專利名稱：一種人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞系，具體地說(shuō)是涉及一種人胎盤(pán)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞系，及其用途。
背景技術(shù)：
妊娠過(guò)程中，胎盤(pán)是維系母體和胎兒之間營(yíng)養(yǎng)和物質(zhì)交換的重要內(nèi)分泌器官，是胎兒發(fā)育和妊娠維持得以成功的重要保障。胎盤(pán)中最主要的組成細(xì)胞是滋養(yǎng)層細(xì)胞，包括單核的具有活躍增殖能力的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(CTB)和多核的承擔(dān)主要內(nèi)分泌功能的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞(STB)，STB是由CTB經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜融合而形成的。
從妊娠初始到結(jié)束，胎盤(pán)的大部分功能是由滋養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)執(zhí)行的。胚胎植入時(shí)，依靠滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜的識(shí)別、粘附和侵潤(rùn)，種植并錨定到子宮內(nèi)；同時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌多種激素、細(xì)胞因子等維持胚胎的正常發(fā)育和母胎間的營(yíng)養(yǎng)和物質(zhì)交換；妊娠結(jié)束時(shí)，滋養(yǎng)層細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生蛋白酶等促使胎盤(pán)從子宮上剝離。臨床上，許多妊娠相關(guān)疾病都與滋養(yǎng)層細(xì)胞功能障礙有關(guān)，如自發(fā)流產(chǎn)、先兆子癇、葡萄胎、絨毛膜上皮癌等。因此，在胚胎植入和妊娠發(fā)生的生理及病理研究中，滋養(yǎng)層細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的研究是關(guān)鍵的中心環(huán)節(jié)。
近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，很多學(xué)者致力于建立人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，以獲得能夠模擬正常生理?xiàng)l件下滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)的研究模型。最常用的是絨毛膜上皮癌細(xì)胞系，如Jar，JEG，BeWo，NUC-1，HCCM-5等在文獻(xiàn)1Ringler GE，Strauss JF III(1990)In vitro system for the study of human placental endocrine function.Endocr Rev 11，105-123中所述，它們雖然在某些內(nèi)分泌功能上與正常滋養(yǎng)層細(xì)胞有一定的相似之處，但大部分功能調(diào)節(jié)尤其是增殖調(diào)節(jié)方面與正常細(xì)胞截然不同。Ho等在文獻(xiàn)2Ho CK，Chiang H，Li SY，Yuan CC，Ng HT(1987)Establishment and characterization of atumorigenic trophoblast-like cell line from a human placenta.Cancer Res 47，3220-3224.中報(bào)道了一種來(lái)自于正常足月胎盤(pán)的滋養(yǎng)層樣細(xì)胞系-TL，但該細(xì)胞不能合成多種胎盤(pán)來(lái)源的激素，而且細(xì)胞形態(tài)和特性不均一，具有非整倍體染色體核型，在免疫功能缺陷的裸鼠中能夠引發(fā)腫瘤產(chǎn)生，因而被認(rèn)為是一群腫瘤化的非正常滋養(yǎng)層細(xì)胞系。1992年，Lei等在文獻(xiàn)3Lei KJ，Gluzman Y，Pan CJ，Chou JY(1992)Immortalization ofvirus-free human placental cells that express tissue-specific functions.Mol Endocrinol 6，703-712中，用溫度敏感型的猴病毒SV40大T抗原基因轉(zhuǎn)化人細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，獲得幾株細(xì)胞，它們?cè)?7℃的培養(yǎng)條件下，能夠以腫瘤細(xì)胞的方式無(wú)節(jié)制增殖，在40℃培養(yǎng)條件下，增殖方式類似于正常細(xì)胞，但其激素分泌和調(diào)節(jié)方式卻與正常滋養(yǎng)層細(xì)胞不盡相同，因此這些細(xì)胞仍然無(wú)法作為正常細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的代表。