專利名稱：生脈注射液在制備治療腫瘤減毒藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬中醫(yī)中藥領域，涉及中藥生脈注射液在制藥中的新用途，具體涉及中藥生脈注射液在制備治療腫瘤減毒藥物尤其是惡性腫瘤減毒藥物中的用途。
背景技術：
中藥生脈注射液源于古方“生脈散”，為國家基本藥物、國家中藥保護品種，是中醫(yī)急癥必備的中藥注射液。其企業(yè)生產(chǎn)標準編號為WS3-B-2865-98，中藥保護品種編號為ZYB2071998054-3。
生脈注射液由人參、麥冬、五味子組成，具有益氣養(yǎng)陰，復脈固脫功能。古代醫(yī)家既用于以搶救熱傷元氣、津液耗傷、脈微欲絕等重癥，又用作為氣陰兩虛病人的補益劑。此方歷經(jīng)幾百年的長期應用，安全有效，經(jīng)久不衰。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，證實生脈散的臨床應用范圍的不斷擴大，現(xiàn)主要用于治療心血管病中的抗休克、抗心衰、抗心肌缺血三大適應癥，成為中醫(yī)急癥的用藥方。
化學治療為目前治療惡性腫瘤的主要手段之一，各類化療藥物對人體均有不同程度的毒副作用，出現(xiàn)某些嚴重毒副反應則是限制藥物劑量或使用的直接原因。通常認為化療藥物?！笆欠遣磺濉?、“敵我不分”，在殺傷腫瘤細胞的同時，也殺傷了人體正常組織細胞，尤其是殺傷人體的血液、淋巴組織細胞等免疫防御系統(tǒng)。據(jù)報道，化療導致的主要毒副反應有1.靜脈注射化療藥物時，操作不慎藥液外漏可引起局部組織壞死和栓塞性靜脈炎。
2.抑制骨髓造血系統(tǒng)，主要是白細胞和血小板下降。
3.可不同程度的損害肝臟細胞，出現(xiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶增高、膽紅素上升、肝腫大、肝區(qū)疼痛、黃疸等，嚴重的會引起肝硬化、凝血機制障礙等。
4.有些化療藥物對心血管系統(tǒng)有毒性作用，嚴重的可發(fā)生心力衰竭。
5.對呼吸系統(tǒng)有毒性作用和不良反應的化療藥物可引起急性化學性肺炎和慢性肺纖維化，甚至出現(xiàn)呼吸衰竭。
6.泌尿系統(tǒng)的毒性作用和不良反應表現(xiàn)有蛋白尿，少尿或無尿，有的發(fā)生血尿。
7.某些藥物可影響生殖功能障礙及致癌和致畸作用。
8.在化療的全身反應中，要數(shù)消化系統(tǒng)的毒性作用和不良反應最令患者煩惱，如惡心、嘔吐、食欲不振、腹痛、腹瀉，以及口腔黏膜潰瘍、咽喉炎等。
此外，化療由于其毒副作用，有時還可能出現(xiàn)并發(fā)癥，常見的有感染、出血、穿孔、尿酸結晶等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中藥生脈注射液在制藥中的新用途，具體涉及中藥生脈注射液在制備治療腫瘤減毒藥物尤其是惡性腫瘤減毒藥物中的用途。
本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)代藥理學研究理論，人參對骨髓造血功能有保護及刺激作用，同時有促進腫瘤細胞凋亡的作用；麥冬能抗氧化和捕獲自由基，促進物質(zhì)代謝；五味子可以拮抗各種原因引起的肝損傷，增強肝臟解毒能力等作用，根據(jù)臨床化學治療特點，采用生脈注射液和腫瘤化療藥物，尤其是以烷化劑為代表的化療藥物——CTX、以抗代謝類為代表的化療藥物——5-Fu、以抗腫瘤抗生素為代表的化療藥物——ADM、和以雜類為代表的化療藥物——Oxiplatin，對腫瘤尤其是惡性腫瘤包括肝癌、肉瘤、艾氏腹水瘤細胞株進行試驗，結果證實生脈注射液對化療藥物有明顯減毒的新作用。
本發(fā)明所述的惡性腫瘤細胞株包括H22肝癌細胞株、S180肉瘤細胞株、H22肝癌細胞株(購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所)，艾氏腹水瘤(EAC)細胞株(由復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室惠贈)。
所述化療藥物包括生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司)，以烷化劑為代表的化療藥物——環(huán)磷酰胺Cyclophosphamide(環(huán)磷氮芥、CTX，上海華聯(lián)制藥有限公司)，以抗代謝類為代表的化療藥物——5-Fu(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)，以抗腫瘤抗生素為代表的化療藥物——阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，以雜類為代表的化療藥物——Oxiplatin/L-OHP(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。
本發(fā)明試驗采用試劑包括BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
本發(fā)明通過下述方法和步驟進行試驗瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、CTX組、生脈注射液(大、中、小劑量)+CTX組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為CTX 20mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。采用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
本發(fā)明生脈注射液經(jīng)腫瘤細胞實驗證實對化療藥物在癌細胞中有明顯減毒作用，本發(fā)明的新用途擴大了生脈注射液的適應癥，能造福于腫瘤患者。本發(fā)明的新用途具有下述特點(1)生脈注射液對以烷化劑類為代表的化療藥物——環(huán)磷酰胺Cyclophosphamide有減毒作用；(2)生脈注射液對H22肝癌移植瘤CTX化療有減毒作用；(3)生脈注射液對S180肉瘤移植瘤CTX化療有減毒作用；(4)生脈注射液對艾氏腹水瘤移植瘤CTX化療有減毒作用；(5)生脈注射液對以抗代謝類為代表的化療藥物——5-FU有減毒作用；(6)生脈注射液對H22肝癌移植瘤5-FU化療有減毒作用；(7)生脈注射液對S180肉瘤移植瘤5-FU化療有減毒作用；
(8)生脈注射液對艾氏腹水瘤移植瘤5-FU化療有減毒作用；(9)生脈注射液對以抗腫瘤抗生素類為代表的化療藥物——ADM有減毒作用；(10)生脈注射液對H22肝癌移植瘤ADM化療有減毒作用；(11)生脈注射液對S180肉瘤移植瘤ADM化療有減毒作用；(12)生脈注射液對艾氏腹水瘤移植瘤ADM化療有減毒作用；(13)生脈注射液對以雜類為代表的化療藥物——Oxiplatin有減毒作用；(14)生脈注射液對H22肝癌移植瘤Oxiplatin化療有減毒作用；(15)生脈注射液對S180肉瘤移植瘤Oxiplatin化療有減毒作用；(16)生脈注射液對艾氏腹水瘤移植瘤Oxiplatin化療有減毒作用。
具體實施例方式
實施例1生脈注射液對H22肝癌移植瘤，以烷化劑類為代表的化療藥物CTX化療減毒作用試驗材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株H22肝癌細胞株，購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物環(huán)磷酰胺Cyclophosphamide(環(huán)磷氮芥、CTX，購于上海華聯(lián)制藥有限公司)，生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、CTX組、生脈注射液(大、中、小劑量)+CTX組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為CTX 20mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)<p>表3 處方篩選結果

