專利名稱：一種納米微凝膠、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)、高分子化學(xué)和藥物制劑領(lǐng)域，提供了一種蛋白質(zhì)/多糖納米微凝膠。本發(fā)明還提供了該納米微凝膠的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微米尺寸和納米尺寸的藥物載體引起了科學(xué)界和工業(yè)界的廣泛興趣，這些載體可以是膠體、囊泡或者微球。它們可以裝載活細(xì)胞、酶、香味油、藥物、維生素、農(nóng)用化學(xué)品、催化劑等，并且具有很多優(yōu)勢液體可以包埋在固體里面，當(dāng)作固體來使用；毒性物質(zhì)可以安全地處理；不穩(wěn)定的化合物可以被保護(hù)起來；氣味和口感可以被有效地屏蔽；藥物可以被控制和有選擇地釋放等(InternationalJournal of Pharmaceutics 242(2002)163-166)。在食品、醫(yī)藥和化妝品工業(yè)中，天然大分子形成的藥物/營養(yǎng)物載體由于具有生物利用性和生物降解性因而受到特別的青睞。到目前為止，有通過乳化、噴霧干燥的方法，將豆油裝入酪蛋白微膠囊是(J.Agric.Food Chem.49(2001)1934-1938)；用兩種不同的蛋白質(zhì)或者蛋白-多糖混合物在溶液中共凝聚的方法制備藥物微膠囊包埋體系(InternationalJournal of Pharmaceutics 242(2002)l63-166；Journal Microencapsulation 19(2002)549-558)；酪蛋白與含有還原性糖的碳水化合物進(jìn)行Maillard反應(yīng)后的產(chǎn)物用乳化、干燥的方法包裹對氧氣敏感的油(US Patent Application 20030185960)；磷酸鈣作為內(nèi)核，將要裝載的藥物或者蛋白質(zhì)與磷酸鈣結(jié)合后用酪蛋白將表面包裹起來作為口服藥物(United States Patent Application 20020054914)。然而，這些由生物大分子形成的藥物/營養(yǎng)物載體還存在以下不足之處對帶電荷的親水小分子藥物不能有效的包埋、富集和控制釋放；載體的粒徑偏大，都在微米尺度；有的體系不穩(wěn)定，需要加穩(wěn)定劑；制備不簡便。
微凝膠作為藥物載體有其獨(dú)特的優(yōu)勢1、相對于實(shí)心的膠體粒子，微凝膠的低密度結(jié)構(gòu)可以為藥物分子提供更大的容載空間；2、相對于空心球結(jié)構(gòu)的膠體粒子，微凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以提供更多的藥物結(jié)合位點(diǎn)，有利于藥物分子的高濃度富集；3、帶有弱酸/弱堿基團(tuán)的微凝膠，其自身的電荷性質(zhì)可以隨溶液的pH值而改變，因此與帶有電荷的小分子之間的相互作用也隨pH值而變化，所以可以通過pH的調(diào)節(jié)而有效地富集和釋放帶電荷的藥物分子。目前，利用微凝膠作為約物載體的研究已經(jīng)越來越多(Nature 394(1998)459-462)。作為微凝膠的基體材料大多為合成高分子和部分改性的天然高分子，制備的方法有乳液聚合、陰離子共聚、相鄰聚合物鏈交聯(lián)、反相微乳液聚合等(Advances in Colloid and InterfaceScience 80(1999)1-25)。然而，這些方法的實(shí)施都有一定的難度并且不適合作為口服藥物和營養(yǎng)物載體。因此，有必要發(fā)展更簡單、有效和通用的方法制備純天然的生物大分子微凝膠。
蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，具有許多生理和生物功能。食品蛋白質(zhì)是人類的主要營養(yǎng)物之一并且在食品科學(xué)中發(fā)揮著重要的作用，如增稠、凝膠、乳化、發(fā)泡、粘接、結(jié)合水、油脂和香料等(Food Proteins and Their Applications，S.Damodaran and A.Paraf，1997，Marcel Dekker，Inc.New York.1-24)。蛋白質(zhì)是兩性大分子，其分子所帶的電荷與溶液的pH有關(guān)當(dāng)pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，分子帶正電荷；pH大于其等電點(diǎn)時(shí)，分子帶負(fù)電荷；pH在其等電點(diǎn)時(shí)，分子的凈電荷為零。蛋白質(zhì)受熱以后會(huì)破壞其特定的空間結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)會(huì)從分子內(nèi)部轉(zhuǎn)移到分子表面而引起分子間的疏水締合；含有巰基和分子內(nèi)二硫鍵的蛋白質(zhì)分子會(huì)形成分子間的二硫鍵而引起分子聚集。對于大多數(shù)食品蛋白質(zhì)水溶液，在遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)的pH值下加熱時(shí)，蛋白質(zhì)首先變性形成珠子狀的聚集體，然后進(jìn)一步聚集形成透明的宏觀凝膠體；當(dāng)溶液的pH值在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)熱變性后會(huì)形成無規(guī)的聚集體，然后進(jìn)一步聚集形成混濁的宏觀凝膠體；當(dāng)溶液的pH位于上述之間時(shí)，蛋白質(zhì)在加熱變性時(shí)會(huì)形成上述兩種聚集體和半透明的凝膠體(Food Proteins and Their Applications，S.Damodaran and A.Paraf，1997，Marcel Dekker，Inc.New York.327-330)。多糖是另一類常見的生物大分子，一些多糖的水溶液加熱后也可以形成宏觀凝膠體。