專利名稱：一種由黃芪、丹參和苦參素制成的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種主要由黃芪或其提取物、丹參或其提取物和苦參素制成的藥物組合物，及其制備方法。
2、背景技術(shù)肝炎是一種常見病和多發(fā)病，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國肝炎患者和病毒攜帶者占總?cè)丝诘?0％。其中以病毒性肝炎為主，病毒性肝炎又可分為急性肝炎、慢性肝炎、重癥肝炎和膽型肝炎。肝炎是一種傳染性疾病，由于其流行性廣、危害性大、發(fā)病率高，是目前國內(nèi)外公認(rèn)的疑難病癥之一。中國是乙型肝炎的高流行區(qū)，有超過40％的人受過乙型肝炎病毒(HBV)感染，有1億多人口為慢性HBsAg攜帶者。乙型肝炎治愈率僅為10％，絕大部分轉(zhuǎn)為慢性肝炎，嚴(yán)重的轉(zhuǎn)化為肝腹水、肝癌。其中，肝纖維化的形成和發(fā)展是影響預(yù)后和病情轉(zhuǎn)危的關(guān)鍵病理變化之一，也是臨床慢性肝病治療中最為復(fù)雜的疑難問題。國內(nèi)外近年來治療肝炎的藥物雖然有許多，但大多療效并不理想，治療后病情易反復(fù)，且價格又十分昂貴。至今，市場上仍缺少抗肝炎療效確切，副作用又較小的藥物。
黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)的干燥根。味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌的功效。黃芪的主要有效成分為黃芪多糖和黃芪總皂苷?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)表明，黃芪多糖和黃芪總皂苷均有體外抗乙肝病毒活性，黃芪注射液(主要有效成分為黃芪總皂苷)對刀豆蛋白誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷、硫代乙酰胺所致的大鼠肝損傷、免疫性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，黃芪多糖有增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能。
丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bage.的干燥根及根莖。味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效。丹參在治療慢性乙型肝炎方面的作用機(jī)理主要包括(1)涼血解毒抗菌消炎，減輕或消除肝實(shí)質(zhì)炎癥，同時幫助肝臟恢復(fù)解毒功能；(2)改善肝內(nèi)血液循環(huán)，糾正肝臟的微循環(huán)障礙，活血化瘀使肝脾回縮；(3)調(diào)整機(jī)體免疫功能，消除免疫復(fù)合物對肝臟的損害；(4)促進(jìn)肝細(xì)胞再生，抗肝纖維化；(5)恢復(fù)肝功能。丹參水溶性成分主要是以丹參素為基本結(jié)構(gòu)的酚酸類化合物，丹參總酚酸化合物具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以清除超氧陰離子和羥自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而減輕肝損傷。丹參水煎劑能明顯降低CCl4誘導(dǎo)的急、慢性肝損傷大鼠的血清ALT水平，減輕肝細(xì)胞變性壞死，促進(jìn)肝功能恢復(fù)，同時減少肝臟膠原沉積。
苦參素為氧化苦參堿(Oxymatrine)與極少量氧化槐果堿(Oxysophocarpine)的混合堿，是從豆科植物苦豆草Sophoro alopecuroides L.的種子苦豆子或豆科植物苦參sophora flarescens Ait.的根中提取的生物堿?？鄥⑺匾呀?jīng)作為化學(xué)藥品上市，并且已收載入《國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》第16冊第363頁(國家藥典委員會編)，其中規(guī)定按干燥品計算，含氧化苦參堿(C15H24N2O2)不得少于98.0％。近幾年氧化苦參堿在治療病毒性肝炎方面的研究主要進(jìn)展包括(1)氧化苦參堿具有直接抗乙型肝炎病毒作用；(2)氧化苦參堿能抑制膠原活動度和防治肝纖維化；(3)氧化苦參堿可阻斷肝細(xì)胞異常凋亡；(4)氧化苦參堿對實(shí)驗(yàn)性小鼠肝衰竭具有保護(hù)作用。
目前，利用黃芪或其提取物、丹參或其提取物和苦參素的相互作用，配伍組方，制備用于治療肝臟疾病方面的藥物，尚未見報道。
3、發(fā)明內(nèi)容為了滿足臨床需要，更好的治療肝臟疾病，延緩或減少肝炎向肝腹水或肝癌的轉(zhuǎn)化，提高肝炎患者的生命質(zhì)量，本發(fā)明提供了一種主要用于治療肝臟疾病的藥物組合物及其制備方法，主要由黃芪或其提取物、丹參或其提取物和苦參素制成，對四氯化碳、D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷、四氯化碳誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷、酒精誘導(dǎo)小鼠慢性肝損傷均具有顯著的保護(hù)作用，并且可以顯著抑制鴨乙型肝炎病毒，產(chǎn)生了意想不到的效果。
本發(fā)明藥物組合物由黃芪、丹參和苦參素制成，其重量份數(shù)為黃芪400～10000份、丹參200～6000份、苦參素10～200份，優(yōu)選為黃芪1000～5000份、丹參500～3000份、苦參素20～100份，進(jìn)一步優(yōu)選為黃芪2000份、丹參1500份、苦參素40份。
本發(fā)明藥物組合物中的黃芪、丹參可以用適宜的溶劑和方法單獨(dú)或混合提取加工得到提取物，總提取物再與苦參素和藥學(xué)上可接受的輔料混合制成任一臨床上或藥學(xué)上可接受的劑型。“單獨(dú)提取”是指，黃芪、丹參每一味藥材分別通過不同的工藝單獨(dú)提取得到提取物，再將各提取物混合得到總提取物?！盎旌咸崛　笔侵?，黃芪、丹參兩味藥材一起提取得到總提取物。所得的總提取物中所含的主要有效成分為黃芪總皂苷和丹參總酚酸，或者為黃芪多糖和丹參總酚酸；主要有效成分的總含量最好不低于50％。
上述黃芪、丹參的提取制備方法中，所用的溶劑是指藥學(xué)上常用的溶劑，可以是水或乙醇等；所用的方法是指中藥提取的一般方法，可以是煎煮法、回流提取法、浸漬法、滲漉法或連續(xù)提取法等。例如，黃芪可以用水提醇沉的方法制備得到黃芪總皂苷或黃芪多糖，丹參可以用水提醇沉或乙醇回流提取的方法制備得到丹參總酚酸。本發(fā)明提供了黃芪(以總皂苷或多糖為主要有效成分)、丹參(以總酚酸為主要有效成分)的優(yōu)選提取制備工藝。
原料藥的具體制備方法如下因?yàn)楝F(xiàn)代藥理試驗(yàn)研究表明黃芪總皂苷和黃芪多糖均有抗乙肝病毒和保護(hù)藥物性肝損傷的作用，所以黃芪的“單獨(dú)提取”方法因其活性成分的不同可采用不同的提取方法，分別如下以總皂苷為主要有效成分的黃芪的優(yōu)選提取制備工藝，如下
取黃芪藥材，加水煎煮三次，每次1.5小時，第一次加水10倍量，二、三次均為8倍量，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀處理2次，第一次溶液中含醇量為75％，第二次為85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并濃縮至每1ml相當(dāng)于原藥材10g，加于已處理好的大孔吸附樹脂柱上，先用2倍體積的水沖柱，再用4倍體積的70％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、真空干燥，即得。通過本工藝制備的黃芪總皂苷得率為0.5～2％，總皂苷的含量不低于50％，黃芪甲苷的含量不低于2.0％。
黃芪還可以通過下述工藝提取制備，但不僅限于下述工藝工藝一取黃芪藥材，加水煎煮三次，每次2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀處理2次，第一次溶液中含乙醇量為60％，第二次為85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并濃縮至每1ml相當(dāng)于原藥材10g，減壓濃縮、真空干燥，即得。通過本工藝制備的黃芪總皂苷得率為2～4％，總皂苷的含量不低于40％，黃芪甲苷的含量不低于1％。
工藝二取黃芪藥材，加水煎煮三次，每次1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀處理1次使含乙醇量為60％，冷藏放置，回收乙醇并濃縮至每1ml相當(dāng)于原藥材10g，并減壓濃縮、真空干燥，即得。通過本藝制備的黃芪總皂苷得率為3～5％，總皂苷含量的不低于30％，黃芪甲苷的含量不低于1％。