事實(shí)上，到目前為止，國(guó)際上還沒(méi)有建立人正常滋養(yǎng)層細(xì)胞系，盡管眾多的學(xué)者付出了極大的努力。這主要是由于將人作為研究對(duì)象，倫理問(wèn)題導(dǎo)致獲得人胎盤(pán)組織這一研究材料有一定的障礙(尤其在西方國(guó)家)，同時(shí)由于人的個(gè)體差異性很大，導(dǎo)致了來(lái)自于不同研究者的結(jié)果相互矛盾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種永生化的、保持正常滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系，及其用途。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系，是通過(guò)下述步驟建立的從人正常妊娠6-7周的胎盤(pán)組織中分離到細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞；從中篩選出具有增殖能力的細(xì)胞群；經(jīng)過(guò)端粒酶催化亞基基因轉(zhuǎn)染，獲得了4個(gè)具有端粒酶活性的長(zhǎng)壽命的細(xì)胞株B6Tert-1、B6Tert-2、B6Tert-3和B6Tert-4。
本發(fā)明建立的B6Tert-1細(xì)胞，已于2005年9月22日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No.1461。
對(duì)B6Tert-1細(xì)胞進(jìn)行生化和增殖特性的鑒定細(xì)胞形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡下觀察，B6Tert-1細(xì)胞在培養(yǎng)皿中保持單層生長(zhǎng)，為多角型的上皮樣細(xì)胞，細(xì)胞為單核，每個(gè)細(xì)胞中含有1-5個(gè)核仁；在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中很少觀察到多核細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞接種密度較低時(shí)，一些細(xì)胞可以伸拉得很長(zhǎng)，用延伸的偽足樣結(jié)構(gòu)聯(lián)系相距較遠(yuǎn)的細(xì)胞，如圖1所示。這種均一的細(xì)胞形態(tài)一直保持到210世代，并能夠繼續(xù)延續(xù)。
本發(fā)明建立的B6Tert-1細(xì)胞具備正常細(xì)胞的增殖特性和人類細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的生化功能，而且在裸鼠中不致瘤；同時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，已經(jīng)達(dá)到210世代，是一種永生化的人正常細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞系，可用作篩選抗生育藥物和治療妊娠相關(guān)疾病藥物的靶細(xì)胞模型，也為進(jìn)一步研究人滋養(yǎng)層細(xì)胞功能提供了理想的體外模型，為研究胚胎植入和妊娠發(fā)生生理及病理機(jī)制的重要基礎(chǔ)。


圖1為在相差倒置顯微鏡下觀察到的B6Tert-1細(xì)胞；其中，(A)為80世代的B6Tert-1細(xì)胞；(B)為接種密度較低時(shí)的B6Tert-1細(xì)胞，可伸出長(zhǎng)的偽足樣結(jié)構(gòu)(*)；標(biāo)尺為25μm。
圖2為核酸印跡分析顯示B6Tert-1細(xì)胞中hCGα和hCGβmRNA的表達(dá)，以胎盤(pán)絨毛(Placenta villi)來(lái)源的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，管家基因GAPDH作為內(nèi)參照。
圖3為RT-PCR分析顯示B6Tert-1細(xì)胞中多種MMPs和TIMPs mRNA的表達(dá)模式，以胎盤(pán)絨毛組織(Placenta vill)來(lái)源的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，管家基因GAPDH作為PCR反應(yīng)的內(nèi)參照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.B6Tert-1細(xì)胞系的建立首先從妊娠6-7周齡的人工流產(chǎn)胎盤(pán)(此時(shí)也可以稱之為絨毛)中分離細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞。從計(jì)劃生育門(mén)診獲得無(wú)菌的絨毛組織3-5個(gè)，于冰浴中帶回實(shí)驗(yàn)室；以下操作均在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行。