專利名稱：：用于抑制c－met二聚化及活化的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：廣義而言，本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及生長因子調(diào)控領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及HGF/c-met信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)因子，以及所述調(diào)節(jié)因子的用途。
背景技術(shù)：
：HGF是一種間充質(zhì)-衍生的多效性因子，對大量不同細(xì)胞類型具有促有絲分裂、動力產(chǎn)生和細(xì)胞成形的活性。HGF作用是通過一種特異性酪氨酸激酶c-met來介導(dǎo)的，異常的HGF及c-met表達(dá)多見于各種腫瘤。參見，例如，Mauliketal.，Cytokine&GrowthFactorReviews(2002)，1341-59；Danilkovitch-Miagkova&Zbar，J.Clin.Invest.(2002)，109(7)863-867。HGF/c-Met信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控與腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。參見，例如，Trusolino&Comoglio，NatureRev.(2002)，2289-300)。HGF能夠與Met受體酪氨酸激酶(RTK)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，調(diào)節(jié)各種生物反應(yīng)，例如細(xì)胞分散、增殖及存活。HGF-Met信號傳導(dǎo)對于正常的胚胎發(fā)育，特別是肌肉祖細(xì)胞的遷移以及肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是必不可少的(Bladtetal.，1995；Hamanoueetal.，1996；Mainaetal.，1996；Schmidtetal.，1995；Ueharaetal.，1995)。Met敲除與HGF敲除小鼠的發(fā)育表型非常相似，表明HGF是Met受體的同源配體(cognateligand)(Schmidtetal.，1995；Ueharaetal.，1995)。另外，HGF-Met還在肝臟再生、脈管生成，和傷口愈合中發(fā)揮作用(Bussolinoetal.，1992；MatsumotoandNakamura，1993；Nusratetal.，1994)。Met受體前體經(jīng)過蛋白水解切割為通過二硫鍵連接在一起的細(xì)胞外α亞單位和跨膜β亞單位(Tempestetal.，1988)。所述的β亞單位含有胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，在C-末端上含有多-底物錨定位點(dockingsite)，接頭蛋白就是結(jié)合于此處啟動信號傳導(dǎo)(Bardellietal.，1997；Nguyenetal.，1997；Peliccietal.，1995；Ponzettoetal.，1994；Weidneretal.，1996)。當(dāng)HGF結(jié)合時，Met的活化分別通過Gab1及Grb2/Sos介導(dǎo)的PI3-激酶和Ras/MAPK活化導(dǎo)致酪氨酸激酶的磷酸化和下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而驅(qū)動細(xì)胞的運動和增殖(Furgeetal.，2000；Hartmannetal.，1994；Ponzettoetal.，1996；RoyalandPark，1995).Met能夠轉(zhuǎn)化致癌物-處理過的骨肉瘤細(xì)胞系(Cooperetal.，1984；Parketal.，1986)。在多種人的癌癥中發(fā)現(xiàn)了Met的過表達(dá)或基因-擴增。例如，Met蛋白在結(jié)腸直腸癌中過表達(dá)了至少5倍，并且在肝轉(zhuǎn)移中是基因擴增的(gene-amplified)(DiRenzoetal.，1995；Liuetal.，1992)。另外還有報道Met蛋白過表達(dá)于口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌及肺癌(Jinetal.，1997；Morelloetal.，2001；Natalietal.，1996；Oliveroetal.，1996；Suzukietal.，1994)。此外，還發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌、胃癌，和結(jié)腸直腸癌中也有mRNA的過表達(dá)(Boixetal.，1994；Kuniyasuetal.，1993；Liuetal.，1992)。在腎乳頭狀癌中發(fā)現(xiàn)Met的激酶結(jié)構(gòu)域中有大量突變，導(dǎo)致組成型受體活化(Oliveroetal.，1999；Schmidtetal.，1997；Schmidtetal.，1999)。這些活化突變賦予組成型Met酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致MAPK活化，病灶形成及腫瘤發(fā)生(Jeffersetal.，1997)。此外，這些突變加強了細(xì)胞移動及侵入(Giordanoetal.，2000；Lorenzatoetal.，2002)。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中的HGF-依賴性Met活化能介導(dǎo)加強的運動、分散及遷移，最終導(dǎo)致侵入性的腫瘤生長及轉(zhuǎn)移(Jeffersetal.，1996；Meinersetal.，1998)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Met能夠與驅(qū)動受體活化、轉(zhuǎn)化及侵入的其他蛋白質(zhì)相互作用。在瘤形成的細(xì)胞中，Met能夠與α6β4整聯(lián)蛋白相互作用，加快HGF-依賴性的侵入生長，α6β4整聯(lián)蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分例如層粘連蛋白的受體(Trusolinoetal.，2001)。此外，已經(jīng)證實所述的Met的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域能與semaphorin家族成員plexinB1相互作用，從而加快侵入性生長(Giordanoetal.，2002)。另外，還發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)的CD44v6能夠與Met和HGF形成復(fù)合體，從而導(dǎo)致Met受體活化(Orian-Rousseauetal.，2002)。Met是受體酪氨酸激酶(RTKs)亞家族的成員，該家族包括Ron和Sea(Mauliketal.，2002)。Met細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)測定表明其與semaphorins和plexins之間具有同源性。Met的N-末端含有大約500個氨基酸的Sema結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域保守存在于所有的semaphorins和plexins中。所述semaphorins和plexins屬于一個大的分泌型及膜結(jié)合型蛋白質(zhì)家族，該家族首先報道了在神經(jīng)發(fā)育中所起的作用(VanVactorandLorenz，1999)。但是，更近的研究發(fā)現(xiàn)semaphorin過表達(dá)與腫瘤侵入及轉(zhuǎn)移有關(guān)。發(fā)現(xiàn)于plexins、semaphorins和整聯(lián)蛋白中的富含半胱氨酸的PSI結(jié)構(gòu)域(又稱Met相關(guān)序列結(jié)構(gòu)域)位于其后接有4個IPT重復(fù)單元的Sema結(jié)構(gòu)域的附近，這4個重復(fù)單元是在plexins及轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白-樣區(qū)域。最近研究表明MetSema結(jié)構(gòu)域足以結(jié)合HGF及肝素(Gherardietal.