專利名稱：一種防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物和醫(yī)療器械領(lǐng)域，涉及防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄支架。具體涉及一種防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架。
背景技術(shù)：
支架植入術(shù)取代了大部分的球囊擴(kuò)張術(shù)，成為冠心病介入治療(PCI)的主要方法。但支架內(nèi)再狹窄嚴(yán)重阻礙了該項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。研究預(yù)測，基因治療有望成為解決支架植入后再狹窄的有效途徑。據(jù)報(bào)道，目前大多數(shù)的基因治療以抑制平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖和遷移為治療策略。但是，研究表明細(xì)胞凋亡的相對不足是再狹窄形成的重要原因。白介素-1β轉(zhuǎn)換酶(ICE)基因是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞的共同途徑，已有研究發(fā)現(xiàn)該基因有誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的血管SMC凋亡作用，但是否可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制內(nèi)膜增生，防止PCI后再狹窄未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄支架，具體涉及一種防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架。
本發(fā)明根據(jù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)ICE基因轉(zhuǎn)染可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制抑制新內(nèi)膜形成，防治再狹窄的理論基礎(chǔ)；制備以質(zhì)粒為載體、以明膠涂層支架為遞送系統(tǒng)的ICE基因支架。
本發(fā)明采用明膠涂層金屬不銹鋼支架，攜帶質(zhì)粒pcDNA4介導(dǎo)的白介素-1β轉(zhuǎn)換酶(ICE)基因，經(jīng)療效及作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，本支架可使基因局部轉(zhuǎn)染血管壁能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制內(nèi)膜增生，可用于防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄，具有安全性和可行性。
本發(fā)明支架通過下述方法和步驟制備1.獲取目的基因ICE所述的基因ICE，可采用限制性內(nèi)切酶法、化學(xué)合成法、PCR擴(kuò)增或RT-PCR法、基因組文庫或cDNA文庫篩選法獲取。
2.以真核細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)?；虿《緸檩d體，構(gòu)建人ICE克隆。
所述質(zhì)?？梢詾閜cDNA4、pSI或pCMV-HA；病毒可以為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒。
3.pcDNA4-ICE重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、鑒定后，溶解于0.1M Tris(PH 8.0)或純水中，濃度為4～15mg/ml。
4.制備載pcDNA4-ICE基因支架。
5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ICE明膠涂層支架轉(zhuǎn)染犬冠脈的有效性、安全性，轉(zhuǎn)染犬冠脈的組織病理學(xué)變化(生物相容性)，轉(zhuǎn)染犬冠脈的形態(tài)學(xué)變化，轉(zhuǎn)染犬冠脈細(xì)胞凋亡的變化，轉(zhuǎn)染犬冠脈對細(xì)胞增殖指數(shù)的影響和支架轉(zhuǎn)染犬冠脈對α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM actin)的影響。
