專利名稱：血液組分的深低溫保藏和復蘇改進的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般地涉及保存血液和血液組份，更具體地，本發(fā)明涉及一種在冷凍前向紅細胞里添加深低溫保藏液以及使用前將其從紅細胞中洗去的改進系統(tǒng)。
背景技術：
人的血液主要包括三種特化細胞紅細胞、白細胞和血小板。這些細胞懸浮在一種被稱為血漿的蛋白質及其他化學物質混合物水溶液中。在過去，輸血一直使用全血，但當前傾向于對特殊病人僅收集和輸送他所需要的那些血液組份。這種方法能保存有效的血液供應，在多數(shù)情況下對病人有利，因為病人不接觸不需要的血液組份。
血液組份一般從供血者采集的全血中獲得。一種一次性使用的由器具(例如輸液管和接頭)、采血針和一個或多個收集袋組成的血液采集裝置，用于從供血者采集全血。詳細地說，將采血針扎入供血者的手臂，血液在重力的作用下流入裝有抗凝劑的收集袋里。隨后，用血液處理器將全血分成一種或多種要求的組份。血液處理器包括旋轉的分離室，它使全血多次受到重力的作用，從而根據(jù)密度將各種血液組份分開。即密度大的組份如紅細胞(RBCs)聚集在分離室里的外周，而密度小的組份通過一個出口流出。當分離過程完成后，分離室里的RBCs被移去。血液組份也可以通過單采血液成分術(apheresis)獲得，來自供血者的全血直接提供給血液處理器進行分離和收集。對于這種方法，任何未收集的血液組份都可直接回輸給供血者。
收集的血液組份在回輸給供血者或輸給其他病人之前可以保存。例如，單個的血液組份如RBCs可以在4℃左右冷藏數(shù)天。還有其它方法冷凍RBCs來進一步延長它們的儲存時間。例如，根據(jù)RBCs的制備方法，RBCs能在-80℃或-160℃左右深低溫保藏數(shù)年。
具體地說，RBCs通常與甘油一起保存，甘油在冷凍之前穿過細胞膜。沒有甘油，RBCs在冷凍過程中不能存活。授予Valeri的名稱為用于儲存和處理血液的設備及方法的美國專利No.33,924中公開了一種保存和處理血液的方法和設備，在冷凍前使RBCs甘油化及輸血前從融化的RBCs洗去甘油。尤其是在盛RBCs的袋子里分三步加入甘油。首先，將RBCs袋放在搖床上，以每分鐘約180次的速度進行搖動，50ml的甘油溶液依靠重力加入袋中。將搖床關閉約5分鐘，使RBCs和甘油達到平衡。下一步，打開搖床，再向袋中加入約50ml的甘油溶液。再次關閉搖床使RBCs和甘油溶液平衡約兩分鐘。然后將袋子從搖床上取下，操作員一邊手工搖動袋子一邊再加入約400ml的甘油溶液。
將袋子放在一種袋子離心裝置上來濃縮甘油化的RBCs。結果袋子里含有濃縮的、甘油化的RBCs和上清甘油溶液。為了除去上清，將袋子置于血漿提取器里。然后將其封存于外包裝紙的袋子里，放在-80℃冰箱里保存。正如‘924專利里注釋的，整個處理過程必須在4小時內完成，獲得的甘油化的RBCs有約60％的血細胞比容。
因此，現(xiàn)有技術的甘油化處理過程是費時、費力的工作。而且需要技術熟練的操作人員以確保甘油溶液在適當?shù)臅r間有適合的量。不適當?shù)慕o予甘油滲透壓(osmolite)可能損傷RBCs。特別是，如果加入甘油的速度過快，RBCs將受到摩爾滲透壓濃度的休克，而導致細胞損傷。
現(xiàn)有技術的在輸血前洗滌融化的、冷凍保存的RBCs的方法很顯然也是費時、費力的工作。更具體地，如‘924專利所描述的，將冷凍的RBCs袋子放在熱水浴中20-25分鐘融化RBCs。應用一種儀器，如Haemonetics Corp.的115型，包括搖床、離心裝置和洗滌滾筒。首先，50ml 12％氯化鈉溶液依靠重力流入袋里，通過搖床的搖動與融化的RBCs混合。關閉搖床兩分鐘使兩種溶液達到平衡。然后再次，打開搖床，向袋子里加入100ml的0.9％氯化鈉和0.2％葡萄糖溶液，搖動混合。然后關閉搖床約兩分鐘讓溶液平衡。再次打開搖床，向袋子里加入150ml氯化鈉/葡萄糖溶液。關閉搖床兩分鐘。對于甘油溶液，向融化的RBCs里加入每種體積的洗滌溶液也是一個必須謹慎處理的過程。特別是，洗滌溶液也是一種滲透壓(osmolite)，如果加入過快可能導致RBCs細胞膜的破裂。
離心袋子里的內容物以除去洗滌溶液和甘油，將得到的RBCs轉移到收集袋里。在輸液前，洗滌后的RBCs通過離心進行濃縮并除去上清。最終的RBCs的血細胞比容低于40％。
如同‘924專利介紹的，RBCs對摩爾滲透壓濃度休克敏感而需要重復、詳細的步驟。不但在冷凍保藏時制備RBCs，而且在輸血前復蘇保藏的RBCs時都必須手工操作，以避免滲透壓濃度的突然改變。這是一種昂貴的方法，限制了冷藏方法的使用，而且大量需要及時的血液采集。此外，由于化學物質和其他關系，商業(yè)上可買到的甘油溶液一般裝在橡膠塞的玻璃瓶中，而不是有管子連接的塑料袋。為了獲得這種甘油，必須使用針或刺，從而產(chǎn)生了一個開放系統(tǒng)，即潛在的污染空氣和其他的雜質可能進入這個系統(tǒng)。此外，由于甘油的粘度高，不能依靠重力通過滅菌后的濾膜。所以，任何進入這個系統(tǒng)的污染物都可能接觸到RBCs。盡管這不影響RBCs的冷凍保藏時間，但是它要求融化的紅細胞必須在24小時內使用，否則只能廢棄。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種制備冷凍保藏紅細胞的改進方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種快速釋放深低溫保藏液到紅細胞而不引起摩爾滲透壓濃度休克的改進方法。