，2003)。Met激酶結(jié)構(gòu)域的作用已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)地研究，但是Met的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域還知之甚少。盡管大家都知道HGF結(jié)合Met的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)е率荏w活化，但是還不清楚，哪個亞-結(jié)構(gòu)域，如果有，參與了受體的二聚化。但是，顯然如果能夠闡明Met細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的亞-結(jié)構(gòu)域在活化HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸中的作用(如果有的話)，那么將會為靶向治療的設(shè)計帶來明顯益處，例如并且尤其是在涉及Met受體本身功能異常的臨床情況中。本申請中引用的所有文獻(xiàn)，包括專利申請及公開文本，在此全文引入作為參考。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是部分建立在下述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上的肝細(xì)胞生長因子受體c-met的二聚化是一個生物/細(xì)胞過程，是一個重要且有利的治療靶標(biāo)。本申請發(fā)現(xiàn)破壞該過程可有效地抑制與細(xì)胞生長有關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的活化，這種活化與許多疾病狀態(tài)例如癌癥中的細(xì)胞生長失調(diào)有關(guān)。本發(fā)明還進(jìn)一步以下述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)在影響c-met二聚化進(jìn)而活化HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸中，必需的和/或發(fā)揮重要作用的是c-met蛋白質(zhì)的某些而非所有的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供了以干擾HGF與c-met細(xì)胞外部分特異性結(jié)構(gòu)域間結(jié)合為基礎(chǔ)的組合物和方法。鑒定出c-met二聚化或c-met與同源配體結(jié)合中所需的c-met特異性部分，能為更好地優(yōu)化針對下述病理狀況的預(yù)防和/或治療方法提供獨一無二且有益的靶標(biāo)，所述病理狀況即與HGF/c-Met途徑異?；虿涣夹盘杺鲗?dǎo)有關(guān)的病理狀況。因此，本發(fā)明提供了與調(diào)節(jié)HGF/c-met途徑有關(guān)的方法、組合物、試劑盒及制品，包括對c-met配體結(jié)合、c-met二聚化、活化以及其他與HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)生物/生理活性的調(diào)節(jié)。在一個方面，本發(fā)明提供了干擾所述HGF/c-met信號傳導(dǎo)途徑的c-met拮抗劑。例如，本發(fā)明提供了一種能干擾c-met二聚化的c-met拮抗劑。一個實施方案中，本發(fā)明所述的c-met拮抗劑能干擾c-metSema結(jié)構(gòu)域的二聚化功能(即，Sema結(jié)構(gòu)域能夠在影響受體二聚化中發(fā)揮作用)。一個實施例中，c-met拮抗劑能干擾c-metSema結(jié)構(gòu)域影響c-met二聚化的能力。干擾可以是直接的或間接的。例如，c-met拮抗劑可以與所述c-metsema結(jié)構(gòu)域中的一段序列結(jié)合，從而抑制所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合伴侶(例如另一c-met分子)間的相互作用。另一實施例中，c-met拮抗劑與位于所述c-metsema結(jié)構(gòu)域之外的一段序列結(jié)合，但是所述結(jié)合能破壞c-metSema結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合伴侶(例如另一c-met分子)間的相互作用。一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑能結(jié)合c-met(例如，所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)從而干擾c-met的二聚化。一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑與c-met結(jié)合從而干擾c-metSema結(jié)構(gòu)域影響c-met二聚化的能力。例如，一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種拮抗劑，該拮抗劑與c-met分子結(jié)合時能抑制所述分子的二聚化。一個實施方案中，本發(fā)明的c-met拮抗劑能夠與c-metSema結(jié)構(gòu)域中的一段序列特異性地結(jié)合。一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑能干擾c-met的二聚化包括均二聚作用。一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑能干擾c-met的二聚化包括異二聚作用(即，c-met與非-c-met分子間的二聚化)。在一些情況下，獲得一種不妨礙配體(例如HGF)與c-met間結(jié)合的c-met拮抗劑是有利的。因此，一些實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑不能結(jié)合c-met上的配體(例如HGF)結(jié)合位點。另一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑基本上不能抑制配體(例如，HGF)與c-met的結(jié)合。一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑基本上不與配體(例如，HGF)競爭性地結(jié)合c-met。一個實施例中，本發(fā)明的拮抗劑可用于偶聯(lián)一種或多種其他拮抗劑，其中所述拮抗劑靶向HGF/c-met軸中的不同過程和/或功能。因此，一個實施方案中，本發(fā)明的c-met拮抗劑與c-met上的表位結(jié)合，而該表位是與另一種c-met拮抗劑結(jié)合的表位不同的表位，例如用保藏號為ATCCHB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)的雜交瘤細(xì)胞系制備的單克隆抗體Fab片段。另一個實施方案中，本發(fā)明的c-met拮抗劑不同于(即不是)用保藏號為ATCCHB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)的雜交瘤細(xì)胞系制備的單克隆抗體Fab片段。一個實施方案中，本發(fā)明的c-met拮抗劑不含有用保藏號為ATCCHB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)的雜交瘤細(xì)胞系所制備抗體的c-met結(jié)合序列。在一些情況下，具有能干擾c-met二聚化以及配體結(jié)合的c-met拮抗劑是有利的。例如，本發(fā)明的拮抗劑還可以進(jìn)一步包括與HGF競爭性結(jié)合c-met的能力。在本發(fā)明c-met拮抗劑的一個實施方案中，拮抗劑與c-met的結(jié)合能抑制HGF對c-met的活化。本發(fā)明所述c-met拮抗劑的一個實施方案中，所述拮抗劑與細(xì)胞中c-met的結(jié)合能抑制該細(xì)胞的增殖、分散、形態(tài)發(fā)生(morphogenesis)和/或運動(motility)。一個實施方案中，本發(fā)明的c-met拮抗劑包含肽，該肽含有至少一部分c-metSema結(jié)構(gòu)域或其變體。一個實施例中，本發(fā)明的拮抗劑包含肽，該肽含有選自下列序列中的至少一種序列LDAQT(SEQIDNO1)(例如，c-met中的第269-273位殘基)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)(例如，c-met中的第300-308位殘基)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)(例如，c-met中的第350-357位殘基)和NVRCLQHF(SEQIDNO4)(例如，c-met中的第381-388位殘基)。