將組織置于預(yù)先冷卻到4℃的PBS緩沖液中，洗去沾染的血塊；將組織轉(zhuǎn)移到新鮮的PBS緩沖液中，于解剖鏡下分離絨毛和基底膜并棄去基底膜；收集絨毛并剪碎成2-3mm3的小塊，轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，加入含有0.2-0.3％的胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)的PBS緩沖液20ml，混勻后于4-9℃消化30-50min；離心(1000rpm，5min)后棄去上請(qǐng)液，加入20ml新鮮的FD培養(yǎng)液和終濃度為20-40IU/mL的DNA酶(美國(guó)GIBCO公司)，常溫下消化5-15min；離心(1000rpm，5min)后棄去上請(qǐng)液，加入20-40ml新鮮的FD培養(yǎng)液懸浮組織，經(jīng)150目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心(1000rpm，5min)收集細(xì)胞；加入2mlFD培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，同時(shí)在10ml離心管中制備1.25％-2.5％的BSA密度梯度(下層為2ml配制于FD培養(yǎng)液的2.5％BSA溶液，上層為2ml配制于FD培養(yǎng)液的1.25％BSA溶液)，將細(xì)胞懸液小心加入BSA密度梯度上層，保持直立并在室溫下沉降30-60min；收集最下層的細(xì)胞，用FD培養(yǎng)液懸浮后，按照2-4X105/皿的密度接種于涂有6-10μg/cm2Cellmatrix(I型膠原，日本Osaka生物化學(xué)研究所)的35mm培養(yǎng)皿中，所用的條件培養(yǎng)液為添加了10ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(美國(guó)Sigma公司)、1μg/mL胰島素(美國(guó)Sigma公司)、2mmol/L谷胺酰胺和0.1％BSA(美國(guó)Sigma公司)的FD培養(yǎng)液，1.5-2ml/皿，于37℃，5％CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，更換新鮮的條件培養(yǎng)液。
然后從培養(yǎng)的細(xì)胞中篩選能夠保持增殖能力的細(xì)胞群。在上述培養(yǎng)條件下，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1-2個(gè)月，每24-48小時(shí)更換一次培養(yǎng)液。期間有大量的細(xì)胞漂浮起來(lái)并死亡，但有少量細(xì)胞保持貼壁生長(zhǎng)，并開(kāi)始緩慢增殖。待這些細(xì)胞增殖到鋪滿培養(yǎng)皿底面的70-90％時(shí)，進(jìn)行消化傳代，具體方法是棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗培養(yǎng)皿一次，加入1ml含0.05-0.1％胰蛋白酶的PBS液，將培養(yǎng)皿置于冰上5-10min，棄去胰蛋白酶液，加入100-200μl PBS液，將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)5-10min，取出并加入適量條件培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于另外2-3個(gè)新的涂有Cellmatrix的35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)按照上述方法培養(yǎng)。
隨后向細(xì)胞中導(dǎo)入端粒酶催化亞基基因(htert)。培養(yǎng)上述增殖細(xì)胞至第10-20代，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底面的40-60％時(shí)，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。具體方法是1)準(zhǔn)備至少2皿細(xì)胞；2)在一個(gè)小管中，將6μl FuGene6(德國(guó)Boehringer Mannheim公司)試劑與94μlFD培養(yǎng)液均勻混和，于室溫下放置5min；3)另取兩個(gè)小管，一個(gè)加入溶解在5-20μl水中的10-40μg htert表達(dá)質(zhì)粒pGRN145(美國(guó)Geron公司)，另一個(gè)加入等體積的水；4)將2)中稀釋的FuGene6試劑分別逐滴加入3)中的兩個(gè)小管中，同時(shí)輕柔搖動(dòng)小管以混勻；室溫放置15min；5)將4)中混勻的試劑分別加入1)中準(zhǔn)備好的兩個(gè)培養(yǎng)皿中，注意保證在培養(yǎng)皿各個(gè)部位均勻滴加；其中加入FuGene 6試劑和htert表達(dá)質(zhì)粒pGRN145混合物的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，另一個(gè)加入FuGene 6試劑和水混合物的細(xì)胞為陰性對(duì)照組；6)將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10小時(shí)；7)更換新鮮的條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；8)加入3-10μg/ml Hygromycin(美國(guó)SIGMA公司)，連續(xù)培養(yǎng)5-10天，并通過(guò)更換培養(yǎng)液棄去死亡的細(xì)胞。