本發(fā)明從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制入手，選擇ICE基因，以pcDNA4為載體，構(gòu)建了人pcDNA4-ICE真核表達(dá)重組質(zhì)粒，制備明膠涂層金屬不銹鋼支架攜帶質(zhì)粒pcDNA4介導(dǎo)的白介素-1β轉(zhuǎn)換酶基因局部轉(zhuǎn)染犬冠狀動(dòng)脈安全、有效、可行。所述明膠涂層金屬不銹鋼支架具有很好的生物相容性，所述支架攜帶質(zhì)粒pcDNA4介導(dǎo)的ICE基因顯著抑制了犬冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄，可誘導(dǎo)再狹窄的冠狀動(dòng)脈組織新生內(nèi)膜和中膜SMC凋亡。


圖1是pcDNA4-ICE真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖。
圖2模型組支架植入后4w損傷冠脈組織病理學(xué)變化(HE×14)內(nèi)膜明顯增厚。
圖3涂層組支架植入后4w損傷冠脈組織病理學(xué)變化(HE×14)內(nèi)膜明顯增厚。
圖4空質(zhì)粒組支架植入后4w損傷冠脈組織病理學(xué)變化(HE×14)內(nèi)膜明顯增厚。
圖5基因轉(zhuǎn)染組支架植入后4w損傷冠脈組織病理學(xué)變化(HE×14)內(nèi)膜厚度較其他組減小。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1獲取目的基因ICE采用限制性內(nèi)切酶法、化學(xué)合成法、PCR擴(kuò)增或RT-PCR法、基因組文庫或cDNA文庫篩選法獲取目的基因ICE。本發(fā)明從人鼻咽癌cDNA文庫中應(yīng)用PCR擴(kuò)增獲取ICE。
構(gòu)建人ICE克隆以pcDNA4/myc-His為載體，重組pcDNA4-ICE真核表達(dá)質(zhì)粒；應(yīng)用EcoR I、XhoI雙酶切目的基因片斷以及pcDNA4載體，雙粘端鏈接重組。
pcDNA4-ICE重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、鑒定后，溶解在0.1M Tris(PH 8.0)或純水中，濃度為4～15mg/ml。
所述的pcDNA4-ICE重組質(zhì)粒具有序列1的序列。
制備載pcDNA4-ICE基因支架將明膠溶于水，配成5％的溶液，加入明膠含量2％的戊二醛，攪拌均勻后，噴涂在支架上，50～60℃烘箱烘干，涂好的支架壓握在球囊導(dǎo)管上，一部分封裝于塑料包裝袋中，環(huán)氧乙烷消毒后待用，另一部分浸入制備的pcDNA4-ICE溶液中10min，取出，無菌吹干后，再重復(fù)浸漬，封裝，備用。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)球囊導(dǎo)管技術(shù)，支架直徑、冠脈直徑以1.2～1.3∶1比例植入支架制作犬冠狀動(dòng)支架內(nèi)再狹窄模型，將吸附有質(zhì)粒pcDNA4介導(dǎo)的人ICE基因(10mg/ml)支架植入犬冠狀動(dòng)脈前降支或回旋支相應(yīng)段作為基因轉(zhuǎn)染組，每只動(dòng)物植入兩只支架，以相同方法植入明膠涂層加質(zhì)粒支架、單純明膠涂層支架或裸支架分別作為空質(zhì)粒組、涂層組、模型組(各組10只犬，20只支架)。分別于術(shù)后第1w和第4w處死部分犬。1w時(shí)，RT-PCR技術(shù)檢測基因轉(zhuǎn)染組支架血管段及重要器官人ICEmRNA表達(dá)，免疫組化法檢測人ICE蛋白表達(dá)。4w時(shí)，計(jì)算機(jī)圖像定量分析支架血管段新生內(nèi)膜面積、腔面積和平均內(nèi)膜厚度。不同時(shí)間點(diǎn)，光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察各組支架血管段及重要器官組織病理學(xué)變化，免疫組化法測定支架血管段內(nèi)膜和中膜增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、α-SM actin表達(dá)并圖像半定量分析，TUNEL法結(jié)合圖像分析、流式細(xì)胞儀技術(shù)、透射電鏡觀察和檢測細(xì)胞凋亡。
結(jié)果表明1.本ICE明膠涂層支架轉(zhuǎn)染犬冠脈有效、安全在犬支架植入后第1w，只有基因轉(zhuǎn)染組支架血管段顯示有人特異性ICEmRNA和ICE蛋白表達(dá)，全身重要器官和其余3組不表達(dá)。
2.ICE明膠涂層支架轉(zhuǎn)染犬冠脈的組織病理學(xué)變化(生物相容性)第1w時(shí)光學(xué)顯微鏡下可見支架損傷處新生內(nèi)膜層炎性細(xì)胞浸潤，掃描電鏡顯示各組損傷冠脈組織均可見程度類似的內(nèi)皮細(xì)胞表面白細(xì)胞粘附，血小板和纖維蛋白沉積，內(nèi)皮再生不完整。第4w時(shí)，掃描電鏡顯示基因轉(zhuǎn)染組、涂層組及空質(zhì)粒組內(nèi)皮細(xì)胞成熟，內(nèi)皮完整，無白細(xì)胞粘附及纖維蛋白沉積；模型組內(nèi)皮細(xì)胞不成熟，內(nèi)皮完整，纖維蛋白沉積，無白細(xì)胞粘附。各時(shí)間點(diǎn)4組均無動(dòng)脈瘤形成，無血栓形成，無中膜、外膜壞死。