天然的食品蛋白質(zhì)和多糖可以食用而且價(jià)格低廉，是制備微凝膠的理想基體材料。雖然食品蛋白質(zhì)和多糖在加熱時(shí)很容易形成宏觀凝膠，但是到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)利用蛋白質(zhì)和多糖制備微凝膠的報(bào)道。另外，還沒有發(fā)現(xiàn)利用簡單的加熱方法制備納米微凝膠的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可食用的蛋白質(zhì)和多糖微凝膠。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種簡單、方便、高效、通用的蛋白質(zhì)/多糖微凝膠的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述微凝膠的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種納米微凝膠，該納米微凝膠是由在相同pH條件下帶有不同電荷的兩種蛋白質(zhì)或者是由一種蛋白質(zhì)和一種多糖通過加熱使蛋白質(zhì)變性形成的。
本發(fā)明的微凝膠具有核一殼結(jié)構(gòu)，核含有一種蛋白質(zhì)，而殼含有另一種蛋白質(zhì)或者一種多糖；核和殼所帶的電荷受溶液pH的影響當(dāng)微凝膠由兩種不同的蛋白質(zhì)組成時(shí)，pH小于兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，微凝膠的核和殼都帶正電荷，當(dāng)pH大于兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，微凝膠的核和殼都帶負(fù)電荷，當(dāng)pH位于兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)之間時(shí)，微凝膠的核和殼帶相反電荷，當(dāng)pH等于組成微凝膠殼的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，微凝膠的殼不帶電荷；當(dāng)微凝膠由蛋白質(zhì)和多糖組成時(shí)，pH位于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和多糖電離常數(shù)pK之間時(shí)，微凝膠的核和殼帶相反電荷，對于堿性多糖，當(dāng)pH大于其pK+2時(shí)，微凝膠的殼不帶電荷，對于酸性多糖，當(dāng)pH小于其pK-2時(shí)，微凝膠的殼不帶電荷。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了工種上述微凝膠的制備方法。
利用兩種具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)或者帶有不同電荷的蛋白質(zhì)和多糖，在特定的條件下，即溶液的pH值位于這兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)之間或者使溶液中的蛋白質(zhì)/多糖帶有相反電荷時(shí)，這兩種分子生成靜電復(fù)合物、膠束或者沉淀，然后改變?nèi)芤旱膒H值到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，攪拌或者靜置一段時(shí)間使分子發(fā)生重組位于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)由于本身的電荷趨于零而傾向于聚集，而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的另一種蛋白質(zhì)或者帶有電荷的多糖由于自身帶有大量的同種電荷而互相排斥傾向于遠(yuǎn)離。此時(shí)將溶液加熱使蛋白質(zhì)變性，位于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)會(huì)形成幾乎不帶電荷的無規(guī)聚集體，而另一種蛋白質(zhì)或者多糖會(huì)在其周圍形成含有大量同種電荷的線性的聚集體，因此就形成了納米尺度的微觀凝膠。這種微觀凝膠通常具有一定的核殼結(jié)構(gòu)，即位于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)主要位于微凝膠的內(nèi)部而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)或者多糖主要富集在微凝膠的外部。微凝膠形成之后，在微凝膠內(nèi)部的分子由于發(fā)生了分子間的疏水、氫鍵作用以及二硫鍵的交聯(lián)，因而非常穩(wěn)定；而微凝膠外部的分子由于帶有同種電荷而互相排斥，因而使微凝膠粒子在溶液中可以長期穩(wěn)定的存在。
基于上述原理，本發(fā)明提供了一種通用的制備蛋白質(zhì)微凝膠或者蛋白質(zhì)和多糖微凝膠的方法。該方法包括以下步驟(1)分別將在相同pH條件下帶有不同電荷的兩種蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)和多糖配制成水溶液并使其混合形成靜電復(fù)合物、膠束或者沉淀；(2)其次，調(diào)整混合溶液的酸堿度，使其pH值與混合溶液中任一種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差值為0～3，攪拌或者靜置以使沉淀溶解或者使靜電復(fù)合物擴(kuò)散均勻，但不要使靜電復(fù)合物完全解離；(3)最后，加熱混合溶液使其中的蛋白質(zhì)變性，從而得到微凝膠。
(1)中使用兩種蛋白質(zhì)時(shí)，這兩種蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)；當(dāng)使用多種蛋白質(zhì)時(shí)，其中至少有兩種蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)；當(dāng)使用蛋白質(zhì)和多糖時(shí)，二者在一定的pH范圍內(nèi)帶有相反的電荷。