之后進(jìn)行細(xì)胞的克隆和擴(kuò)增工作。細(xì)胞經(jīng)過(guò)上述基因轉(zhuǎn)染和藥物篩選處理后，對(duì)照組的細(xì)胞幾乎全部死亡，而實(shí)驗(yàn)組有1-5％的細(xì)胞存活，并且呈現(xiàn)小克隆生長(zhǎng)。借助顯微鏡觀察，標(biāo)記出這些小克隆，棄去培養(yǎng)液后，將底部涂有薄層凡士林油的克隆環(huán)蓋在標(biāo)記的克隆上面，按照前面所述的方法將各個(gè)克隆環(huán)內(nèi)的細(xì)胞消化下來(lái)，分別接種于涂有Cellmatrix的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入1ml條件培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿70-90％培養(yǎng)板底面后，再次消化并接種于涂有Cellmatrix的35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，按照1∶3的比例進(jìn)行消化傳代，使細(xì)胞逐漸得以擴(kuò)增。
在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，為了能夠保存細(xì)胞，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷凍。細(xì)胞消化后，移入10ml離心管中，并添加5-10ml FD培養(yǎng)液，離心(1000rpm，5min)并棄去上清液，用1ml預(yù)先冷卻至4℃的細(xì)胞冷凍液(FD培養(yǎng)液中添加10％胎牛血清和10％二甲基亞砜)懸浮細(xì)胞，移入細(xì)胞凍存管中，依次置于4℃ 30min，-20℃ 60min和-80℃過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入液氮中保存。
經(jīng)過(guò)上述過(guò)程，共獲得4個(gè)穩(wěn)定的克隆細(xì)胞株，分別被命名為B6Tert-1、B6Tert-2、B6Tert-3和B6Tert-4。經(jīng)過(guò)近3年的培養(yǎng)，目前B6Tert-1細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到210世代(細(xì)胞分裂一次即為一個(gè)世代)，沒(méi)有出現(xiàn)任何衰老特征。細(xì)胞生物學(xué)界普遍接受的觀點(diǎn)是細(xì)胞壽命超過(guò)100世代即為達(dá)到了永生化，因此我們所建立的B6Tert-1細(xì)胞已經(jīng)是永生化的細(xì)胞。該B6Tert-1細(xì)胞已于2005年9月22日保藏于保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No.1461。
實(shí)施例2.細(xì)胞增殖特性分析1)細(xì)胞的增殖速度B6Tert-1(80PDs)細(xì)胞按照104個(gè)/皿接種于涂有Cellmatrix的35mm培養(yǎng)皿中，從第1-11天每天均隨機(jī)取三皿進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并由此繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，B6Tert-1的細(xì)胞倍增時(shí)間為36小時(shí)；細(xì)胞于第9天達(dá)到匯合狀態(tài)(即細(xì)胞緊密接觸，培養(yǎng)皿內(nèi)沒(méi)有多余的空隙)，此時(shí)細(xì)胞增殖速度減慢并最終停止增殖。這種現(xiàn)象被成為細(xì)胞生長(zhǎng)的“接觸抑制”，是正常細(xì)胞的增殖特性之一。
2)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)將B6Tert-1細(xì)胞按照5×105個(gè)/皿接種于涂有Cellmatrix的35mm培養(yǎng)皿中，用1-100ng/ml EGF刺激細(xì)胞48小時(shí)后，各個(gè)刺激劑量分別選取三皿細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，B6Tert-1細(xì)胞增殖受EGF調(diào)節(jié)，1-100ng/ml EGF能夠刺激B6Tert-1細(xì)胞增殖，隨著EGF濃度的增加，細(xì)胞增殖速度也加快，EGF對(duì)細(xì)胞增殖的最大刺激效應(yīng)為100ng/ml。
將B6Tert-1細(xì)胞按照5×105個(gè)/皿接種于涂有Cellmatrix的35mm培養(yǎng)皿中，加入10ng/ml EGF，同時(shí)加入0，0.1，1和10ng/ml TGFβ，處理48小時(shí)后，每一刺激劑量分別選取三皿細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，在B6Tert-1細(xì)胞中，TGFβ本身并不影響細(xì)胞增殖，但能夠部分地拮抗EGF的作用；10ng/ml TGFβ作用48小時(shí)使兩種細(xì)胞中EGF引起的細(xì)胞增殖量均減少了約35％。