本發(fā)明的再一個目的是快速洗滌融化的紅細胞而不引起摩爾滲透壓濃度休克的改進方法。
簡要地說，本發(fā)明涉及一種釋放深低溫保藏液到紅細胞以便長期冷凍保藏和在紅細胞復蘇過程中除去深低溫保藏液的系統(tǒng)。這個系統(tǒng)優(yōu)選包括連接著搖床、離心裝置和一個或幾個速度可選的泵的控制器。顯示器、打印機和輸入設備也與控制器相連。深低溫保藏裝置用于將深低溫保藏液運送到濃縮的紅細胞的裝置，它可以放在搖床上?？刂破鹘?jīng)過泵監(jiān)測和控制深低溫保藏液向紅細胞的運送。尤其是，控制器定期地測定已經(jīng)添加到紅細胞的深低溫保藏液的量，在此基礎上，依據(jù)新的計算方法計算深低溫保藏液的流速。這個計算方法提供了紅細胞的摩爾滲透壓濃度線性增加，用來選擇降低休克的危險性和使處理時間最短。經(jīng)過動態(tài)地調整泵的速度，控制器在整個深低溫保藏處理過程中以計算所得流速運送深低溫保藏液。
在復蘇過程中，一種包括分離室和洗滌液的復蘇裝置，相似地安裝在這個系統(tǒng)上。融化的紅細胞優(yōu)選地放在搖床上，通過兩個泵不但與洗滌液相連而且與分離室相連。為了復蘇紅細胞，控制器監(jiān)測和控制用于稀釋紅細胞的第一個體積洗滌液的運送。特別是，控制器依據(jù)第二個計算方法動態(tài)地調整稀釋體積的洗滌液向紅細胞運輸?shù)乃俣?。第二個計算方法也是依據(jù)已釋放的洗滌液的計算體積來提供紅細胞摩爾滲透壓濃度線性降低，以選擇縮短稀釋時間和減少休克的發(fā)生。通過動態(tài)地調整兩個泵的速度，控制器在整個稀釋過程中以計算出的流速運送洗滌液。紅細胞在稀釋后被轉移至分離室，為了從紅細胞洗去任何殘留的深低溫保藏試劑，可在分離室里另外加入洗滌液。
在優(yōu)選實施方案中，深低溫保藏液在接觸紅細胞之前優(yōu)選地通過除菌的濾膜。通過過濾深低溫保藏液除去潛在的污染物，使復蘇后紅細胞的儲存時間顯著延長。此外，在復蘇過程中，在加入洗滌液之前復蘇的紅細胞首先用一定體積的高滲溶液稀釋。高滲溶液有與融化的紅細胞相近的摩爾滲透壓濃度，進一步降低了休克的危險性。而且，額外的洗滌循環(huán)有利于除去在復蘇過程中不能存活的衰弱細胞分解產(chǎn)生的碎片和將洗滌后的紅細胞懸浮在保存液里，以便使它的儲存時間更長。而且，深低溫保藏和復蘇過程中的每個步驟都在系統(tǒng)控制器的管理下自動執(zhí)行，顯著地減少誤差和縮短整個處理時間。
附圖簡述本發(fā)明的上述和進一步的優(yōu)點可以通過下面結合附圖的描述得到更好的理解。


圖1本發(fā)明中制備深低溫保藏紅細胞的改良系統(tǒng)的框圖；圖2A-B深低溫保藏紅細胞優(yōu)選方法的流程圖；圖3是圖1改良系統(tǒng)上復蘇深低溫保藏后紅細胞的框圖；以及圖4A-D復蘇上面深低溫保藏紅細胞優(yōu)選方法的流程圖。
發(fā)明詳述圖1是本發(fā)明中改進的深低溫保藏/復蘇系統(tǒng)100的框圖。系統(tǒng)100由一個控制器102、一個搖床104、第一個泵106、一個離心驅動裝置108和第二個泵110組成。離心驅動裝置108有一個分離室，它與下面描述的洗滌紅細胞有關?？刂破?02可操作與搖床104、兩個泵106，110和離心驅動裝置108連接，也可以與多個輸入/輸出設備連接。例如，控制器102優(yōu)選可以與顯示器112連接，將信息呈遞給系統(tǒng)操作員；又可以與打印機114相連，打印報告和其他信息。系統(tǒng)操作員通過輸入設備116(例如鍵盤和/或鼠標)將命令輸入控制器102。泵106和泵110、離心驅動裝置108、顯示器112、輸入裝置116和控制器102都被安裝在機箱118里。
在優(yōu)選實施方案中，控制器102由一個或多個中央處理器(CPU)和有關的存儲器組成，它裝有象下面描述的執(zhí)行本發(fā)明的各個步驟的可執(zhí)行的軟件指令。泵106和泵108優(yōu)選都是雙向蠕動泵，每個循環(huán)可供給約1ml的液體。每個泵106、108都含有一個光學空氣監(jiān)測器(未顯示)來確定在與泵相連的管道中是否存在空氣。本發(fā)明中適當?shù)慕M成部分與Haemonetics公司的移動收集系統(tǒng)(MCS)No.8150的組成部分相似。
紅細胞的深低溫保藏首先，從供血者采集約450ml的全血，裝在含有抗凝劑的原始袋中。應當理解采集全血的實際體積和其血細胞比容的水平由深低溫保藏后復蘇過程中使用的分離室的大小來決定。全血可以按常規(guī)方式在4℃左右保存。其次，用常規(guī)方法離心全血，使紅細胞與其他血液組份分離。例如，全血以1615倍的重力離心4分鐘來分離紅細胞。離心紅細胞的裝置和程序為本領域中技術熟練的人員所周知，就不在此敘述了。分離的紅細胞(RBCs)也可以在4℃左右短期保存。然而，在深低溫保藏處理開始之前，RBCs和深低溫保藏液優(yōu)選加熱至室溫(如22-30℃)。
