專(zhuān)利名稱(chēng)：一種促進(jìn)骨再生的微膠囊及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種微膠囊，特別關(guān)于一種促進(jìn)骨再生的微膠囊。
背景技術(shù)：
目前骨再生的基因治療利用自體干細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，如利用腺病毒載體攜帶的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因，轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，再植入骨缺損部位，促進(jìn)骨再生。目前在大小動(dòng)物身上均已取得成功。但現(xiàn)在的骨再生基因治療還有以下缺點(diǎn)(1)均利用自體細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，由于細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增需要較長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)法用于急診病人；即使對(duì)于擇期手術(shù)的病人，需要病人首先來(lái)院取骨髓，待細(xì)胞培養(yǎng)到所需數(shù)量(根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，獲得107細(xì)胞需要25天左右時(shí)間)后再來(lái)醫(yī)院，難以為病人所接受。再者個(gè)體的的干細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量存在較大差異，難以保證所培養(yǎng)的每個(gè)病人的細(xì)胞均有較好的活力。如老年人骨髓中干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量都較年輕人差，患全身性疾病、代謝性疾病和化療的病人也同樣面臨干細(xì)胞數(shù)量不足、質(zhì)量下降的問(wèn)題。(2)如采用腺病毒作為基因的載體，腺病毒本身會(huì)誘導(dǎo)排斥反應(yīng)，限制了目的基因在體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間。(3)如利用異體或異種細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞，需使用全身性免疫抑制劑，對(duì)人體的免疫功能有一定的損害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供(1)一種促進(jìn)骨再生的微膠囊；(2)微膠囊在制備治療骨疾病藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的(1)攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的重組腺病毒，將BMP-2cDNA片段(由ATCC提供)插入載體PAC-CMV中，構(gòu)成重組質(zhì)粒PAC-CMVBMP2，再將PAC-CMVBMP2經(jīng)Xho I酶切后與5型腺病毒基因經(jīng)Cla I酶切后的大片段在293細(xì)胞中同源重組，形成攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因-2基因的重組腺病毒。
(2)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染，取體重120g左右SD大鼠，氯胺酮腹腔麻醉。在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)股骨，用咬骨鉗截除其遠(yuǎn)近端。用10ml alpha-MEM完全培養(yǎng)基沖洗出骨髓組織，接種于100mm培養(yǎng)皿，每皿10ml，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育。3天后半量換液，1周后完全換液，以后每周換液2次。約于14天，貼壁細(xì)胞幾乎90％匯合，吸凈培養(yǎng)基，以PBS沖洗2次，加入1ml 0.05胰蛋白酶(含0.02％EDTA)，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育5分鐘，加入9ml低糖a-MEM完全培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶的活性。用吸管輕輕吹打細(xì)胞使成為單細(xì)胞懸液，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞稱(chēng)第一傳代細(xì)胞。同法進(jìn)行第2傳代細(xì)胞培養(yǎng)。第2傳代細(xì)胞近90％匯合后，吸干培養(yǎng)基，每皿加入4ml病毒工作液過(guò)夜(MOI＝100)，或不加處理，孵化過(guò)夜。吸凈病毒工作液，每皿加10ml alpha-MEM完全培養(yǎng)基(FCS經(jīng)熱滅活)繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)BMP-2基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊化將BMP-2基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞重新懸浮在過(guò)濾除菌的1.5％海藻酸鈉溶液中，細(xì)胞濃度3×106/ml。