可見(jiàn)，B6Tert-1細(xì)胞的增殖分別受到不同生長(zhǎng)因子的正向和副向調(diào)節(jié)作用，具有較強(qiáng)的可調(diào)節(jié)性。
實(shí)施例3.細(xì)胞致瘤性分析(Tumorigenicity)將生長(zhǎng)至80世代和210世代的B6Tert-1細(xì)胞按照107細(xì)胞/100μl分別皮下注射至裸鼠中，每個(gè)世代的細(xì)胞注射3只裸鼠。觀察裸鼠中的腫瘤生長(zhǎng)狀況。三個(gè)月后，未見(jiàn)裸鼠中有任何腫瘤形成?？梢?jiàn)，B6Tert-1細(xì)胞不具備致瘤性。
實(shí)施例4.染色體分析對(duì)80世代和210世代的B6Tert-1細(xì)胞進(jìn)行染色體分析，通過(guò)分析各自約100個(gè)分裂中期的細(xì)胞染色體，發(fā)現(xiàn)它們都有正常人體細(xì)胞的雙倍體核型，含有46條染色體，其中包括性染色體X和Y?？梢?jiàn)，B6Tert-1細(xì)胞的染色體為正常細(xì)胞核型。
實(shí)施例5.滋養(yǎng)層細(xì)胞特性分析選用80-100世代的B6Tert-1細(xì)胞進(jìn)行生化特性分析，結(jié)果分別敘述如下1)細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin，CK)的表達(dá)細(xì)胞角蛋白是上皮來(lái)源的細(xì)胞中特異的細(xì)胞骨架蛋白，可以分為多種亞型。人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞是上皮來(lái)源的細(xì)胞，具有CK7，Ck8，CK18等多種細(xì)胞角蛋白。
實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定B6Tert-1細(xì)胞中CK8蛋白的分布。將培養(yǎng)的B6Tert-1細(xì)胞用0.125％的戊二醛(含3％蔗糖)于37℃固定20分鐘，然后孵育于0.3％的H2O2中以去除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶。滴加鼠抗人CK8抗體(1∶100；SIGMA)后于4℃孵育過(guò)夜。第二天，用PBS洗細(xì)胞3遍后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Polymer(DAKOEnvisionTM試劑盒提供)室溫孵育30min，PBS洗3遍。加入二氨基聯(lián)苯胺顯色5-15min，自來(lái)水沖洗以終止顯色反應(yīng)。在顯微鏡下進(jìn)行陽(yáng)性信號(hào)的觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超過(guò)99％的B6Tert-1細(xì)胞都呈現(xiàn)CK8的免疫陽(yáng)性染色，表明它們都是上皮細(xì)胞來(lái)源，符合正常滋養(yǎng)層細(xì)胞的特性。
2)人絨毛膜促性腺激素(hCG)的表達(dá)人絨毛膜促性腺激素hCG是人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞特異產(chǎn)生的激素，該蛋白主要由兩個(gè)亞基組成，即hCGα和hCGβ。正常情況下，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞只能夠合成hCGα，不具備激素功能，只有合體滋養(yǎng)層細(xì)胞才能夠合成兩種亞基，組成功能性的hCG蛋白。因此，hCGα的表達(dá)可以作為細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的標(biāo)志，而hCGβ的表達(dá)是細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生合體化的標(biāo)志之一。檢測(cè)這些分子表達(dá)的手段是核酸印跡分析。其具體的操作如下i.細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)總RNA的提取按TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))說(shuō)明提取細(xì)胞和組織中的總RNA按106細(xì)胞/ml TRIzol試劑的比例向細(xì)胞中加入TRIzol試劑；對(duì)于組織，則按照100mg組織/mlTRIzol試劑的比例加入TRIzol試劑，置于冰上，進(jìn)行勻漿，將勻漿后的液體收集到離心管中；上述樣本于室溫放置5min后加入200μl氯仿，用力振蕩25秒，室溫放置3min；4℃離心13,000rpm/15min使液體分層；將上層含RNA的水相吸至新離心管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕晃勻，室溫放置10min使RNA沉淀；4℃離心13,000rpm/10min，使RNA在離心管底積壓成小塊；傾去異丙醇，以70％乙醇洗滌RNA沉淀，4℃離心10,000rpm/5min收集RNA；室溫干燥，加入無(wú)菌水溶解RNA。