參考圖1，冷凍裝置優(yōu)選安裝在系統(tǒng)100上。更具體地，深低溫保藏液瓶120通過第一根管線122與第一個泵106相連。常規(guī)的針式連接器和滴注室被用于連接管線122和瓶子120，一個可以從關到開狀態(tài)轉換的夾子或氣動閥124被固定在管線122上來控制深低溫保藏液向第一個泵106的流動。在優(yōu)選實施方案中，深低溫保藏液是按重量計算的濃度為57.1％的甘油溶液，通常保存在500ml的玻璃瓶里。深低溫保藏液120被懸掛在與機箱118連接的輸血(IV)架(未顯示)上。第二根管線126連接第一個泵106和裝紅細胞的容器128。容器128包括通過無菌的連接裝置(SCD)130與第二根管線126相連的管道部分128a。SCD130是一種象Terumo的312型一樣的、使兩根管線無菌焊接起來的眾所周知的裝置。
第二根管線126里安裝有壓力探針132和除菌濾膜134。濾膜134是優(yōu)選0.2μm的親水型濾膜，例如Pall/Gelman Sciences，Inc.高級IV-3空氣凈化濾膜。安裝在濾膜134和SCD接頭130之間的壓力探針132將相應的壓力信號傳遞給主控制器108來保證SCD接頭不破裂和容器128不被灌注得太滿。為確保流經(jīng)導管126的深低溫保藏液無菌，在壓力探針132處也使用了0.2μm的親水性濾膜136。在優(yōu)選實施方案中，管線122和126都是通過第一個蠕動泵106的單個、連續(xù)的管線。
圖2A-B是本發(fā)明深低溫保藏處理步驟200的流程圖。如上所述，在低溫保藏裝置安裝到系統(tǒng)100上以后，系統(tǒng)操作員按圖202所示將容器128里的RBCs凈重和血細胞比容水平記入系統(tǒng)100，按圖204所示將容器128放在搖床104上。然后，按圖206和圖208所示，控制器102計算容器128內RBC濃縮物的體積，并將適當體積的深低溫保藏液運送到RBC濃縮物。RBC濃縮物的體積Vi根據(jù)下面的公式來確定。
Vi＝NWi/[1.1*Hcti/100+1.026*(1-Hcti/100)](1)其中NWi指深低溫保藏前濃縮后紅細胞的凈重(克)和Hcti指深低溫保藏前紅細胞的血細胞比容水平(％)。
與濃縮紅細胞混合的深低溫保藏液的總體積Vg按下面的公式來計算。
Vg＝Cf/(Ci-Cf)*Vi*(1-Hcti/100+Hcti*W/100)(2)其中Cf指深低溫保藏處理過程中濃縮紅細胞里深低溫保藏試劑的預計濃度(％)，Ci指深低溫保藏液里深低溫保藏試劑的濃度(％)和W指濃縮紅細胞里水的體積百分比(％)。
W、Ci和Cf的數(shù)值由操作員通過輸入設備116輸入系統(tǒng)100，控制器102按常規(guī)的相應缺值方式進行預構造。在優(yōu)選實施方案中，主控制器102按W為72％，CI為57.1％(最通?？傻玫降母视偷陌俜直?和Cf為40％(在-80℃保存的濃縮紅細胞中甘油的理想濃度)來進行預構造。
其次，操作員按圖210所示從瓶子120的滴注室向起始管122中壓入起始體積的深低溫保藏液。然而，此時閥門124仍保持關閉狀態(tài)。操作員按圖212所示通過輸入設備116啟動控制器(如按“開始”鍵)。按圖214所示，控制器102啟動第一個泵106和搖床104，以3Hz的頻率和1.5英寸的雙振幅進行工作。如圖216所示，第一個泵106以30ml/分鐘的起始流速啟動?？刂破?02通過監(jiān)測相應的空氣檢測器的空氣輸出量來檢查到達泵106的液體。如圖218所示，如果泵工作10ml以后還沒檢測到液體，控制器102關閉泵106并發(fā)送出錯信息到顯示器112，指示操作員應檢查導管122的閉合狀況。如圖220所示如果檢測到液體，控制器102就通過壓力探針132監(jiān)測容器128里壓力的增加。
如圖222所示，當壓力超過100mm Hg，控制器102開啟閥門124，并根據(jù)泵的循環(huán)數(shù)計算通過泵106運送到容器128的深低溫保藏液的體積。如圖224所示，在液體檢測過程中如果檢測到泵出了約5ml的液體后，壓力還沒有達到100mm Hg，控制器102將關閉泵106并發(fā)送出錯信息到顯示器112。出錯信息要求操作員檢查導管122，126的滲漏情況。假定壓力達到適合的水平并開啟閥門124，控制器102就開始運送預定體積(Vg)的深低溫保藏液給容器128里的紅細胞。
由于在57.1％的甘油溶液(例如約7230mOsm/KgH2O)和容器128中濃縮的紅細胞(例如約320mOsm/KgH2O)之間存在較大的摩爾滲透壓濃度差別，紅細胞在深低溫保藏過程中極易受到高滲刺激和細胞損傷的影響。也就是，盡管甘油確實通過細胞膜擴散，然而在嚴格意義上這不是真正的等滲(osmdite)，RBCs和甘油溶液之間的高摩爾滲透壓濃度差別導致水分從RBCs“泵出”的速度遠高于從甘油溶液擴散到細胞內的速度。這樣細胞膜受到較大的應激，特別是在處理的開始階段可能導致細胞的破裂。當越來越多的甘油擴散到紅細胞里時，它們的摩爾滲透壓濃度上升，從而減少了深低溫保藏液的摩爾滲透壓濃度差別和后來受刺激的危險。在本領域現(xiàn)有技術中，甘油開始以小的、固定的量加入來限制可能的RBC損傷。然而，這種方法費時、費力并容易出錯。
在本發(fā)明中，深低溫保藏液優(yōu)選連續(xù)地運送到RBCs。特別是，深低溫保藏液按紅細胞的摩爾滲透壓濃度隨時間線性增加(例如dOsmolarity/dt＝常數(shù))的方式運送。這樣，本發(fā)明通過利用增加紅細胞的摩爾滲透壓濃度來增加深低溫保藏液運送的速度。而且，通過增加深低溫保藏液添加到RBCs里的速度，顯著地減少了完成整個處理過程的時間。
尤其是，主控制器102連續(xù)地計算深低溫保藏液合適的流速和動態(tài)地調整泵106的工作速度以達到理想的流速。深低溫保藏液的流速Fg按照下面的公式進行計算。