各個指標數(shù)據(jù)測定法方如下顆粒流動性用固定圓錐底法測定休止角。
流動性觀察片子的完整性、光潔度、是否粘結沖頭等。
崩解時限按照中國藥典2000年版附錄崩解時限測定發(fā)進行測定。
分散均勻性去分散片3片，置100ml水中震搖，在20℃±1℃水中，3分鐘應全部崩解并通過2號篩。
分析結果綜合3個處方考察指標的數(shù)據(jù)來看，性狀、休止角、崩解時限、分散均勻性等各項指標，處方2的測試結果最為理想，因此選用處方2。即竹瀝浸膏150g、低取代羥丙基纖維素9g、微晶纖維素12g、乳糖9g、甘露醇9g、甜菊糖9g、硬脂酸鎂12g、淀粉90g、1％PVP水溶液適量，共制1000片，0.3g/片，每片含竹瀝浸膏150mg，制成1000片。
實施例6 本發(fā)明藥物口含片的制備原料及輔料竹瀝浸膏150g、淀粉50g、甘露醇75g、檸檬酸5g、硬脂酸鎂20g、蒸餾水適量、檸檬黃色素、香精適量；共制1000片，0.3g/片，每片含竹瀝浸膏150mg。
輔料用量的篩選主要是為了調(diào)節(jié)制劑的口感，取竹瀝浸膏和輔料按不同的量進行配制，經(jīng)多次配比，結果表明加入淀粉50g，甘露醇75g，檸檬酸5g，硬脂酸鎂20g的比例配制的制劑其制粒過程順利、壓出的片劑各方面均能符合規(guī)定，并且酸甜適宜，口感較好。
制備方法取竹瀝浸膏150g，加50-60℃的蒸餾水1000ml溶解，溶解后用100目篩過濾，濾液作為藥液漿備用。取藥用淀粉50g，甘露醇25g，硬脂酸鎂20g過100目篩后備用。然后按以下步驟操作1、將輔料裝入沸騰制粒機中的原料容器中，藥液漿裝入輸液小車盛液桶內(nèi)。2、調(diào)試噴槍在0.3～0.4Mpa正常壓力下，調(diào)節(jié)泵機流量和噴嘴，使噴霧均勻無顆粒，噴射有力，覆蓋面大。3、升啟原料容器，使主機密閉，設定溫控儀上溫度控制范圍25～40℃，開啟電磁閥，加熱換熱室內(nèi)空氣。啟試引風機，運轉(zhuǎn)30秒后，開干燥起，調(diào)節(jié)風門，使物料沸騰混合，待溫度升至所需值時，致的免疫抑制。表2是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表2

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；(3)荷瘤鼠應用生脈注射液后IgA、IgG、IgM升高，與對照組以及單純CTX組比較差異顯著，P＜0.05，說明生脈注射液可提高荷瘤鼠的體液免疫功能。表3是生脈注射液對體液免疫的影響。
表3

vs對照組*P＜0.05；(4)生脈注射液對肝腎功能的保護作用荷瘤鼠在應用化療藥物CTX后出現(xiàn)ALT、BUN升高，說明化療藥物對小鼠肝腎功能具有一定的毒性，但在聯(lián)合生脈注射液后可有效保護荷瘤鼠的肝腎功能，使升高的ALT、BUN出現(xiàn)了不同程度的下降，P＜0.05，ALB在各組未出現(xiàn)明顯變化。表4是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表4