本發(fā)明中可以采用不同的蛋白質(zhì)組合或者蛋白質(zhì)/多糖組合。蛋白質(zhì)可以是任何水溶性的蛋白質(zhì)，而水溶性食品蛋白質(zhì)較佳，多糖必須是帶有電荷的多糖，所形成的蛋白質(zhì)組合或者蛋白質(zhì)和多糖組合必須在混合時(shí)帶有相反電荷，或者在某一pH條件下帶有相反電荷，如卵清白蛋白和卵清溶菌酶、牛血清白蛋白和卵清溶菌酶、αs-酪蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白、卵清白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白、β-酪蛋白和卵清溶菌酶、αS-酪蛋白和卵清溶菌酶、κ-酪蛋白和卵清溶菌酶、酪蛋白和卵清溶菌酶、殼聚糖和卵清白蛋白、殼聚糖和αS-酪蛋白、海藻酸鹽和卵清溶菌酶組合等等。
在本發(fā)明中，(1)中配制成水溶液時(shí)，先將蛋白質(zhì)或者多糖配制成質(zhì)量百分濃度大于0且小于10％的水溶液，再將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)和多糖按摩爾比為0.05～20的比例混合。配制的水溶液濃度在8％以下較佳。
多糖和蛋白質(zhì)在溶解時(shí)可能需要加入額外的酸(如醋酸)或者堿(如氫氧化鈉)來幫助其溶解或者調(diào)整其溶液的pH值。
在本發(fā)明中，(1)中當(dāng)兩種溶液混合時(shí)，混合溶液的pH值應(yīng)使兩種蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)和多糖產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電吸引力；較佳地，使混合溶液pH值為其中任意兩個(gè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的中間值，或者是任意一個(gè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與多糖電離常數(shù)pK的中間值。
在本發(fā)明中，用稀酸或者稀堿調(diào)整混合溶液的pH值。調(diào)節(jié)混合溶液pH值時(shí)所用的酸是鹽酸、醋酸、磷酸或者檸檬酸中的任一種；所用的堿是氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或者醋酸鈉中的任一種。濃度可以采用0.01～1.0mol/L。
然后再將混合溶液的pH值調(diào)整到任何一個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，具體pH值的確定和攪拌時(shí)間與所選擇的蛋白質(zhì)和多糖有關(guān)，pH值確定的標(biāo)準(zhǔn)是兩個(gè)蛋白質(zhì)間或者蛋白質(zhì)與多糖間的靜電相互作用力很弱或者為零，通常使混合溶液的pH值與其中一個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差值為0～3；較佳地，兩者的差值為0～2；更佳地，兩者的差值為0～1。
在本發(fā)明中，調(diào)節(jié)好混合溶液的酸堿度后，可以攪拌或者靜置0-24小時(shí)，攪拌或者靜置時(shí)間確定的標(biāo)準(zhǔn)是兩種分子之間的宏觀沉淀溶解或者靜電復(fù)合物擴(kuò)散均勻但不要使靜電復(fù)合物完全解離。時(shí)間過長，不能獲得很好的目標(biāo)產(chǎn)物。
本發(fā)明制備的微凝膠是通過加熱使蛋白質(zhì)變性得到的，加熱溫度和加熱時(shí)間的選擇標(biāo)準(zhǔn)是使溶液中的蛋白質(zhì)可以充分變性。在本發(fā)明中，可采用50～100℃，并保持1分鐘～3小時(shí)；更佳地，采用70～90℃加熱30～120分鐘。
本發(fā)明制備的微凝膠具有核-殼結(jié)構(gòu)，核主要由一種蛋白質(zhì)組成，而殼主要由另一種蛋白質(zhì)或者多糖組成，微凝膠的核和殼所帶的電荷隨著溶液pH的改變而不同。例如，使用兩種具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)制備的微凝膠，當(dāng)溶液的pH低于這兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，微凝膠的核和殼都帶有正電荷；當(dāng)溶液的pH高于這兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，微凝膠的核和殼都帶有負(fù)電荷；當(dāng)溶液的pH位于這兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)之間時(shí)，微凝膠的核和殼帶相反的電荷；當(dāng)溶液的pH值在位于微凝膠殼的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近時(shí)，微凝膠的殼不帶電荷因而微凝膠會(huì)進(jìn)一步聚集，但這種聚集會(huì)隨著溶液pH的變化而重新分散開來。圖2是利用卵清白蛋白(等電點(diǎn)4.7)和卵清溶菌酶(等電點(diǎn)10.7)所制備的微凝膠(實(shí)施例1)在不同pH時(shí)所帶電荷的示意圖。
利用本發(fā)明獲得的微凝膠，具有很好的單分散性，利用動(dòng)態(tài)光散射、透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡表征微凝膠近似為球形，粒徑隨兩種蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)和多糖的組成及比例而變化，大約在40～700nm之間。
