專利名稱：殼寡糖及其衍生物作為抗hiv－1多肽藥物載體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料和藥物學(xué)的交叉領(lǐng)域，涉及殼寡糖及其衍生物的應(yīng)用，尤其是殼寡糖及其衍生物作為抗HIV-1多肽藥物載體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病為獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，該病由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV或艾滋病病毒)感染而引起，導(dǎo)致被感染者免疫功能的部份或完全喪失，CD4細(xì)胞數(shù)目減少，繼而發(fā)生機(jī)會(huì)性感染、腫瘤等，臨床表現(xiàn)多種多樣。該病傳播速度快、死亡率高，且目前無法治愈。
針對HIV-1的侵入、傳染的機(jī)制及其他一些可能抑制HIV-1的機(jī)理，現(xiàn)階段已經(jīng)研究設(shè)計(jì)出多種類型的抑制藥物，主要分為4個(gè)類型CD4受體抑制劑，趨化因子受體抑制劑，其他類錨定抑制劑，膜融合抑制劑。其中膜融合類抑制劑的報(bào)道較多，效果也比較突出，以C多肽和N多肽為代表，主要是干擾gp41形成穿膜構(gòu)象，達(dá)到破壞病毒與宿主細(xì)胞膜融合的過程，我們已獲得抗HIV-1的C22和M3多肽等系列膜融合抑制劑，見中國專利200510023542.1和200510028550.5。
目前多肽藥物的給藥途徑主要有靜脈注射給藥和口服給藥，靜脈注射給藥則直接靜脈點(diǎn)滴或皮下注射，注射時(shí)會(huì)出現(xiàn)局部疼痛，而且藥劑量與病毒負(fù)荷量相關(guān)，藥物在體內(nèi)生物半衰期一般很短，并需長期反復(fù)注射用藥，持續(xù)皮下注射受阻于技術(shù)問題，因此必將影響病人用藥。而多肽口服給藥是最受人們歡迎的給藥途徑也是一種友好的給藥途徑。但是多肽和蛋白質(zhì)類藥物在胃腸道給藥過程中普遍存在下列尚未克服的難點(diǎn)胃酸催化降解、胃腸道內(nèi)酶解、胃腸道粘膜滲透性差；而且多肽藥物相對分子量大，脂溶性較差，難以透過半透膜，影響吸收；多肽藥物還存在化學(xué)和構(gòu)象不穩(wěn)定等。
為解決上述問題，吸收促進(jìn)劑是目前提高生物膜通透性所采用的主要方法。作用機(jī)制為①增加肽類和蛋白質(zhì)類藥物的溶解度；②抑制蛋白水解酶的降解作用；③吸收促進(jìn)劑的陽離子與膜表面的陰離子結(jié)合，促進(jìn)吸收，提高生物利用度；④通過擾亂膜上的磷脂層來降低膜的阻礙作用。理想的促進(jìn)劑應(yīng)可逆地、特異地提高藥物的通透性；無毒可以再生；作用機(jī)制明確；具有合適的理化性質(zhì)；價(jià)廉易得。兩類主要的滲透促進(jìn)劑包括能夠滲透進(jìn)入上皮細(xì)胞的小分子化合物(如螯合劑、去污劑、表面活性劑、氨基酸衍生物等)和不能吸收至體內(nèi)的高分子聚合物(如交聯(lián)聚丙烯酸和殼寡糖等)。
殼聚糖是自然界中僅次于纖維素的取之不盡、用之不竭的第二大天然生物有機(jī)資源。殼聚糖(chitosan)也稱為幾丁聚糖，是甲殼質(zhì)(chitin)部分脫乙酰后的產(chǎn)物，它是一種線性聚陽離子多糖，脫乙酰度和分子量是其兩大理化指標(biāo)。結(jié)構(gòu)如下 甲殼質(zhì)廣泛存在于蟹、蝦、金龜子等甲殼類動(dòng)物外殼和香菇等真菌類以及細(xì)菌類細(xì)胞膜中。它是由2-氨基-2-脫氧葡萄糖單體通過β-(1，4)糖苷鍵連接起來的直鏈多糖，學(xué)名為(1，4)-2-氨基-2-脫氧-β-D葡萄糖，具有無生物毒性，生物相容性好以及生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)。目前，各種不同分子量、粘度和脫乙酰度的殼聚糖均可便捷得到。
殼寡糖(chitosan-oligosaccharide)是利用殼聚糖為原料，通過生物工程技術(shù)降解制備獲得的2-20個(gè)氨基葡萄糖以β-(1，4)糖苷鍵連接而成的低聚氨基葡萄糖。由于殼寡糖較低的分子量，呈水溶性，容易被人體吸收，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛。目前被廣泛用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、飲料工業(yè)、化妝品工業(yè)等多種工業(yè)領(lǐng)域中；也廣泛應(yīng)用于飼料業(yè)、植物土壤改良等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。