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；vs CTX組#P＜0.05.
(5)應用CTX后小鼠出現(xiàn)外周血WBC、Hb以及PLT明顯下降，而聯(lián)合生脈注射液后則出現(xiàn)了不同程度的提高，P＜0.05，說明生脈注射液對小鼠化療后骨髓造血有保護作用。表5是生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表5

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；vsCTX組#P＜0.05實驗結果證實，生脈注射液可增加CTX對H22肝癌移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少CTX化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例2生脈注射液對S180肉瘤移植瘤，以烷化劑類為代表的化療藥物CTX化療減毒作用試驗材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株S180肉瘤細胞株，購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物環(huán)磷酰胺Cyclophosphamide(環(huán)磷氮芥、CTX，購于上海華聯(lián)制藥有限公司)，生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、CTX組、生脈注射液(大、中、小劑量)+CTX組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為CTX 20mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)CTX組瘤重抑制率為45.89％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為61.73％、66.16％和63.96％，明顯高于單純CTX組，P＜0.05。
表6是生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表6

vs對照組**P＜0.01；vs CTX組#P＜0.05.
(2)S180荷瘤鼠在單獨注射CTX后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，CD8升高，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合CTX各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高同時伴有CD8下降，與CTX組及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。
表7是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表7

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；(3)荷瘤鼠在注射CTX后IgG、IgM和IgA水平明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgM以及IgA的產(chǎn)生水平增高，與對照組、CTX組比較均有顯著性差異，P＜0.05，表8是生脈注射液對體液免疫的影響。
表8

vs對照組*P＜0.05；(4)荷瘤鼠在應用CTX后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、BUN(尿素氮)明顯升高，P＜0.01，而生脈注射液聯(lián)合CTX應用時ALT、BUN有一定程度降低，與CTX組比較差異顯著，P＜0.05；ALB(血清白蛋白)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表9是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表9

vs對照組**P＜0.01；vs CTX組#P＜0.05.
(5)荷瘤鼠在應用CTX后出現(xiàn)WBC、Hb、PLT降低，P＜0.05或P＜0.01，而聯(lián)合生脈注射液各組WBC、Hb、PLT數(shù)量有一定提高，與CTX組比較差異顯著，P＜0.05。表10是生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表10

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；vsCTX組#P＜0.05結果證實生脈注射液可增加CTX對S180移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少CTX化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例3生脈注射液對EAC移植瘤，以烷化劑類為代表的化療藥物CTX化療減毒實驗材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株艾氏腹水瘤(EAC)細胞株，由復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物環(huán)磷酰胺Cyclophosphamide(環(huán)磷氮芥、CTX，購于上海華聯(lián)制藥有限公司)，生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、CTX組、生脈注射液(大、中、小劑量)+CTX組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為CTX 20mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)CTX組瘤重抑制率為44.39％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為67.43％、67.06％和65.80％，明顯高于單純CTX組，P＜0.05。表11是生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表11

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；vs CTX組#P＜0.05，##P＜0.05.
(2)EAC荷瘤鼠在單獨注射CTX后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，CD8升高，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合CTX各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高同時伴有CD8下降，與CTX組及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。表12是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表12

vs對照組*P＜0.05；**P＜0.01.
(3)EAC荷瘤鼠在注射CTX后IgG、IgM和IgA水平明顯低于對照組，P＜0.01，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgM的產(chǎn)生水平增高，與對照組、CTX組比較均有顯著性差異，P＜0.05。表13是生脈注射液對體液免疫的影響。
表13

vs對照組*P＜0.05；**P＜0.05.
(4)荷瘤鼠在應用CTX后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、BUN(尿素氮)升高，而生脈注射液聯(lián)合CTX應用時ALT、BUN有一定程度降低，與CTX組比較差異顯著，P＜0.05。ALB(血清白蛋白)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表14是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表14

vs對照組*P＜0.05 **P＜0.01；vs CTX組#P＜0.05，##P＜0.01.
(5)荷瘤鼠在應用CTX后出現(xiàn)WBC、Hb、PLT明顯降低，P＜0.01，而聯(lián)合生脈注射液各組WBC、Hb、PLT數(shù)量有一定提高，與CTX組比較差異顯著，P＜0.05。表15是生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表15

vs對照組*P＜0.05**P＜0.15；vs CTX組#P＜0.05.
結果證實生脈注射液可增加CTX對EAC移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少CTX化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例4生脈注射液對H22肝癌移植瘤，以抗代謝類為代表的化療藥物5-FU化療減毒材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株H22肝癌細胞株，購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物0.25g 5-FU(購于上海旭東海普藥業(yè)有限公司)生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、5-FU組、生脈注射液(大、中、小劑量)+5-FU組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為5-FU 20mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)5-FU組瘤重抑制率為37.03％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為63.28％、66.46％和62.90％，明顯高于單純5-FU組，P＜0.05，其中以生脈注射液中劑量組更高一些，但統(tǒng)計學無差異。表16是生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表16