另一實施例中，本發(fā)明的拮抗劑包含肽，該肽基本上由選自下列序列中的至少一種序列組成LDAQT(SEQIDNO1)、LTEKRKKRS(SEQIDNO2)、KPDSAEPM(SEQIDNO3)和NVRCLQHF(SEQIDNO4)。一個實施方案中，所述肽含有序列LTEKRKKRS(SEQIDNO2)。一個實施方案中，所述肽基本上由LTEKRKKRS(SEQIDNO2)組成。一個實施方案中，所述肽含有序列LDAQT(SEQIDNO1)。一個實施方案中，所述肽基本上由LDAQT(SEQIDNO1)組成。一個實施方案中，所述肽含有序列KPDSAEPM(SEQIDNO3)。一個實施方案中，所述肽基本上由KPDSAEPM(SEQIDNO3)組成。一個實施方案中，所述肽含有序列NVRCLQHF(SEQIDNO4)。一個實施方案中，所述肽基本上由NVRCLQHF(SEQIDNO4)組成。一些實施方案中，所述肽是一種變體，其中含有與序列LDAQT(SEQIDNO1)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)和/或NVRCLQHF(SEQIDNO4)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體保留有能與c-met分子形成復(fù)合體的能力。一些實施方案中，這些肽中含有增強其抑制和/或治療作用(包括，例如增強親和力、提高藥物動力學(xué)特性(例如半衰期、穩(wěn)定性、清除率)、減少對受試者的毒性)的修飾。所述修飾包括，例如，涉及糖基化、PEG化(pegylation)、用非天然生成但功能等價的氨基酸、連接基團等取代的修飾。合適的修飾已為本領(lǐng)域所熟知，可以根據(jù)需要憑經(jīng)驗來決定。一些實施方案中，本發(fā)明的c-met拮抗劑是或含有小分子(例如，有機分子)、肽(例如，低聚肽)、抗體、抗體片段、適體(aptamer)、寡核苷酸(例如，反義寡核苷酸)，或其組合。一些實施方案中，本發(fā)明的c-met拮抗劑通過本申請中本發(fā)明所述的篩選或鑒定方法獲得。另一方面，本發(fā)明提供了用于篩選或鑒定c-met拮抗劑的方法。一個實施例中，所述方法包括讓侯選物與表達(dá)c-met的細(xì)胞接觸，在所述侯選物存在下所述細(xì)胞中的c-met二聚化和/或活化被抑制(用眾多標(biāo)準(zhǔn)及方法中的任一種，本申請中記載了其中的一些)表明所述物質(zhì)是c-met拮抗劑。另一實施例中，所述方法包括讓候選物質(zhì)與其中含有至少一部分c-metSema結(jié)構(gòu)域的靶分子接觸，據(jù)此選出能特異性結(jié)合所述靶分子的物質(zhì)(稱為c-met拮抗劑)。一些實施方案中，本發(fā)明所述的篩選方法進(jìn)一步還包括讓被選物質(zhì)與表達(dá)c-met的細(xì)胞接觸，然后對該細(xì)胞中c-met二聚化的抑制情況進(jìn)行測定(例如，對所述細(xì)胞中c-met二聚化程度進(jìn)行檢測或測量)。c-met二聚化的抑制情況可以采用本領(lǐng)域已知的眾多方法，根據(jù)本領(lǐng)域已知的多種標(biāo)準(zhǔn)中的任一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定(一些在本申請中已詳細(xì)描述)。例如，c-met二聚化抑制情況可以用c-met活化量的減少顯示，也可以用細(xì)胞中c-met相關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)量顯示。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以使用和依據(jù)本領(lǐng)域已知的大量方法及標(biāo)準(zhǔn)測定，其中的一些已在于本申請中描述。例如，HGF/c-met途徑申細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生在生物學(xué)上可以顯示為所述信號傳導(dǎo)途徑中靶分子磷酸化的改變。因此，例如，可以對與HGF/c-met途徑中一種或多種已知磷酸化靶標(biāo)有關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化的量進(jìn)行測量。所述磷酸化靶標(biāo)的實例包括c-met本身及促有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)。在一個方面，本發(fā)明提供了其中含有本發(fā)明所述一種或多種拮抗劑以及載體的組合物。一個實施方案中，所述載體是藥物學(xué)上可接受的。在一個方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明所述c-met拮抗劑的核酸。一個實施方案中，本發(fā)明所述核酸編碼c-met拮抗劑，該拮抗劑是一種多肽或其中含有多肽(例如，低聚肽)。一個實施方案中，本發(fā)明所述核酸編碼c-met拮抗劑，該拮抗劑是或含有抗體或其片段。在一個方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明所述核酸的載體。在一個方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明所述核酸或本發(fā)明所述載體的宿主細(xì)胞。載體可以是任一類型，例如一種重組載體例如一種表達(dá)載體。眾多宿主細(xì)胞中的任意一種都可使用。一個實施方案中，宿主細(xì)胞是一種原核細(xì)胞，例如，大腸桿菌。一個實施方案中，宿主細(xì)胞是一種真核細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在一個方面，本發(fā)明提供了用于制備本發(fā)明所述拮抗劑的方法。例如，本發(fā)明提供了一種制備本身是或含有抗體(或其片段)的c-met拮抗劑的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述抗體(或其片段)的重組載體，然后回收所述抗體。另一實施例中，本發(fā)明提供了一種制備本身是或含有多肽(例如低聚肽)的c-met拮抗劑的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述多肽(例如低聚肽)的重組載體，然后回收所述多肽(例如低聚肽)。一個方面，本發(fā)明提供了其中包括容器的制品；以及盛裝于該容器中的組合物，其中所述組合物含有一種或多種本發(fā)明所述c-met拮抗劑。一個實施方案中，所述組合物含有本發(fā)明所述的核酸。一個實施方案中，含拮抗劑的組合物進(jìn)一步還含有載體，一些實施方案中該載體是藥物學(xué)可接受的。一個實施方案中，本發(fā)明所述的制品進(jìn)一步還包括用于指導(dǎo)將組合物(例如，所述拮抗劑)施用至受試者的說明書。在一個方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其中含有第一包裝物，該第一包裝物其中含有一種或多種本發(fā)明所述c-met拮抗劑；以及其中含緩沖液的第二包裝物。一個實施方案中，所述緩沖液是藥物學(xué)上可接受的。一個實施方案中，含拮抗劑的組合物進(jìn)一步還含有載體，一些實施方案中該載體是藥物學(xué)可接受的。一個實施方案中，本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)一步還包括用于指導(dǎo)將組合物(例如，所述拮抗劑)施用至受試者的說明書。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述c-met拮抗劑在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關(guān)病癥。所述c-met拮抗劑可以是本申請所述的任一形式，包括抗體、抗體片段、小分子(例如有機分子)、多肽(例如，低聚肽)、核酸(例如，寡核苷酸，如反義寡核苷酸)、適體，或其組合。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述核酸在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關(guān)病癥。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述表達(dá)載體在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關(guān)病癥。