類似于圖1中的方法制備，但在最后步驟的酰鹵用烷基鹵化物替換。
制備后，本發(fā)明的化合物可用于各種應用中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，有絲分裂可通過多種方法來改變；也就是說，可通過增加或者降低有絲分裂途徑中的組分的活性來改變。不同的是，有絲分裂可通過抑制或者活化某些組分干擾其平衡來影響(如被破壞)。類似的方法也可用于改變減數(shù)分裂。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物用于調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體的形成，由此導致延長有絲分裂中細胞周期休止。在此所用術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指改變有絲分裂紡錘體的形成，包括增加或者降低紡錘體的形成。在此所用術(shù)語“有絲分裂紡錘體的形成”是指通過有絲分裂驅(qū)動蛋白將微管組合成雙極結(jié)構(gòu)。在此所用術(shù)語“有絲分裂紡錘體功能障礙”是指有絲分裂停止或者形成單極紡錘體。
本發(fā)明的化合物可用于與有絲分裂驅(qū)動蛋白--KSP結(jié)合和/或調(diào)節(jié)其活性。在優(yōu)選的實施方案中，KSP是人KSP，但也可使用來源于其他生物體的KSP驅(qū)動蛋白。在本發(fā)明中，“調(diào)節(jié)”是指增加或者降低紡錘極分離，導致有絲分裂紡錘極的畸形(如張開)，或者對有絲分裂紡錘體產(chǎn)生形態(tài)干擾。為此目的，KSP的定義中還包括KSP的變體和/或片段。參見1999年10月27日遞交的美國專利申請“Methods of Screening forModulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell ProliferationStates(篩選細胞增殖調(diào)節(jié)劑的方法以及診斷細胞增殖狀態(tài)的方法)”(申請?zhí)枮?9/428,156)，其內(nèi)容在此并入作為參考。另外，在本發(fā)明中也可使用其他的有絲分裂驅(qū)動蛋白。然而，本發(fā)明的化合物對于KSP具有特異性。
在活性測試中，KSP或者本發(fā)明的化合物非可擴散地結(jié)合在不溶性載體上，該載體具有分開的樣品接受區(qū)域(如微量滴定板、陣列(array)等)。不溶性載體可由任何本發(fā)明的化合物可結(jié)合于其上的材料制成，易于與可溶性材料分離，或者與總的篩選方法相配適。此等載體的表面可以是固體或者多孔性的，而且可以是任何形狀的。合適的不溶性載體的例子包括微量滴定板、陣列、膜和珠。這些材料通常是由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖、尼龍或者硝基纖維素、TeflonTM等制成。微量滴定板和陣列是特別方便的，因為使用少量的試劑和樣品可同時進行大量的測試。本發(fā)明化合物的具體結(jié)合方式不是關(guān)鍵性的，只要其與試劑以及本發(fā)明的總方法相匹配，保持化合物的活性而且不可擴散即可。優(yōu)選的結(jié)合方法包括使用抗體(當?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)合于載體上時，其不會立體地阻斷配體結(jié)合位點或者活化序列)，直接結(jié)合在“粘性”或者離子載體上，化學交聯(lián)，在表面上合成蛋白質(zhì)或藥物等。在結(jié)合蛋白質(zhì)或者藥物后，通過洗滌除去過量的未結(jié)合材料。樣品接受區(qū)域然后可通過與牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、或者其他接種蛋白或者其他物質(zhì)保溫而被阻斷。
本發(fā)明的抗有絲分裂劑可單獨使用以調(diào)節(jié)有絲分裂驅(qū)動蛋白、特別是KSP的活性。在該實施方案中，本發(fā)明的有絲分裂劑與KSP混合，然后分析KSP的活性。驅(qū)動蛋白活性在本領(lǐng)域中是已知的，而且包括一種或者多種驅(qū)動蛋白活性。驅(qū)動蛋白活性包括影響ATP水解的能力；微管結(jié)合；滑行以及聚合/解聚(對微管動力學的影響)；與紡錘體其他蛋白質(zhì)的結(jié)合；與細胞周期控制中涉及的蛋白質(zhì)結(jié)合；作為其他酶的底物；如激酶或者蛋白酶；以及特異性的驅(qū)動蛋白細胞活性如紡錘極分離。
進行分析的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的(例如參見Hall等人(1996)，Biophys.J.，713467-3476；Turner等人，1996，AnalBiochem.242(1)20-5；Gittes等人，1996，Biophys.J.70(1)418-29；Shirakawa等人，1995，J.Exp.Biol 1981809-15；Winkelmann等人，1995，Biophys.J.682444-53；Winkelmann等人，1995，Biophys.J.6872S)。
也可使用本領(lǐng)域中已知的測定ATP酶水解活性的方法。優(yōu)選地，使用以溶液為基礎(chǔ)的實驗。于1999年5月18日遞交的第09/314,464號美國專利申請(其內(nèi)容在此并入作為參考)描述了此等實驗?；蛘?，使用常規(guī)的方法。例如，可對驅(qū)動蛋白中的Pi釋放進行定量。在一個優(yōu)選的實施方案中，ATP酶水解活性實驗使用0.3M的PCA(高氯酸)和孔雀綠試劑(8.27mM鉬(II)酸鈉、0.33mM的孔雀綠草酸鹽、以及0.8mM的TritonX-100)。在進行該實驗時，10μl的反應物在90μl的冷0.3M PCA中淬滅。使用磷酸鹽標準物，所以可將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為mM所釋放的無機磷酸鹽。當所有的反應物和標準物都已在PCA中淬滅時，在例如微量滴定板的相關(guān)孔中添加100μl的孔雀綠試劑。使混合物顯色10-15分鐘，然后讀取板在650nm處的吸光度。如果使用磷酸鹽標準物，則可將吸光度讀數(shù)轉(zhuǎn)化為mM Pi，并相對時間作圖。另外，本領(lǐng)域中已知的ATP酶實驗包括熒光素酶實驗。
驅(qū)動蛋白運動域的ATP酶活性也可用于監(jiān)測調(diào)節(jié)劑的作用。在一個實施方案中，在沒有微管存在下進行驅(qū)動蛋白ATP酶實驗。在另一個實施方案中，在有微管存在時進行ATP酶實驗。在上述實驗中可檢測不同類型的調(diào)節(jié)劑。在優(yōu)選的實施方案中調(diào)節(jié)劑的作用不依賴于微管和ATP的濃度。在另一個實施方案中，通過增加ATP、微管或者這兩者的濃度，可降低調(diào)節(jié)劑對驅(qū)動蛋白ATP酶的作用。在又一個實施方案中，通過增加ATP、微管或者這兩者的濃度，可增加調(diào)節(jié)劑的作用。