vs對照組*P＜0.05；vs 5-FU組#P＜0.05.
(2)H22荷瘤鼠在單獨注射5-FU后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合5-FU各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高，與5-FU組、及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。但生脈注射液大、中、小各組在提高CD3、CD4以及CD4/CD8比值方面沒有表現(xiàn)出劑量依賴效應。表17是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表17

vs對照組*P＜0.05；(3)H22荷瘤鼠在注射5-FU后IgG、IgM的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgM的產(chǎn)生水平增高，與對照組、5-FU組比較均有顯著性差異，P＜0.05。IgA水平在各組間無明顯差異。表18生脈注射液對體液免疫的影響。
表18

vs對照組*P＜0.05；(4)H22荷瘤鼠在應用5-FU后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)升高(41.6±3.5)，而生脈注射液聯(lián)合5-FU應用時可使ALT一定程度降低，大、中、小劑量組分別為35.8±2.6、35.0±8.0、36.7±4.2，與5-FU組比較差異顯著，均P＜0.05。ALB(血清白蛋白)、BUN(尿素氮)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表19是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表19

vs對照組*P＜0.05；vs 5-FU組#P＜0.05.
(5)荷瘤鼠在應用5-FU后出現(xiàn)WBC、PLT明顯降低，Hb影響較小，而聯(lián)合生脈注射液各組WBC、PLT數(shù)量有一定提高，與5-FU組比較差異顯著，P＜0.05。但其提高血細胞的療效沒有出現(xiàn)劑量依賴效應。表20生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表20

vs對照組*P＜0.05；vs 5-FU組#P＜0.05結果證實生脈注射液可增加5-FU對H22肝癌移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少5-FU化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例5生脈注射液對S180肉瘤移植瘤，以抗代謝類為代表的化療藥物5-FU化療減毒材料
(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株S180肉瘤細胞株，購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物0.25g 5-FU(購于上海旭東海普藥業(yè)有限公司)，生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、5-FU組、生脈注射液(大、中、小劑量)+5-FU組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為5-FU 20mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為
瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)5-FU組瘤重抑制率為46.19％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為67.74％、66.08％和66.82％，明顯高于單純5-FU組，P＜0.05。表21生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表21

vs對照組**P＜0.01；vs CTX組#P＜0.05.
(2)荷瘤鼠在單獨注射5-FU后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合5-FU各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高，與5-FU組、及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。但生脈注射液大、中、小各組在提高CD3、CD4以及CD4/CD8比值方面沒有表現(xiàn)出劑量依賴效應。表22是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表22

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；(3)S180荷瘤鼠在注射5-FU后IgA、IgG、IgM的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgA、IgG、IgM的產(chǎn)生水平增高，后，返回左頸外靜脈。開放血流15min后立即取出棉線稱重，減去絲線重量即得血栓濕重，并分別觀察給藥后8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h后，血栓的濕重，觀察本發(fā)明膠囊及原膠囊劑的起效時間及速度。
表8 對大鼠動-靜脈旁路血栓形成的影響(x±s，n＝10)與空白對照組比較*P＜0.05。

結果如表8所示，開放血流15min后絲線上有明顯的血栓黏附，本發(fā)明膠囊劑140mg/kg、原膠囊280mg/kg均可明顯抑制血栓的形成，與空白對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)；本發(fā)明膠囊劑與原膠囊作用強度相當(P＞0.05)。且本發(fā)明膠囊劑的起效速度快于原膠囊8小時以上。(本發(fā)明膠囊為64h開始起效，原膠囊于72h開始起效，與空白對照組比較有顯著性差異，P＜0.05)。
具體實施例方式
實施例1 膠囊劑的制備原料配方黃芪1320g、赤芍540g、丹參540g、當歸540g、川芎540g、桃仁540g、紅花260g、制乳香260g、制沒藥260g、雞血藤400g、牛膝540g、桂枝400g、桑枝540g、地龍540g、全蝎260g、水蛭540g。
制法(1)取川芎、當歸、桂枝、制乳香、制沒藥粉碎成粗粉，加10倍量水浸泡1小時，水蒸氣蒸餾6小時，收集揮發(fā)油，用4倍量的β-環(huán)糊精制成包合物，得揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，藥渣及藥液備用；(2)取丹參，每次用4倍量的95％乙醇回流提取1.5小時，共提取2次，提取液濾過，合并濾液，減壓回收乙醇、濃縮、干燥后，得丹參酮提取物，丹參藥渣備用；(3)取全蝎、水蛭、地龍粉碎成粗粉，再超微粉碎成超微粉，備用；(4)取赤芍、黃芪、紅花、桃仁、桑枝、牛膝、雞血藤七味藥材粗粉，與上<p>表5 對心肌缺血大鼠血清CK、LDH、AST活性以及心肌梗死百分比的影響