Fg＝K[Vi*(W*Hcti/100)+Vg]2/[Vi*(W*Hcti/100)*(Oi-Og)](3)其中K指紅細胞摩爾滲透壓濃度增加的選定速率(mOsm/Kg H2O/min.)，Vi指深低溫保藏前紅細胞的體積(ml)，Vg指現(xiàn)時流速計算之前已加入到紅細胞的深低溫保藏液的體積(ml)，Oi指深低溫保藏前紅細胞的摩爾滲透壓濃度(mOsm/Kg H2O)和Og指深低溫保藏液的摩爾滲透壓濃度(mOsm/Kg H2O)。
既然深低溫保藏液的流速是依據(jù)已添加到紅細胞的深低溫保藏液的體積(Vg)來確定，起始流速應由控制器102不同于公式(1)單獨來確定。起始流速FO由下面公式確定。
FO＝K*Vi*(W*Hcti/100)/(Oi-Og)(4)此外，在任何假設時間t處理紅細胞的深低溫保藏液的體積按下面公式計算。
Vg＝K*Vi*(1-0.28*Hcti/100)*t/(Oi-Og-K*t)(5)將要求體積的深低溫保藏液運送至紅細胞所需要的總時間T計算如下。
T＝Vg*(Oi-Og)/K/[Vi*(1-0.28*Hcti/100)+Vg](6)主控制器102按以上定義的公式(3)-(6)確定的數(shù)值以常規(guī)方式進行預構造。應當理解參數(shù)K，Oi和Og由操作員輸入或在控制器102的存儲器里預構造。在優(yōu)選實施方案中，控制器102按K約為500，Oi為320和Og為7230進行預構造。
如圖226所示，控制器102通過設置泵106相應的工作速度以起始流速FO開始從瓶子120運送深低溫保藏液。此后，按圖228所示，控制器102用公式(5)連續(xù)確定已加入容器128里的深低溫保藏液的量Vg。然后，按圖230所示，控制器102確定深低溫保藏液的計算體積是否等于為獲得選定濃度所要求的體積。如果不等，按圖232所示，控制器102以公式(3)計算出一個新的流速Fg。然后如圖234所示，調整泵106以獲得這個新的流速?？刂破?02將等到以起始流速FO泵出至少1ml的深低溫保藏液后，才進行第一次計算和相應的調整。
在優(yōu)選實施方案中，控制器102依據(jù)執(zhí)行上述處理過程的軟件包來實時地計算新流速Fg的數(shù)值和調整泵的速度。根據(jù)控制器102的處理器和存儲部分的操作特點，每隔約200ms就計算和調整泵的速度。然而，應當理解控制器102可以按任何設定的時間間隔編制計算新流速Fg的程序。也應當理解如果流速的變化基本上小于泵可被調整的最小增量(例如低于1/2ml/min，因為泵可調整的增量是1ml/min)時，泵的速度沒有改變。
如框236所示，當前面確定的總體積(Vg)的深低溫保藏液被運送到容器128，控制器102就關閉泵106和隨后(例如約30秒后)關閉搖床104。容器128的導管部分128a被從導管126切斷和被加熱封閉。如圖238所示，標有濃縮RBCs單位、操作員、捐贈中心、日期、原始血液凈重、原始血液的血細胞比容、原始血液體積和加入的深低溫保藏液體積，深低溫保藏處理所用時間和其他信息的標簽由控制器102的打印機114打印出來。將標簽貼在容器128上作為鑒定說明。
深低溫保藏處理之后，容器128里的液體總體積約為700-800ml，包括約200ml的“純”RBCs(含有少量的血漿)懸浮在約400-500ml的深低溫保藏液里。按圖240所示，容器128由系統(tǒng)操作員直接進行袋式離心，按常規(guī)方法除去上清深低溫保藏液，將剩下的約200ml純RBCs(總體積約300ml)進行冷凍。袋式離心涉及將容器在高轉速下離心，這是本領域中技術熟練人員所周知的，在此不再詳細介紹。深低溫保藏處理過程完成后，甘油化的RBCs在-80℃深低溫保藏。
應當理解依據(jù)系統(tǒng)100使用的除菌濾膜134的類型，導管126里的壓力應保持在特定的限度內。例如，用Pall/Gelman Sciences，Inc.的除菌濾膜，壓力應不超過310kN/m2(或45磅/平方英寸)。為保持濾膜134的壓力在此限度內，控制器102允許的最大流速應不超過80ml/min。這樣，如果由公式(3)計算的深低溫保藏液流速要求相應泵的速度超過80ml/min，控制器102也不會超過80ml/min。
本發(fā)明提供了一種制備深低溫保藏紅細胞的改進方法。應當理解除甘油外的其他深低溫保藏液如羥乙基淀粉(HES)、二甲基亞砜(DMSO)等也能由本發(fā)明使用。應當進一步理解除紅細胞外的其他血液組分也可以使用上述的深低溫保藏程序。也應當理解可以選用深低溫保藏試劑的其他理想濃度Cf在其他溫度下保存(如30％，在-160℃保存)。
冷凍紅細胞的復蘇圖3是圖示復蘇預先冷凍紅細胞的系統(tǒng)100的框圖。如上所述，系統(tǒng)100包括一個可任選連接到兩個泵106和108上的控制器102、離心驅動單元108、振蕩平臺104、顯示器112以及打印機114。操作者可以通過輸入裝置116把數(shù)據(jù)及其他信息輸入系統(tǒng)100中。為了復蘇容器128中預先冷凍的紅細胞，優(yōu)選在系統(tǒng)100上安裝一個單獨的復蘇裝置(harness)。具體地，通過一段起始管線150和一個三相接頭152，將3個不同的溶液袋144、146和148連接到泵110上。優(yōu)選在袋144中盛裝防腐溶液，例如購自Haemonetics公司的AS-3。優(yōu)選在袋146中盛裝洗液(例如，0.9％氯化鈉和0.2％葡萄糖溶液)以及優(yōu)選在袋148中盛裝高滲溶液(例如，12％氯化鈉溶液)。袋148中盛裝的高滲溶液優(yōu)選具有與容器128中融化RBCs近乎相等的摩爾滲透壓濃度。與袋144、146和148分別相連的是充汽閥門154、156和158，這些閥門可以在開和關兩種狀態(tài)之間切換。