ii. RNA凝膠電泳和轉(zhuǎn)移將1.6g瓊脂糖混入100ml去離子水中，加熱溶解，待冷卻至60℃左右后，加入32ml 5×MOPS緩沖液和29.2ml甲醛，混勻倒入凝膠托板中，室溫下凝固1小時(shí)，制成1％的電泳凝膠。將25μg總RNA樣品(9μl)、4μl 5×MOPS、7μl甲醛、20μl去離子甲酰胺和4μl 10×加樣緩沖液(50％甘油，1mM EDTA(pH8.0)，0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯氰)混合，65℃加熱變性10min，迅速置于冰上冷卻5min。將樣品加入凝膠的點(diǎn)樣孔，按照4V/cm恒壓電泳，待溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部時(shí)停止電泳(約2-3h)。室溫下用去離子水漂洗凝膠，10min×2遍；以20×SSC緩沖液漂洗凝膠，室溫，15min×2遍。剪取適當(dāng)大小的Hybond+尼龍膜(美國(guó)Pharmacia公司)，在20×SSC中浸泡5min；將膠疊加在膜上，置于真空轉(zhuǎn)運(yùn)儀(Pharmacia)，50mBar轉(zhuǎn)移1-3h。轉(zhuǎn)移后的尼龍膜在2×SSC漂洗一下，在紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)10sec，使RNA與膜共價(jià)結(jié)合。尼龍膜可置于4℃保存。
iii.探針標(biāo)記和純化根據(jù)Genebank中hCGα、hCGβ基因和管家基因GAPDH的cDNA序列，分別設(shè)計(jì)引物序列如下，并由上海深能博采公司合成hCGα上游引物5’-CGAAGGGTTAGTGTCGAGC-3’下游引物5’-ATGGACTTGGAAGGCTGG-3’hCGβ上游引物5’-TTCCTACACCCTACTCCCTGT-3’下游引物5’-CCGGCAGGACCCCCTGCAGCA-3’GAPDH上游引物5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3’下游引物5’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’于冰上混勻下列反應(yīng)體系(總體積20μl)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)人胎盤(pán)組織總RNA(1μg/μl) 2μl寡聚脫氧鳥(niǎo)苷酸(500μg/ml，Promega公司) 1μl脫氧核糖核酸(10mmol/L，Invitrogen) 1μl無(wú)菌去離子水(Invitrogen) 12μl65℃加熱變性5min后，迅速置于冰上2min；再加入4μl 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(Invitrogen)，混勻，42℃孵育2min；再加入1μl Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)，混勻，42℃孵育50min。70℃加熱15min滅活反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物(即cDNA模板)保存在-20℃。
隨后于冰上混勻如下PCR反應(yīng)體系(總體積50μl)10×PCR緩沖液(Promega) 5μlMgCl2(25mmol/L，Promega) 2μldNTP(各10mmol/L) 1μl上游引物(10μmol/L)1μl下游引物(10μmol/L)1μl去離子水 37μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA模板 1μl
Taq DNA Polymerase (Promega) 2μl混勻后，在PCR儀上進(jìn)行如下擴(kuò)增程序94℃/3min→[94℃/30 sec→56-67℃(因不同的擴(kuò)增基因而不同)/30sec→72℃/50sec]×30個(gè)循環(huán)→72℃/5min。
PCR產(chǎn)物送交上海深能博采公司進(jìn)行測(cè)序，序列符合hCGα和hCGβ基因cDNA片段的可作為核酸印跡雜交的探針。
采用prime-a-gene試劑盒(Promega)按照隨機(jī)引物法進(jìn)行探針的[α-32P]放射性標(biāo)記。混和如下成分5×標(biāo)記緩沖液(Promega) 10μl無(wú)dCTP的dNTP混合物(Promega)2μl加熱至98℃變性的PCR產(chǎn)物25ng無(wú)核酸酶的BSA(Promega) 2μl[α-32P]dCTP(3000Ci/mmol，北京亞輝公司)5μlDNA聚合酶Klenow片段(Promega) 5U加無(wú)核酸酶的水到終體積 50μl混勻，室溫反應(yīng)1h，即可獲得[α-32P]標(biāo)記的cDNA探針。