以多糖為主要有效成分的黃芪的優(yōu)選提取制備工藝，如下取黃芪藥材，加7倍量70％乙醇提取二次，每次2小時，提取液棄去，取藥渣加水提取二次，合并提取液，濃縮至提取液體積與生藥材的比例為1.05∶1，加入乙醇沉淀使含醇量達(dá)到70％，濾過，得沉淀，沉淀用70％乙醇洗滌，再用適量水溶解，濾過，濾液過大孔樹脂，用水洗脫，收集水洗液，將水洗液濃縮至藥液體積與藥材比例為1∶2.5，加入乙醇使含醇量達(dá)到70％，得沉淀，將沉淀用95％乙醇和丙酮洗滌脫水，減壓干燥(60℃)，即得。通過本工藝制備的黃芪多糖得率為0.5～2％，多糖的含量不低于50％。
黃芪還可以通過下述工藝提取制備，但不僅限于下述工藝工藝一取黃芪藥材，加水回流提取三次，每次2小時，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.15～1.23，加乙醇使含醇量達(dá)80％，靜置24小時，濾過，沉淀加水溶解，濾過，再加乙醇使含醇量達(dá)85％，靜置24小時，濾過，收集沉淀，真空干燥，即得。通過本工藝制備的黃芪多糖得率為2～4％，多糖的含量不低于40％。
工藝二取黃芪藥材，加10倍量80％乙醇提取4小時，提取液棄去，取藥渣加水提取二次，每次2小時，每次加水10倍量，合并提取液，濾過，濾液加乙醇使含醇量達(dá)85％，濾過，濾液減壓濃縮至稠膏狀，噴霧干燥，即得。通過本工藝制備的黃芪多糖得率為3～4％，多糖的含量不低于35％。
以總酚酸為主要有效成分的丹參的優(yōu)選提取制備工藝，如下取丹參藥材，粉碎成粗粒，加水煎煮三次，第一次2小時，加水12倍量，第二、三次各1.5小時，加水10倍量，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.17～1.20。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75％，第二次使含醇量為85％，各靜置24h，回收乙醇至相對密度為1.17～1.20，噴霧干燥，即得。通過本工藝制備的丹參總酚酸得率為1～3％，丹參總酚酸的含量不低于50％，丹酚酸B的含量不低于1.5％。
丹參還可通過下述工藝提取制備，但不僅限于下述工藝工藝一取丹參藥材，加水煎煮兩次，各2小時，第一次加水12倍量，第二次加水10倍量，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.17～1.20，加乙醇沉淀使含醇量達(dá)75％，靜置24h，回收乙醇至相對密度為1.23～1.28(80℃)，真空干燥(50℃)，即得。通過本工藝制備的丹參總酚酸得率2～4％，丹參總酚酸的含量不低于40％，丹酚酸B的含量不低于0.8％。
工藝二取丹參藥材，加85％乙醇回流2小時，濾過，濾液減壓回收乙醇至稠膏；藥渣加水(10倍量)煎煮1小時，濾過，濾液與上述稠膏合并，減壓濃縮至適量，50℃真空干燥，粉碎，過篩，即得。通過本工藝制備的丹參總酚酸得率為3～5％，丹參總酚酸的含量不低于30％，丹酚酸B的含量不低于0.3％。
本發(fā)明藥物組合物，還可以由黃芪總皂苷或者黃芪多糖代替黃芪、丹參總酚酸代替丹參投料制得，按照提取物相對于藥材的得率計算，本發(fā)明藥物組合物可以有以下兩種不同配比，重量份分別為配比1黃芪總皂苷2～200份、丹參總酚酸2～200份、苦參素10～200份，優(yōu)選為黃芪總皂苷5～100份、丹參總酚酸5～100份、苦參素20～100份，進(jìn)一步優(yōu)選為黃芪總皂苷10～40份、丹參總酚酸15～45份、苦參素40份。
配比2以多糖為主要有效成分的黃芪提取物即黃芪多糖2～200份、丹參總酚酸2～200份、苦參素10～200份，優(yōu)選為黃芪多糖5～100份、丹參總酚酸5～100份、苦參素20～100份，進(jìn)一步優(yōu)選為黃芪多糖10～40份、丹參總酚酸15～45份、苦參素40份。
上述藥物組合物中，黃芪總皂苷的主要有效成分為總皂苷，總皂苷的含量不低于30％，最好不低于50％，黃芪甲苷的含量不低于1.0％，最好不低于2.0％；黃芪多糖的主要有效成分的為多糖，多糖的含量不低于35％，最好不低于50％；丹參總酚酸的主要有效成分為總酚酸，總酚酸的含量不低于30％，最好不低于50％，丹酚酸B的含量不低于0.3％，最好不低于1.5％。
黃芪總皂苷、黃芪多糖、丹參總酚酸均可參照前述方法制備。按上述兩種配比得到的總提取物中的主要有效成分為黃芪總皂苷和丹參總酚酸，或者為黃芪多糖和丹參總酚酸；主要有效成分的總含量最好不低于50％。
本發(fā)明藥物組合物，藥物組分的用量是經(jīng)過發(fā)明人進(jìn)行大量摸索總結(jié)得出的，各組分用量在上述重量份范圍內(nèi)都具有較好療效。上述組成，若以克為單位，可以制成10～1000次用量的制劑，如作為水針或粉針，可制成20～2000支，每次用量1～10支。如作為片劑或膠囊劑，可制成40～4000片，每次服用1～10片。上述組成是按重量份作為配比的，如大規(guī)模生產(chǎn)可以以千克或噸為單位，小規(guī)模生產(chǎn)也可以以克為單位。上述重量份數(shù)對于特殊病人，可以相應(yīng)調(diào)整組成的比例，增加或者減少不超過100％。
本發(fā)明藥物組合物，可以制成任一臨床上或藥學(xué)上可接受的劑型，以口服、鼻吸入或胃腸外給藥的方式施用于需要這種治療的患者?？诜o藥時，可制成口服常釋劑型(如片、腸溶片、分散片、咀嚼片、口腔崩解片、膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊等)、緩釋控釋劑型(如緩釋片、控釋片、緩釋膠囊、控釋膠囊等)、口服液體劑(如口服溶液、糖漿等)、滴丸、顆粒劑等；胃腸外給藥時，可將其制成注射用的溶液、注射用水或油懸浮劑、栓劑等。優(yōu)選劑型為注射劑和口服制劑，如粉針、水針、氯化鈉注射液、葡萄糖注射液、片、膠囊、軟膠囊、顆粒、滴丸、口服液等。
上述藥物組合物，可采用現(xiàn)有制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法生產(chǎn)，必要時可以添加各種藥學(xué)上可接受的輔料，包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
本發(fā)明藥物組合物，主要用于制備抗肝臟疾病的藥物。藥理藥效研究表明，黃芪或其提取物黃芪總皂苷或者黃芪多糖、丹參或其提取物、苦參素合并用藥對四氯化碳(CCl4)致小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷、D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性肝損傷、四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷、酒精誘導(dǎo)小鼠慢性肝損傷均具有顯著的保護(hù)作用，并且可以顯著抑制鴨乙型肝炎病毒(DHBV)；提示其在治療病毒性肝炎、藥物性肝損傷、脂肪肝、酒精肝方面將有顯著療效。
本發(fā)明藥物組合物，具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)提供了一種新的復(fù)方抗肝炎藥物，滿足臨床需要。
(2)對本發(fā)明藥物組合物中藥物組份的用量進(jìn)行了大量摸索研究，通過不同配比制成的注射液對四氯化碳(CCl4)致肝損傷小鼠血清ALT和AST水平的影響的研究，篩選出具有顯著療效的重量配比。
(3)藥理藥效研究表明，本發(fā)明藥物組合物對D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性肝損傷有顯著保護(hù)作用，能顯著降低血清AST水平，升高血清ALB水平，降低肝指數(shù)；對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷有顯著保護(hù)作用，能顯著降低血清ALT和AST水平，顯著升高血清ALB水平，顯著減輕肝纖維化程度和降低纖維化發(fā)生率；對酒精誘導(dǎo)的小鼠慢性肝損傷也有顯著的保護(hù)作用，能顯著降低血清血清ALT、AST、TG水平，減輕肝組織病變；可以顯著抑制鴨乙型肝炎病毒(DHBV)，高劑量組的效果與陽性對照組的效果相當(dāng)，并且停藥后無反跳現(xiàn)象。產(chǎn)生了意想不到的效果。
(4)本發(fā)明藥物組合物，可以以黃芪、丹參、苦參素投料，也可以以黃芪總皂苷或者黃芪多糖、丹參總酚酸、苦參素為原料，可制成任一臨床上或藥學(xué)上可接受的劑型。
(5)對本發(fā)明藥物組合物制成的制劑或所用的提取物，進(jìn)行了鑒別、含量測定、穩(wěn)定性研究等，有效成分明確、含量高，制劑穩(wěn)定性好，便于控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床用藥安全。
(6)提供了優(yōu)選的制備工藝，簡便易行，且制劑質(zhì)量高，適應(yīng)于工業(yè)化大生產(chǎn)。
(7)本發(fā)明藥物組合物藥療效確切，合并用藥后用藥量減少，具有廣闊的應(yīng)用前景。