第二段管線160將泵110連接到Y-形接頭162上，優(yōu)選包括一個除菌濾器164，可以是0.22μm的親水濾膜。第三段管線166包括一個兩相閥門168，它連接到泵106的一側。通過SCD130與閥門168的一個接口相連的是容器128的管口部分128a，而容器128再被放置到振蕩平臺104上。眾所周知，容器128中的紅細胞在放上平臺104之前優(yōu)選先在水浴中融化。位于終端用來收集復蘇后的RBC的袋170可以預先連接到兩-相閥門168的另一接口上。在第三段管線166中插入壓力探頭132以及與其相連的濾器136。第四段管線172將泵106與Y-形接頭162連接。Y-形接頭162的出口通過第五段管線174與分離筒178的入口176相連，分離筒178位于離心驅動裝置108內。離心筒178的出口180可以通過第六段管線184與廢液袋182相連，管線184上裝有一充氣閥門185。優(yōu)選在第六段管線184中插入第二個壓力探頭186以及與其相連的除菌濾器188。優(yōu)選實施方案中，管線150、160、172和166都是經(jīng)由相應泵110和106安裝的單向連續(xù)管線。
分離筒178可以是一個帶有分流器和縮短血漿核心(plasma core)的275ml離心容積(spun volume)吹塑筒，與Haemonetics公司生產(chǎn)的275ml吹塑筒系列類似。分流器(未畫出)把上述筒體分成2個腔室(一個分離腔和一個洗滌腔)，這樣有助于紅細胞的洗滌。
用高滲溶液稀釋融化的紅細胞如果融化的紅細胞具有40％深低溫保藏液(例如，甘油)濃度，那么融化紅細胞的摩爾滲透壓濃度應該設定為5200mOsm/KgH2O。常用洗滌溶液的摩爾滲透壓濃度(例如0.9％氯化鈉/0.2％葡萄糖溶液)大約為300mOsm/KgH2O。復蘇過程中，這種高摩爾滲透壓濃度差別使紅細胞發(fā)生低滲休克(即，它們快速出現(xiàn)在水上)以及因而引發(fā)的細胞破壞。為了減小低滲休克的危險，優(yōu)選首先用具有與融化紅細胞同一數(shù)量級摩爾滲透壓濃度的高滲溶液稀釋紅細胞。通過用高滲溶液稀釋融化后的紅細胞，一些深低溫保藏溶液被從細胞中抽取出來，RBC上清液體積增加，從而減小了復蘇過程中RBC低滲休克發(fā)生的可能。
加入高滲溶液還可以輕微的減小紅細胞摩爾滲透壓濃度。更特異地，融化后的紅細胞用高滲溶液稀釋后，摩爾滲透壓濃度Oph可以用下列公式表示。
Oph＝(Vt*Ot+Vh*Oh)/(Vt+Vh)(7)其中，Vt是融化后的紅細胞的體積(ml)，Ot融化后的紅細胞的摩爾滲透壓濃度(mOsm/KgH2O)，Vh是加入到融化后紅細胞中的高滲溶液的體積(ml)，以及Oh是高滲溶液的摩爾滲透壓濃度(mOsm/KgH2O)。
優(yōu)選實施方案中，取摩爾滲透壓濃度約4000mOsm/KgH2O的12％氯化鈉高滲溶液50ml，用來實現(xiàn)稀釋后紅細胞的理想摩爾滲透壓濃度4800-5300mOsm/KgH2O以及理想的上清緩沖溶液體積。因此，復蘇過程第一步中的一項操作就是將約50ml高滲溶液與融化后的紅細胞混合。
圖4A-D是對應于優(yōu)選的紅細胞復蘇過程的步驟400的流程圖。當復蘇裝置一旦正確地安裝而且容器128被放上振蕩平臺104時，系統(tǒng)操作者就可以優(yōu)選按照模塊402所示啟動系統(tǒng)100。如模塊404所示，作為響應，控制器102啟動振蕩平臺104，優(yōu)選的操作條件為3Hz和1.5英寸峰間振幅。另外，如模塊406所示連接到高滲溶液(優(yōu)選50ml 12％氯化鈉溶液載荷)袋148上的閥門158處于開放狀態(tài)，泵110被啟動，以泵速約60ml/min使得溶液從右到左(相對于圖3)向濾器164流動?？刂破?02還監(jiān)測著與泵110相連的空氣檢測器。具體地，如模塊408所示，盡管在泵110上約有5個泵循環(huán)，但是控制器102可以檢查空氣是否正被檢測。如果是這樣，如模塊410所示控制器102優(yōu)選關閉泵110并在顯示器112上發(fā)出錯誤信息。如模塊412所示，當一旦在泵110檢測到液體，控制器102就會對流經(jīng)泵110的液體進行計量，用約5ml高滲溶液灌注濾器164。
接下來，如模塊414所示，控制器102以從右向左的流向啟動泵106(相對圖3而言)，并且調節(jié)閥門168向容器128提供液體流通。來自袋148的高滲溶液流到泵110，經(jīng)由濾器164和Y-形接頭162到達泵106。從泵106流出后，高滲溶液流經(jīng)閥門168，流入容器128。優(yōu)選地，控制器102以150ml/min的流速操縱泵110，以比泵110小約5％的操縱速度操縱泵106。通過以來自泵110的5％ delta運行泵106，控制器102能確保幾乎或根本沒有空氣進入容器128中?？刂破?02還監(jiān)測泵110的壓力以確保其保持在特定的限度內，如模塊416所示。如果泵110的壓力超過范圍±150mmHg，例如，控制器102優(yōu)選將泵106和110二者都去-啟動并發(fā)送出錯誤信息，如模塊418所示。當預期量的高滲溶液已經(jīng)流過泵100時(例如，50ml把各段管線中的體積都考慮在內)，關閉高滲溶液袋148上的閥門158，如模塊420所示，這樣就完成了用高滲溶液對融化紅細胞的最初稀釋。