與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與原膠囊比較#P＞0.05。
結果如表4及表5所示，結扎大鼠冠狀動脈左前降支可以導致大鼠急性心肌缺血，表現(xiàn)為心電圖J點明顯抬高，血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性(含量)明顯升高，心肌梗死百分比明顯增加。本發(fā)明膠囊劑140mg/kg、280mg/kg與原膠囊280mg/kg均可在冠狀動脈結扎后一定時間范圍內(nèi)抑制心電圖J點的抬高；明顯抑制血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性(含量)的升高；降低心肌梗死百分比。本發(fā)明膠囊劑與原膠囊作用強度相當(P＞0.05)。
三、對大鼠體內(nèi)血栓形成的影響1、取大鼠50只，隨機分為空白對照組，原膠囊組，本發(fā)明膠囊劑小劑量組(70mg/kg)、中劑量組(140mg/kg)、大劑量組(280mg/kg)，每組10只。連續(xù)灌胃給藥3天，第2天給藥后禁食16小時, 末次給藥90分鐘后，水合氯醛麻醉(360mg/kg，i.p.)，分離右側(cè)頸總動脈及左頸外靜脈，在聚乙烯管中放入一根長5cm已稱重的七號絲線。以含肝素鈉(50U/ml)的生理鹽水溶液充滿聚乙烯管，聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈，另一端插入右頸總動脈。打開夾閉血管的動脈夾，使血流從右總頸動脈流經(jīng)聚乙烯管后，返回左頸外靜脈。開放血流15min后立即取出棉線稱重，減去絲線重量即得血栓濕重。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)5-FU組瘤重抑制率為44.18％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為63.52％、65.74％和63.64％，明顯高于單純5-FU組，P＜0.05，其中以生脈注射液中劑量組更高一些，但統(tǒng)計學無差異。表26是生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表26

vs對照組**P＜0.01；vs 5-FU組#P＜0.05.
(2)EAC荷瘤鼠在單獨注射5-FU后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，與對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合5-FU各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高，與5-FU組、及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。但生脈注射液大、中、小各組在提高CD3、CD4以及CD4/CD8比值方面沒有表現(xiàn)出劑量依賴效應。表27是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表27

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；(3)荷瘤鼠在注射5-FU后IgA、IgG、IgM的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgA、IgG、IgM的產(chǎn)生水平增高，與對照組、5-FU組比較均有顯著性差異，P＜0.05。表28是生脈注射液對體液免疫的影響。
表28

vs對照組*P＜0.05；(4)H22荷瘤鼠在應用5-FU后血清ALT、BUN明顯升高，而生脈注射液聯(lián)合5-FU應用時可使ALT、BUN一定程度降低，與5-FU組比較差異顯著，均P＜0.05。ALB各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表30是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表30

vs對照組**P＜0.01；vs 5-FU組#P＜0.05.
(5)荷瘤鼠在應用5-FU后出現(xiàn)WBC、PLT明顯降低，而聯(lián)合生脈注射液各組WBC、PLT數(shù)量有一定提高，與5-FU組比較差異顯著，P＜0.05。表31是生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表31

Vs對照組**P＜0.01；vs 5-FU組#P＜0.05結果證實生脈注射液可增加5-FU對EAC移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少5-FU化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例7生脈注射液對H22肝癌移植瘤，以抗腫瘤抗生素類為代表的化療藥物ADM化療減毒材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株H22肝癌細胞株，購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物10mg阿霉素(由浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，)，生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、ADM組、生脈注射液(大、中、小劑量)+ADM組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為ADM 2mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明
(1)ADM組瘤重抑制率為54.36％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為74.31％、77.50％和73.89％，明顯高于單純ADM組，均P＜0.05，其中以生脈注射液中劑量組更高。表32生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表32

vs對照組**P＜0.01；vs ADM組#P＜0.05.
(2)H22荷瘤鼠在單獨注射ADM后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，CD8升高，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合ADM各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高，同時伴有CD8下降，與ADM組及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。表33是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表33

vs對照組*P＜0.05；**P＜0.01.
(3)H22荷瘤鼠在注射ADM后IgG、IgM和IgA的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgA和IgM的產(chǎn)生水平增高，與對照組、ADM組比較均有顯著性差異，P＜0.05，其中生脈注射液中劑量對免疫功能的改善明顯高于大、小劑量。表34是生脈注射液對體液免疫的影響。
表34

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；(4)荷瘤鼠在應用ADM后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)和BUN(尿素氮)升高明顯，而生脈注射液聯(lián)合ADM應用時可使ALT、BUN一定程度降低，與ADM組比較差異顯著，均P＜0.05。ALB(血清白蛋白)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表35是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表35

vs對照組**P＜0.01；vs ADM組#P＜0.05.
(5)荷瘤鼠在應用ADM后出現(xiàn)WBC、Hb、PLT明顯降低，P＜0.01，而聯(lián)合生脈注射液各組WBC、Hb、PLT數(shù)量有一定提高，與ADM組比較差異顯著，P＜0.05。說明生脈注射液對小鼠骨髓造血具有保護作用。表36是生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表36

vs對照組**P＜0.01；vsADM組#P＜0.05結果證實生脈注射液可增加ADM對H22肝癌移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少ADM化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例8生脈注射液對S180移植瘤，以抗腫瘤抗生素類為代表的化療藥物ADM化療減毒材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株S180肉瘤細胞株，購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物10mg阿霉素(由浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))，生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、ADM組、生脈注射液(大、中、小劑量)+ADM組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為ADM 2mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQUest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)ADM組瘤重抑制率為33.46％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為49.74％、51.15％和50.13％，明顯高于單純ADM組，P＜0.05，其中以生脈注射液中劑量組更高一些，但統(tǒng)計學無差異。表37是生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表37

vs對照組**P＜0.01；vs ADM組#P＜0.05.
(2)S180荷瘤鼠在單獨注射ADM后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，CD8升高，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合ADM各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高同時伴有CD8下降，與5-FU組及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。表38是，生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表38

vs對照組*P＜0.05；**P＜0.01.
(3)荷瘤鼠在注射ADM后IgG、IgM和IgA的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgA和IgM的產(chǎn)生水平增高，與對照組、ADM組比較均有顯著性差異，P＜0.05。表39是生脈注射液對體液免疫的影響。
表39