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述宿主細(xì)胞在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關(guān)病癥。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述制品在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關(guān)病癥。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述試劑盒在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關(guān)病癥。本發(fā)明提供了可用于調(diào)節(jié)與HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸失調(diào)有關(guān)的疾病狀態(tài)的方法及組合物。所述HGF/c-met信號傳導(dǎo)途徑涉及多種生物學(xué)及生理功能，包括，例如，細(xì)胞增殖及血管生成。因此，，在一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中包括向受試者施用能調(diào)節(jié)c-met胞外部分亞-結(jié)構(gòu)域功能的物質(zhì)/分子，從而調(diào)節(jié)HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。一個實施方案中，所述亞-結(jié)構(gòu)域包含全部或至少一部分c-metSema結(jié)構(gòu)域。在一個方面，本發(fā)明提供了一種能抑制c-met活化的細(xì)胞增殖的方法，該方法包括讓細(xì)胞或組織與有效量的本發(fā)明所述c-met拮抗劑接觸，從而抑制與c-met活化相關(guān)的細(xì)胞增殖。在一個方面，本發(fā)明提供了一種治療受試者與c-met活化失調(diào)相關(guān)的病理狀況的方法，該方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明所述c-met拮抗劑，從而治療該病理狀況。在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于抑制表達(dá)c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者的細(xì)胞生長的方法，該方法包括讓所述細(xì)胞與本發(fā)明的c-met拮抗劑接觸，從而引發(fā)對所述細(xì)胞生長的抑制。一個實施方案中，所述細(xì)胞與不同細(xì)胞所表達(dá)的HGF接觸(例如，通過旁分泌作用)。一個方面，本發(fā)明提供了一種對哺乳動物進(jìn)行治療性處理的方法，該哺乳動物患有含表達(dá)c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者的細(xì)胞的癌性腫瘤，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的本發(fā)明所述c-met拮抗劑，從而有效治療所述哺乳動物。一個實施方案中，所述細(xì)胞與不同細(xì)胞所表達(dá)的HGF接觸(例如，通過旁分泌作用)。一個方面，本發(fā)明提供了一種治療或防止細(xì)胞增殖病癥的方法，該細(xì)胞增殖病癥與c-met表達(dá)或活性升高或者肝細(xì)胞生長加快或者兩者相關(guān)，所述方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明所述c-met拮抗劑，從而有效治療或防止所述細(xì)胞增殖病癥。一個實施方案中，所述增殖病癥是癌癥。一個方面，本發(fā)明提供了一種用于抑制細(xì)胞生長的方法，其中所述細(xì)胞生長至少部分地取決于c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者的生長加強作用，所述方法包括讓所述細(xì)胞與有效量的本發(fā)明所述c-met拮抗劑接觸，從而抑制所述細(xì)胞的生長。一個實施方案中，所述細(xì)胞與不同細(xì)胞所表達(dá)的HGF接觸(例如，通過旁分泌作用)。一種治療哺乳動物腫瘤的方法，其中所述腫瘤生長至少部分取決于c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者的生長加強作用，所述方法包括讓所述細(xì)胞與有效量的本發(fā)明所述c-met拮抗劑接觸，從而有效地治療所述腫瘤。一個實施方案中，所述細(xì)胞與不同細(xì)胞所表達(dá)的HGF接觸(例如，通過旁分泌作用)。本發(fā)明所述的方法可用于任一適合的病理狀態(tài)，例如，與HGF/c-met信號傳導(dǎo)途徑失調(diào)相關(guān)的細(xì)胞和/或組織。一個實施方案中，本發(fā)明所述方法中所靶向的細(xì)胞是一種癌細(xì)胞。例如所述癌細(xì)胞可以選自乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳頭狀癌細(xì)胞(例如，甲狀腺)、結(jié)腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、腎臟癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、頭及頸部鱗狀癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞以及血癌細(xì)胞。一個實施方案中，本發(fā)明所述方法中所靶向的細(xì)胞是一種高度增生性的(hyperproliferative)和/或增生性的(hyperplastic)細(xì)胞。一個實施方案中，本發(fā)明所述方法中所靶向的細(xì)胞是一種發(fā)育異常的細(xì)胞。另一個實施方案中，本發(fā)明所述方法中所靶向的細(xì)胞是一種轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞。本發(fā)明所述方法還可以進(jìn)一步包括補充處理步驟。例如，一個實施方案中，一種方法進(jìn)一步還包括下述步驟讓靶細(xì)胞和/或組織(例如，癌細(xì)胞)經(jīng)歷放療和/或化療。如本申請所述，c-met活化是一種重要的生物反應(yīng)，它的失調(diào)會引發(fā)許多病理狀況。因此，本發(fā)明所述方法的一個實施方案中，所靶向的細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)是具有下述特征的細(xì)胞與相同組織來源的正常細(xì)胞相比，其中的c-met活化增強。一個實施方案中，本發(fā)明所述方法可引發(fā)靶細(xì)胞死亡。例如，與本發(fā)明的拮抗劑接觸可以導(dǎo)致細(xì)胞無法通過c-met途徑傳導(dǎo)信號，因而導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞生長受到抑制。c-met活化(及因此而導(dǎo)致的信號傳導(dǎo))的失調(diào)可以起因于多種細(xì)胞變化，包括，例如，HGF(c-met同源配體)和/或c-met本身的過表達(dá)。因此，一些實施方案中，本發(fā)明所述方法包括以具有下述特征的細(xì)胞為靶細(xì)胞與相同組織來源的正常細(xì)胞相比，該細(xì)胞所表達(dá)的c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者以更高豐度表達(dá)。c-met-表達(dá)細(xì)胞可以受到多種來源的HGF的調(diào)節(jié)，即以自分泌或旁分泌方式。例如，本發(fā)明所述方法的一個實施方案中，靶細(xì)胞與不同細(xì)胞中表達(dá)的或表達(dá)出的肝細(xì)胞生長因子接觸/結(jié)合(例如，通過旁分泌作用)。所述不同的細(xì)胞可以來自與靶細(xì)胞相同或不同的組織來源。一個實施方案中，靶細(xì)胞是與靶細(xì)胞本身表達(dá)的HGF接觸/結(jié)合(例如，通過自分泌作用/回路)。C-met活化和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還可以不依賴配體單獨發(fā)生。因此，在本發(fā)明所述方法的一個實施方案中，靶細(xì)胞中的c-met活化不依賴配體單獨發(fā)生。附圖簡述圖1.Met缺失突變體的簡圖從N-末端對Met胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了亞-結(jié)構(gòu)域缺失，并在TM區(qū)后加了V5/His標(biāo)簽。