利用本發(fā)明方法可以得到1％或者濃度更高的微凝膠水溶液。所制備的微凝膠可以在水溶液中長期保存，圖1顯示出利用卵清白蛋白和卵清溶菌酶所制備的微凝膠(實(shí)施例1)在水溶液中存放120天以后，其粒徑和粒徑分布幾乎沒有變化。所制備的微凝膠可以經(jīng)過冷凍抽干后將得到的干燥粉末進(jìn)行保存，這種粉末可以再次分散到水溶液中并且保持其原有的粒徑和粒徑分布。
本發(fā)明的制備方法不需要特殊設(shè)備，產(chǎn)品不需要分離，可以直接用來包埋藥物。
在另一方面，本發(fā)明還提供了上述微凝膠制備方法的應(yīng)用，即得到的微凝膠通過擴(kuò)散方式將小分子包裹在微凝膠中。擴(kuò)散過程的條件視具體情況而定，例如，將待包裹的小分子溶于微凝膠溶液中，或者將微凝膠溶于待包裹的小分子溶液中。
本發(fā)明制備的微凝膠可以作為藥物和營養(yǎng)物的載體。
由于本發(fā)明制備的微凝膠屬于納米材料(具體見圖3)，而且整個(gè)過程全部采用天然大分子以及可食用的酸和堿，沒有加入其他化學(xué)物質(zhì)，因此所制備的微凝膠不僅其包埋效果好，食用吸收效果也良好，可以用于口服藥物的納米載體。
同理，本發(fā)明制備的微凝膠可以作為營養(yǎng)物的納米載體。
本發(fā)明制備的微凝膠將藥物或者營養(yǎng)物包裹在其中后，可以通過人的消化道或者蛋白酶的水解方式將藥物或者營養(yǎng)物從微凝膠中釋放出來。
本發(fā)明制備的微凝膠可以用于制備染料、香料和化妝品納米載體。
本發(fā)明制備的微凝膠將藥物、營養(yǎng)物、染料、香料、化妝品包裹在其中后，可以通過改變?nèi)芤核釅A度的方式將其從微凝膠中釋放出來。
利用本發(fā)明制備的微凝膠對帶電荷的小分子具有很好的包埋和釋放效果。例如圖2所示的微凝膠，可以在pH 4.7時(shí)通過擴(kuò)散富集帶有負(fù)電荷的小分子藥物；將溶液保持在酸性或者中性pH，被包埋的小分子不會(huì)從微凝膠釋放出來；只有當(dāng)溶液的pH大于10.7時(shí)，帶負(fù)電荷的小分子藥物才會(huì)釋放出來；另一方面，利用食品蛋白質(zhì)和多糖制備的微凝膠在人的消化道可以被降解，因此可以釋放出所包埋的小分子藥物。
本發(fā)明可以通過選擇不同的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)配對或蛋白質(zhì)-多糖配對而制備具有特定核、殼電荷性質(zhì)的微凝膠，因而可以包埋多種藥物、營養(yǎng)物、染料、香料和化妝品。
利用本發(fā)明制備微凝膠，整個(gè)過程全部采用天然大分子以及可食用的酸和堿，沒有加入其他化學(xué)物質(zhì)，因此所制備的微凝膠可以作為口服藥物/營養(yǎng)物載體，不僅其包埋效果好，食用吸收效果也良好。
利用本發(fā)明獲得的微凝膠具有包裹帶電荷的小分子藥物/營養(yǎng)物的良好效果，由于其可食用性，因此作為藥物/營養(yǎng)物的載體有其廣闊的應(yīng)用前景。尤其是利用本發(fā)明獲得的微凝膠十分適合運(yùn)用包埋對環(huán)境敏感的物質(zhì)。


圖1是用卵清白蛋白和卵清溶菌酶制備的微凝膠在水溶液中存放120天時(shí)的粒徑和粒徑分布圖。
圖2是用卵清白蛋白和卵清溶菌酶制備的微凝膠在不同pH水溶液中所帶電荷的示意圖。
圖3是用卵清白蛋白和卵清溶菌酶制備的微凝膠的透射電鏡圖片。
圖4是用卵清白蛋白和卵清溶菌酶制備的微凝膠水溶液的粒徑和粒徑分布。
具體實(shí)施例方式
例1.卵清白蛋白(Ovalbumin)和卵清溶菌酶(Lysozyme)在堿性水溶液中形成微凝膠。
將卵清白蛋白和卵清溶菌酶分別溶解在去離子水中，配成2mg/mL和0.624mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。在磁力攪拌下將1.2mL白蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為10.3并適當(dāng)攪拌60分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱1.5小時(shí)，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液平均粒徑為147nm，多分散系數(shù)為0.127(圖4)。透射電子顯微鏡測量出該微凝膠經(jīng)過干燥后其平均粒徑只有80nm(圖3)。該微凝膠溶液極其穩(wěn)定，在4℃的冰箱內(nèi)存放了120天無明顯的變化(圖1所示)。
在上述體系中，將白蛋白與溶菌酶的摩爾比控制在0.05～5的范圍內(nèi)，溶液的pH調(diào)節(jié)到9.0～11.0的范圍內(nèi)，均可得到窄分散的、粒徑為80～300nm范圍內(nèi)的穩(wěn)定的微凝膠。
將上述微凝膠溶液冷凍抽干，將所得的固體粉末用去離子水溶解，用0.1mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至酸性或堿性，仍可得到上述穩(wěn)定的微凝膠溶液。
例2.卵清白蛋白(Ovalbumin)和卵清溶菌酶(Lysozyme)在酸性水溶液中形成微凝膠。
將卵清白蛋白和溶菌酶分別溶解在去離子水中，配成2mg/mL和0.624mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。在磁力攪拌下將600μL白蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.06mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為10.0并適當(dāng)攪拌3分鐘使之混合均勻，再用0.01mol/L HCl快速調(diào)節(jié)溶液的pH為5.0，然后迅速將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱10分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液平均粒徑為71.4nm，多分散系數(shù)為0.224。