體外調(diào)節(jié)KSP的生化活性的藥物可接著在體內(nèi)進行篩選。此等藥物在體內(nèi)的篩選方法包括有關(guān)細胞周期分布、細胞存活率、或者有絲分裂紡錘體之存在、形態(tài)、活性、分布或者量的實驗。例如通過流動細胞計監(jiān)測細胞數(shù)量在細胞周期中的分布的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，測量細胞存活率的方法也是如此。例如參見1999年10月27日遞交的美國專利申請“Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation andMethods of Diagnosing Cell Proliferation States(篩選細胞增殖調(diào)節(jié)劑的方法以及診斷細胞增殖狀態(tài)的方法)”(申請?zhí)枮?9/428,156)，其內(nèi)容在此并入作為參考。
除如上所述的實驗外，監(jiān)測紡錘體的形成和畸形的顯微鏡法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已知的(例如參見Whitehead和Rattner(1998)，J.Cell Sci.1112551-61；Galgio等人，(1996)J.Cell Biol.，135399-414)。
本發(fā)明的化合物抑制KSP驅(qū)動蛋白。抑制作用的一個量度是IC50，其定義為KSP的活性被降低50％時的化合物濃度?；衔锏腎C50優(yōu)選低于約1mM，在優(yōu)選實施方案中，IC50低于約100μM，在更優(yōu)選的實施方案中，IC50低于約10μM，在特別優(yōu)選的實施方案中，IC50低于約1μM，在尤為優(yōu)選的實施方案中，IC50低于約100nM，而在最優(yōu)選的實施方案中，IC50低于約10nM。IC50的測量是用ATP酶實驗進行的。
抑制作用的另一個量度是Ki。對于IC50低于1μM的化合物，Ki或者Kd定義為喹唑啉酮與KSP相互作用的解離常數(shù)。優(yōu)選的化合物具有低于約100μM的Ki，在優(yōu)選實施方案中，Ki低于約10μM，在更優(yōu)選的實施方案中，Ki低于約1μM，在特別優(yōu)選的實施方案中，Ki低于約100nM，而在最優(yōu)選的實施方案中，Ki低于約10nM。化合物的Ki是根據(jù)三個假設(shè)由IC50測定的。第一，僅一個化合物分子結(jié)合在酶上，而且沒有合作性。第二，活性酶的濃度和測試化合物是已知的(例如，在制劑中沒有顯著量的雜質(zhì)或者失活形式)。第三，酶—抑制劑復合物的酶促速率是零。速率(即化合物濃度)的數(shù)據(jù)擬合于以下等式中V=VmaxE0[r-(E0+I0+kd)-(E0+I0+kd)2-4E0I02E0]]>其中V是觀察速率，Vmax是游離酶的速率，I0是抑制劑濃度，E0是酶濃度，而Kd是酶—抑制劑復合物的解離常數(shù)。
抑制作用的再一個量度是GI50，其定義為細胞生長速率降低50％時的化合物濃度。優(yōu)選的化合物具有低于約1mM的GI50?；衔锏膬?yōu)選度隨著GI50而變化GI50低于約20μM的化合物是更優(yōu)選的，GI50為約10μM的化合物是更優(yōu)選的，GI50低于約1μM的化合物是更優(yōu)選的，GI50為約100nM的化合物是更優(yōu)選的，GI50低于約10nM的化合物是更優(yōu)選的。GI50是通過使用細胞增殖實驗來測定的。
本發(fā)明的化合物用于治療細胞增殖性疾病?？捎帽景l(fā)明的方法及組合物治療的疾病狀態(tài)包括但不限于癌癥(進一步如下所述)、自體免疫性疾病、關(guān)節(jié)炎、移植物排斥反應、炎性腸疾病、醫(yī)療過程(包括但不限于手術(shù)、血管成形術(shù)等)誘發(fā)的增殖作用。可以理解的是，在某些情況下，細胞有可能處于高或者低的增殖狀態(tài)(異常狀態(tài))，而且仍需要治療。例如，在傷口愈合期間，細胞有可能“正常地”進行增殖，但希望能夠增強該增殖作用。類似地，如上所討論的，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，細胞有可能處于“正常”狀態(tài)，但希望通過直接增強作物的生長或者通過抑制負面影響作物的植物或者生物體的生長，調(diào)節(jié)增殖作用，以促進作物的生長。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括應用于罹患這些疾病之一的細胞或者個體或者防止其罹患這些疾病之一。
本發(fā)明的化合物和方法對于治療癌癥被認為是特別有用的，包括實體瘤，如皮膚、乳腺、腦、子宮頸癌、睪丸癌等。更具體而言，可用本發(fā)明的組合物及方法治療的癌癥包括但不限于心肉瘤(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肉瘤)、粘液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂瘤和畸胎瘤；肺支氣管癌(鱗狀細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌)、肺泡(細支氣管)癌、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨錯構(gòu)瘤、間皮瘤；胃腸道食管(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)，胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)，胰(胰管腺癌、胰島瘤、高血糖素瘤、胃泌素瘤、類癌瘤、胰腺瘤)，小腸(腺癌、淋巴瘤、類癌瘤、卡波濟肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂瘤、神經(jīng)纖維瘤、纖維瘤)，大腸(腺癌、管腺瘤、絨毛腺瘤、錯構(gòu)瘤、平滑肌瘤)；生殖泌尿道腎(腺癌、維爾姆斯腫瘤[腎胚細胞瘤]、淋巴瘤、白血病)，膀胱和尿道(鱗狀細胞癌、過渡細胞癌、腺癌)，前列腺(腺癌、肉瘤)，睪丸(精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、絨膜癌、肉瘤、間質(zhì)細胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣腫瘤、脂瘤)；肝臟肝細胞瘤(肝細胞癌)、膽管癌、肝胚細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤、血管瘤；骨成骨肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤因肉瘤、惡性淋巴瘤(網(wǎng)狀細胞肉瘤)、多發(fā)性脊髓瘤、惡性巨細胞腫瘤脊索瘤、軟骨骨瘤(骨軟骨外生骨疣)、良性軟骨瘤、成軟骨細胞瘤、軟骨粘液纖維瘤、骨樣骨瘤和巨細胞腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)顱骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黃瘤、畸形性骨炎)，腦膜(腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤病)，腦(星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管瘤、胚組織瘤[松果體瘤]、多形性成膠質(zhì)細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、先天性腫瘤)，脊索(神經(jīng)纖維瘤、腦膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤)；婦科子宮(子宮腦膜癌)，子宮頸(子宮頸癌、腫瘤前子宮頸發(fā)育異常)，卵巢(卵巢癌[漿液囊腺癌、假粘液性囊腺癌、未分類的癌]、粒層—膜細胞腫瘤、塞爾托利—萊迪希細胞腫瘤、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)，外陰(鱗狀細胞癌、上皮內(nèi)癌、腺癌、纖維肉瘤、黑素瘤)，陰道(透明細胞癌、鱗狀細胞癌、葡萄簇狀肉瘤[胚胎橫紋肌肉瘤])，輸卵管(癌)；血液血液(髓細胞樣白血病[急性和慢性]、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、骨髓及外骨髓增殖性疾病、多發(fā)性骨髓瘤、脊髓發(fā)育不良綜合癥)，何杰金病、非何杰金淋巴瘤[惡性淋巴瘤]；皮膚惡性黑素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波濟肉瘤、痣發(fā)育不良痣、脂瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕瘤、牛皮癬；以及腺體成神經(jīng)細胞瘤。因此，在此所用術(shù)語“癌細胞”包括受到任何一種如上所述的病癥影響的細胞。
因此，本發(fā)明的組合物可給藥于細胞。術(shù)語“給藥”是指向細胞培養(yǎng)基以及患者中的細胞給藥治療有效量的本發(fā)明有絲分裂劑。術(shù)語“治療有效量”是指可對給藥個體產(chǎn)生作用的劑量。精確的劑量取決于治療目的，而且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過已知的方法來確定。本領(lǐng)域眾所周知的是，必需根據(jù)全身與局部給藥、年齡、體重、總的健康狀況、性別、飲食、給藥時間、藥物的相互作用以及疾病的嚴重程度，對給藥劑量進行調(diào)整，而且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用常規(guī)的實驗來確定。在此所用術(shù)語“細胞”是指可改變其中有絲分裂或者減數(shù)分裂的幾乎大多數(shù)的任何細胞。
在本發(fā)明中，“患者”包括人和其他動物(特別是哺乳動物)以及其他生物體。因此，本發(fā)明的方法可應用于人的治療和獸醫(yī)領(lǐng)域中。在優(yōu)選的實施方案中，患者是哺乳動物，而在最優(yōu)選的實施方案中，患者是人。
具有所希望的藥理活性的有絲分裂劑可與生理上可接受的載體一起給藥于患者。根據(jù)引入的方式，本發(fā)明的化合物可以如下所述多種方法進行配制。治療活性化合物在制劑中的濃度可為0.1-100重量％。藥物可單獨或者與其他治療(如放射療法)或者其他化學治療劑一起進行。
在優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物是水溶性的形式，如藥物學上可接受的鹽，這包括酸和堿加成鹽。“藥物學上可接受的酸加成鹽”是指仍保留游離堿的生物有效性、與無機酸或者有機酸形成的那些鹽，所述無機酸例如是鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，而有機酸例如是醋酸、丙酸、甘醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等?！八幬飳W上可接受的堿加成鹽”包括衍生于無機堿的鹽，例如是鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁鹽等。特別優(yōu)選的是銨、鉀、鈉、鈣和鎂鹽。衍生于藥物學上可接受的有機非毒性堿的鹽包括伯胺、仲胺、叔胺、取代胺(包括天然取代的胺)、環(huán)狀胺、以及堿性離子交換樹脂的鹽，這些有機堿例如是異丙基胺、三甲基胺、二乙基胺、三乙基胺、三丙基胺、和乙醇胺。
藥物組合物可制成各種劑型，例如顆粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊劑、混懸劑、藥膏劑、洗劑等。在制備包含治療活性化合物的組合物時，可使用適合于口服以及局部使用的藥物級有機或者無機載體和/或稀釋劑。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括含水介質(zhì)、植物和動物油脂。作為輔劑可以使用穩(wěn)定劑、濕潤劑、和乳化劑、用于改變滲透壓的鹽或者用于確保足夠的pH值的緩沖液、以及皮膚滲透增強劑。藥物組合物還可包括一種或者多種以下成分載體蛋白，如血清白蛋白；緩沖液；填料，如微晶纖維素、乳糖、玉米和其他淀粉；粘合劑；甜味劑和其他調(diào)味劑；著色劑；以及聚乙二醇。添加劑在本領(lǐng)域中是已知的，而且可以在各種制劑中使用。
本發(fā)明的有絲分裂劑可通過多種途徑進行給藥，包括但不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、透皮、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、肺內(nèi)、陰道、直腸、或者眼內(nèi)。在某些情況下，例如在治療傷口和炎癥時，本發(fā)明的抗有絲分裂劑可直接以溶液或者噴霧劑給藥。
在用于篩選結(jié)合KSP驅(qū)動蛋白的化合物的方法中使用本發(fā)明的化合物時，將KSP結(jié)合在載體上，然后在實驗中添加本發(fā)明的化合物(其是有絲分裂劑)?；蛘?，將本發(fā)明的化合物結(jié)合在載體上，然后添加KSP?？稍谄渲袑で笮碌慕Y(jié)合劑的化合物包括特異性抗體、在化學文庫的篩選中已鑒別的非天然結(jié)合劑、肽類似物等。篩選出對于人細胞具有低毒性的候選藥物是篩選實驗特別有用的一個方面。為此目的可使用多種實驗，包括體外標記的蛋白—蛋白結(jié)合實驗，電泳移動性位移實驗，用于蛋白結(jié)合的免疫實驗，官能團實驗(磷酸化實驗等)，等等。