iv.雜交尼龍膜貼壁置于雜交玻璃管內(nèi)，加入10ml預(yù)雜交液，65℃孵育4h；棄去預(yù)雜交液，加入5ml新鮮雜交液(預(yù)雜交液中加入10％硫酸葡聚糖)和變性探針(標(biāo)記好的探針于95-100℃水浴中加熱10min，迅速置于冰上)，混勻，65℃雜交過(guò)夜(15-20 h)。將雜交液倒在安全廢液缸中，用洗膜液I(1×SSC，0.1％SDS)室溫洗滌雜交膜30min，用洗膜液II(25mM的NaH2PO4.2H2O，25mM的Na2HPO4.12H2O，1mM的EDTA，1％SDS)于65℃洗膜30min×3次。雜交后的尼龍膜封于保鮮膜中，在暗室疊放于X光片(日本富士)上，置于壓片盒中，-80℃曝光1～7天。
v.洗片在暗室將X光片在顯影液中顯影，安全燈光(顯影紅燈)下觀察顯影程度，及時(shí)中止顯影，然后置于定影液中定影5min，自來(lái)水沖凈，晾干。
通過(guò)上述的核酸印跡雜交過(guò)程，發(fā)現(xiàn)B6Tert-1細(xì)胞中有一定水平的hCGα表達(dá)，而未檢測(cè)到hCGβ表達(dá)，如圖2所示。表明B6Tert-1細(xì)胞是細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，沒(méi)有發(fā)生合體化。
3)促性腺激素釋放激素(GnRH)的分布正常細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠產(chǎn)生一定量的GnRH。首先按照常規(guī)方法制備兔抗人GnRH多克隆抗體。將GnRH十肽與BSA耦聯(lián)，與付氏完全佐劑充分混勻后，按照150μg/只兔的蛋白量皮下多點(diǎn)注射新西蘭兔，每間隔兩周加強(qiáng)注射一次，共加強(qiáng)注射4次，從第三次免疫后一周開(kāi)始測(cè)定血清抗體滴度，末次免疫兩周后處死兔，并心臟采血，分離血清凍存于-20℃。
通過(guò)類似于細(xì)胞角蛋白檢測(cè)的免疫細(xì)胞化學(xué)分析方法，分析GnRH在細(xì)胞中的分布情況，結(jié)果表明超過(guò)98％的B6Tert-1細(xì)胞呈現(xiàn)GnRH免疫陽(yáng)性反應(yīng)，信號(hào)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。這進(jìn)一步說(shuō)明B6Tert-1細(xì)胞具備細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的特性。
4)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其組織抑制因子(tissueinhibitor of MMPs，TIMPs)的表達(dá)MMPs和TIMPs是細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白酶和抑制劑，它們的產(chǎn)生使滋養(yǎng)層細(xì)胞具備一定的侵潤(rùn)能力。本研究應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)B6Tert-1細(xì)胞產(chǎn)生MMPs和TIMPs的能力。
根據(jù)目的基因的GenBank登錄號(hào)，檢索其cDNA序列。利用Omiga軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(見(jiàn)下表1)，由上海申能博彩公司合成。
表1 用于PCR反應(yīng)的引物序列和反應(yīng)條件

隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)，具體方法如上所述。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，將0.2g瓊脂糖加入20ml TE緩沖液中，加熱溶解后，倒入凝膠托板中，制成1％瓊脂糖凝膠；將10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入凝膠的加樣孔中，按照4V/cm恒壓電泳，待溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部時(shí)停止電泳(約1-2h)。在紫外燈下檢測(cè)PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，并用凝膠紫外掃描分析儀成像(美國(guó)UnitedBio公司)，如圖3所示，RT-PCR分析顯示B6Tert-1細(xì)胞中多種MMPs和TIMPs mRNA的表達(dá)模式，胎盤(pán)絨毛組織(Placenta vill)來(lái)源的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，管家基因GAPDH作為PCR反應(yīng)的內(nèi)參照。
通過(guò)上述的RT-PCR反應(yīng)，證實(shí)B6Tert-1細(xì)胞中有MMP-2、-9、-14及TIMP-1、-2、-3，-4mRNA的表達(dá)，具備一定的侵潤(rùn)能力。
上述細(xì)胞增殖和生化特性的鑒定，表明B6Tert-1細(xì)胞具備正常細(xì)胞的增殖特性和人類細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的生化功能，而且在裸鼠中不致瘤；同時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，已經(jīng)達(dá)到210世代。因此，B6Tert-1細(xì)胞是永生化的人正常細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞系。