在上述體系中，將白蛋白與溶菌酶的摩爾比控制在0.05～5的范圍內(nèi)，溶液的pH調(diào)節(jié)到4.0～6.5的范圍內(nèi)，均可得到粒徑為50～300nm范圍內(nèi)的穩(wěn)定的微凝膠。
例3.牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)和溶菌酶(Lysozyme)在堿性或者酸性水溶液中形成微凝膠。
將牛血清白蛋白和溶菌酶分別溶解在去離子水中，配成2.838mg/mL和0.624mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。在磁力攪拌下將1.5mL牛血清白蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為8.90并適當(dāng)攪拌15分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱1小時(shí)，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為151.8nm，多分散系數(shù)為0.0880。
在上述體系中，將牛血清白蛋白與溶菌酶的摩爾比控制在0.05～5的范圍內(nèi)，溶液的pH調(diào)節(jié)到4.0～6.5或8.0～11.0的范圍內(nèi)，均可得到粒徑為50～300nm范圍內(nèi)的穩(wěn)定的微凝膠。
例4.αs-酪蛋白(αs-Casein)和卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白(Ovotransferrin)在中性水溶液中形成微凝膠。
將αs-酪蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白分別溶解在去離子水中，配成4mg/mL和0.5mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。在磁力攪拌下將38.4μL酪蛋白的水溶液滴加到3mL卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白的水溶液中，以0.04mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為6.97并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱1小時(shí)，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為138nm，多分散系數(shù)為0.214。
在上述體系中，將αs-酪蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白的摩爾比控制在0.05～5的范圍內(nèi)，溶液的pH調(diào)節(jié)到5.3～8.5的范圍內(nèi)，均可得到粒徑為50～500nm范圍內(nèi)的穩(wěn)定的微凝膠。
例5.卵清白蛋白(Ovalbumin)和卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白(Ovotransferrin)在中性水溶液中形成微凝膠。
將卵清白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白分別溶解在去離子水中，配成11.2mg/mL和0.5mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。在磁力攪拌下將40μL白蛋白的水溶液滴加到3mL卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白的水溶液中，以0.04mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為7.0并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱1小時(shí)，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為142.4nm，多分散系數(shù)為0.161。
在上述體系中，當(dāng)卵清白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白的摩爾比控制在0.05～10的范圍內(nèi)，溶液的pH調(diào)節(jié)到5.3～8.5的范圍內(nèi)，均可得到粒徑為50～500nm范圍內(nèi)的穩(wěn)定的微凝膠。
例6.殼聚糖(Chitosan)和卵清白蛋白(Ovalbumin)在酸性水溶液中形成微凝膠。
將殼聚糖溶解在2％的醋酸中，配成濃度為2％的粘稠的殼聚糖醋酸水溶液；將卵清白蛋白溶解在去離子水中，配成0.5mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。在磁力攪拌下將161μL殼聚糖的醋酸水溶液滴加到3mL白蛋白的水溶液中并適當(dāng)攪拌10分鐘使之混合均勻，以0.2mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為5.30并攪拌5分鐘。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱20分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為508.9nm，多分散系數(shù)為0.386。
在上述體系中，當(dāng)殼聚糖/卵清白蛋白的重量比在0.1～10的范圍內(nèi)，溶液的pH調(diào)節(jié)到4.0～8.0的范圍內(nèi)，均可得到粒徑為100～1000nm范圍內(nèi)的穩(wěn)定的微凝膠。
例7.β-酪蛋白(β-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在酸性水溶液中形成微凝膠。