可以多種方法測定有絲分裂劑與KSP的結(jié)合。在優(yōu)選的實施方案中，有絲分裂劑(本發(fā)明的化合物)例如用熒光或者放射活性基團標記，然后直接測量結(jié)合。例如，這可如下進行將所用或者部分的KSP連接在固體載體上，添加經(jīng)標記的有絲分裂劑(例如其中至少一個原子被可檢測的同位素替換的本發(fā)明化合物)，洗滌掉過量的試劑，然后測定固體載體上存在的標記物的量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可使用各種阻斷和洗滌步驟。
術(shù)語“標記”是指化合物直接或者間接地用可提供檢測信號的標記物標記，所述標記物例如是放射同位素、熒光標記、酶、抗體、顆粒(如磁性顆粒)、化學發(fā)光標記、或者特異性結(jié)合分子等。特異性結(jié)合分子包括一對物質(zhì)，如生物素和抗生蛋白鏈菌素，地谷新和抗地谷新等。對于特異性結(jié)合物，根據(jù)如上所述的已知方法，互補一方通常與待檢測的分子結(jié)合。標記物可直接或者間接提供可檢測的信號。
在某些實施方案中，僅標記其中一個化合物。例如，可用125I或者熒光團在酪氨酸位置處標記驅(qū)動蛋白?；蛘?，用不同的標記物標記一個以上的組分，例如蛋白質(zhì)用125I，而有絲分裂劑用熒光團。
本發(fā)明的化合物也可用作篩選其他候選藥物時的競爭劑。在此所用的術(shù)語“候選生物活性劑”或者“候選藥物”或者語法上等同的詞是指待檢測其生物活性的任何分子，如蛋白質(zhì)、寡肽、小的有機分子、多糖、多核苷酸等。它們可直接或者間接改變細胞增殖表型或者細胞增殖序列的表達，所述細胞增殖序列包括核酸序列和蛋白序列。在其他情況下，篩選改變細胞增殖蛋白結(jié)合和/或活性。該類型的篩選可在有或者沒有微管存在時進行。在篩選蛋白結(jié)合或活性時，優(yōu)選的實施方案不包括任何已知可以結(jié)合具體的蛋白的分子，例如聚合物結(jié)構(gòu)(如微管)以及能量源(如ATP)。實驗的優(yōu)選實施方案包括在其內(nèi)源天然狀態(tài)下不結(jié)合分子增殖蛋白的候選藥物(在此稱為“外源性”藥物)。在其他優(yōu)選的實施方案中，外源性藥物進一步排除KSP的抗體。
候選藥物可包括多種類別的化學物質(zhì)，但通常是有機分子，優(yōu)選分子量為100-2500道爾頓的小有機分子。候選藥物包括與蛋白的結(jié)構(gòu)相互作用所必需的官能團，特別是氫鍵和親脂性結(jié)合的官能團，其通常至少包括胺、羰基、羥基、醚、或者羧基，優(yōu)選官能團中至少有兩個。候選藥物經(jīng)常包括環(huán)狀碳或者雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或者多芳香結(jié)構(gòu)，它們被一個或者多個上述官能團取代。候選藥物還可在生物分子中選擇，所述生物分子包括肽、糖、脂肪酸、甾體化合物、嘌呤、嘧啶、以及它們的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或者組合。特別優(yōu)選的是肽。
候選藥物是由包括合成或者天然化合物的文庫的多種來源得到的。例如，隨機可有多種方式，而且涉及多種有機化合物及生物分子的合成，包括隨機寡核苷酸的表達?；蛘撸毦?、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫也是可以利用或者容易產(chǎn)生的。另外，天然或者合成的文庫及化合物可容易地通過常規(guī)的化學、物理和生物化學方法進行改性。已知的藥物可進行針對性或者隨機的化學改性，如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
競爭性篩選實驗可通過在第一個樣品中混合KSP以及候選藥物來進行。第二個樣品包括有絲分裂劑、KSP以及候選藥物。這可在有或者沒有微管存在時進行。測定這兩個樣品中的候選藥物結(jié)合，而兩個樣品之間的結(jié)合變化或者不同表明存在能夠結(jié)合KSP并潛在調(diào)節(jié)其活性的藥物。也就是說，如果第二個樣品中候選藥物的結(jié)合不同于第一個樣品中的，則表明候選藥物能夠結(jié)合KSP。
在優(yōu)選的實施方案中，候選藥物的結(jié)合是通過使用競爭性結(jié)合實驗來測定。在該實施方案中，競爭劑是已知與KSP結(jié)合的結(jié)合物質(zhì)，如抗體、肽、結(jié)合配偶體、配體等。在某些情況下，例如在候選藥物和結(jié)合物質(zhì)之間，用結(jié)合物質(zhì)置換候選藥物，可存在競爭性結(jié)合。
在一個實施方案中，候選藥物是經(jīng)過標記的。候選藥物或者競爭劑或者它們兩個，首先添加至KSP中，其時間足以進行結(jié)合?？稍谌魏斡欣谧罴鸦钚缘臏囟认逻M行保溫，通常在4-40℃之間。
保溫的時間根據(jù)最佳活性來選擇，但也可進行最佳化，以有利于快速高輸出篩選。通常0.1-1小時是足夠的。過量的試劑通常被除去或者洗掉。接著添加第二組分，然后是有或者沒有經(jīng)過標記的組分，以表明結(jié)合。
在優(yōu)選的實施方案中，首先添加競爭劑，然后添加候選藥物。競爭劑的替換是候選藥物與KSP結(jié)合并由此能夠結(jié)合以及潛在調(diào)節(jié)KSP活性的指標。在該實施方案中，組分可進行標記。因此，例如，如果競爭劑是經(jīng)過標記的，則在洗滌溶液中存在標記物表明被藥物替換?；蛘?，如果候選藥物被標記，在載體上存在標記物表明進行了替換。
在另一個實施方案中，候選藥物首先添加，并進行保溫和洗滌，然后是競爭劑。不存在競爭劑的結(jié)合表明候選藥物以更高的親和性與KSP結(jié)合。因此，如果候選藥物是標記的，在載體上存在標記物，沒有競爭劑的結(jié)合，有可能表明候選藥物能夠與KSP結(jié)合。
鑒別出KSP的結(jié)合位點是非常有價值的。這可通過各種方法來進行。在一個實施方案中，一旦鑒別出KSP與有絲分裂劑結(jié)合，就使KSP分段或者改性，然后重復實驗以鑒別出結(jié)合所必需的組分。
調(diào)節(jié)作用是通過篩選能夠調(diào)節(jié)KSP活性的候選藥物來測試的，其包括以下步驟如上所述混合候選藥物和KSP，然后測定KSP生物活性的變化。因此，在該實施方案中，候選藥物應與KSP結(jié)合(雖然這不是必須的)，并改變其生物或者生化活性。該方法包括細胞的體外篩選法和體內(nèi)篩選法，其中包括細胞周期分布、細胞存活率、有絲分裂紡錘體是否存在、形態(tài)、活性、分布或者量的變化。
或者，可使用不同的篩選，以鑒別出與天然KSP結(jié)合但不與改性KSP結(jié)合的候選藥物。