以下通過試驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述藥物組合物的有益效果，這些試驗(yàn)例包括本發(fā)明藥物組合物的藥效學(xué)試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)。本發(fā)明藥物組合物具有下列有益效果，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明藥物組合物僅具有下列有益效果。
以下試驗(yàn)例中用HDK1代替以黃芪總皂苷、丹參總酚酸、苦參素為主要有效成分的藥物組合物，用HDK2代替以黃芪多糖、丹參總酚酸、苦參素為主要有效成分的藥物組合物。以下試驗(yàn)例中所用的黃芪總皂苷為實(shí)施例1制備所得，所用的黃芪多糖為實(shí)施例2制備所得，所用的丹參總酚酸為實(shí)施例3制備所得。試驗(yàn)例2～6中所用的HDK1注射液、HDK2注射液為實(shí)施例4制備所得。
試驗(yàn)例1藥效學(xué)試驗(yàn)——黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的影響受試動物健康小鼠，240只，體重20～25g，雌雄兼用，隨機(jī)分為24組，每組10只。
供試品氯化鈉注射液(正常對照組)250ml∶2.25g，山東長富潔晶藥業(yè)有限公司黃芪總皂苷注射液自制，2ml，含黃芪總皂苷136mg(相當(dāng)于原藥材10g)黃芪多糖注射液自制，2ml，含黃芪多糖122mg(相當(dāng)于原藥材10g)丹參注射液自制，2ml，含丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)苦參素注射液自制，2ml∶200mg(黃芪+丹參+苦參素)1注射液自制，見表1-1(以黃芪總皂苷、丹參總酚酸、苦參素為主要有效成分)(黃芪+丹參+苦參素)2注射液自制，見表1-1(以黃芪多糖、丹參總酚酸、苦參素為主要有效成分)給藥劑量見表1-1。
試驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分為24組，每組10只，分別為正常對照組、模型組和各給藥組。正常對照組和模型組尾靜脈注射生理鹽水20ml/kg，每日1次，連續(xù)7天；各給藥組尾靜脈注射給藥150mg/kg，每日1次，連續(xù)7天。最后一次尾靜脈注射2h后，正常對照組腹腔注射花生油10ml/kg，其余各組均腹腔注射0.12％四氯化碳(CCl4)花生油溶液10ml/kg。16h后斷頭處死動物，取血清，測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。斷頭取血后，肝組織作常規(guī)病理組織學(xué)檢查。
試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論結(jié)果見表1-1。與正常對照組相比較，模型組的血清ALT和AST水平均極顯著升高(p＜0.01，p＜0.001)，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝組織明顯受損，并出現(xiàn)壞死，說明造模成功。與模型組相比較，各給藥組對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷均具有保護(hù)作用，能降低血清ALT和AST水平，減輕肝組織病變和壞死；黃芪總皂苷注射液和黃芪多糖注射液對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用較弱，丹參注射液和苦參素注射液對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有顯著的保護(hù)作用(p＜0.05)；黃芪400～10000份、丹參200～6000份、苦參素10～200份制成的(黃芪+丹參+苦參素)1注射液和(黃芪+丹參+苦參素)2注射液對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷均具有極顯著的保護(hù)作用(p＜0.01)，黃芪1000～5000份、丹參500～3000份、苦參素20～100份制成的注射液的保護(hù)作用更好，尤其以黃芪2000份、丹參1500份、苦參素40份制成的注射液的保護(hù)作用最好(p＜0.001)。
表1-1黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對CCl4肝損傷小鼠的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝10)
與正常對照組相比較#p＜0.01，##p＜0.01；與模型組相比較*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；與苦參素注射液組相比較ap＜0.05，bp＜0.01；與丹參注射液組相比較cp＜0.05，dp＜0.01；與黃芪總皂苷注射液組相比較ep＜0.01；與黃芪多糖注射液組相比較fp＜0.01。
與黃芪總皂苷注射液組相比較，各個配比的(黃芪+丹參+苦參素)1注射液對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有極顯著的保護(hù)作用(p＜0.01)；與黃芪多糖注射液組相比較，各個配比的(黃芪+丹參+苦參素)2注射液對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有極顯著的保護(hù)作用(p＜0.01)。與丹參注射液相比較，各個配比的(黃芪+丹參+苦參素)1注射液和(黃芪+丹參+苦參素)2注射液對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用均具有顯著的保護(hù)作用(p＜0.05，p＜0.01)。與苦參素注射液相比較，各個配比的(黃芪+丹參+苦參素)1注射液和(黃芪+丹參+苦參素)2注射液對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用均具有顯著的保護(hù)作用(p＜0.05，p＜0.01)。
試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪、丹參、苦參素合并用藥對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，并且，相同給藥劑量下，各個配比的(黃芪+丹參+苦參素)1注射液和(黃芪+丹參+苦參素)2注射液對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用均優(yōu)于黃芪總皂苷注射液、黃芪多糖注射液、丹參注射液和苦參素注射液單獨(dú)使用的效果。提示，黃芪、丹參、苦參素合并用藥具有協(xié)同作用，在抗肝炎、肝損傷方面有顯著作用。
試驗(yàn)例2黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性肝損傷的作用受試動物健康小鼠，100只，體重20～25g，雌雄兼用，隨機(jī)分為10組，每組10只。
供試品氯化鈉注射液(正常對照組)250ml∶2.25g，山東長富潔晶藥業(yè)有限公司丹參注射液自制，2ml，含丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)苦參素注射液自制，2ml∶200mgHDKl注射液自制，5ml∶482mg，含黃芪總皂苷136mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mgHDK2注射液自制，5ml∶468mg，含黃芪多糖122mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mg給藥劑量見表1-2。
試驗(yàn)方法小鼠100只，隨機(jī)分為10組，每組10只，分別為正常對照組、模型組和各給藥組。正常對照組和模型組每日尾靜脈注射生理鹽水20ml/kg，每日1次，連續(xù)10天；各給藥組按表1-2尾靜脈注射給藥，每日1次，連續(xù)10天。正常對照組在最后一次尾靜脈注射1h后，腹腔注射生理鹽水；其余各組均腹腔注射100g/L的D-氨基半乳糖500mg/kg。24h后，處死動物取血，離心取血清，測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和白蛋白(ALB)水平。處死后，取肝臟，吸去血液，剪去脂肪、系膜，精確稱重，計算肝指數(shù)。
試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論結(jié)果見表1-2。與正常對照組相比較，模型組的血清AST水平極顯著升高(p＜0.01)，血清ALB顯著下降(p＜0.05)，肝指數(shù)顯著升高(p＜0.01)，說明造模成功。與模型組相比較，各給藥組對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷均具有保護(hù)作用，能降低血清AST水平，升高血清ALB水平，降低肝指數(shù)；丹參注射液、苦參素注射液、低劑量HDK1注射液和低劑量HDK2注射液對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用(p＜0.05)，中、高劑量HDK1注射液和HDK2注射液對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷具有極顯著的保護(hù)作用(p＜0.01，p＜0.001)。