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；(4)S180荷瘤鼠在應用ADM后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)和BUN(尿素氮)升高明顯，而生脈注射液聯(lián)合ADM應用時可使ALT、BUN一定程度降低，與ADM組比較差異顯著，均P＜0.05。ALB(血清白蛋白)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表40是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表40

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；vs ADM組#P＜0.05，##P＜0.01.
(5)荷瘤鼠在應用ADM后出現(xiàn)WBC、Hb、PLT明顯降低，P＜0.01，而聯(lián)合生脈注射液各組WBC、Hb、PLT數(shù)量有一定提高，與ADM組比較差異顯著，P＜0.05。表41是生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表41

與鹽水對照組比較**P＜0.01；與5-FU組比較#P＜0.05結果證實生脈注射液可增加ADM對S180移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少ADM化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例9生脈注射液對EAC移植瘤，以抗腫瘤抗生素類為代表的化療藥物ADM化療減毒材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株艾氏腹水瘤(EAC)，由復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室惠贈。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物10mg阿霉素(由浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、ADM組、生脈注射液(大、中、小劑量)+ADM組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為ADM 2mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)ADM組瘤重抑制率為39.23％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為68.30％、69.09％和69.49％，明顯高于單純ADM組，P＜0.05。表42生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表42

vs對照組*P＜0.05；vs ADM組#P＜0.05.
(2)EAC荷瘤鼠在單獨注射ADM后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，CD8升高，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合ADM各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高同時伴有CD8下降，與5-FU組及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。表43是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表43

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；(3)生脈注射液對體液免疫的影響荷瘤鼠在注射ADM后IgG、IgM和IgA的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgA和IgM的產(chǎn)生水平增高，與對照組、ADM組比較均有顯著性差異，P＜0.05或P＜0.01。表44生脈注射液對體液免疫的影響。
表44

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；(4)EAC荷瘤鼠在應用ADM后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)和BUN(尿素氮)升高明顯，均P＜0.01，而生脈注射液聯(lián)合ADM應用時可使ALT、BUN一定程度降低，與ADM組比較差異顯著，均P＜0.05。ALB(血清白蛋白)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表45生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表45

vs對照組**P＜0.01；vs ADM組#P＜0.05.
(5)荷瘤鼠在應用ADM后出現(xiàn)WBC、Hb、PLT明顯降低，P＜0.01，而聯(lián)合生脈注射液各組WBC、Hb、PLT數(shù)量有一定提高，與ADM組比較差異顯著，P＜0.05。表46生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表46

vs對照組**P＜0.01；vsADM組#P＜0.05結果證實生脈注射液可增加ADM對EAC移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少EAC化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例10生脈注射液對H22肝癌移植瘤，以雜類為代表的化療藥物Oxiplatin/L-OHP化療減毒材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株H22肝癌細胞株，購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物Oxiplatin/L-OHP(50mg奧鉑，購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、Oxiplatin組、生脈注射液(大、中、小劑量)+Oxiplatin組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為Oxiplatin 6mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)L-OHP組瘤重抑制率為37.36％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為64.80％、66.90％和65.56％，明顯高于單純L-OHP組，P＜0.05。表47是生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表47

vs對照組*P＜0.05；vs L-OHP組#P＜0.05.
(2)H22荷瘤鼠在單獨注射L-OHP后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低、CD8升高，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合L-OHP各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高，與L-OHP組、及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。表48是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表48

vs對照組*P＜0.05 **P＜0.01；(3)荷瘤鼠在注射L-OHP后IgG、IgM的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgM以及IgA的產(chǎn)生水平增高，在統(tǒng)計學上有顯著性差異，P＜0.05。表49是生脈注射液對體液免疫的影響。
表49

vs對照組*P＜0.05；(4)H22荷瘤鼠在應用L-OHP后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)明顯升高(72.0±20.0)，而生脈注射液聯(lián)合L-OHP應用時可使ALT一定程度降低，大、中、小劑量組分別為52.8±11.6、51.6±13.0、53.9±11.6，與L-OHP組比較差異顯著，均P＜0.05。ALB(血清白蛋白)、BUN(尿素氮)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表50是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表50

vs對照組*P＜0.05**P＜0.05；vs 5-FU組#P＜0.0 5.
(5)荷瘤鼠在應用L-OHP后出現(xiàn)WBC明顯降低，而Hb、PLT影響較小，在聯(lián)合生脈注射液各組WBC數(shù)量有一定提高，與L-OHP組比較差異顯著，P＜0.05。表51生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
表51