每一突變體的N-末端都附加了Met信號肽(S.P.)序列?？s寫對應(yīng)含義如下Sema-semaphorin；PSI-plexin，semaphorin，整聯(lián)蛋白；plexins中的IPT-免疫球蛋白樣區(qū)及轉(zhuǎn)錄因子；和TM-跨膜。Sema區(qū)上的箭頭指向Met蛋白水解位點。圖2.Sema結(jié)構(gòu)域是Met交聯(lián)所必需的A將Met缺失突變體轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，并與遞增濃度的硫代-EGS接觸。取10μg裂解物進(jìn)行4-12％SDS-PAGE電泳分析，然后用V5抗體進(jìn)行免疫印跡測試。EC-M代表單體EC-WT，EC-D代表二聚體的EC-WT。星號表示有未處理的EC-WT存在。B將EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，然后與遞增濃度的硫代-EGS接觸，裂解，用V5或Flag抗體免疫沉淀，然后進(jìn)行8％SDS-PAGE電泳分析。將免疫沉淀樣本用Flag或V5抗體作免疫印跡分析。圖3.HGF和抗-Met抗體(本申請中稱為“5D5”)結(jié)合Met的Sema結(jié)構(gòu)域A用指定的加有MetV5/His標(biāo)簽的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用V5抗體免疫沉淀，4-12％SDS-PAGE電泳，用His抗體免疫印跡。B將A中得到的免疫沉淀物用5μgHGF孵育。將樣本進(jìn)行4-12％SDS-PAGE電泳，然后用能識別α鏈的HGF抗體進(jìn)行免疫印跡分析。加入10ngHGF作為陽性對照。CB中的免疫沉淀和免疫印跡都使用scHGF(R494E)進(jìn)行。作為陽性對照，15ngscHGF(R494E)用樣本進(jìn)行了分析。D用指定構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，4-12％SDS-PAGE電泳，用V5抗體進(jìn)行免疫印跡分析。E將D中的轉(zhuǎn)染裂解物用抗-Met5D5抗體免疫沉淀，然后用His抗體進(jìn)行免疫印跡分析。FB中的硝酸纖維素膜用MetC-12抗體再探測。圖4.腫瘤細(xì)胞系中內(nèi)源c-Met的交聯(lián)向已經(jīng)經(jīng)受了血清-饑餓的293，H441，MDA-MB-435和A549細(xì)胞加入遞增濃度的硫代-EGS。交聯(lián)前，A549細(xì)胞再用100μg/mlHGF孵育。裂解物用MetC-12抗體作免疫印跡分析。帶有*的條帶表示未經(jīng)處理的WT-Met。圖5.Met信號傳導(dǎo)被rSemar和抗-Met5D5-Fab抑制。Met的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可減弱Met信號傳導(dǎo)A將A549細(xì)胞維持在無血清的培養(yǎng)基，然后用0、5、10、50或100μg/ml的rSema加10ng/mlHGF處理10分鐘，用于磷酸-Met及磷酸-MAPK試驗。裂解物用MetC-12抗體免疫沉淀，用磷酸酪氨酸抗體免疫印跡檢測磷酸化的Met，然后用Met抗體免疫印跡。H441和MDA-MB-435細(xì)胞用0，5，10，或100μg/mlrSema加5或10ng/mlHGF分別處理5分鐘。蛋白質(zhì)用磷酸-MAPK檢測，然后用MAPK抗體再探測。帶*的條帶代表未經(jīng)處理的WT-Met。B對A中的數(shù)據(jù)用NIHImage軟件定量，然后繪制為左側(cè)的柱形圖，其中含有每一樣本之間磷酸化蛋白相對于非磷酸化蛋白的比例。右側(cè)圖表示的是來自另一實驗的數(shù)據(jù)。C將A549，H441和MDA-MB-435細(xì)胞維持在無血清培養(yǎng)，用10μg/mlrSema或抗-Met5D5-Fab處理。將這些樣本用磷酸酪氨酸、Met、磷酸-MAPK或MAPK抗體進(jìn)行免疫印跡分析。標(biāo)*的條帶表示未經(jīng)處理的WT-Met。D將C中數(shù)據(jù)定量后，按照B中方法繪圖。E用指定構(gòu)建體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。通過用V5抗體免疫印跡，檢測Met變體的表達(dá)。標(biāo)*的條帶表示未經(jīng)處理的EC-WT。F(左)E中裂解物用MetC-12抗體免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗體進(jìn)行免疫印跡分析。印跡膜用Met抗體再探測。(右)裂解物用磷酸-MAPK免疫印跡分析，然后用MAPK再探測。G對F中的數(shù)據(jù)用NIHImage軟件定量，然后繪制為左側(cè)的柱形圖，其中含有每一樣本之間磷酸化蛋白相對于非磷酸化蛋白的比例。右側(cè)圖表示的是來自另一實驗的數(shù)據(jù)。每一幅圖中的柱形從左至右對應(yīng)于F中的標(biāo)出的泳道，分別為“模擬物”，“EC-WT”，“ΔS”，“ΔP”和“TM”。圖6.rSema和抗-Met5D5-Fab抑制細(xì)胞運動H441細(xì)胞劃痕，在無血清培養(yǎng)基中用模擬物，rSema，抗-Met5D5-Fab或HGF處理兩天。進(jìn)行4次相互獨立的實驗，給出了有代表性的數(shù)據(jù)。圖7.細(xì)胞遷移被rSema和抗-Met5D5-Fab抑制將MDA-MB-435細(xì)胞種植于每一跨孔上部腔室無血清培養(yǎng)基中，并用模擬物、rSema、或抗-Met5D5-Fab處理。作為陽性對照，向模擬物-處理孔的下部腔室加入HGF。移動細(xì)胞用結(jié)晶紫染色。測量洗脫出的細(xì)胞的560nm處吸光度。3個獨立的移動試驗都一式兩份平行進(jìn)行，并給出了代表性圖形。本發(fā)明的實施方式本發(fā)明提供了干擾HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸從而治療和/或預(yù)防與所述軸失調(diào)相關(guān)病理狀況的方法。本發(fā)明至少部分地建立在下列發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)之上闡明本申請所述c-met內(nèi)亞結(jié)構(gòu)域/子序列是配體結(jié)合和/或c-met受體二聚化(以及由此導(dǎo)致的c-met活化)所必需的。本發(fā)明進(jìn)一步還提供了可用于本發(fā)明所述方法的組合物、試劑盒及制品。本申請還提供了這些方法、組合物、試劑盒及制品的詳細(xì)描述。常規(guī)技術(shù)本發(fā)明的實施，除非另有說明外，都采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。所述技術(shù)在多篇文獻(xiàn)中有充分的解釋，例如，“MolecularCloningALaboratoryManual”，secondedition(Sambrooketal.，1989)；“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait，ed.，1984)；“AnimalCellCulture”(R.I.Freshney，ed.，1987)；“MethodsinEnzymology”(AcademicPress，Inc.)；“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(F.M.Ausubeletal.，eds.，1987，andperiodicupdates)；“PCRThePolymeraseChainReaction”，(Mullisetal.，ed.，1994)；“APracticalGuidetoMolecularCloning”(PerbalBernardV.，1988)。定義就一種肽(例如，VDWVCFRDLGCDWEL，LDAQT，LTEKRKKRS，KPDSAEPM，NVRCLQHF)或多肽而言，″氨基酸序列同一性百分比(％)″的定義為在序列對齊以及必要時為實現(xiàn)最大百分比序列同一性而引入缺口(gap)后，候選序列中的與特異性肽或多肽序列之間相同的氨基酸殘基所占的百分比。為了測定氨基酸序列同一性百分比的對齊可以通過本領(lǐng)域已知的多種方式實現(xiàn)，例如使用公眾可獲得的計算機軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定適于測量對齊的參數(shù)，包括為實現(xiàn)所比較序列全長范圍的最大對齊所需的任一算法。