將β-酪蛋白和溶菌酶分別溶解在去離子水中，配成10mg/mL和0.624mg/mL的蛋白質(zhì)水溶液。在磁力攪拌下將120/μLβ-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.01mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液的pH為4.46并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為222.6nm，多分散系數(shù)為0.0692。
在上述體系中，當(dāng)β-酪蛋白/溶菌酶的摩爾比在0.05～10的范圍內(nèi)，pH值在4.0～7.5時(shí)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
例8.β-酪蛋白(β-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在堿性水溶液中形成微凝膠。
將β-酪蛋白和溶菌酶分別溶解在去離子水中，配成10mg/mL和0.624mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。在磁力攪拌下將120μLβ-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.06mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為10.28并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為195.9nm，多分散系數(shù)為0.177。
在上述體系中，當(dāng)β-酪蛋白/溶菌酶的摩爾比在0.05～10的范圍內(nèi)，pH值在8.5～11.0時(shí)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
例9.αS-酪蛋白(αS-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在酸性水溶液中形成微凝膠。
將αS-酪蛋白和溶菌酶分別溶解在去離子水中，配成4mg/mL和0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力攪拌下將300μLαS-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.01mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液的pH為5.30并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為191nm，多分散系數(shù)為0.125。
在上述體系中，當(dāng)αS-酪蛋白/溶菌酶的摩爾比在0.05～10的范圍內(nèi)，pH值在4.0～7.0時(shí)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
例10.αS-酪蛋白(αS-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在堿性水溶液中形成微凝膠。
將αS-酪蛋白和溶菌酶分別溶解在去離子水中，配成4mg/mL和0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力攪拌下將300μLαS-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.04mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為10.2并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為172.9nm，多分散系數(shù)為0.207。
在上述體系中，當(dāng)β-酪蛋白/溶菌酶的摩爾比在0.05～10的范圍內(nèi)，pH值在8.5～11.0時(shí)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
例11.κ-酪蛋白(αS-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在酸性和中性水溶液中形成微凝膠。
將κ-酪蛋白和溶菌酶分別溶解在去離子水中，配成8.2mg/mL和0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力攪拌下將120μLαS-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.01mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液的pH為4.74并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為288.8nm，多分散系數(shù)為0.0828。
在上述體系中，當(dāng)κ-酪蛋白/溶菌酶的摩爾比在0.05～10的范圍內(nèi)，pH值在4.0～8.0時(shí)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
例12.酪蛋白(Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在酸性水溶液中形成微凝膠。
將酪蛋白加入去離子水中，并加入0.1mol/L NaOH攪拌過夜使之溶解，配成10.0mg/mL的pH值為7.2的酪蛋白水溶液。將溶菌酶溶解在去離子水中，配成0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力攪拌下將120μL酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.01mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液的pH為4.50并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為230.6nm，多分散系數(shù)為0.121。