3.ICE明膠涂層支架轉(zhuǎn)染犬冠脈的形態(tài)學(xué)變化形態(tài)學(xué)定量分析結(jié)果顯示基因轉(zhuǎn)染組腔面積為5.10±0.68mm2，較其它3組明顯增大(模型組，2.92±0.49mm2；涂層組，3.22±0.80mm2；空質(zhì)粒組，2.83±0.31mm2；n＝8；P＜0.05)。新生內(nèi)膜面積較模型組、涂層組、空質(zhì)粒組顯著減少(模型組，2.23±0.22mm2；涂層組，2.16±0.33mm2；空質(zhì)粒組，1.92±0.18mm2；基因轉(zhuǎn)染組，1.49±0.14mm2；n＝8；P＜0.05)。平均內(nèi)膜厚度也較其它3組顯著減少(模型組，0.32±0.06mm；涂層組，0.25±0.06mm；空質(zhì)粒組，0.30±0.08mm；基因轉(zhuǎn)染組，0.13±0.04mm；n＝8；P＜0.05)。
4.ICE明膠涂層支架轉(zhuǎn)染犬冠脈細(xì)胞凋亡的變化透射電鏡第1w、第4w時(shí)透射電鏡形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于其余各組。
流式細(xì)胞儀定量分析流式細(xì)胞儀定量分析發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡百分率明顯高于其它各組。1w時(shí)各組細(xì)胞凋亡百分率模型組，25.05±3.96％；涂層組，28.03±5.76％；空質(zhì)粒組27.65±4.32％；基因轉(zhuǎn)染組，34.74±2.89％；n＝8；P＜0.05。4w時(shí)各組細(xì)胞凋亡百分率模型組，23.94±0.14％；涂層組，26.91±9.43％；空質(zhì)粒組25.43±3.26％；基因轉(zhuǎn)染組，30.77±7.34％；n＝8；P＜0.05。
凋亡指數(shù)基因轉(zhuǎn)染組凋亡指數(shù)明顯高于模型組、涂層組、空質(zhì)粒組。1w，內(nèi)膜模型組，30.33±5.69％；涂層組，35.67±6.59％；空質(zhì)粒組29.00±3.61％；基因轉(zhuǎn)染組，50.00±4.58％；n＝8；P＜0.05。4w，內(nèi)膜模型組，21.00±6.00％；涂層組，18.33±2.08％；空質(zhì)粒組20.67±4.04％；基因轉(zhuǎn)染組，35.67±6.03％。n＝8；P＜0.05。1w，中膜模型組13.33±3.79，％；涂層組7.67±2.08，％；空質(zhì)粒組，12.00±3.61％；基因轉(zhuǎn)染組，25.01±4.99％；n＝8；P＜0.05。4w，中膜模型組，9.00±5.29％；涂層組，9.33±3.51％；空質(zhì)粒組7.33±3.52％；基因轉(zhuǎn)染組，20.67±4.51％。n＝8；P＜0.05。
5.ICE明膠涂層支架轉(zhuǎn)染犬冠脈對細(xì)胞增殖指數(shù)的影響第1w，第4w時(shí)基因轉(zhuǎn)染組損傷血管內(nèi)膜、中膜的增殖指數(shù)和對照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
6.ICE明膠涂層支架轉(zhuǎn)染犬冠脈對α-SM actin的影響免疫組化法檢測α-SM actin，第1w和第4w時(shí)基因轉(zhuǎn)染組陽性面積百分率明顯小于其它3組。1w模型組，61.24±6.46％；涂層組，58.16±2.40％；空質(zhì)粒組，56.00±5.57％；基因轉(zhuǎn)染組，41.13±3.99％；n＝8；P＜0.05。4w模型組，40.33±3.51％；涂層組，42.67±7.23％；空質(zhì)粒組，41.67±3.06％；基因轉(zhuǎn)染組，28.67±4.73％；n＝8；P＜0.05。
SEQUENCE LISTING<110>上海市第一人民醫(yī)院<120>一種防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架<130>pcDNA4-ICE重組質(zhì)粒<140>200510023715X<141>2005-01-31<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1215<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1)..