用洗滌液稀釋融化后的紅細胞另外，還用預期體積的來自溶液袋146中的洗滌溶液稀釋融化后的紅細胞。但是，用高滲溶液稀釋后融化紅細胞的摩爾滲透壓濃度約為4900mOsm/KgH2O，而洗滌溶液，例如0.9％氯化鈉/0.2％葡萄糖溶液的摩爾滲透壓濃度約為300mOsm/KgH2O，因而把洗滌液加入到紅細胞中時，存在高滲休克的危險(因為洗滌液中的水進入細胞的速度比深低溫保藏液擴散出細胞的速度快，從而導致細胞膨脹)。為了將發(fā)生上述情況的可能性和洗滌時間最小化，控制器102動態(tài)調節(jié)洗滌液的流速，使洗滌液以適當?shù)南♂岓w積輸送給RBCs，從而使RBC的摩爾滲透壓濃度隨時間而線性減小(例如，d摩爾滲透壓濃度/dt＝恒量)。當補加洗滌液時保持紅細胞摩爾滲透壓濃度恒定減小，從而使紅細胞避免低滲休克，但仍還有一些深低溫保藏液擴散出細胞。
根據(jù)下列公式可以測定出流速Fs，作為已被紅細胞處理后的洗滌液的一項功能。
Fs＝KD[Vi*(W*Hcti/100)+Vs]2/[Vi*(W*Hcti/100)*(Oi-Os)(8)其中KD是期望的摩爾滲透壓濃度減小速度(mOsm/KgH2O/min)，Vi為高滲溶液稀釋后融化紅細胞的體積(ml)，Hcti為用高滲溶液稀釋后融化紅細胞的血細胞比容水平(％)，Vs為已經(jīng)釋放到融化紅細胞的洗滌液的體積(ml)，Oi為高滲溶液稀釋后融化紅細胞的摩爾滲透壓濃度(mOsm/KgH2O)，以及Os為洗滌液的摩爾滲透壓濃度(mOsmlKgH2O)。由于洗滌液流速的測定取決于已經(jīng)釋放到紅細胞的洗滌液體積Vs，因此初始流速必須脫離公式(8)獨立測定。初始的洗滌液流速FsO優(yōu)選用下列公式測定Fso＝KD*Vi*(W*Hcti/100)/(Oi-Os)(9)任一給定時間點t時已被融化紅細胞處理的洗滌液體積用下列公式計算。
Vs＝KD*Vi*(W*Hcti/100)*t/(Oi-Os-KD*t)(10)類似地，釋放預期稀釋體積的洗滌液所需的總時間T用下列公式計算。
T＝Vs*(Oi-Os)/KD/[Vi*(W*Hcti/100)+Vs](11)
用預期體積Vsl的洗滌液稀釋后紅細胞的摩爾滲透壓濃度Osl用下列公式計算。
Osl＝(Vh*Oph+Vsl*Os)/(Vh+Vsl)(12)為了獲得約2835mOsm/KgH2O的最終摩爾滲透壓濃度，應該用約340ml洗滌液稀釋紅細胞，這僅僅是容器128的體積功能。更特異地，如果容器128的容積為800ml并且已經(jīng)裝有350ml的深低溫保藏RBCs和50ml的高滲溶液，那么就只可以再加入340ml左右的洗滌液而不超過容器的容積。因此，控制器102以用公式(8)周期確定的流速繼續(xù)把總體積為340ml的洗滌液釋放給紅細胞。
具體地，當關閉閥門158時，控制器10打開閥門156流出洗滌液，如模塊422所示。然后，如模塊424所示當其余的高滲溶液已到達容器128后，而且洗滌液也快要進入容器128(即，有足夠體積已經(jīng)流過泵110充滿了連通管線及組件)時，控制器102優(yōu)選地開始以用公式(9)確定的初始流速Fso將洗滌液釋放到容器128?？刂破?02并開始計算已輸送到容器128的洗滌溶液的點體積。并且可以把該運行數(shù)值顯示到顯示器112上。控制器102不斷地測定釋放到融化紅細胞的洗滌液量，如模塊426所示，并且決定這個量是否等于預期量(例如340ml)，如模塊428所示。如果不是這樣，控制器102根據(jù)已經(jīng)釋放到紅細胞的現(xiàn)有體積用公式(8)重新計算洗滌液的流速，如模塊430所示，并調節(jié)泵110和106的速度從而實現(xiàn)新的流速，如模塊432所示。另外，控制器102優(yōu)選地計算出新的流速數(shù)值Fs，并且以實時(real time basis)調節(jié)泵速(例如，每200ms調節(jié)一次)。
控制器102還監(jiān)測泵106的壓力以確保其保持在選定范圍內(例如，±150mmHg)。如果壓力超過了選定范圍，控制器102優(yōu)選使泵106和110關停并向顯示器112發(fā)送警告或錯誤信息。
當預期量的洗滌液已經(jīng)釋放到容器128中的紅細胞時，控制器102優(yōu)選使泵106和110關停，并關閉閥門156中斷袋146中的洗滌液的供應，如模塊434所示。使泵106和110關停后，優(yōu)選控制器102讓平臺104再繼續(xù)運行10秒鐘，如模塊436所示。
上清液的去除現(xiàn)在，容器128中包括了融化紅細胞的體積以及分別來自袋148和146的高滲溶液和洗滌液稀釋體積。系統(tǒng)100優(yōu)選通過離心把該溶液中較輕的相(即，上清液)從紅細胞中分離出來。具體地，控制器102啟動離心驅動單元108以約8000rpm旋轉離心筒178，如模塊438所示。接下來控制器102啟動泵106以從左到右的方向(相關于圖3)把紅細胞從容器128泵入到離心筒178中，如模塊440所示。泵106可以最大的筒178填充速度運行(例如，200ml/min.)?？刂破?02還可以根據(jù)泵循環(huán)計算出進入離心筒178的液體體積。離心筒178旋轉驅動較重的紅細胞向外貼靠到筒的內表面上，而紅細胞中的上清液(包括高滲和洗滌溶液)則收集在一個呈向內輻射狀分布的環(huán)狀區(qū)域內。上清液受迫流出筒178的出口180，并收集于廢液袋182中。筒178優(yōu)選包括一個光線傳感器(未顯示)，用它來監(jiān)測存在于筒178的液體以確保更多的光吸收紅細胞不被廢棄到廢液袋182中。