試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪、丹參、苦參素合并用藥對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，并且保護(hù)作用與給藥劑量相關(guān)，高劑量組效果最好；各劑量HDK1注射液和HDK2注射液對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用均優(yōu)于丹參注射液和苦參素注射液單獨(dú)使用的效果。提示，黃芪、丹參、苦參素合并用藥具有協(xié)同作用，在抗急性肝炎、急性肝損傷方面有顯著作用。
表1-2黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠的作用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝10)
與正常對照組相比較#p＜0.05，##p＜0.01；與模型組相比較*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；與苦參素注射液組相比較ap＜0.05，bp＜0.01；與丹參注射液組相比較cp＜0.05，dp＜0.01。
試驗(yàn)例3黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對大鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用受試動物健康大鼠，100只，體重180～200g，雌雄兼用，隨機(jī)分為10組，每組10只。
供試品氯化鈉注射液(正常對照組)250ml∶2.25g，山東長富潔晶藥業(yè)有限公司丹參注射液自制，2ml，含丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)苦參素注射液自制，2ml∶200mgHDK1注射液自制，5ml∶482mg，含黃芪總皂苷136mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mgHDK2注射液自制，5ml∶468mg，含黃芪多糖122mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mg給藥劑量見表1-3。
試驗(yàn)方法健康大鼠10只，皮下注射花生油3ml/kg，每周2次，共8周，作為正常對照組。其余大鼠，皮下注射40％四氯化碳(CCl4)花生油溶液3ml/kg，每周2次，共8周，誘導(dǎo)肝纖維化；隨后隨機(jī)分為9組，每組10只，分別為模型組和各給藥組。此后，各組按表1-4腹腔注射給藥，每日1次，共10周。末次給藥24h后，下腔靜脈采血，測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和白蛋白水平(ALB)；同時，取肝組織作常規(guī)病理組織學(xué)檢查。
試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論結(jié)果見表1-3。與正常對照組相比較，模型組的血清ALT、AST水平均極顯著升高(p＜0.01)，血清ALB水平極顯著下降(p＜0.01)，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)大鼠出現(xiàn)比較典型的肝纖維化，說明造模成功。與模型組相比較，各給藥組對肝纖維化大鼠均具有保護(hù)作用，能降低血清ALT和AST水平，升高血清ALB水平，減輕肝纖維化程度和纖維化發(fā)生率；丹參注射液、苦參素注射液、低劑量HDK1注射液和低劑量HDK2注射液對肝纖維化大鼠具有顯著的保護(hù)作用(p＜0.05)；中、高劑量HDK1注射液和HDK2注射液對肝纖維化大鼠具有極顯著的保護(hù)作用(p＜0.01，p＜0.001)。
表1-3黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對肝纖維化大鼠的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝10)
與正常對照組相比較#p＜0.01；與模型組相比較*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；與苦參素注射液組相比較ap＜0.05，bp＜0.01；與丹參注射液組相比較cp＜0.05，dp＜0.01。
試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪、丹參、苦參素合并用藥對肝纖維化大鼠具有顯著的保護(hù)作用，并且保護(hù)作用與給藥劑量相關(guān)，高劑量組效果最好；各劑量HDK1注射液和HDK2注射液對肝纖維化大鼠的保護(hù)作用均優(yōu)于丹參注射液和苦參素注射液單獨(dú)使用的效果。提示，黃芪、丹參、苦參素合并用藥具有協(xié)同作用，在抗慢性肝炎、肝纖維化、慢性肝損傷方面有顯著作用。
試驗(yàn)例4黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對小鼠慢性酒精性肝損傷的保護(hù)作用受試動物健康小鼠，100只，體重20～25g，雌雄兼用，隨機(jī)分為10組，每組10只。
供試品氯化鈉注射液(正常對照組)250ml∶2.25g，山東長富潔晶藥業(yè)有限公司丹參注射液自制，2ml，含丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)苦參素注射液自制，2ml∶200mgHDK1注射液自制，5ml∶482mg，含黃芪總皂苷136mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mgHDK2注射液自制，5ml∶468mg，含黃芪多糖122mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mg給藥劑量見表1-4。
試驗(yàn)方法健康小鼠10只，灌胃給予蒸餾水12ml/kg，每天1次，共5周，作為正常對照組。其余小鼠，灌胃給予50％乙醇12ml/kg，每天1次，共5周；隨后隨機(jī)分為9組，分別為模型組和各給藥組。此后，各組按表1-4腹腔注射給藥，每日1次，共8周。末次給藥24h后，下腔靜脈采血，測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和甘油三酯(TG)水平；同時，取肝組織作常規(guī)病理組織學(xué)檢查。
試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論結(jié)果見表1-4。與正常對照組相比較，模型組的血清ALT、AST、TG水平均顯著升高(p＜0.01)，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝組織明顯受損，肝細(xì)胞脂肪性病變、空泡變性、凋亡等，說明造模成功。與模型組相比較，各給藥組對小鼠慢性酒精性肝損傷均具有保護(hù)作用，能降低血清血清ALT、AST、TG水平，減輕肝組織病變；丹參注射液、苦參素注射液、低劑量HDK1注射液和低劑量HDK2注射液對小鼠慢性酒精性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用(p＜0.05，p＜0.01)；中、高劑量HDK1注射液和HDK2注射液對小鼠慢性酒精性肝損傷具有極顯著的保護(hù)作用(p＜0.01，p＜0.001)。
表1-4黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對小鼠慢性酒精性肝損傷的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝10)
與正常對照組相比較#p＜0.01；與模型組相比較*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；與苦參素注射液組相比較ap＜0.05，bp＜0.01；與丹參注射液組相比較cp＜0.05，dp＜0.01。
試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪、丹參、苦參素合并用藥對小鼠慢性酒精性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，并且保護(hù)作用與給藥劑量相關(guān)，高劑量組效果最好；各劑量HDK1注射液和HDK2注射液對小鼠慢性酒精性肝損傷的保護(hù)作用均優(yōu)于丹參注射液和苦參素注射液單獨(dú)使用的效果。提示，黃芪、丹參、苦參素合并用藥具有協(xié)同作用，在抗酒精性肝損傷方面有顯著作用。