vs對照組*P＜0.05；vs 5-FU組#P＜0.05
結果證實生脈注射液可增加LOHP對H22肝癌移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少LOHP化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例11生脈注射液對S180肉瘤移植瘤，以雜類為代表的化療藥物Oxiplatin/L-OHP化療減毒材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株S180肉瘤細胞株，購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究所。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物 Oxiplatin/L-OHP(50mg奧鉑，購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、L-OHP組、生脈注射液(大、中、小劑量)+L-OHP組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dx×Rx/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為L-OHP 6mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)單獨應用L-OHP組瘤重抑制率為37.09％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為57.06％、59.78％和57.23％，明顯高于單純L-OHP組，均P＜0.05，其中生脈中劑量組療效要好于大、小劑量組。表51生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表51

vs對照組**P＜0.01；vs L-OHP組#P＜0.05.
(2)荷瘤鼠在單獨注射L-OHP后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低、CD8升高，與對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合L-OHP各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高，與L-OHP組、及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。表52是生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表52

vs對照組*P＜0.05；(3)荷瘤鼠在注射L-OHP后IgA、IgG、IgM的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgM以及IgA的產(chǎn)生水平增高，在統(tǒng)計學上有顯著性差異，P＜0.05。表53生脈注射液對體液免疫的影響。
表53

vs對照組*P＜0.05；(4)H22荷瘤鼠在應用L-OHP后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)明顯升高，而生脈注射液聯(lián)合L-OHP應用時可使ALT一定程度降低，與L-OHP組比較差異顯著，均P＜0.05。ALB(血清白蛋白)、BUN(尿素氮)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表54是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表54

vs對照組**P＜0.01；vs L-OHP組#P＜0.05.
(5)荷瘤鼠在應用L-OHP后出現(xiàn)WBC明顯降低，在聯(lián)合生脈注射液各組WBC數(shù)量有一定提高，與L-OHP組比較差異顯著，P＜0.05。表55是生脈注射液對骨髓造血具有保護作用。
表55

vs對照組**P＜0.01；vsL-OHP組#P＜0.05結果證實生脈注射液可增加L-OHP對S180移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少L-OHP化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
實施例12生脈注射液對艾氏腹水瘤移植瘤，以雜類為代表的化療藥物Oxiplatin/L-OHP化療減毒材料(1)實驗動物雌性ICR小鼠50只，(體重20±2g)，購于中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。
(2)瘤株艾氏腹水瘤(EAC)細胞株，由復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室惠贈。
(3)主要儀器和試劑BECTON DICKINSON流式細胞儀，型號FACSCaliburxi；日本7600-010全自動生化分析儀、K-21血球計數(shù)儀；3321小鼠CD4-FITC單抗、2769小鼠CD3-PE單抗、2778小鼠CD8-FITC單抗，購于法國曼特生物基因技術有限公司。
(4)藥物Oxiplatin/L-OHP(50mg奧鉑，購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)生脈注射液(上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。
方法瘤細胞復蘇后接種于小鼠腹腔內(nèi)，取瘤細胞處于快速增殖期的腹水，生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至2×107個細胞/毫升，備用。所有動物常規(guī)消毒，沿腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2ml，壓迫止血。造模后當日隨機分為5組，設對照組、L-OHP組、生脈注射液(大、中、小劑量)+L-OHP組，每組10只。
藥物及動物處理根據(jù)孫敬方《動物實驗方法學》人與小鼠劑量換算公式dB＝dA×RB/RA×(WA/WB)1/3獲得小鼠劑量為L-OHP 6mg/kg，生脈注射液大、中、小劑量分別為3.5ml/kg、7ml/kg、14ml/kg。生脈注射液及化療藥以生理鹽水調(diào)節(jié)容量，調(diào)配成0.4ml/鼠，腹腔注射，對照組僅予等量生理鹽水腹腔注射，復制模型次日起給藥，連續(xù)給藥14天。停藥次日脫椎處死動物，眼眶取血，送復旦大學腫瘤醫(yī)院中心實驗室及檢驗科進行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢測。
血常規(guī)應用日本K-21血球計數(shù)儀檢測。
肝腎功能及免疫球蛋白通過日本7600-010全自動生化分析儀進行檢測。
免疫功能檢測小鼠眼球摘除取血，1∶25肝素抗凝，取A、B兩管，分別在A管中加入CD3、CD8單抗各20ul，B管中加入CD4單抗20ul，然后兩管分別加入100ul細胞懸液，混勻后暗處室溫中孵育30分鐘，后加入紅細胞溶解液2ml混勻靜置10分鐘，1500/s離心5分鐘，棄上清液，PBS清洗2次上機。利用CELLQuest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光488nm，波長576nm，X軸為前向散射光，Y軸為側(cè)向散射光，確定淋巴細胞群，計數(shù)窗內(nèi)細胞10000個在FL1-H的直方圖上以FITC標記對照單抗，調(diào)整確定電壓及放大倍數(shù)，并在此基礎上測定淋巴細胞群的陽性表達率。
分離瘤塊，稱重，計算瘤重抑制率。計算公式為瘤重抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果表明(1)L-OHP組瘤重抑制率為45.74％，而生脈注射液(大、中、小劑量)組瘤重抑制率分別為71.42％、73.20％和72.80％，明顯高于單純L-OHP組，P＜0.05。表56是生脈注射液對瘤重抑制率的影響。
表56