第一次清洗階段當筒178還在旋轉時，優(yōu)選地通過操作泵110以恒定的流速(例如，50ml/min)加入一定體積(例如，100ml)的洗滌液，如模塊442所示。相應體積(例如，100ml)的上清液，包括高滲及洗滌溶液被移去。然后，控制器102使離心驅動單元108關停，停止筒178，并且讓RBCs與剩余上清液重混合約45秒，如模塊444所示。
用洗滌液第二次洗滌融化紅細胞接下來，優(yōu)選地通過操作泵106把分離筒178中的內容物(約280ml)沿從右到左的方向(相對于圖3)泵回到容器128中，如模塊446所示。泵速可以為約200ml/min。當筒178中的內容物返回到容器128時，優(yōu)選地控制器102啟動平臺104，并把第二批洗滌液從洗液袋146中釋放到容器128中，如模塊448所示。更特異地，控制器102優(yōu)選地釋放約410ml的洗液，分別根據(jù)初始及動態(tài)流速公式(9)和(8)，如上面與步驟424及432有關的描述。另外，410ml洗液只是容器128容積的一個指標。具體地，由于容器128具有約250～260ml(即，筒體積)液體，另加入410ml仍保持總體積低于其容積(例如，800ml)。向紅細胞中加入第二批洗液后，控制器關停振蕩平臺104，如模塊450所示?，F(xiàn)在，RBCs已經(jīng)被1倍體積的高滲溶液和2倍體積的洗滌液所稀釋，RBCs摩爾滲透壓濃度應該接近于洗滌液的摩爾滲透壓濃度。下述步驟將把剩余的深低溫保藏液從紅細胞中洗脫出來。
應該理解的是，對融化紅細胞的補充稀釋可以重復上述操作來完成。
洗滌階段優(yōu)選實施方案中，系統(tǒng)100在離心筒178中對稀釋后的紅細胞進行5個獨立的洗滌階段。通過洗滌階段使RBCs中的深低溫保藏液完全去除，并且除去來自不能完整耐受冷凍和復蘇過程的弱勢細胞的任意碎片(例如，破裂的細胞膜、游離的血紅蛋白等)。就每個洗滌階段而言，下面按照討論的那樣，對洗滌溶液的體積、其進入筒178中的流速以及平衡時間進行選擇以使RBCs的摩爾滲透壓濃度隨時間線性變化。首先，控制器102啟動離心驅動單元108以約8000rpm旋轉筒178，如模塊452所示，通過泵106把容器128中的稀釋后的紅細胞泵入到離心筒178中，如模塊454所示。轉移開始和結束時的泵速可以設定為150ml/min和50ml/min。接下來，控制器102繼續(xù)把約150ml的洗滌溶液從袋146中釋放到旋轉筒178，如模塊456所示。洗滌液可以約50ml/min的流速釋放。憑經(jīng)驗確定這些數(shù)值為RBC摩爾滲透壓濃度提供通常的線性變化。除去筒178中產(chǎn)生的上清液并收集于廢液袋182，如模塊458所示。加入預期體積的洗滌液并除去上清液后，控制器102啟動離心驅動單元108的制動機制并關停筒178，如模塊460所示。典型地，使筒178停止旋轉需要約15秒。優(yōu)選地，筒178在預先設定的平衡延續(xù)時段(例如，45秒)內保持靜止。平衡延續(xù)使得RBC摩爾滲透壓濃度繼續(xù)發(fā)展。
平衡延續(xù)過程中，可以通過泵106把設定體積(例如，20ml)的筒內容物泵入容器128中，如模塊462所示。這樣可以使筒頂部可被再抽入并且限制后續(xù)洗滌階段中的紅細胞損失?？刂破?02接著啟動離心驅動單元108，在預先設定的時段(例如，60秒)內以約8000rpm旋轉筒178，把此前去除體積的液體返回到筒178，如模塊464所示。這樣就完成了第一次洗滌階段。
接下來控制器102確定是否執(zhí)行另一個洗滌階段，如模塊466所示。如果是這樣，控制器102優(yōu)選重復步驟456至466。如顯示的那樣，在優(yōu)選實施方案中，對稀釋后的紅細胞進行5個洗滌階段。第二個洗滌階段優(yōu)選使用約300ml以約100ml/min釋放的洗滌液，而第三到第五洗滌階段各使用300ml以150ml/min釋放的洗滌液。
用保藏液懸浮復蘇后的紅細胞洗滌循環(huán)完成后，控制器102用保藏液懸浮洗滌后的紅細胞。洗滌后的紅細胞的懸浮可以分多個階段進行。更具體地，隨著筒178以約8000rpm旋轉，優(yōu)選以恒定的流速把袋144中預定體積(例如，80ml)保藏液釋放到筒178，如模塊468所示。如模塊470所示，然后制動離心驅動單元108，停止筒178。為了增加RBCs的最終血細胞比容，優(yōu)選在制動過程中關閉廢液袋182上的閥門185，除最后保藏循環(huán)時它是開放的，從而除去另外的上清液并收集于廢液袋182中。在預先設定的駐留時間(dwell time)(例如，45秒)內使筒178還保持靜止，如模塊472所示。這段駐留時段使得筒內容物(即，洗滌后的紅細胞和保藏液)相互混合，并且得到一種均勻的紅細胞懸液。駐留時段后，重啟動離心驅動單元108，以約8000rpm旋轉筒178足夠長的時間(例如，60秒)從而實現(xiàn)足夠的紅細胞沉積，如模塊474所示。