試驗(yàn)例5黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥抗鴨乙型肝炎病毒(DHBV)的作用受試動物1日齡北京鴨，雌雄兼用。
供試品注射用阿昔洛韋(陽性對照組)0.25mg，湖北科益藥業(yè)股份有限公司丹參注射液自制，2ml，含丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)苦參素注射液自制，2ml∶200mgHDK1注射液自制，5ml∶482mg，含黃芪總皂苷136mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mgHDK2注射液自制，5ml∶468mg，含黃芪多糖122mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mg給藥劑量見表1-5。
試驗(yàn)方法1日齡北京鴨足靜脈注射DHBV-DNA陽性血清，每只0.2ml，感染后7天取血，分離血清，-20℃保存待檢。篩選出感染成功的陽性鴨60只，隨機(jī)分為10組，每組6只，分別為模型組、陽性對照組和各給藥組。感染后第13天開始，各組按表1-5靜脈注射給藥，每天1次，共2周。分別于給藥前、給藥第7天、給藥第14天和停藥后第3天，自鴨腿脛靜脈抽血，分離血清，-20℃保存待檢。用DHBV-DNADot Blot法檢測上述鴨血清，以雜交斑點(diǎn)吸光度(OD)值作為標(biāo)本DHBV-DNA水平值。
試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論結(jié)果見表1-5。與模型組相比較，各給藥組對鴨DHBV病毒均有顯著抑制作用(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)。給藥期間，陽性對照注射用阿昔洛韋對鴨DHBV病毒有極顯著的抑制作用(p＜0.001)，但是停藥后DHBV水平又升高；給藥期間，丹參注射液、苦參素注射液對鴨DHBV病毒均有顯著的抑制作用(p＜0.05)，但是停藥后苦參素注射液給藥組的DHBV水平又明顯升高；低劑量HDK1注射液和低劑量HDK2注射液對鴨DHBV病毒均有顯著的抑制作用(p＜0.05)，中、高劑量HDK1注射液和HDK2注射液有極顯著的抑制作用(p＜0.01)，并且停藥后DHBV-DNA水平無明顯升高。
表1-5黃芪、丹參、苦參素聯(lián)合用藥對鴨DHBV-DNA的抑制作用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝6)
與模型組相比較*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；與苦參素注射液組相比較ap＜0.05，bp＜0.01；與丹參注射液組相比較cp＜0.05，dp＜0.01。
試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪、丹參、苦參素合并用藥對鴨DHBV病毒具有顯著的抑制作用，并且抑制作用與給藥劑量相關(guān)，高劑量組的效果最好；各劑量HDK1注射液和HDK2注射液對鴨DHBV病毒的抑制作用均優(yōu)于丹參注射液和苦參素注射液單獨(dú)使用的效果。給藥期間，高劑量組HDK1注射液和HDK2注射液對鴨DHBV病毒的抑制作用略低于陽性對照組注射用阿昔洛韋的效果，但是，停藥后注射用阿昔洛韋組出現(xiàn)明顯的反跳現(xiàn)象，而HDK1注射液和HDK2注射液組無明顯反跳現(xiàn)象。提示，黃芪、丹參、苦參素合并用藥具有協(xié)同作用，在抗病毒性肝炎方面有顯著作用，并且停藥后無反跳現(xiàn)象。
試驗(yàn)例6HDK1注射液、HDK2注射液穩(wěn)定性試驗(yàn)供試品HDK1注射液自制，5ml∶482mg，含黃芪總皂苷136mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mgHDK2注射液自制，5ml∶468mg，含黃芪多糖122mg(相當(dāng)于原藥材10g)、丹參總酚酸146mg(相當(dāng)于原藥材7.5g)、苦參素200mg考察項(xiàng)目性狀、pH值、澄明度、有關(guān)物質(zhì)、標(biāo)示含量。
長期試驗(yàn)置溫度25℃±2℃、相對濕度60％±10％的條件下放置12個月。分別于第3個月、6個月、9個月、12個月，比較外觀后，測試各項(xiàng)指標(biāo)，將結(jié)果與0個月比較；12個月末增加無菌和熱原檢查。
試驗(yàn)結(jié)果溫度25℃±2℃、相對濕度60％±10％的條件下放置12個月，各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化；長期試驗(yàn)12個月末，熱原、無菌檢查均符合規(guī)定。
結(jié)論上述考察結(jié)果表明，HDK1注射液、HDK2注射液的各項(xiàng)指標(biāo)均比較穩(wěn)定，可以長期儲存，適應(yīng)于工業(yè)大生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中各劑型的輔料可以用藥學(xué)上可接受的輔料替換，或者減少、增加。
以下實(shí)施例中用HDK1代替以黃芪總皂苷、丹參總酚酸、苦參素為主要有效成分的藥物組合物，用HDK2代替以黃芪多糖、丹參總酚酶、苦參素為主要有效成分的藥物組合物。實(shí)施例4～13中所用的黃芪總皂苷為實(shí)施例1制備所得，所用的黃芪多糖為實(shí)施例2制備所得，所用的丹參總酚酸為實(shí)施例3制備所得。
實(shí)施例1黃芪總皂苷的制備以及鑒別和含量測定黃芪總皂苷的翻備取黃芪藥材，加水煎煮三次，每次1.5小時，第一次加水10倍量，二、三次均為8倍量，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀處理2次，第一次溶液中含醇量為75％，第二次為85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并濃縮至每1ml相當(dāng)于原藥材10g，加于已處理好的大孔吸附樹脂柱上，先用2倍體積的水沖柱，再用4倍體積的70％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、真空干燥，即得。
分別制備三批黃芪總皂苷，提取物得率見表2-1。
黃芪總皂苷的鑒別鑒別試驗(yàn)一取本品10mg，加甲醇20ml，加熱回流1小時，濾過，濾液加于中性氧化鋁柱(100～120目，5g，內(nèi)徑10～15mm)上，用40％甲醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20ml，合并正丁醇液；用水洗滌2次，每次20ml；棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)，紫外光燈(365nm)下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)。
鑒別試驗(yàn)二取本品10mg，加乙醇30ml，加熱回流20分鐘，濾過，濾液加0.3％氫氧化鈉溶液15ml使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5～6，用乙酸乙酯15ml振搖提取，分取乙酸乙酯液，用鋪有無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)作為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏后置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。
分別對上述三批黃芪總皂苷進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，結(jié)果均符合要求。
黃芪總皂苷的含量測定總皂苷的含量測定對照品溶液的制備精密稱取于105℃干燥至恒重的黃芪甲苷對照品10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml含黃芪甲苷干品0.1mg)。
供試品溶液的制備取本品100mg，精密稱定，加水25ml使溶解，移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次10ml，棄去水液，正丁醇至水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，移?5ml量瓶中，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