在上述體系中，當(dāng)酪蛋白/溶菌酶的摩爾比在0.05～10的范圍內(nèi)，pH值在4.0～7.0時(shí)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
例13.酪蛋白(Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在堿性水溶液中形成微凝膠。
將酪蛋白加入去離子水中，并加入0.1mol/L NaOH攪拌過夜使之溶解，配成10.0mg/mL的pH值為7.2的酪蛋白水溶液。將溶菌酶溶解在去離子水中，配成0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力攪拌下將120μL酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.04mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為10.3l并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為224.1nm，多分散系數(shù)為0.208。
在上述體系中，當(dāng)β-酪蛋白/溶菌酶的摩爾比在0.05～10的范圍內(nèi)，pH值在9.0～11.0的時(shí)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
例14.殼聚糖(Chitosan)和αS-酪蛋白(αS-Casein)在酸性水溶液中形成微凝膠。
將殼聚糖溶解在2％的醋酸中，配成濃度為2％的粘稠的殼聚糖醋酸水溶液；將αS-酪蛋白溶解在去離子水中，配成1.03mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。在磁力攪拌下將161μL殼聚糖的醋酸水溶液滴加到3mLαS-酪蛋白的水溶液中并適當(dāng)攪拌10分鐘使之混合均勻，以0.2mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為4.20并攪拌5分鐘。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為262.8nm，多分散系數(shù)為0.316。
在上述體系中，當(dāng)殼聚糖/αS-酪蛋白的質(zhì)量比在0.1～10在的范圍內(nèi)，溶液的pH調(diào)節(jié)到3.5～7.5的范圍內(nèi)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
例15.雞蛋蛋白粉(Chicken Albumin)在水溶液中形成微凝膠。
將雞蛋蛋白粉溶解在去離子水中，配成2mg/mL的混合蛋白溶液，以0.02mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為6.0并適當(dāng)攪拌5分鐘使之混合均勻。然后將混合好的溶液置于80℃的水浴中加熱30分鐘，即可得到穩(wěn)定的微凝膠溶液。用動(dòng)態(tài)激光光散射測量所得到的微凝膠溶液粒徑為161.4nm，多分散系數(shù)為0.350。
在上述體系中，當(dāng)溶液的pH值在4.0～10.5時(shí)，均可得到穩(wěn)定的微凝膠粒子。
權(quán)利要求
1.一種納米微凝膠，其特征是由在相同pH條件下帶有不同電荷的兩種蛋白質(zhì)或者是由一種蛋白質(zhì)和一種多糖通過加熱使蛋白質(zhì)變性所形成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微凝膠，其特征是該微凝膠具有核-殼結(jié)構(gòu)，核含有一種蛋白質(zhì)，而殼含有另一種蛋白質(zhì)或者一種多糖；核和殼所帶的電荷受溶液pH的影響當(dāng)微凝膠由兩種不同的蛋白質(zhì)組成時(shí)，pH小于兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，微凝膠的核和殼都帶正電荷，當(dāng)pH大于兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，微凝膠的核和殼都帶負(fù)電荷，當(dāng)pH位于兩種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)之間時(shí)，微凝膠的核和殼帶相反電荷，當(dāng)pH等于組成微凝膠殼的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，微凝膠的殼不帶電荷；當(dāng)微凝膠由蛋白質(zhì)和多糖組成時(shí)，pH位于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和多糖電離常數(shù)pK之間時(shí)，微凝膠的核和殼帶相反電荷，對于堿性多糖，當(dāng)pH大于其pK+2時(shí)，微凝膠的殼不帶電荷，對于酸性多糖，當(dāng)pH小于其pK-2時(shí)，微凝膠的殼不帶電荷。
3.一種如權(quán)利要求1所述納米微凝膠的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟(1)將在相同pH條件下帶有不同電荷的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)和多糖配制成水溶液并使其形成靜電復(fù)合物或者膠束或者沉淀；(2)其次，調(diào)整混合溶液的酸堿度，使其pH值與混合溶液中任一種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為0～3，攪拌或者靜置以使膠束或者沉淀溶解或者使靜電復(fù)合物擴(kuò)散均勻，但不完全解離；(3)最后，加熱混合溶液使其中的蛋白質(zhì)變性，從而得到微凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微凝膠的制備方法，其特征是(1)中使用的兩種蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)；當(dāng)使用多種蛋白質(zhì)時(shí)，其中至少有兩種蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)；當(dāng)使用蛋白質(zhì)和多糖時(shí)，二者在一定的pH范圍內(nèi)帶有相反的電荷。