可在實驗中使用陽性對照和陰性對照。優(yōu)選的是，所有的對照和測試樣品都進行至少三次，以得到統(tǒng)計學顯著的結(jié)果。所有樣品的保溫時間應足以使藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合。在保溫后，洗滌所有的樣品，使得沒有非特異性結(jié)合的材料，然后測定結(jié)合而且通常被標記的藥物的量。例如，當使用放射性標記物時，樣品可在閃爍計數(shù)器中計數(shù)，以測定結(jié)合化合物的量。
在篩選實驗中可包括多種其他試劑。這些試劑包括例如鹽、中性蛋白質(zhì)(如白蛋白)、洗滌劑等，它們可有利于最佳的蛋白—蛋白結(jié)合和/或降低非特異性或者背景相互作用。還可使用可提高使用效率的試劑，如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、殺微生物劑等?？梢匀魏雾樞蛱砑咏M分的混合物，以提高所需的結(jié)合。
以下實施例用于更詳細地描述實施本發(fā)明的方式。應理解的是，這些實施例絕不是對本發(fā)明真實范圍的限制，而僅是用于說明目的。在此引用的所有參考文獻都全文引入作為參考。
實施例以下縮寫及術(shù)語的含意如下所示
實施例1化合物的合成總的合成方法見圖1和2所示。
步驟1N-丁?；彴被郊姿嵩?頸500ml圓底燒瓶中添加氨基鄰苯甲酸(1)(0.5mol，68.5g)和二甲基甲酰胺(250ml)，該圓底燒瓶上配有溫度計、滴液漏斗、以及磁攪拌棒。在該溶液中滴加丁酰氯(0.55mol，57.1ml)，其速度應使混合物的溫度不超過40℃。在室溫下劇烈攪拌該懸浮液至少3小時。將混合物傾倒在水(2000ml)中，并再攪拌1小時。過濾收集沉淀出的產(chǎn)物，用冷水洗滌，然后在減壓下于P2O5上干燥，產(chǎn)生化合物2(67.3g，65％)。
步驟22-丙基-3，1-[4H]苯并惡嗪-4-酮在500ml的圓底燒瓶中將化合物2(51.8g，0.25mol)溶解在乙酸酐(180ml)中，該圓底燒瓶配有磁攪拌棒、Claisen蒸餾頭(帶有真空入口)和溫度計。將該燒瓶放置在油浴中，然后在劇烈攪拌下緩慢加熱至170-180℃。在大氣壓力下緩慢蒸餾除去所產(chǎn)生的乙酸。在轉(zhuǎn)化過程中監(jiān)測蒸餾裝置的頭溫。將反應混合物冷卻至60℃，并在減壓下通過蒸餾除去過量的乙酸酐(約20mm Hg)。然后冷卻殘留物，并使產(chǎn)物結(jié)晶。產(chǎn)物用正己烷(75ml)研磨，然后過濾分離，得到2-丙基-3，1-[4H]苯并惡嗪-4-酮(3)(29.3g，62％)。上述方法得到的化合物3已足夠純，并直接用于下一步中。
步驟32-丙基-3-芐基喹唑啉-4-酮在單口250ml圓底燒瓶中使化合物3(28.4g，0.15mol)和芐胺(17.5ml，0.16mol)在氯仿(50ml)中回流6小時?；衔?消耗完全后，減壓蒸發(fā)氯仿。在配有Claisen蒸餾頭和磁攪拌棒的燒瓶中向殘留物添加乙二醇(100ml)和氫氧化鈉顆粒(0.60g)。將該燒瓶浸沒在油浴中，并在劇烈攪拌下預熱至130-140℃的浴溫，然后保持5小時，同時蒸餾除去所產(chǎn)生的水。反應完全后，使澄清溶液冷卻至室溫，并保持過夜，以沉淀出產(chǎn)物。添加3％鹽酸溶液，將懸浮液的pH調(diào)節(jié)為7-8，過濾出晶體，并用冷水洗滌，然后用異丙醇(或者丙酮)重結(jié)晶，得到化合物2-丙基-3-芐基喹唑啉-4-酮(化合物4)(28.0g，67％)。
步驟42-(1′-溴丙基)-3-芐基喹唑啉-4-酮在三口250ml燒瓶中添加化合物4(27.8g，0.10mol)、無水醋酸鈉(10.0g)和冰乙酸(130ml)，該燒瓶配有溫度計、滴液漏斗、和攪拌棒。在40℃下向該溶液中滴加溶解在乙酸(10ml)中的溴(16.0g，0.10mol)，用時1-2小時。添加完成后，將混合物傾倒在水(1500ml)中，并在室溫下攪拌1-2小時。過濾分離沉淀出的產(chǎn)物2-(1′-溴丙基)-3-芐基喹唑啉-4-酮(5)，用溫水洗滌以除去痕量的乙酸，然后用少量的異丙醇淋洗。干燥后得到化合物5(53.0g，92％)。
步驟52-[1′-(N，N-二甲基亞乙基二胺基)丙基]-3-芐基喹唑啉-4-酮在無水乙醇(60ml)中溶解化合物5(10.7g，0.03mol)和N，N-二甲基亞乙基二胺(6.6ml，0.06mol)，然后加熱回流6小時。反應完全后，減壓蒸發(fā)溶劑。將殘留物溶解在二氯甲烷(150ml)中，然后用3％氫氧化鈉水溶液(約10-20ml)洗滌。有機層用硫酸鎂干燥，然后減壓蒸發(fā)至干。殘留的油性產(chǎn)物在短的硅膠墊上通過快速色譜法純制，其中使用氯仿-甲醇-氨水90∶10∶0.1作為洗脫劑，得到所希望的化合物(5)--2-[1′-(N，N-二甲基亞乙基二胺基)丙基]-3-芐基喹唑啉-4-酮(6)(6.0g，55％)。
步驟62-[1′-(N-4-氟苯甲?；?-(N，N-二甲基亞乙基二胺基)丙基]-3-芐基喹唑啉-4-酮在HPLC級的氯仿(0.5ml)中制備化合物5(1.822g，5.0mmol)的原料液。在2.0ml體積的燒瓶中制備對氟苯甲酰氯(160.2mg，1mmol)在HPLC級的1，2-二氯乙烷(2.0ml)中的原料液。在HPLC級的1，2-二氯乙烷中制備三乙胺(2.0ml，0.5M)的溶液。用Beckman Biomet2000自動液體分配器將100μl的各溶液移液至玻璃反應容器中。使用機械搖動器搖動反應混合物，在超聲水浴中進行超聲處理，然后在室溫下保溫過夜。混合物在氯仿(300μl)中稀釋，然后用5％碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。真空除去溶劑，得到化合物(6)(65％)。用TLC分析該化合物的純度，其中用二氯甲烷-乙醇-濃氨水100∶10∶1洗脫。
實施例2和3合成通式結(jié)構(gòu)1d的化合物 所有的無水溶劑都購自于Aldrich Chemical Company，并儲存在SureSeal容器中。大多數(shù)的試劑購自于Aldrich Chemical Company?？s寫DCM，二氯甲烷；DIEA，N，N-二異丙基乙基胺；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；TES，三乙基硅烷；TFA，三氟乙酸。陣列合成(array synthesis)是在15×75mm圓底螺旋帽玻璃管中進行的，該玻璃管放置在4×6列鋁制合成裝置中，用Teflon襯里橡膠膜密封。添加試劑，用單個或者多通道安全移液管進行含水萃取。用Whatman/Polyfiltronics 24孔、10ml過濾裝置進行過濾。揮發(fā)性物質(zhì)由陣列中的蒸發(fā)是用Labconco渦旋蒸發(fā)器或者通過用4×6氮氣歧管吹掃來進行的。