但是，對于本申請目的而言，氨基酸序列同一性％數(shù)值可以使用序列比較的計算機程序ALIGN-2得到，其中ALIGN-2程序的全部源代碼見下表A。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech，Inc.公司編制，表A中顯示的源代碼已經(jīng)在U.S.CopyrightOffice，WashingtonD.C.，20559中以用戶文件備案，其美國版權(quán)登記號為No.TXU510087。ALIGN-2程序公眾可以從Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California獲取，或者可以用下表A提供的源代碼編程。ALIGN-2程序應(yīng)該編制為可用于UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)字化的UNIXV4.0D。所有序列比較參數(shù)都用ALIGN-2程序設(shè)定，且不改變。在使用ALIGN-2進(jìn)行氨基酸序列比較時，給定的氨基酸序列A與給定的氨基酸序列B之間的氨基酸序列同一性％(也可以表述為給定氨基酸序列A具有或包含與給定氨基酸序列B之間的一定％的氨基酸序列同一性)可以用下列公式計算100乘以X/Y的分?jǐn)?shù)其中X是在A和B程序?qū)R結(jié)果中被序列對齊程序ALIGN-2評分為完全匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，Y為序列B中的氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)該理解的是氨基酸序列A的長度并不等于氨基酸序列B的長度，A相對于B的氨基酸序列同一性％不等于B相對于A的氨基酸序列同一性％。除非另外專門說明，本申請中使用的所有氨基酸序列同一性％數(shù)值都是用ALIGN-2電腦程序在前段中描述的方法獲得的。表A/*　　*　　*C-C從12升至15　*Z為EQ的平均值　　*B為ND的平均值　　*matchwithstopis_M;stop-stop=0;J(joker)match=0　　*/　　#define_M-8/*valueofamatchwithastop*/　　int_day[26][26]={　　/*ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ*/　　/*A*/{2,0,-2,0,0,-4,1,-1,-1,0,-1,-2,-1,0,_M,1,0,-2,1,1,0,0,-6,0,-3,0},　　/*B*/{0,3,-4,3,2,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,2,_M,-1,1,0,0,0,0,-2,-5,0,-3,1},　　/*C*/{-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4,0,-2,0,-2,-8,0,0,-5},　　/*D*/{0,3,-5,4,3,-6,1,1,-2,0,0,-4,-3,2,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,2},　　/*E*/{0,2,-5,3,4,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,1,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,3},　　/*F*/{-4,-5,-4,-6,-5,9,-5,-2,1,0,-5,2,0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3,0,-1,0,0,7,-5},　　/*G*/{1,0,-3,1,0,-5,5,-2,-3,0,-2,-4,-3,0,_M,-1,-1,-3,1,0,0,-1,-7,0,-5,0},　　/*H*/{-1,1,-3,1,1,-2,-2,6,-2,0,0,-2,-2,2,_M,0,3,2,-1,-1,0,-2,-3,0,0,2},　　/*I*/{-1,-2,-2,-2,-2,1,-3,-2,5,0,-2,2,2,-2,_M,-2,-2,-2,-1,0,0,4,-5,0,-1,-2},　　/*J*/{0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},　　/*K*/{-1,0,-5,0,0,-5,-2,0,-2,0,5,-3,0,1,_M,-1,1,3,0,0,0,-2,-3,0,-4,0},　　/*L*/{-2,-3,-6,-4,-3,2,-4,-2,2,0,-3,6,4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-1,0,2,-2,0,-1,-2},　　/*M*/{-1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0,0,4,6,-2,_M,-2,-1,0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-1},　　/*N*/{0,2,-4,2,1,-4,0,2,-2,0,1,-3,-2,2,_M,-1,1,0,1,0,0,-2,-4,0,-2,1},　　/*O*/{_M,_M,_M，_M,_M,_M，_M，_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,0,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M},　　/*P*/{1,-1,-3,-1,-1,-5,-1,0,-2,0,-1,-3,-2,-1,_M,6,0,0,1,0,0,-1,-6,0,-5,0},　　/*Q*/{0,1,-5,2,2,-5,-1,3,-2,0,1,-2,-1,1,_M,0,4,1,-1,-1,0,-2,-5,0,-4,3},　　/*R*/{-2,0,-4,-1,-1,-4,-3,2,-2,0,3,-3,0,0,_M,0,1,6,0,-1,0,-2,2,0,-4,0},　　/*S*/{1,0,0,0,0,-3,1,-1,-1,0,0,-3,-2,1,_M,1,-1,0,2,1,0,-1,-2,0,-3,0},　　/*T*/{1,0,-2,0,0,-3,0,-1,0,0,0,-1,-1,0,_M,0,-1,-1,1,3,0,0,-5,0,-3,0},　　/*U*/{0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},　　/*V*/{0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4,0,-2,2,2,-2,_M,-1,-2,-2,-1,0,0,4,-6,0,-2,-2},　　/*W*/{-6,-5,-8,-7,-7,0,-7,-3,-5,0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5,2,-2,-5,0,-6,17,0,0,-6},　　/*X*/{0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},<!--SIPO<DPn="15">--><dpn="d15"/>　　/*Y*/{-3,-3,0,-4,-4,7,-5,0,-1,0,-4,-1,-2,-2,_M,-5,-4,-4,-3,-3,0,-2,0,0,10,-4},　　/*Z*/{0,1,-5,2,3,-5,0,2,-2,0,0,-2,-1,1,_M,0,3,0,0,0,0,-2,-6,0,-4,4}　　};　　/*　　*/　　#include＜stdio.h＞　　#include＜ctype.h＞　　#defineMAXJMP16/*maxjumpsinadiag*/　　#defineMAXGAP24/*don′tcontinuetopenalizegapslargerthanthis*/　　#defineJMPS1024/*maxjmpsinanpath*/　　#defineMX4/*saveifthere′satleastMX-1basessincelastjmp*/　　#defineDMAT3/*valueofmatchingbases*/　　#defineDMIS0/*penaltyformismatchedbases*/　　#defineDINS08/*penaltyforagap*/　　#defineDINS11/*penaltyperbase*/　　#definePINS08/*penaltyforagap*/　　#definePINS14/*penaltyperresidue*/　　structjmp{　　shortn[MAXJMP];/*sizeofjmp(negfordely)*/　　unsignedshortx[MAXJMP];/*baseno.ofjmpinseqx*/　　};/*limitsseqto2^16-1*/　　structdiag{　　intscore;/*scoreatlastjmp*/　　longoffset;/*offsetofprevblock*/　　shortijmp;/*currentjmpindex*/　　structjmpjp;/*listofjmps*/　　};　　structpath{　　intspc;/*numberofleadingspaces*/　　shortn[JMPS];/*sizeofjmp(gap)*/　　intx[JMPS];/*locofjmp(lastelembeforegap)*/　　};<!