本發(fā)明中提到的幾種溶液的配方如下1.FD培養(yǎng)液將下列藥品溶解后，經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾并無(wú)菌保存于4℃。
F12(GIBCO公司)10.6gDMEM(GIBCO) 13.4g青霉素20萬(wàn)單位鏈霉素20萬(wàn)單位HEPES 1.686gNaHCO32.4g去離子水 2000ml2.PBS緩沖液將下列藥品溶解后，經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾并無(wú)菌保存于4℃。
NaCl 8gKCl 0.3gNa2HPO4 1.83gKH2PO40.02g葡萄糖2g去離子水 1000ml
3.5XMOPs緩沖液乙酸鈉2.72gMOPs 10.3g0.5M EDTA 5ml將上述藥品混和于493ml去離子水中，加入2ml 10NNaOH混勻后，經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾并避光保存于常溫。
4.20XSSC緩沖液將下列藥品溶解于1000ml去離子水中，并用1N NaOH調(diào)節(jié)PH值為7.0。常溫保存。
NaCl175.3g檸檬酸三鈉 88.2g5.預(yù)雜交液將下列試劑溶解于去離子水中，并定容至100ml。保存于4℃。
SDS(十二烷基磺酸鈉) 7gNa2HPO4-12H2O 4.9gNaH2PO4 0.988g0.5M EDTA 0.2mlBSA 1g甲酰胺15ml6.TE緩沖液0.5M Tris緩沖液(pH8.0)2ml0.5M EDTA 0.2ml去離子水 98ml7.0.5M Tris緩沖液(pH8.0)在800ml去離子水中溶解60.55g Tris，加入約21ml濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，用去離子水定容至1000ml。
權(quán)利要求
1.一種人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系，于2005年9月22日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No1461。
2.如權(quán)利要求1所述的人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系，其為通過(guò)下述步驟建立的從人正常妊娠6-7周的胎盤(pán)組織中分離到細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞；從中篩選出具有增殖能力的細(xì)胞群；經(jīng)過(guò)端粒酶催化亞基基因轉(zhuǎn)染，獲得了4個(gè)具有端粒酶活性的長(zhǎng)壽命的細(xì)胞株。
3.一種權(quán)利要求1所述的人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系在用作人滋養(yǎng)層細(xì)胞功能研究和篩選抗生育藥物及治療妊娠相關(guān)疾病藥物的靶細(xì)胞模型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系，于2005年9月22日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No.1461。該人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系是通過(guò)下述步驟建立的從人正常妊娠6－7周的胎盤(pán)組織中分離到細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞；從中篩選出具有增殖能力的細(xì)胞群；經(jīng)過(guò)端粒酶催化亞基基因轉(zhuǎn)染，獲得了4個(gè)具有端粒酶活性的長(zhǎng)壽命的細(xì)胞株。本發(fā)明建立的細(xì)胞系具備正常細(xì)胞的增殖特性和人類細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的生化功能，而且在裸鼠中不致瘤；同時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，已經(jīng)達(dá)到210世代，是一種永生化的人正常細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞系，可用作篩選抗生育藥物和治療妊娠相關(guān)疾病藥物的靶細(xì)胞模型，也為進(jìn)一步研究人滋養(yǎng)層細(xì)胞功能提供了理想的體外模型，為研究胚胎植入和妊娠發(fā)生生理及病理機(jī)制的重要基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K35/50GK1935990SQ20051008650
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者王雁玲, 莊臨之, 仇巍, 李玉俠, 李榮皓 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所