海藻酸鈉的細(xì)胞懸浮液通過(guò)注射器泵的7號(hào)鈍頭針滴出，通過(guò)大功率高壓脈沖微膠囊制備儀(參見(jiàn)實(shí)用新型專(zhuān)利微膠囊成型裝置(專(zhuān)利號(hào)00218100.2))，剪切注射器泵滴出的液滴，并控制其粒徑。海藻酸鈉細(xì)胞液滴在100mM氯化鈣溶液中凝膠化，約5分鐘后形成海藻酸鈣細(xì)胞膠珠；用生理鹽水清洗2次后，將海藻酸鈣細(xì)胞膠珠懸浮在過(guò)濾除菌的0.05％-0.1％聚賴(lài)氨酸溶液中5分鐘，聚賴(lài)氨酸與海藻酸鈣發(fā)生聚電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)成膜，形成包埋骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聚賴(lài)氨酸海藻酸鹽微膠囊。再用生理鹽水清洗2次，之后浸入0.15％海藻酸鈉溶液約5分鐘，形成又一層海藻酸鈉外衣，用生理鹽水清洗2次，然后用55mM檸檬酸鈉溶液20ml反應(yīng)6分鐘，微膠囊的中心部分被液化。經(jīng)生理鹽水清洗后，加入培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
本發(fā)明運(yùn)用微囊化技術(shù)的基本原理利用化學(xué)方法包埋移植用細(xì)胞，在細(xì)胞外形成完整的囊膜，即微膠囊。微膠囊具有選擇通透性，膜上的孔隙允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等小分子物質(zhì)自由進(jìn)出，但抗體等大分子物質(zhì)和免疫細(xì)胞被阻擋在囊外。微膠囊為其內(nèi)部提供了一個(gè)免疫保護(hù)的微環(huán)境，使微囊內(nèi)的細(xì)胞異體移植后，可以免受宿主排斥反應(yīng)的攻擊，而在異體存活并分泌治療性重組蛋白(一般分子量小于100kD)。因此，在細(xì)胞移植中使用微囊化技術(shù)，不僅不需要使用免疫抑制劑，還擴(kuò)大了移植供體的來(lái)源，同時(shí)也為治療骨缺損節(jié)約了時(shí)間。
本發(fā)明一種促進(jìn)骨再生的微膠囊，由以下方法制得(1)腺病毒載體攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因；(2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)；(3)攜帶成骨基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；(4)骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊化。
步驟(1)和步驟(4)中骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因?yàn)楣切螒B(tài)發(fā)生蛋白基因2。
步驟(2)骨髓選自大鼠骨髓。
步驟(2)中用alpha-MEM完全培養(yǎng)基沖洗出骨髓組織。
步驟(4)中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮在海藻酸鈉溶液中，經(jīng)處理形成海藻酸鈣細(xì)胞膠珠。將海藻酸鈣細(xì)胞膠珠懸浮聚賴(lài)氨酸溶液中，經(jīng)處理形成包埋骨髓基質(zhì)干細(xì)胞聚賴(lài)氨酸海藻酸鹽微膠囊。
本發(fā)明所公開(kāi)一種促進(jìn)骨再生的微膠囊，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在允許使用非自體(異體或異種)干細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，這樣減少取自體干細(xì)胞需擴(kuò)增培養(yǎng)的時(shí)間，用于急診病人，并可以先在體外篩選，能確保細(xì)胞的質(zhì)量，擴(kuò)大細(xì)胞和基因治療的應(yīng)用范圍。


圖1顯示BMP-2基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊化。
圖2A顯示微囊化第4天，體外X-gal染色確定微囊內(nèi)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的表達(dá)。
圖2B顯示微囊化第28天，體外X-gal染色確定微囊內(nèi)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的表達(dá)。