--SIPO<DPn="16">--><dpn="d16"/>　　char*ofile;/*outputfilename*/　　char*namex[2];/*seqnames:getseqs()*/　　char*prog;/*prognameforerrmsgs*/　　char*seqx[2];/*seqs:getseqs()*/　　intdmax;/*bestdiag:nw()*/　　intdmax0;/*finaldiag*/　　intdna;/*setifdna:main()*/　　intendgaps;/*setifpenalizingendgaps*/　　intgapx,gapy;/*totalgapsinseqs*/　　intlen0,len1;/*seqlens*/　　intngapx,ngapy;/*totalsizeofgaps*/　　intsmax;/*maxscore:nw()*/　　int*xbm;/*bitmapformatching*/　　longoffset;/*currentoffsetinjmpfile*/　　structdiag*dx;/*holdsdiagonals*/　　structpathpp[2];/*holdspathforseqs*/　　char*calloc(),*malloc(),*index(),*strcpy();　　char*getseq(),*g_calloc();　　/*Needleman-Wunschalignmentprogram　　*　　*usage:progsfile1file2*其中file1和file2是兩個dna或兩個蛋白質(zhì)序列。*序列可以大寫或小寫或者也可以大小寫同時使用*用′;′,′>′或′<′開頭的任一行都被忽略*最大filelength為65535(limitedbyunsignedshortxinthejmpstruct)*其1/3或更多的單元為ACGTU的序列判定為DNA*Outputisinthefile"align.out"　　*　　*Theprogrammaycreateatmpfilein/tmptoholdinfoabouttraceback.　　*OriginalversiondevelopedunderBSD4.3onavax8650　　*/　　#include"nw.h"　　#include"day.h"　　static_dbval[26]={<!--SIPO<DPn="17">--><dpn="d17"/>　　1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0　　};　　static_pbval[26]={　　1,2|(1＜＜(′D′-′A′))|(1＜＜(′N′-′A′)),4,8,16,32,64,　　128,256,0xFFFFFFF,1＜＜10,1＜＜11,1＜＜12,1＜＜13,1＜＜14,　　1＜＜15,1＜＜16,1＜＜17,1＜＜18,1＜＜19,1＜＜20,1＜＜21,1＜＜22,　　1＜＜23,1＜＜24,1＜＜25|(1＜＜(′E′-′A′))|(1＜＜(′Q′-′A′))　　};　　main(ac,av)　　main　　intac;　　char*av[];　　{　　prog=av;　　if(ac!=3){　　fprintf(stderr,"usage:%sfile1file2\n",prog);　　fprintf(stderr,"wherefile1andfile2aretwodnaortwoproteinsequences.\n");　　fprintf(stderr,"Thesequencescanbeinupper-orlower-case\n");　　fprintf(stderr,"Anylinesbeginningwith′;′or′＜′areignored\n");　　fprintf(stderr,"Outputisinthefile\"align.out\"\n");　　exit(1);　　}　　namex=av[1];　　namex[1]=av[2];　　seqx=getseq(namex,&amp;len0);　　seqx[1]=getseq(namex[1],&amp;len1);　　xbm=(dna)_dbval:_pbval;　　endgaps=0;/*1topenalizeendgaps*/　　ofile="align.out";/*outputfile*/　　nw();/*fillinthematrix,getthepossiblejmps*/　　readjmps();/*gettheactualjmps*/　　print();/*printstats,alignment*/　　cleanup(0);/*unlinkanytmpfiles*/<!--SIPO<DPn="18">--><dpn="d18"/>　　}　　/*dothealignment,returnbestscore:main()　　*dna:valuesinFitchandSmith,PNAS,80,1382-1386,1983　　*pro:PAM250values　　*Whenscoresareequal,weprefermismatchestoanygap,prefer　　*anewgaptoextendinganongoinggap,andpreferagapinseqx　　*toagapinseqy.　　*/　　nw()　　nw　　{　　char*px,*py;/*seqsandptrs*/　　int*ndely,*dely;/*keeptrackofdely*/　　intndelx,delx;/*keeptrackofdelx*/　　int*tmp;/*forswappingrow0,row1*/　　intmis;/*scoreforeachtype*/　　intins0,ins1;/*insertionpenalties*/　　registerid;/*diagonalindex*/　　registerij;/*jmpindex*/　　register*col0,*col1;/*scoreforcurr,lastrow*/　　registerxx,yy;/*indexintoseqs*/　　dx=(structdiag*)g_calloc("togetdiags",len0+len1+1,sizeof(structdiag));　　ndely=(int*)g_calloc("togetndely",len1+1,sizeof(int));　　dely=(int*)g_calloc("togetdely",len1+1,sizeof(int));　　col0=(int*)g_calloc("togetcol0",len1+1,sizeof(int));　　col1=(int*)g_calloc("togetcol1",len1+1,sizeof(int));　　ins0=(dna)DINS0:PINS0;　　ins1=(dna)DINS1:PINS1;　　smax=-10000;　　if(endgaps){　　for(col0=dely=-ins0,yy=1;yy＜=len1;yy++){　　col0[yy]=dely[yy]=col0[yy-1]-ins1;　　ndely[yy]=yy;　　}<!--SIPO<DPn="19">--><dpn="d19"/>　　col0=0;/*WatermanBullMathBiol84*/　　}　　else　　for(yy=1;yy＜=len1;yy++)　　dely[yy]=-ins0;　　/*fillinmatchmatrix　　*/　　for(px=seqx,xx=1;xx＜=len0;px++,xx++){　　/*initializefirstentryincol　　*/if(endgaps){　　if(xx==1)　　col1=delx=-(ins0+ins1);　　else　　col1=delx=col0-ins1;　　ndelx=xx;　　}else{　　col1=0;　　delx=-ins0;　　ndelx=0;　　}　　...nwfor(py=seqx[1],yy=1;yy＜=len1;py++,yy++){　　mis=col0[yy-1];　　if(dna)　　mis+=(xbm[*px-′A′]&amp;xbm[*py-′A′])DMAT:DMIS;　　else　　mis+=_day[*px-′A′][*py-′A′];　　/*updatepenaltyfordelinxseq;　　*favornewdeloverongongdel　　*ignoreMAXGAPifweightingendgaps　　*/<!