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微凝膠的制備方法，其特征是混合蛋白質(zhì)或多糖的溶液時(shí)，使混合溶液pH值為其中任意兩個(gè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的中間值，或者是任意一個(gè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與多糖電離常數(shù)pK的中間值。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微凝膠的制備方法，其特征是(1)中先將蛋白質(zhì)或者多糖配制成質(zhì)量百分濃度大于0且小于10％的水溶液，再將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)與多糖按摩爾比為0.05～20的比例混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微凝膠的制備方法，其特征是先將蛋白質(zhì)或者多糖配制成質(zhì)量百分濃度大于0且小于8％的水溶液，再混合。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微凝膠的制備方法，其特征是混合溶液的pH值用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微凝膠的制備方法，其特征是調(diào)節(jié)混合溶液pH值時(shí)所用的酸是鹽酸、醋酸、磷酸或者檸檬酸中的任一種；所用的堿是氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或者醋酸鈉中的任一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微凝膠的制備方法，其特征是調(diào)節(jié)混合溶液pH值的弱酸或弱堿濃度為0.01～1.0mol/L。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微凝膠的制備方法，其特征是混合溶液的pH值與混合溶液中某一個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差值為0～2。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微凝膠的制備方法，其特征是混合溶液的pH值與混合溶液中某一個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差值為0～1。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微凝膠的制備方法，其特征是調(diào)節(jié)好混合溶液的酸堿度后，攪拌或者靜置0-24小時(shí)。
14.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微凝膠的制備方法，其特征是加熱混合溶液到50～100℃，并保持1分鐘～3小時(shí)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的微凝膠的制備方法，其特征是加熱混合溶液到70～90℃，加熱30～120分鐘。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微凝膠的應(yīng)用，其特征是微凝膠形成以后，通過擴(kuò)散方式將小分子包裹在微凝膠中。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微凝膠的應(yīng)用，其特征是將該微凝膠作為藥物或者營養(yǎng)物的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微凝膠的應(yīng)用，其特征是將該微凝膠用于口服藥物或者營養(yǎng)物的納米載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微凝膠的應(yīng)用，其特征是將該微凝膠用于制備染料、香料或者化妝品的納米載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用蛋白質(zhì)/多糖制備的納米微凝膠及其制備方法，屬于生物化學(xué)、高分子化學(xué)和藥物制劑領(lǐng)域。本發(fā)明的納米微凝膠是由在相同pH條件下帶有不同電荷的兩種蛋白質(zhì)或者一種蛋白質(zhì)和一種多糖通過加熱使蛋白質(zhì)變性所形成的。本發(fā)明利用在特定pH范圍內(nèi)由兩種或兩種以上在相同pH條件下帶有不同電荷的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)和多糖分子形成靜電復(fù)合物、膠束或者沉淀，通過調(diào)節(jié)溶液pH值并加熱，獲得具有核—?dú)そY(jié)構(gòu)的納米微凝膠。該膠體通過包埋/擴(kuò)散方法，可將藥物或者營養(yǎng)物包裹其中，得到可食用的藥物或者營養(yǎng)物納米膠體。亦可將香料或者化妝品或者染料包裹在上述納米微凝膠中，并在特定環(huán)境和特定部位釋放。
文檔編號A61K47/36GK1654510SQ20051002364
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日
發(fā)明者姚萍, 喻紹勇, 江明 申請人:復(fù)旦大學(xué)