實施例2(單個化合物的固相合成)步驟1)稱量1，3-二氨基丙烷三苯甲基樹脂(Novabiochem，1.2mmol/g)(0.20g，0.24mmol)并添加至螺旋帽玻璃管中，然后添加3ml的DMF和氯仿1∶1混合物。添加DIEA(0.130ml，0.72mmol)和2-(1′-溴丙基)-3-芐基喹唑啉-4-酮(實施例1中制備的)(0.188g，0.48mmol)。密封過玻璃管，加熱至70℃，然后搖動過夜。過濾樹脂，并進行洗滌(3×DCM，2×MeOH，1×DCM，2×醚)，然后真空干燥。27mg等份的樹脂用5∶5∶90的TFA∶TES∶DCM處理15分鐘，然后過濾并蒸發(fā)混合物，得到8mg(產(chǎn)率64％)的喹唑啉酮二胺中間體。LCMS分析表明純度＞80％。
步驟2)步驟1中的樹脂在3ml的DCM中溶漲。添加DIEA(0.130ml，0.72mmol)和4-溴芐基溴(0.12g，0.48mmol)。密封玻璃管，然后搖動過夜。LCMS分析裂解等份表明有約1∶1起始物和產(chǎn)物的混合物。再添加0.130ml的DIEA和0.12g的4-溴芐基溴，然后在70℃下?lián)u動混合物8小時。過濾樹脂，洗滌(如上所述)，然后真空干燥。
步驟3)步驟2中的樹脂用5∶5∶90的TFA∶TES∶DCM搖動并過濾2次。合并濾液并蒸發(fā)，得到140mg的橙色油狀物。該物質(zhì)用反相制備性HPLC(乙腈-水梯度)進行純制，得到27mg(對于3個步驟為17％)的單TFA鹽。
實施例3(組合合成多個化合物)步驟1)分別將1，2-二氨基乙烷三苯甲基樹脂(Novabiochem，0.95mmol/g)(200g，1.9mmol)和1，3-二氨基丙烷三苯甲基樹脂(Novabiochem，1.14mmol/g)(2.0g，2.28mmol)放置在不同的10ml聚丙烯燒結(jié)管(Bio-Rad)中。在每個管中添加4ml的DMF、4ml的氯仿、3eq.的DIEA(分別為1.0ml和1.2ml)、以及2eq.的2-(1′-溴丙基)-3-芐基喹唑啉-4-酮(實施例1制得的)(分別為1.5g和1.8g)。該混合物在70℃下?lián)u動過夜。每個混合物進行洗滌(3×DCM、2×MeOH、1×DCM、2×醚)，然后真空干燥。裂解等份的分析表明存在合適的喹唑啉酮-二胺，每個的純度都大于90％。
2)在陣列頭2排中的每個玻璃管內(nèi)放入喹唑啉酮乙基-二胺樹脂(105mg，0.10mmol)，然后在陣列后2排的每個玻璃管內(nèi)放入喹唑啉酮丙基-二胺樹脂(88mg，0.10mmol)。在每個玻璃管中添加DIEA(0.131ml，0.75mmol)。在陣列頭2排的每個玻璃管中添加不同的胺，并在陣列后2排的玻璃管中重復進行添加。反應裝置在70℃下?lián)u動過夜。通過用細點凝膠-孔尖的多通道移液管由每個玻璃管中除去液體，然后洗滌樹脂(2×DCM、1×MeOH、1×DCM)，并真空干燥。
3)在陣列中的每個玻璃管內(nèi)添加2ml的10∶5∶85TFA∶TES∶DCM溶液。反應裝置搖動45分鐘，然后將混合物轉(zhuǎn)移至過濾裝置中進行過濾，然后用0.75ml的DCM洗滌2次。蒸發(fā)溶液，得到黃色-紅色的油狀物。用醚研磨這些粘的油狀物2次，溶解在DCM中，然后用4M鹽酸二惡烷溶液處理，得到鹽酸鹽(每個化合物不知道數(shù)目的鹽)，為棕色-白色的粉末或者無定形固體。LCMS分析表明所有的純度都大于75％。
實施例4-6用手性色譜法將6個外消旋喹唑啉酮化合物分離成它們的對映體。以下描述其中3個化合物的手性色譜法。
實施例4 柱-Chiralpak AD，250×4.6mm(Diacel Inc.)樣品-0.5mg/ml，在乙醇中。
條件-15分鐘的60％乙醇己烷溶液，對映體1在4.5分鐘洗脫，對映體2在4.9分鐘洗脫。
實施例5 柱-Chiralcel OJ，250×4.6mm(Diacel Inc.)樣品-0.5mg/ml，在乙醇中。
條件-15分鐘的10％乙醇己烷溶液，(R)-對映體在8.4分鐘洗脫，(S)-對映體在9.6分鐘洗脫。
實施例6 柱-Chiralpak AD，250×4.6mm(Diacel Inc.)樣品-0.5mg/ml，在乙醇中。
條件-15分鐘的70％乙醇己烷溶液，對映體1在6.5分鐘洗脫，對映體2在8.8分鐘洗脫。
下表描述了如上分離的三個其他化合物的外消旋物及對映體的IC50活性。在所有三個情況中，一個對映體顯著強于另一個對映體。通過獨立的手性合成，似乎活性更強的對映體是R對映體。
實施例7和8以下兩個化合物是用圖4中所示的路線以單一對映體的形式合成的。數(shù)據(jù)表明活性更強的對映體是R對映體。
實施例9通過酒石酸重結(jié)晶的手性拆分實施例1中制得的中間體A可轉(zhuǎn)化為中間體B，其在拆分時，為圖4中所示的頭5個步驟提供了一個替代方法。該方法如以下合成路線所示
B的R對映體可通過在異丙醇和甲醇的混合物中加熱B與1.1當量D-酒石酸的混合物而選擇性結(jié)晶，然后使混合物返回至室溫。
實施例9X＝Cl，R＝H外消旋中間體B(1.5g)溶解在100ml沸騰的異丙醇中，然后與0.8g的D-酒石酸在100ml沸騰甲醇中的溶液混合。使該混合物緩慢達到室溫。放置過夜后，過濾除去固體，然后用乙酸乙酯和己烷洗滌，并進行空氣干燥。經(jīng)干燥的固體(0.8g)溶解在50ml異丙醇和50ml甲醇的沸騰混合物中，然后使它們緩慢冷卻至室溫。放置過夜后，過濾出所得的固體，并用乙酸乙酯和己烷洗滌，然后進行空氣干燥。經(jīng)干燥的固體用飽和碳酸氫鈉溶液攪拌30分鐘，然后用乙酸乙酯萃取。有機相干燥(硫酸鎂)，過濾，然后蒸發(fā)至干。所得的澄清油狀物重量為345mg。將其中一部分轉(zhuǎn)化為S-Mosher酰胺并用1H NMR檢查產(chǎn)物，由此測定手性純度大于95％。根據(jù)圖4中的剩余步驟，由上述步驟中得到的物質(zhì)起始使用D-和L-酒石酸制備如下的對映體純的化合物。
在用喹唑啉酮KSP抑制劑處理的細胞中誘導有絲分裂停止如下通過測量DNA含量進行FACS分析以測定細胞周期階段。Skov-3細胞(人卵巢癌)分裂為1∶10，鋪放在10cm的皿中，然后用包含5％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基一起生長至亞融合。細胞然后用10nM紫杉醇、400nM喹唑啉酮1、200nM喹唑啉酮2、或者0.25％的DMSO(化合物的載體)處理24小時。用包含5mM EDTA的PBS將細胞由板中沖洗下來，沉淀，再用包含1％FCS的PBS洗滌一次，然后在4℃下在85％乙醇中固定過夜。在分析之前，使細胞沉淀，洗滌一次，然后在每毫升10μg碘化丙錠和250μg核糖核酸酶的溶液中于37℃下染色半個小時。在Becton-Dickinson FACScan上進行流動細胞計分析，用Modfit軟件分析每個樣品中10000個細胞的數(shù)據(jù)。
喹唑啉酮化合物以及已知的抗有絲分裂劑紫杉醇，使細胞由G0/G1細胞周期階段(2n DNA含量)移動至G2/M細胞周期階段(4n DNA含量)。發(fā)現(xiàn)該類的其他化合物具有類似的作用。