vs對照組*P＜0.05，**P＜0.01；vsL-OHP組#P＜0.05.
(2)EAC荷瘤鼠在單獨注射L-OHP后出現(xiàn)外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低，CD8升高，與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學差異，P＜0.05；而生脈注射液聯(lián)合L-OHP各組小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高同時伴有CD8下降，與5-FU組及對照組比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05，其中生脈大劑量對免疫功能的改善要優(yōu)于中、小劑量。表57生脈注射液對T細胞亞群的影響。
表57

vs對照組*P＜0.05；**P＜0.01.
(3)EAC荷瘤鼠在注射L-OHP后IgA、IgG、IgM的產(chǎn)生明顯低于對照組，P＜0.05，而在聯(lián)合生脈注射液治療后可使IgG、IgM以及IgA的產(chǎn)生水平增高，在統(tǒng)計學上有顯著性差異，P＜0.05。表58是生脈注射液對體液免疫的影響。
表23

vs對照組*P＜0.05；(4)荷瘤鼠在應用5-FU后血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)升高(48.8±6.3)，而生脈注射液聯(lián)合5-FU應用時可使ALT一定程度降低，大、中、小劑量組分別為40.9±3.9、42.1±3.5、42.4±4.8，與5-FU組比較差異顯著，均P＜0.05。ALB(血清白蛋白)、BUN(尿素氮)在各組間沒有出現(xiàn)顯著性差異。表24是生脈注射液對肝腎功能的保護作用。
表24

vs對照組**P＜0.01；vs CTX組#P＜0.05，##P＜0.01.
(5)荷瘤鼠在應用5-FU后出現(xiàn)WBC、PLT明顯降低，Hb影響較小，而聯(lián)合生脈注射液各組WBC、PLT數(shù)量有一定提高，與5-FU組比較差異顯著，P＜0.05。但其提高血細胞的療效沒有出現(xiàn)劑量依賴效應。表25是生脈注射液對骨髓造血的保護作用。
結果證實生脈注射液可增加LOHP對EAC移植瘤的抑瘤作用，提高荷瘤鼠免疫功能，減少LOHP化療所致肝腎、骨髓毒性反應。
權利要求
1.生脈注射液在制備治療腫瘤減毒藥物中的用途。
2.生脈注射液在制備治療惡性腫瘤減毒藥物中的用途。
3.生脈注射液在制備治療惡性腫瘤烷化劑類化療減毒藥物中的用途。
4.生脈注射液在制備治療H22肝癌移植瘤CTX化療減毒藥物中的用途。
5.生脈注射液在制備治療S180肉瘤移植瘤CTX化療減毒藥物中的用途。
6.生脈注射液在制備治療艾氏腹水瘤移植瘤CTX化療減毒藥物中的用途。
7.生脈注射液在制備治療惡性腫瘤抗代謝類化療減毒藥物中的用途。
8.生脈注射液在制備治療H22肝癌移植瘤5-FU化療減毒藥物中的用途。
9.生脈注射液在制備治療S180肉瘤移植瘤5-FU化療減毒藥物中的用途。
10.生脈注射液在制備治療艾氏腹水瘤移植瘤5-FU化療減毒藥物中的用途。
11.生脈注射液在制備治療惡性腫瘤抗腫瘤抗生素類化療減毒藥物中的用途。
12.生脈注射液在制備治療H22肝癌移植瘤ADM化療減毒藥物中的用途。
13.生脈注射液在制備治療S180肉瘤移植瘤ADM化療減毒藥物中的用途。
14.生脈注射液在制備治療艾氏腹水瘤移植瘤ADM化療減毒藥物中的用途。
15.生脈注射液在制備治療惡性腫瘤雜類化療減毒藥物中的用途。
16.生脈注射液在制備治療H22肝癌移植瘤Oxiplatin化療減毒藥物中的用途。
17.生脈注射液在制備對S180肉瘤移植瘤Oxiplatin化療減毒藥物中的用途。
18.生脈注射液在制備對艾氏腹水瘤移植瘤Oxiplatin化療減毒藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于中醫(yī)中藥領域，涉及中藥生脈注射液在制藥中的新用途，提供中藥生脈注射液在制備治療腫瘤減毒藥物尤其是惡性腫瘤減毒藥物中的新用途。本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)代藥理學關于中藥生脈注射液研究，結合臨床化學治療特點，采用生脈注射液和腫瘤化療藥物，尤其是以烷化劑為代表的化療藥物－CTX、以抗代謝類為代表的化療藥物－5－Fu、以抗腫瘤抗生素為代表的化療藥物－ADM、和以雜類為代表的化療藥物－Oxiplatin，對腫瘤尤其是惡性腫瘤包括肝癌、肉瘤、艾氏腹水瘤細胞株進行試驗，結果證實生脈注射液對所述化療藥物有明顯減毒作用。
文檔編號A61P43/00GK1679766SQ20051002356
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月25日 優(yōu)先權日2005年1月25日
發(fā)明者陳震, 丁建彌, 劉魯明, 陳忠梁, 廖進明, 張正光, 樂國祥, 康愛仙 申請人:上海和黃藥業(yè)有限公司, 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院