圖3顯示轉(zhuǎn)染BMP-2的MSC微囊體外分泌情況。每點(diǎn)5組，取平均值。每組微囊內(nèi)細(xì)胞總量約2.5×106/組，培養(yǎng)于15ml alpha-MEM(含15％小牛血清)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染取體重120g左右SD大鼠，氯胺酮腹腔麻醉。在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)股骨，用咬骨鉗截除其遠(yuǎn)近端。用10ml alpha-MEM完全培養(yǎng)基沖洗出骨髓組織，接種于100mm培養(yǎng)皿，每皿10ml，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育。3天后半量換液，1周后完全換液，以后每周換液2次。約于14天，貼壁細(xì)胞幾乎90％匯合，吸凈培養(yǎng)基，以PBS沖洗2次，加入1ml0.05胰蛋白酶(含0.02％EDTA)，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育5分鐘，加入9ml低糖a-MEM完全培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶的活性。用吸管輕輕吹打細(xì)胞使成為單細(xì)胞懸液，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞稱(chēng)第一傳代細(xì)胞。同法進(jìn)行第2傳代細(xì)胞培養(yǎng)。第2傳代細(xì)胞近90％匯合后，吸干培養(yǎng)基，每皿加入4ml病毒工作液過(guò)夜(MOI＝100)，或不加處理，孵化過(guò)夜。吸凈病毒工作液，每皿加10ml alpha-MEM完全培養(yǎng)基(FCS經(jīng)熱滅活)繼續(xù)培養(yǎng)。
實(shí)施例2
BMP-2基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊化(見(jiàn)圖1)將BMP-2基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞重新懸浮在過(guò)濾除菌的1.5％海藻酸鈉溶液中，細(xì)胞濃度3×106/ml。海藻酸鈉的細(xì)胞懸浮液通過(guò)注射器泵的7號(hào)鈍頭針滴出，通過(guò)大功率高壓脈沖微膠囊制備儀(參見(jiàn)實(shí)用新型專(zhuān)利微膠囊成型裝置(專(zhuān)利號(hào)00218100.2))，剪切注射器泵滴出的液滴，并控制其粒徑。海藻酸鈉細(xì)胞液滴在100mM氯化鈣溶液中凝膠化，約5分鐘后形成海藻酸鈣細(xì)胞膠珠；用生理鹽水清洗2次后，將海藻酸鈣細(xì)胞膠珠懸浮在過(guò)濾除菌的0.05％-0.1％聚賴(lài)氨酸溶液中5分鐘，聚賴(lài)氨酸與海藻酸鈣發(fā)生聚電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)成膜，形成包埋骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聚賴(lài)氨酸海藻酸鹽微膠囊。再用生理鹽水清洗2次，之后浸入0.15％海藻酸鈉溶液約5分鐘，形成又一層海藻酸鈉外衣，用生理鹽水清洗2次，然后用55mM檸檬酸鈉溶液20ml反應(yīng)6分鐘，微膠囊的中心部分被液化。經(jīng)生理鹽水清洗后，加入培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
實(shí)施例3體外X-gal染色確定微囊內(nèi)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的表達(dá)(見(jiàn)圖2A、圖2B)為了在體外評(píng)估基因治療的有效性，最首要的就是看所轉(zhuǎn)染的基因是否表達(dá)。為此，我們先轉(zhuǎn)染報(bào)告基因β-gal入MSC，再微囊化，觀(guān)察微囊內(nèi)細(xì)胞是否能持續(xù)分泌β-gal。轉(zhuǎn)染β-gal的MSC經(jīng)微囊化后7天，14，21，28天，分別運(yùn)用X-gal進(jìn)行組化染色。首先將微囊移入15ml離心管中，用0.5％戊二醛固定10分鐘，PBS洗三遍，再加入X-gal染液37℃5％CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜。X-gal染液含1mg/ml X-gal，35mM K3Fe(CN)6，35mMK3Fe(CN)6·3H2O，2mM MgCl2。次日放入10cm培養(yǎng)皿顯微鏡下觀(guān)察拍照。結(jié)果顯示，微囊內(nèi)的轉(zhuǎn)β-gal細(xì)胞能和未微囊的轉(zhuǎn)β-gal細(xì)胞一樣，分泌β-gal。并且至少能持續(xù)分泌28天。
實(shí)施例4ELI SA測(cè)定分泌至囊外的基因重組產(chǎn)物BMP2的含量(見(jiàn)圖3)轉(zhuǎn)染BMP-2基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微囊化后每隔2天在換液時(shí)留取上清液，，用ELISA法測(cè)量BMP2的含量。取出ELISA專(zhuān)用孔板，每孔先加入100ul Assay Diluent RD-19，再加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，用封膠封住，室溫下?lián)u床2小時(shí)。用400ul Wash Buffer洗孔，洗完后用力拍板，重復(fù)洗板4次，再每孔痂200ulBMP-2Conjugate室溫?fù)u床2小時(shí)，再重復(fù)洗孔4次，再加200ul Substrate Solution，避光室溫下30分鐘后，加入50ul StopSolution，混勻后酶標(biāo)儀下測(cè)OD450nm。同時(shí)以未轉(zhuǎn)染BMP-2基因的MSC培養(yǎng)上清做空白對(duì)照。結(jié)果顯示，在近一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)測(cè)BMP-2的含量。與空白組比較，差異明顯。表明微囊內(nèi)同樣能持續(xù)分泌BMP-2。