給藥喹唑啉酮KSP抑制劑后的單極紡錘體形成為測定G2/M累積的本質(zhì)，人腫瘤細胞系Skov-3(卵巢)、HeLa(子宮頸)、和A549(肺)以每孔4000個細胞(SKOV-3 & HeLa)或者8000個細胞(A549)的密度放入96孔板中，使它們粘附24小時，然后用各種濃度的喹唑啉酮化合物處理24小時。細胞固定在4％甲醛中，并用抗微管蛋白抗體(隨后使用熒光標記的輔助抗體識別)和Hoechst染料(其染色DNA)進行染色。
肉眼檢查表明喹唑啉酮化合物使細胞周期停止在有絲分裂的前中期。DNA縮合，并且開始形成紡錘體，但休止的細胞均勻地表現(xiàn)為單極紡錘體，這表明抑制了紡錘極體的分離。微量注射抗KSP抗體也使有絲分裂停止，而且休止的細胞也表現(xiàn)為單極紡錘體。
在用喹唑啉酮KSP抑制劑處理的腫瘤細胞系中抑制細胞增殖以1000-2500個細胞/孔(取決于細胞系)的密度將細胞放入96孔板的孔中，然后使它們粘附/生長24小時。添加化合物時的時間作為T0。使用試劑3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS)的四唑基實驗(I.S.第5,185,450號美國專利)(參見Promega產(chǎn)品目錄#G3580，CellTiter 96AQueousOneSolution Cell Proliferation Assay)，被用于測定T0時的細胞存活數(shù)量以及接觸化合物48小時后存活細胞的數(shù)量。48小時后存活的細胞數(shù)量與添加藥物時的存活細胞數(shù)量相比較，以計算生長抑制作用。
在僅用載體(0.25％DMSO)處理的對照孔中細胞在48小時后的生長被認為是100％的生長，而添加化合物的孔中的細胞生長與其進行比較。喹唑啉酮KSP抑制劑抑制以下腫瘤類型的人腫瘤細胞系的細胞增殖肺(NCI-H460、A549)、乳腺(MDA-MB-231、MCF-7、MCF-7/ADR-RES)、結(jié)腸(HT29、HCT15)、卵巢(SKOV-3、OVCAR-3)、白血病(HL-60(TB)、K-562)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(SF-268)、腎(A498)、骨肉瘤(U2-OS)、以及子宮頸(HeLa)。另外，在有喹唑啉酮化合物時，還對鼠腫瘤系(B 16，黑素瘤)產(chǎn)生生長抑制作用。
GI50是通過化合物的濃度(μM)對處理孔中細胞生長的百分比作圖而計算的。對于化合物計算的GI50是與對照組相比50％抑制生長時的估計濃度，即、以下等式表示的時間的濃度100×[(處理48小時-T0)/(對照48小時-T0)]＝50所有的化合物濃度測試雙份，而對照是12個孔的平均值。NationalCancer Institute使用了非常類似的96孔板方案和GI50計算方法(參見Monks等人，J.Natl.Cancer Inst.83757-766(1991))。但是，National CancerInstitute用于定量細胞數(shù)目的方法不是使用MTS，而是使用另外的方法。
IC50的計算本發(fā)明化合物對KSP活性的IC50值是使用ATP酶實驗來測定的。使用以下的溶液溶液1由3mM的磷烯酸醇丙酮酸鉀鹽(Sigma P-7127)、2mM的ATP(Sigma A-3377)、1mM的IDTT(Sigma D-9779)、5μM的紫杉醇(Sigma T-7402)、10ppm的消泡289(Sigma A-8436)、25mM的Pipes/KOH pH 6.8(Sigma P6757)、2mM的氯化鎂(VWRJT400301)、以及1mM的EGTA(Sigma E3889)組成。溶液2由1mM的NADH(Sigma N8129)、0.2mg/ml的BSA(Sigma A7906)、丙酮酸激酶7U/ml、L-乳酸脫氫酶10U/ml(Sigma P0294)、100nM的KSP運動域、50μg/ml的微管、1mM的DTT(Sigma D9779)、5μM的紫杉醇(Sigma T-7402)、10ppm的消泡289(Sigma A-8436)、25mM的Pipes/KOH pH 6.8(Sigma P6757)、2mM的氯化鎂(VWR JT4003-01)、以及1mM的EGTA(Sigma E3889)組成。使用溶液1在96孔板(CorningCostar3695)上制備化合物的系列稀釋液(8-12個2倍稀釋液)。在系列稀釋后，每個孔有50μl的溶液1。在每個孔中添加50μl的溶液2，由此使反應開始。這可通過手工使用多通道移液管或者用自動液體處理裝置來實現(xiàn)。微量滴定板轉(zhuǎn)移至微板吸光度讀數(shù)器中，并以動態(tài)讀取每個孔在340nm處的多個吸光度讀數(shù)。所觀察到的變化速率與ATP酶成正比，并繪制其隨化合物濃度變化的圖。對于標準IC50測定，所需要的數(shù)據(jù)是通過以下4個參數(shù)的等式使用非線性擬合程序(如Grafit 4)進行擬合 其中y是觀察到的速率，而x是化合物濃度。
喹唑啉酮化合物抑制各種細胞系的生長，包括表達P-糖蛋白(也稱為多藥物抗藥性，或者MDR+)的細胞系(MCF-7/ADR-RES，HCT15)，所述糖蛋白可對其他治療劑如紫杉醇產(chǎn)生耐藥性。因此，喹唑啉酮類化合物是能夠抑制細胞增殖的抗有絲分裂劑，而且不會由于耐藥性腫瘤細胞系的MDR+過度表達而被耐受。
雖然GI50值有變化，但發(fā)現(xiàn)該類的其他化合物都抑制細胞增殖。所測試的喹唑啉酮化合物的GI50值在200nM至高于最高的測試濃度。由此，雖然大多數(shù)抑制KSP活性的化合物在生物化學上不抑制細胞增殖，但對于某一些，在最高的測試濃度(通常為約20μM)時，細胞生長被抑制了50％以下。許多化合物的GI50值低于10μM，而且有一些的GI50值低于1μM。在臨床上已成功地用于治療癌癥(癌癥化學治療劑)的抗增殖化合物的GI50在很大范圍內(nèi)變化。例如，在A549細胞中，紫杉醇的GI50是4nM，多柔比星是63nM，5-氟尿嘧啶是1μM，而羥基脲是500μM(這些數(shù)據(jù)是由National Cancer Institute，Development TherapeuticProgram提供的，http//dtp.nci.nih.gov/)。因此，可以使用在實際上任何濃度下都可抑制細胞增殖的化合物。但優(yōu)選的是，化合物的GI50值低于1mM。更優(yōu)選的是，化合物的GI50值低于20μM。更優(yōu)選的是，化合物的GI50值低于10μM。GI50值的進一步降低也是希望的，包括化合物的GI50值低于1μM。對于一些本發(fā)明的喹唑啉酮化合物，其抑制細胞增殖時的GI50值在低于20nM-低于10nM的范圍內(nèi)。