(1125)<400>1atg gcc gac aag gtc ctg aag gag aag aga aag ctg ttt atc cgt tcc 48Met Ala Asp Lys Val Leu Lys Glu Lys Arg Lys Leu Phe Ile Arg Ser1 5 10 15atg ggt gaa ggt aca ata aat ggc tta ctg gat gaa tta tta cag aca 96Met Gly Glu Gly Thr Ile Asn Gly Leu Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr20 25 30agg gtg ctg aac aag gaa gag atg gag aaa gta aaa cgt gaa aat gct144Arg Val Leu Asn Lys Glu Glu Met Glu Lys Val Lys Arg Glu Asn Ala35 40 45aca gtt atg gat aag acc cga gct ttg att gac tcc gtt att ccg aaa192Thr Val Met Asp Lys Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Val Ile Pro Lys50 55 60
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1.一種防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架，其特征是采用明膠涂層金屬不銹鋼支架，攜帶質(zhì)粒pcDNA4介導(dǎo)的白介素-1β轉(zhuǎn)換酶基因。
2.按權(quán)利要求1所述的防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架，其特征是所述的白介素-1β轉(zhuǎn)換酶基因具有序列1的序列。
3.按權(quán)利要求1所述的防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架的制備方法，其特征是通過下述方法和步驟制備1)獲取目的基因ICE所述的基因ICE，采用限制性內(nèi)切酶法、化學(xué)合成法、PCR擴(kuò)增或RT-PCR法、基因組文庫或cDNA文庫篩選法獲?。?)以真核細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)?；虿《緸檩d體，構(gòu)建人ICE克??；3)pcDNA4-ICE重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、鑒定后，溶解于0.1M Tris(PH8.0)或純水中，濃度為4～15mg/ml；4)制備載pcDNA4-ICE基因支架；5)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
4.按權(quán)利要求3所述的防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架的制備方法，其中所說的質(zhì)粒是pcDNA4、pSI或pCMV-HA。
5.按權(quán)利要求3的方法，其中所說的載體病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒。
6.按權(quán)利要求3的方法，其中所說的pcDNA4-ICE溶液的濃度為4～15mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物和醫(yī)療器械領(lǐng)域，涉及防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄支架。具體涉及一種防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的載基因支架。本發(fā)明根據(jù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)ICE基因轉(zhuǎn)染可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制抑制新內(nèi)膜形成，防治再狹窄的理論基礎(chǔ)；制備以質(zhì)粒為載體、以明膠涂層支架為遞送系統(tǒng)的ICE基因支架。本發(fā)明采用明膠涂層金屬不銹鋼支架，攜帶質(zhì)粒pcDNA4介導(dǎo)的白介素－1β轉(zhuǎn)換酶(ICE)基因，經(jīng)療效及作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，本支架可使基因局部轉(zhuǎn)染血管壁能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制內(nèi)膜增生，可用于防治冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄，具有安全性和可行性。
文檔編號(hào)A61M31/00GK1692960SQ20051002371
公開日2005年11月9日 申請日期2005年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月31日
發(fā)明者孫寶貴, 何奔, 趙軍禮, 鐘偉 申請人:上海市第一人民醫(yī)院