在醫(yī)藥保健領(lǐng)域，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證表明，殼寡糖具有如下作用增強(qiáng)人體免疫力；降血脂、降血糖作用；能防癌、控制癌細(xì)胞復(fù)發(fā)及抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；降低膽固醇含量，防治動(dòng)脈硬化；活化人體細(xì)胞、抑制細(xì)胞老化，延緩衰老；具有抗血栓、抗凝血、抗菌、保濕作用；全方位提高和強(qiáng)化身體的機(jī)能和體力；可排除人體內(nèi)鉛等有害重金屬，促進(jìn)鈣吸收等。
日化領(lǐng)域，殼寡糖可起活化細(xì)胞、抑制細(xì)菌、皮膚保濕等功能。
農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，通過對果蔬及大田作物的試驗(yàn)和全國各地實(shí)際應(yīng)用表明，殼寡糖有如下功能1、可令植物開啟免疫系統(tǒng)，提高免疫力；可令植物細(xì)胞壁拉長，促進(jìn)植物生長；可令植物細(xì)胞壁縮短加厚，使植物抗倒伏等等。2、可激活植物體內(nèi)各種酶系活性，使植物體各器官生長旺盛，從而提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。3、可誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生抗病酶系，提高植物抗病力，能殺滅引起根腐病、黑星病、疫霉病等病害的病菌，保證植物豐產(chǎn)豐收。4、可促使土壤中自生固氮菌、乳酸菌、纖維分解菌、放線均等有意酶的活性，保證植物在良好的土壤環(huán)境中生長。5、可使土壤中某些微生物分泌殺死線蟲的酶系，成為防治線蟲侵害植物的有效手段。6、可作為飼料添加劑，促進(jìn)畜禽健壯生長；可提高豬的瘦肉率。7、通過拌種、浸種、包衣等方法處理種子，可增強(qiáng)種子發(fā)芽勢力，提高種子發(fā)芽率，促使種子早出苗，出全苗、出壯苗等。水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，可作為魚餌料添加劑，促使魚蝦快速生長，提高產(chǎn)量等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供殼寡糖及其衍生物作為抗HIV-1多肽藥物載體的應(yīng)用。
本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了殼寡糖作為抗HIV-1多肽藥物載體的應(yīng)用。所述的殼寡糖的分子式為 本發(fā)明所述的殼寡糖為分子量范圍為1000～10000、脫乙酰度為75％～100％的殼寡糖。
更進(jìn)一步，本發(fā)明采述的殼寡糖為分子量范圍為2000～8000、脫乙酰度為80％～90％的殼寡糖。
更進(jìn)一步，本發(fā)明采述的殼寡糖為脫乙酰度為85％分子量為5000的殼寡糖。
更進(jìn)一步，本發(fā)明采述的殼寡糖的平均粒子直徑為20～100nm。
更進(jìn)一步，本發(fā)明中所述的多肽藥物主要指抗HIV-1的C22和M3多肽。此處的C22和M3多肽參見中國專利200510023542.1和200510028550.5。
本發(fā)明的另一方面，提供了殼寡糖的衍生物作為抗HIV-1多肽藥物載體的應(yīng)用。所述的衍生物包括殼寡糖鐵配合物。
由上述內(nèi)容可見，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、增加低吸收率的多肽藥物的生物利用率；2、控制多肽藥物的釋放；3、減少多肽藥物對胃腸粘膜的刺激；4、保持多肽藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性；5、提高多肽藥物的靶向性。


圖1為殼寡糖的透射電鏡2為殼寡糖鐵配合物的透射電鏡圖具體實(shí)施方式
本發(fā)明中使用的殼寡糖為濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司公司生產(chǎn)的純度為醫(yī)藥食品級(jí)的殼寡糖。
實(shí)施例1殼寡糖的純化和納米粒的制備純化由于殼寡糖中含有灰分等一些雜質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將其進(jìn)行純化。將脫乙酰度為85％分子量為5000的殼寡糖溶于1％的醋酸中過濾去除不溶性的雜質(zhì)，用大量超純水沖洗濾液至中性，而后用0.22μm的尼龍膜過濾，冷凍干燥得到純化后的殼寡糖。
納米粒的制備水溶性的殼寡糖由于分子內(nèi)的氨基，可在水溶液中進(jìn)行分子自組裝形成納米粒。使用2％磷鎢酸鈉作為負(fù)染液，取少量殼寡糖納米粒溶液滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置10min，用濾紙吸干懸液，再滴加2％(w/v)磷鎢酸鈉負(fù)染5min，于JEOL型號(hào)為1230的透射電子顯微鏡(加速電壓為100kv)下觀察納米粒的形態(tài)。