測定法精密量取對照品溶液、供試品溶液各1ml，置25ml納氏比色管，置水浴中蒸干，放冷，加新鮮配制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml，搖勻，放置5分鐘，置沸水浴中顯色15分鐘，取出，立即置冰浴中冷卻至室溫，加入8ml冰醋酸，搖勻，在538nm波長處測定吸光度，計算，即得。
黃芪甲苷的含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(32∶68)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器。理論板數(shù)以黃芪甲苷峰計算不低于4000。
對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備精密稱取本品40mg，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4小時，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?ml使溶解，放冷，通過Dl01型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用40％乙醇30ml洗脫，棄去洗脫液，繼用70％乙醇80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液10μl、20μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)方程計算，即得。
分別對上述三批黃芪總皂苷進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2-1。
通過本工藝制備的黃芪總皂苷得率為0.5～2％，總皂苷的含量不低于50％，黃芪甲苷的含量不低于2.0％。
表2-1黃芪總皂苷的含量測定結(jié)果和得率
實(shí)施例2黃芪多糖的制備以及鑒別和含量測定黃芪多糖的制備取黃芪藥材，加7倍量70％乙醇提取二次，每次2小時，提取液棄去，取藥渣加水提取二次，合并提取液，濃縮至提取液體積與生藥材的比例為1.05∶1，加入乙醇沉淀使含醇量達(dá)到70％，濾過，得沉淀，沉淀用70％乙醇洗滌，再用適量水溶解，濾過，濾液過大孔樹脂，用水洗脫，收集水洗液，將水洗液濃縮至藥液體積與藥材比例為1∶2.5，加入乙醇使含醇量達(dá)到70％，得沉淀，將沉淀用95％乙醇和丙酮洗滌脫水，減壓干燥(60℃)，即得。
分別制備三批黃芪多糖，得率見表2-2。
黃芪多糖的鑒別(1)取本品約0.2mg，加水5ml溶解后，加堿性酒石酸銅試液5滴，加熱即產(chǎn)生紅色沉淀，冷卻，濾過，取濾液加鹽酸1滴使成酸性，水浴加熱10分鐘，放冷，調(diào)節(jié)pH值至中性，加堿性酒石酸銅試液0.5ml，水浴加熱即產(chǎn)生紅色的氧化亞銅沉淀。
(2)取本品約0.2g，加水2ml溶解后，加5％α-萘酚乙醇溶液0.5ml搖勻，緩緩加入硫酸3ml，兩液面交界處顯紫紅色環(huán)。
分別對上述三批黃芪多糖進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，結(jié)果均符合要求。
黃芪多糖的含量測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加水溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml共6份，分別置25ml量瓶中，加水至2.0ml，并加苯酚溶液(取苯酚300g，鋁片0.3g，碳酸氫鈉0.15g，混合蒸餾，收集182℃餾分，配制成5％水溶液)1.0ml，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，放置5分鐘，置水浴中加熱15分鐘，取出，迅速冷卻至室溫，另以2.0ml水同上平行操作作為空白對照，在490nm波長處測定吸收值，計算回歸方程。
測定法取本品0.5g置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法自“加水至2.0ml”起，依法測定吸收值，依回歸方程計算多糖的含量。
分別對上述三批黃芪多糖進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2-2。
通過本工藝制備的黃芪多糖得率為0.5～2％，多糖的含量不低于50％。
表2-2黃芪多糖的含量測定結(jié)果和得率
實(shí)施例3丹參總酚酸的制備以及鑒別和含量測定丹參總酚酸酸的制備取丹參藥材，粉碎成粗粒，加水煎煮三次，第一次2小時，加水12倍量，第二、三次各1.5小時，加水10倍量，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.17～1.20。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75％，第二次使含醇量為85％，各靜置24h，回收乙醇至相對密度為1.17～1.20，噴霧干燥，即得。
分別制備三批丹參總酚酸，得率見表2-3。
丹參總酚酸的鑒別取本品0.2g，研細(xì)，加70％甲醇25ml，加熱回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0％甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹酚酸B對照品，加70％甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法測定，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
對上述三批丹參總酚酸進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，結(jié)果均符合要求。
丹參總酚酸的含量測定總酚酸的含量測定對照品溶液的制備稱取于105℃干燥至恒重的原兒茶醛對照品1mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加水溶解，并稀釋至刻度，搖勻。
供試品溶液的制備稱取本品50mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加水稀釋至刻度。精密量取0.1ml，置25ml容量瓶中，加乙醇5ml，加入0.3％十二烷基硫酸鈉2ml，0.6％鐵氰化鉀-0.9％三氧化鐵(臨用前等量混合)1ml，暗處放置5分鐘，加入0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，暗處放置20分鐘后，置lena比色池中，720nm處測定。
丹酚酸B的含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)為流動相，檢測波長為286nm。理論板數(shù)按丹參素峰計算應(yīng)不低于1500。
對照品溶液的制備精密稱取丹酚酸B對照品適量，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本品約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1h，取出，放冷，再稱定重量，用75％甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，計算，即得。
對上述三批丹參總酚酸進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2-3。
通過本工藝制備的丹參總酚酸得率為1～3％，總酚酸的含量不低于50％，丹酚酸B的含量不低于1.5％。
表2-3丹參總酚酸的含量測定結(jié)果和得率
實(shí)施例4HDK注射液的制備1、處方HDK1注射液處方黃芪總皂苷136g(相當(dāng)于原藥材10kg)丹參總酚酸146g(相當(dāng)于原藥材7.5kg)苦參素200g聚山梨酯-80 40g注射用水 加至5000ml
共制備1000支注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2注射液處方黃芪多糖 122g(相當(dāng)于原藥材10kg)丹參總酚酸146g(相當(dāng)于原藥材7.5kg)苦參素200g聚山梨酯-80 20g注射用水 加至5000ml
共制備1000支注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟
(1)提前一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水沖洗；(2)取配液量80％的注射用水，加入聚山梨酯-80攪拌溶解，然后加入處方量的黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素，加熱攪拌溶解完全；補(bǔ)加注射用水至全量；(3)加入配液量0.1％的針劑用活性炭，加熱攪拌15分鐘；(4)經(jīng)砂濾棒過濾脫炭，測定并調(diào)節(jié)溶液的pH值；(5)經(jīng)0.45μm的微孔濾膜精濾；(6)檢查溶液的澄明度，半成品化驗(yàn)；(7)將溶液灌裝、熔封于玻璃安瓿中；(8)100℃流通蒸汽滅菌30分鐘；(9)趁熱將樣品放入0.01％的亞甲藍(lán)溶液中檢漏；(10)燈檢，成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例5注射用HDK的制備1、處方注射用HDK1處方黃芪總皂苷136g(相當(dāng)于原藥材10kg)丹參總酚酸146g(相當(dāng)于原藥材7.5kg)苦參素200g聚山梨酯-80 40g甘露醇200g無菌注射用水 加至3000ml