實(shí)施例5微囊內(nèi)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分泌的BMP2活性測(cè)定(見(jiàn)表1)為了驗(yàn)證微囊內(nèi)分泌的BMP-2的活性，我們把微囊(每孔微囊內(nèi)細(xì)胞1×106)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，觀(guān)察囊外MSC的轉(zhuǎn)化情況。分組(1)未轉(zhuǎn)染BMP-2的MSC微囊+MSC共培養(yǎng)(2)轉(zhuǎn)rhBMP-2的MSC微囊+MSC共培養(yǎng)，8天后行堿性磷酸酶(ALP，為成骨細(xì)胞的標(biāo)志蛋白)定量測(cè)定，培養(yǎng)基中加入VitC(50μg/ml)，每2天更換1/3培養(yǎng)基，于8天后吸凈培養(yǎng)基，用Tris緩沖鹽溶液沖洗三次，每皿加入0.5ml 50mmol/L的Tris，用細(xì)胞刮收集，放置于-20℃凍存?zhèn)錅y(cè)。檢測(cè)時(shí)，室溫下解凍，細(xì)胞經(jīng)超聲裂解，用ALP定量檢測(cè)試劑盒(Sigma)測(cè)定裂解液中ALP的濃度。各組的樣本數(shù)均為5。結(jié)果顯示，Adv-hBMP-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊組內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP活性明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊組，p＜0.05。
表1各組ALP活性(sigma unit/ml裂解液)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，IU)

p＜0.05兩組差別有顯著性
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)骨再生的微膠囊，由以下方法制得(1)攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的腺病毒載體；(2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)；(3)攜帶成骨基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；(4)骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微膠囊，其特征在于步驟(1)和步驟(4)中骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因?yàn)楣切螒B(tài)發(fā)生蛋白-2基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微膠囊，其特征在于步驟(2)骨髓選自大鼠骨髓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微膠囊，其特征在于步驟(2)中用alpha-MEM完全培養(yǎng)基沖洗出骨髓組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微膠囊，其特征在于步驟(4)中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮在海藻酸鈉溶液中，經(jīng)處理形成海藻酸鈣細(xì)胞膠珠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微膠囊，其特征在于將海藻酸鈣細(xì)胞膠珠懸浮聚賴(lài)氨酸溶液中，經(jīng)處理形成包埋骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聚賴(lài)氨酸海藻酸鹽微膠囊。
7.權(quán)利要求1所述的微膠囊在制備治療骨疾病藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)骨再生的微膠囊，該微膠囊由以下方法制得(1)攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的重組腺病毒；(2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)；(3)攜帶成骨基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；(4)骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊化。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在允許使用非自體干細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，這樣減少取自體干細(xì)胞需擴(kuò)增培養(yǎng)的時(shí)間，用于急診病人，并可以先在體外篩選，能確保細(xì)胞的質(zhì)量，擴(kuò)大細(xì)胞和基因治療的應(yīng)用范圍。
文檔編號(hào)A61K9/50GK1814303SQ200510110750
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者湯亭亭, 丁惠峰, 戴尅戎, 樓覺(jué)人 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院