實(shí)施例2取實(shí)施例1中制備的殼寡糖和多肽C22，在pH為6.0左右室溫下持續(xù)攪拌進(jìn)行共混復(fù)合，采用超濾膜進(jìn)行過濾分離，制得殼寡糖/多肽C22復(fù)合物納米粒，并冷凍干燥。
實(shí)施例3準(zhǔn)確稱取1.25g按照實(shí)施例1中的方法純化后的脫乙酰度為70％分子量為5000的殼寡糖溶于25ml超純水中，加入三口燒瓶，用1％的HAC調(diào)節(jié)pH＝3.0，在500rpm恒速攪拌下，緩慢加入等體積的0.01M FeCl3溶液，室溫下反應(yīng)12h后，在分子量為2000的超濾膜上用超純水清洗，直至溶液為中性，并除去未反應(yīng)完全的FeCl3，冷凍干燥可得淡黃色的殼寡糖-鐵配合物粉末，冷凍干燥。
實(shí)施例4按照實(shí)施例2的方法將實(shí)施例3中制備的殼寡糖衍生物與多肽藥物M3復(fù)合。
實(shí)施例5取實(shí)施例2和實(shí)施例4中的產(chǎn)物和空白殼寡糖納米粒子置于含6ml磷酸緩沖液(pH7.4PBS)試管中，置于轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/min的搖床中37℃恒溫處理。適當(dāng)間隙，樣品在4℃下最大轉(zhuǎn)速離心30min，取出4ml上層清液，用新鮮磷酸緩沖液補(bǔ)充，用考馬斯亮藍(lán)法計(jì)算釋放出的多肽的量。結(jié)果表明，殼聚糖及其衍生物作為多肽藥物載體能夠很好的控制多肽藥物的釋放。
實(shí)施例6用RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco產(chǎn)品)培養(yǎng)新鮮的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。經(jīng)植物凝集素和IL-2(T細(xì)胞生長因子)活化3天后，用HIV-1感染PBMC1小時(shí)，PBS洗兩次除掉未感染的HIV，細(xì)胞重懸于RPMI 1640培液(含10ng/ml IL-2)中，以1×10-5個(gè)/孔加入含有不同濃度載體抑制劑的96孔板中。HIV感染5天后，用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒INVITROGEN產(chǎn)品)檢查HIV p24抗原的量，以空白培液組為對照。HIV的感染率為樣品孔和對照孔HIV p24抗原釋放量的比值。
權(quán)利要求
1.殼寡糖作為抗HIV-1多肽藥物載體的應(yīng)用。
2.殼寡糖的衍生物作為抗HIV-1多肽藥物載體的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的殼聚糖衍生物為殼寡糖鐵配合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的殼寡糖分子量范圍為1000～10000、脫乙酰度為75％～100％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的殼寡糖分子量范圍為2000～8000、脫乙酰度為80％～90％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的殼寡糖脫乙酰度為85％分子量為5000。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的殼寡糖的平均粒子直徑為20～100nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的多肽藥物主要指抗HIV-1的C22和M3多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了殼寡糖及其衍生物作為抗HIV－1多肽藥物載體的應(yīng)用。殼聚糖及其衍生物作為抗HIV－1多肽藥物載體，可以增加低吸收率的多肽藥物的生物利用率；控制多肽藥物的釋放；減少多肽藥物對胃腸粘膜的刺激；保持多肽藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性；提高多肽藥物的靶向性。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1977973SQ200510110989
公開日2007年6月13日 申請日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者汪世龍, 孫曉宇, 張蕤, 黃進(jìn), 姚思德 申請人:同濟(jì)大學(xué)