共制備1000支注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
注射用HDK2處方黃芪多糖122g(相當(dāng)于原藥材10kg)丹參總酚酸 146g(相當(dāng)于原藥材7.5kg)苦參素 200g聚山梨酯-80 20g甘露醇 200g無菌注射用水加至3000ml
共制備 1000支注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟(1)首先將配液用的容器具及抗生素玻璃瓶，膠塞等進(jìn)行無菌處理；(2)按照處方量稱取原料和輔料；(3)取配液量80％的無菌注射用水，加入聚山梨酯-80攪拌溶解，然后將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素加入加熱攪拌溶解完全，再加入甘露醇加熱攪拌溶解完全，補(bǔ)加無菌注射用水至全量；
(4)加入配液量0.1％的針劑用活性炭，加熱攪拌15分鐘；(5)經(jīng)砂濾棒過濾脫炭，測定并調(diào)節(jié)溶液的pH值；(6)經(jīng)0.22μm的微孔濾膜精濾；(7)檢查溶液的澄明度，半成品化驗(yàn)；(8)分裝于抗生素玻璃瓶中，半壓塞；將樣品放入凍干機(jī)中冷凍干燥；-40℃預(yù)凍4小時，低溫真空干燥-40℃～0℃18小時，然后升溫至20℃真空干燥4小時；(9)凍干結(jié)束，壓塞，軋蓋；(10)成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例6 HDK氯化鈉注射液的制備b1、處方HDK1氯化鈉注射液處方黃芪總皂苷271g(相當(dāng)于原藥材20kg)丹參總酚酸244g(相當(dāng)于原藥材15kg)苦參素400g聚山梨酯-80 80g氯化鈉900g注射用水 加至100000ml
共制備1000瓶注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2氯化鈉注射液處方黃芪多糖 245g(相當(dāng)于原藥材20kg)丹參總酚酸291g(相當(dāng)于原藥材15kg)苦參素400g聚山梨酯-80 40g氯化鈉900g注射用水 加至100000ml
共制備1000瓶注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟(1)前一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水沖洗；(2)取配液量20％的注射用水，加入聚山梨酯-80攪拌溶解，然后將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素加入加熱攪拌溶解完全，將氯化鈉用配液量40％的注射用水溶解完全；(3)合并上述溶液，補(bǔ)加注射用水至全量；(4)加入配液量0.1％的針劑用活性炭，加熱攪拌15分鐘；(5)經(jīng)砂濾棒過濾脫炭，測定并調(diào)節(jié)溶液的pH值；(6)經(jīng)0.45μm的微孔濾膜精濾；
(7)檢查溶液的澄明度，半成品化驗(yàn)；(8)灌裝于100ml的輸液瓶中；(9)115℃熱壓滅菌30分鐘；(10)燈檢，成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例7HDK葡萄糖注射液的制備1、處方HDK1葡萄糖注射液處方黃芪總皂苷271g(相當(dāng)于原藥材20kg)丹參總酚酸291g(相當(dāng)于原藥材15kg)苦參素400g聚山梨酯-80 80g葡萄糖5000g注射用水 加至100000ml
共制備1000瓶注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2葡萄糖注射液處方黃芪多糖 245g(相當(dāng)于原藥材20kg)丹參總酚酸291g(相當(dāng)于原藥材15kg)苦參素400g聚山梨酯-80 40g葡萄糖5000g注射用水 加至100000ml
共制備1000瓶注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟(1)提前一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水沖洗；(2)取配液量20％的注射用水，加入聚山梨酯-80攪拌溶解，然后將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素加入加熱攪拌溶解完全，將葡萄糖用配液量40％的注射用水溶解完全；(3)合并上述溶液，補(bǔ)加注射用水至全量；(4)加入配液量0.1％的針劑用活性炭，加熱攪拌15分鐘；(5)經(jīng)砂濾棒過濾脫炭，測定并調(diào)節(jié)溶液的pH值；(6)經(jīng)0.45μm的微孔濾膜精濾；(7)檢查溶液的澄明度，半成品化驗(yàn)；(8)灌裝于100ml的輸液瓶中；(9)115℃熱壓滅菌30分鐘；(10)燈檢，成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例8HDK片的制備1、處方HDK1片處方黃芪總皂苷68g(相當(dāng)于原藥材5kg)丹參總酚酸73g(相當(dāng)于原藥材3.75kg)苦參素100g淀粉 60.0g預(yù)膠化淀粉50.0g微晶纖維素50.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量硬脂酸鎂 2.0g羧甲淀粉鈉20.0g
共制備1000片注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2片處方黃芪多糖 61g(相當(dāng)于原藥材5kg)丹參總酚酸73g(相當(dāng)于原藥材3.75kg)苦參素100g淀粉 60.0g預(yù)膠化淀粉50.0g微晶纖維素50.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量硬脂酸鎂 2.0g羧甲淀粉鈉20.0g
共制備1000片注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟(1)將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素粉碎過100目篩備用；(2)按照處方量稱取原料和輔料；(3)將羥丙甲纖維素溶于水中制成2％的水溶液備用；(4)將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸、苦參素、淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素混合均勻，加入2％HPMC50％乙醇溶液適量，攪拌均勻，制成適宜軟材；(5)過20目篩制顆粒；顆粒在60℃的條件下烘干；(6)干燥好的顆粒加入硬脂酸鎂和羧甲淀粉鈉，過18目篩整粒，混合均勻；(7)取樣，半成品化驗(yàn)；(8)按照化驗(yàn)確定的片重壓片；(9)成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例9HDK膠囊的制備1、處方
HDK1膠囊處方黃芪總皂苷68g(相當(dāng)于原藥材5kg)丹參總酚酸73g(相當(dāng)于原藥材3.75kg)苦參素100g淀粉 50.0g預(yù)膠化淀粉60.0g微晶纖維素40.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量硬脂酸鎂 1.0g
共制備1000粒注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2膠囊處方黃芪多糖 61g(相當(dāng)于原藥材5kg)丹參總酚酸73g(相當(dāng)于原藥材3.75kg)苦參素100g淀粉 50.0g預(yù)膠化淀粉60.0g微晶纖維素40.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量硬脂酸鎂 2.0g