實施例11重約20g的雌性無毛鼠用套針經(jīng)皮下移植人腫瘤癌的片段，該片段是由無毛鼠宿主中皮下生長的腫瘤中收集的。當腫瘤為約77mg大小時，將動物分成治療組和對照組。每個組包括8只移植有腫瘤的小鼠，每只小鼠在耳部進行標記并隨后單獨進行整個實驗。在分組后的第1天給藥起始劑量(10mg/kg的66mM檸檬酸鹽緩沖液，pH5.0/0.9％鹽水/10％Tween80，每個測試化合物制劑的最大濃度為5mg/ml)，然后按照以下所示的劑量水平及規(guī)程給藥。
從第1天開始，小鼠每周稱重2次，并用側(cè)徑器每周測量腫瘤2次。將這些腫瘤測量的結(jié)果用已知的公式W2×L/2換算為腫瘤重量(mg)。當對照組的腫瘤尺寸達到平均1g時中止實驗。中止時，對小鼠稱重，殺死，然后切下它們的腫瘤。稱量腫瘤，并計算每組的平均治療腫瘤重量。在該模型中，用100％減去平均治療腫瘤重量的變化/平均對照腫瘤重量的變化×100％(ΔT/ΔC)，得到每個組的腫瘤生長抑制作用(TGI)。
用上述方法測試化合物1-5(如下所示)，所得結(jié)果示于表A-D中。在用該方法進行測試時，本發(fā)明的其他化合物也表現(xiàn)出可比的活性。
化合物1
化合物2 化合物3 化合物4
化合物5
表ASKOV3腫瘤異種移植物
表BSKOV3腫瘤異種移植物
表CSKOV3腫瘤異種移植物
表DSKOV3腫瘤異種移植物
雖然已參考具體的實施例對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應認識到，在不偏離本發(fā)明的實質(zhì)及范圍的情況下，還可進行各種改變以及等同替換。另外，為實現(xiàn)本發(fā)明的目的、實質(zhì)和范圍，也可對具體的條件、材料、組合、方法以及處理步驟等進行許多的改進。所有這些改進也在本發(fā)明所附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。本文中引用的所有專利以及出版物在此都并入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種化合物或其藥物學上可接受的鹽，所述化合物結(jié)構(gòu)如下式所示 其中R1選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、以及取代烷基雜芳基；R2和R2′獨立地選自于氫、烷基、氧雜烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、以及取代烷基雜芳基；或者R2和R2′一起形成3-7元環(huán)；R4選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、和R16-亞烷基；R5、R6、R7和R8獨立地選自于氫、烷基、烷氧基、鹵素、氟代烷基、硝基、氰基、二烷基氨基、烷基磺?；?、烷基氨磺酰基、氨磺?；榛?、氨磺?；蓟⑼榱蚧?、羧基烷基、羧酰胺基、氨基羰基、芳基和雜芳基；R16選自于烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、N-雜環(huán)基、以及取代N-雜環(huán)基。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物或鹽，其中，R1選自于氫、烷基、芳基、取代烷基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、烷基芳基、烷基雜芳基和取代烷基芳基，R2選自于氫、烷基或者取代烷基，R2′是氫，而且R2和R2′所連接的立體中心是R構(gòu)型的，R4選自于烷基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、和R16-亞烷基，R5是氫，R6、R7和R8獨立地選自于氫、鹵素、甲基和三氟甲基，R16選自于烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和N-雜環(huán)基。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物或鹽，其中R1選自于氫、低級烷基、取代的低級烷基、芐基、取代芐基、苯基、萘基和取代苯基；R2選自于氫、低級烷基和取代的低級烷基；而R2′是氫；R4選自于低級烷基、環(huán)己基，被羥基、低級烷氧基或者低級烷基取代的苯基，芐基、雜芳基甲基、雜芳基乙基、雜芳基丙基和R16-亞烷基，其中R16選自于二(低級烷基)氨基、(低級烷基)氨基、氨基、低級烷氧基、或者N-雜環(huán)基。
4.如權(quán)利要求3所述的化合物或鹽，其中R1選自于低級烷基、芐基、取代芐基和取代苯基；R2是氫或者低級烷基；R2′是氫；R4是R16-亞烷基；R7選自于氫、氟、氯和甲基；R5、R6和R8是氫；R16選自于二(低級烷基)氨基、(低級烷基)氨基、氨基、吡咯烷基、哌啶基、咪唑基和嗎啉基。
5.由如權(quán)利要求1所述的式Ic化合物或鹽制備如下式Ia的化合物或其藥物學可接受的鹽的方法，該方法包括將所述式Ic化合物?；陨伤鍪絀a的化合物或其藥物學可接受的鹽 其中R3選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、氧雜烷基、氧雜烷基芳基、取代氧雜烷基芳基、氧雜烷基雜芳基、取代氧雜烷基雜芳基、R15O-和R15-NH-；以及R15選自于烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、和取代烷基雜芳基；且其它基團與權(quán)利要求1中的定義相同。
6.如權(quán)利要求1所述的式Ic化合物或鹽在制備如下式Ia所示的化合物或其藥物學可接受的鹽中的應用 其中R3選自于氫、烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、取代烷基雜芳基、氧雜烷基、氧雜烷基芳基、取代氧雜烷基芳基、氧雜烷基雜芳基、取代氧雜烷基雜芳基、R15O-和R15-NH-；以及R15選自于烷基、芳基、烷基芳基、雜芳基、烷基雜芳基、取代烷基、取代芳基、取代烷基芳基、取代雜芳基、和取代烷基雜芳基；且其它基團與權(quán)利要求1中的定義相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及以右式Ic所示的喹唑啉酮類化合物。其中各基團的定義如權(quán)利要求1中所述。本發(fā)明還涉及由所述式Ic所示的化合物制備如式Ia所示的化合物的方法，以及所述式Ic所示的化合物在制備如式Ia所示的化合物中的應用。
文檔編號A61P37/02GK1824656SQ200510119288
公開日2006年8月30日 申請日期2001年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月21日
發(fā)明者杰弗里·T·芬納, 古斯塔夫·貝格內(nèi)斯, 馮柏年, 惠特尼·W·史密斯, 約翰·C·沙巴拉, 小戴維·J·摩根斯 申請人:賽特凱恩蒂克公司