控制器102接下來確定洗滌后的紅細胞的懸浮是否完成，如模塊476所示。如果不是這樣，控制器102優(yōu)選重復上述步驟468～476。優(yōu)選實施方案中，控制器102執(zhí)行1個保藏循環(huán)。此刻，已經(jīng)洗去了紅細胞的深低溫保藏液，并被懸浮于保藏液中。控制器102關停離心驅動單元108，如模塊478所示，然后把洗滌并懸浮后的RBCs泵入最終收集袋170，如模塊480所示。通過操作泵106使RBCs以約20ml/min的流速沿從右到左的方向流動(相對于圖3)。
用保藏液取代上清洗滌液，在深低溫保藏過程中過濾深低溫保藏液并洗滌RBCs(除去弱勢細胞)，最終復蘇的RBCs可以在使用前在4℃保藏約2周。這一延長后的保藏時間遠遠超過了現(xiàn)有技術裝置所能實現(xiàn)的保藏時間，后者典型地不超過24小時。
應該理解的是本發(fā)明中所述的深低溫保藏及復蘇過程可以分別完成和執(zhí)行。
上面的描述僅是本發(fā)明的特定實施方案。但是，顯然可以對上述實施方案進行其他變動及改進，而仍保留它們的部分或全部優(yōu)點。因此，下面所附的權利要求是為了覆蓋落在本發(fā)明范圍之內的所有此類變動或改進。
權利要求
1.一種可以用一定體積稀釋液稀釋融化后的深低溫保藏血液組分的設備，所述稀釋液使所述血液組分在其復蘇過程中有出現(xiàn)摩爾滲透壓濃度休克的可能，該設備包括用于將所述稀釋液與血液組分連通的器具；至少一個安裝在上述連通器具中的變速泵，使得以特定速度操作上述至少一個泵時可限定供給所述血液組分的稀釋液的相應流速；以及一個可操作地連接到至少一個上述泵上的控制器，從而控制稀釋液釋放到血液組分的流速，所述控制器被設計成能動態(tài)地調節(jié)稀釋液的流速，從而減少血液組分發(fā)生摩爾滲透壓濃度休克的可能。
2.權利要求1的設備，其中所述控制器能動態(tài)地調節(jié)稀釋液的流速，從而能保持血液組分摩爾滲透壓濃度呈線性減小。
3.權利要求2的設備，其中所述的血液組分是紅細胞，所述控制器被設計成調節(jié)至少一個泵的速度從而使稀釋液的流速基本上是下列公式給定的速度KD[Vi*(W*Hcti/100)+Vs]2/[Vi*(W*Hcti/100)*(Oi-Os)其中KD是期望的摩爾滲透壓濃度減小速度，Vi為用高滲溶液稀釋后融化紅細胞的體積，W為紅細胞中水的體積百分比，Hcti為用高滲溶液稀釋后融化紅細胞的血細胞比容水平，Vs為已經(jīng)釋放到融化紅細胞的洗滌液的體積，Oi為用高滲溶液稀釋后融化紅細胞的摩爾滲透壓濃度，以及Os為洗滌液的摩爾滲透壓濃度。
4.權利要求3的設備，其中所述控制器被設計成初期調節(jié)至少一個泵的速度，以使稀釋液的初始流速基本滿足下列公式KD*Vi*(W*Hcti/100)/(Oi-Os)。
5.權利要求4的設備，該設備進一步包括一個振蕩平臺，該平臺的作用在于當向血液組分中釋放稀釋液時振蕩所述血液組分。
6.一種用一定體積的稀釋液稀釋融化的，深低溫保藏血液組分的方法，所述稀釋液使血液組分在其復蘇過程中有發(fā)生摩爾滲透壓濃度休克的可能，該方法包括下述步驟通過至少一個變速泵將一定體積的稀釋液與融化的血液組分連通，使得以特定速度操作泵時能限定供給所述血液組分的稀釋液的相應流速；以及通過周期性地改變至少一個泵的速度，動態(tài)地調節(jié)稀釋液的流速，從而減少融化的血液組分發(fā)生摩爾滲透壓濃度休克的可能。
7.權利要求6的方法，該方法進一步包括下述步驟在釋放稀釋液之前用一定體積的高滲溶液稀釋融化后的血液組分，所述高滲溶液具有與所述血液組分基本相同的摩爾滲透壓濃度。
8.權利要求7的方法，其中所述的血液組分是紅細胞，以及所述的動態(tài)調節(jié)步驟包括改變至少一個泵的速度的步驟以使稀釋液的流速基本上為下列公式給定的速度KD[Vi*(W*Hcti/100)+Vs]2/[Vi*(W*Hcti/100)*(Oi-Os)其中KD是期望的摩爾滲透壓濃度減小速度，Vi為用高滲溶液稀釋后融化紅細胞的體積，W為紅細胞中水的體積百分比，Hcti為用高滲溶液稀釋后融化紅細胞的血細胞比容水平，Vs為已經(jīng)釋放到融化紅細胞的洗滌液的體積，Oi為用高滲溶液稀釋后融化紅細胞的摩爾滲透壓濃度，以及Os為洗滌液的摩爾滲透壓濃度。
9.權利要求8的方法，其中所述的動態(tài)調節(jié)步驟進一步包括初期調節(jié)至少一個泵的速度，以使稀釋液的初始流速基本滿足下列公式KD*Vi*(W*Hcti/100)/(Oi-Os)。
10.權利要求9的方法，該方法進一步包括下述步驟在向血液組分中釋放稀釋液時振蕩融化的血液組分。
全文摘要
一種可動態(tài)調節(jié)深低溫保藏液釋放到紅細胞從而實現(xiàn)冷凍的系統(tǒng)。所述釋放速度優(yōu)選由公式確定，該公式能保持紅細胞摩爾滲透壓濃度隨時間線性變化從而防止紅細胞摩爾滲透壓休克。在優(yōu)選實施方案中，該系統(tǒng)包括一個被預先設計成根據(jù)上述公式將深低溫保藏液自動釋放到紅細胞中的控制器。該系統(tǒng)還可以通過稀釋紅細胞以及洗脫出其中的深低溫保藏液來支持融化紅細胞的復蘇。另外，該系統(tǒng)優(yōu)選地調節(jié)稀釋液的流速從而防止復蘇過程中的紅細胞摩爾滲透壓休克。復蘇后，復蘇紅細胞可以懸浮于一種保藏液中以進一步增加它們的儲存壽命。
文檔編號A61K35/18GK1732777SQ20051008591
公開日2006年2月15日 申請日期1999年12月6日 優(yōu)先權日1998年12月7日
發(fā)明者E·帕格斯 申請人:赫默內蒂克斯公司