共制備1000片注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟(1)將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參索粉碎過100目篩備用；(2)按照處方量稱取原料和輔料；(3)將羥丙甲纖維素溶于水中制成2％的水溶液備用；(4)將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸、苦參素、淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素混合均勻，加入2％HPMC50％乙醇溶液適量，攪拌均勻，制成適宜軟材；(5)過20目篩制顆粒；(6)顆粒在60℃的條件下烘干；(7)干燥好的顆粒加入硬脂酸鎂，過18目篩整粒，混合均勻；(8)取樣，半成品化驗(yàn)；(9)按照化驗(yàn)確定的裝量裝入膠囊；(10)成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例10HDK軟膠囊的制備1、處方HDK1軟膠囊處方
黃芪總皂苷68g(相當(dāng)于原藥材5kg)丹參總酚酸73g(相當(dāng)于原藥材3.75kg)苦參素100g大豆油400g大豆磷脂 20g蜂蠟 12g
共制備1000粒注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2軟膠囊處方黃芪多糖 61g(相當(dāng)于原藥材5kg)丹參總酚酸73g(相當(dāng)于原藥材3.75kg)苦參素100g大豆油400g大豆磷脂 20g蜂蠟 12g
共制備1000粒注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟(1)將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素粉碎過100目篩，備用；(2)處方量的大豆油和大豆磷脂、蜂蠟加熱熔融，混勻，放冷；(3)加入黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素，研勻，過膠體磨；(4)取樣，半成品化驗(yàn)；(5)壓制成軟膠囊；(6)成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例11HDK滴丸的制備1、處方HDK1滴丸處方黃芪總皂苷68g(相當(dāng)于原藥材5kg)丹參總酚酸73g(相當(dāng)于原藥材3.75kg)苦參素100g聚乙二醇6000 600g
注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2滴丸處方黃芪多糖 61g(相當(dāng)于原藥材5kg)丹參總酚酸73g(相當(dāng)于原藥材3.75kg)苦參素100g聚乙二醇6000 600g
注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟
(1)聚乙二醇6000在水浴中加熱熔融；(2)聚乙二醇6000全部熔融后加入黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素，攪拌溶解；(3)過60目篩過濾；(4)保持60℃滴入冷至10℃以下的液體石蠟中制成丸；(5)成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例12HDK顆粒的制備1、處方HDK1顆粒處方黃芪總皂苷271g(相當(dāng)于原藥材20kg)丹參總酚酸291g(相當(dāng)于原藥材15kg)苦參素400g糖粉 1150.0g矯味劑適量2％HPMC50％乙醇溶液 適量共制備1000包注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2顆粒處方黃芪多糖245g(相當(dāng)于原藥材20kg)丹參總酚酸 291g(相當(dāng)于原藥材15kg)苦參素 400g糖粉 1150.0g矯味劑 適量2％HPMC50％乙醇溶液 適量共制備1000包注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟(1)將蔗糖粉碎過100目篩備用，黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素粉碎過100目篩備用；(2)按照處方量稱取原料和輔料；(3)將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸、苦參素與糖粉、矯味劑以等量遞加的方法混合均勻，加入2％HPMC50％乙醇溶液適量，攪拌均勻，制成適宜軟材；(4)過20目篩制顆粒；(5)顆粒在60℃的條件下烘干；(6)干顆粒過18目篩整粒；(7)取樣，半成品化驗(yàn)顆粒中主藥的含量，確定裝量；(8)包裝；成品全檢，包裝入庫。
實(shí)施例13HDK口服液的制備1、處方HDK1口服液處方黃芪總皂苷271g(相當(dāng)于原藥材20kg)丹參總酚酸291g(相當(dāng)于原藥材15kg)苦參素400g苯甲酸鈉 40g甜菊甙30g水加至15000ml
共制備1000支注中藥總提取物中主要有效成分總含量為63.22％。
HDK2口服液處方黃芪多糖 245g(相當(dāng)于原藥材20kg)丹參總酚酸291g(相當(dāng)于原藥材15kg)苦參素400g苯甲酸鈉 40g甜菊甙30g水加至15000ml
共制備1000支注中藥總提取物中主要有效成分總含量為61.57％。
2、具體步驟(1)將黃芪總皂苷(或者黃芪多糖)、丹參總酚酸和苦參素加入配液量60％的水中加熱攪拌溶解完全；(2)將苯甲酸鈉和甜菊甙用配液量20％的水溶解完全；(3)合并上述溶液，補(bǔ)加水至全量；(4)過0.8μm的微孔濾膜過濾；(5)半成品化驗(yàn)；(6)灌裝；成品全檢，包裝入庫。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于，該組合物主要由下列重量份的原料藥制成黃芪400～10000份、丹參200～6000份、苦參素10～200份。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，各原料藥的重量份為黃芪1000～5000份、丹參500～3000份、苦參素20～100份。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，各原料藥的重量份為黃芪2000份、丹參1500份、苦參素40份。
4.如權(quán)利要求1～3所述的任一藥物組合物的制備方法，其特征在于，所述的黃芪、丹參可以用適宜的溶劑和方法單獨(dú)或混合提取加工得到提取物，總提取物再與苦參素和藥學(xué)上可接受的輔料混合加工制成任一臨床上或藥學(xué)上可接受的劑型。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于，所述的總提取物中所含的主要有效成分為黃芪總皂苷和丹參總酚酸，或者為黃芪多糖和丹參總酚酸，所含的主要有效成分的總含量不低于50％。
6.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，該組合物還可由下列原料藥制成黃芪總皂苷或者黃芪多糖、丹參總酚酸和苦參素，其重量份為黃芪總皂苷2～200份、丹參總酚酸2～200份、苦參素10～200份，或者為黃芪多糖2～200份、丹參總酚酸2～200份、苦參素10～200份。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特在于，各原料藥的重量份為黃芪總皂苷5～100份、丹參總酚酸5～100份、苦參素20～100份，或者為黃芪多糖5～100份、丹參總酚酸5～100份、苦參素20～100份。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特在于，各原料藥的重量份為黃芪總皂苷10～40份、丹參總酚酸15～45份、苦參素40份，或者為黃芪多糖10～40份、丹參總酚酸15～45份、苦參素40份。
9.如權(quán)利要求6～8所述的任一藥物組合物，其特征在于，所述的黃芪總皂苷中總皂苷的含量不低于30％、黃芪甲苷的含量不低于1.0％，黃芪多糖中多糖的含量不低于35％，丹參總酚酸中總酚酸的含量不低于30％、丹酚酸B的含量不低于0.3％。
10.如權(quán)利要求1～3、6～8所述的任一藥物組合物，其特征在于，該組合物可與藥學(xué)上可接受的輔料混合制成任一臨床上或藥學(xué)上可接受的劑型。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種新的治療肝臟疾病的藥物組合物及其制備方法，由黃芪400～10000份、丹參200～6000份、苦參素10～200份制成，也可以由黃芪總皂苷或者黃芪多糖2～200份、丹參總酚酸2～200份、苦參素10～200份制成?？芍瞥扇我慌R床上或藥學(xué)上可接受的劑型，優(yōu)選為口服制劑和注射劑。本發(fā)明藥物組合物有效成分明確，含量確切，共同發(fā)揮抗病毒性肝炎、藥物性肝損傷、脂肪肝、酒精肝等功效，效果顯著，主要用于制備治療肝臟疾病的藥物。制備工藝簡便易行，制劑質(zhì)量高且穩(wěn)定，適應(yīng)于工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號A61P31/00GK1977889SQ20051004541
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者黃振華 申請人:黃振華