--SIPO<DPn="20">--><dpn="d20"/>　　if(endgaps||ndely[yy]＜MAXGAP){　　if(col0[yy]-ins0＞=dely[yy]){　　dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);　　ndely[yy]=1;　　}else{　　dely[yy]-=ins1;　　ndely[yy]++;　　}　　}else{　　if(col0[yy]-(ins0+ins1)＞=dely[yy]){　　dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);　　ndely[yy]=1;　　}else　　ndely[yy]++;　　}　　/*updatepenaltyfordelinyseq;　　*favornewdeloverongongdel　　*/　　if(endgaps||ndelx＜MAXGAP){　　if(col1[yy-1]-ins0＞=delx){　　delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1);　　ndelx=1;　　}else{　　delx-=ins1;　　ndelx++;　　}　　}else{　　if(col1[yy-1]-(ins0+ins1)＞=delx){　　delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1);　　ndelx=1;　　}else　　ndelx++;　　}　　/*pickthemaximumscore;we′refavoring　　*misoveranydelanddelxoverdely　　*/<!--SIPO<DPn="21">--><dpn="d21"/>　　...nw　　id=xx-yy+len1-1;　　if(mis＞=delx&amp;&amp;mis＞=dely[yy])　　col1[yy]=mis;　　elseif(delx＞=dely[yy]){　　col1[yy]=delx;　　ij=dx[id].ijmp;　　if(dx[id].jp.n&amp;&amp;(!dna||(ndelx＞=MAXJMP　　&amp;&amp;xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){　　dx[id].ijmp++;　　if(++ij＞=MAXJMP){　　writejmps(id);　　ij=dx[id].ijmp=0;　　dx[id].offset=offset;　　offset+=sizeof(structjmp)+sizeof(offset);　　}　　}　　dx[id].jp.n[ij]=ndelx;　　dx[id].jp.x[ij]=xx;　　dx[id].score=delx;　　}　　else{　　col1[yy]=dely[yy];　　ij=dx[id].ijmp;　　if(dx[id].jp.n&amp;&amp;(!dna||(ndely[yy]＞=MAXJMP　　&amp;&amp;xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){　　dx[id].ijmp++;　　if(++ij＞=MAXJMP){　　writejmps(id);　　ij=dx[id].ijmp=0;　　dx[id].offset=offset;　　offset+=sizeof(structjmp)+sizeof(offset);　　}　　}　　dx[id].jp.n[ij]=-ndely[yy];<!--SIPO<DPn="22">--><dpn="d22"/>　　dx[id].jp.x[ij]=xx;　　dx[id].score=dely[yy];　　}　　if(xx==len0&amp;&amp;yy＜len1){　　/*lastcol　　*/　　if(endgaps)　　col1[yy]-=ins0+ins1*(len1-yy);　　if(col1[yy]>smax){　　smax=col1[yy];　　dmax=id;　　}　　}　　}　　if(endgaps&amp;&amp;xx＜len0)　　col1[yy-1]-=ins0+ins1*(len0-xx);　　if(col1[yy-1]＞smax){　　smax=col1[yy-1];　　dmax=id;　　}　　tmp=col0;col0=col1;col1=tmp;　　}　　(void)free((char*)ndely);　　(void)free((char*)dely);　　(void)free((char*)col0);　　(void)free((char*)col1);}　　/*　　*　　*print()--onlyroutinevisibleoutsidethismodule　　*　　*static:　　*getmat()--tracebackbestpath,countmatches:print()　　*pr_align()--printalignmentofdescribedinarrayp[]:print()　　*dumpblock()--dumpablockoflineswithnumbers,stars:pr_align()　　*nums()--putoutanumberline:dumpblock()　　*putline()--putoutaline(name,[num],seq,[num]):dumpblock()　　*stars()--putalineofstars:dumpblock()<!--SIPO<DPn="23">--><dpn="d23"/>　　*stripname()--stripanypathandprefixfromaseqname　　*/　　#include"nw.h"　　#defineSPC3　　#defineP_LINE256/*maximumoutputline*/　　#defineP_SPC3/*spacebetweennameornumandseq*/　　extern_day[26][26];　　intolen;/*setoutputlinelength*/　　FILE*fx;/*outputfile*/　　print()　　print　　{　　intlx,ly,firstgap,lastgap;/*overlap*/　　if((fx=fopen(ofile,"w"))==0){　　fprintf(stderr,"%s:can′twrite%s\n",prog,ofile);　　cleanup(1);　　}　　fprintf(fx,"＜firstsequence:%s(length=%d)\n",namex,len0);　　fprintf(fx,"＜secondsequence:%s(length=%d)\n",namex[1],len1);　　olen=60;　　lx=len0;　　ly=len1;　　firstgap=lastgap=0;　　if(dmax＜len1-1){/*leadinggapinx*/　　pp.spc=firstgap=len1-dmax-1;　　ly-=pp.spc;　　}　　elseif(dmax＞len1-1){/*leadingggapiny*/　　pp[1].spc=firstgap=dmax-(len1-1);　　lx-=pp[1].spc;　　}　　if(dmax0＜len0-1){/*trailinggapinx*/　　lastgap=len0-dmax0-1;<!--SIPO<DPn="24">--><dpn="d24"/>　　lx-=lastgap;　　}　　elseif(dmax0＞len0-1){/*trailinggapiny*/　　lastgap=dmax0-(len0-1);　　ly-=lastgap;　　}　　getmat(lx,ly,firstgap,lastgap);　　pr_align();　　}　　/*　　*tracebackthebestpath,countmatches　　*/　　static　　getmat(lx,ly,firstgap,lastgap)　　getmat　　intlx,ly;/*"core"(minusendgaps)*/　　intfirstgap,lastgap;/*leadingtrailingoverlap*/　　{　　intnm,i0,i1,siz0,siz1;　　charoutx[32];　　doublepct;　　registern0,n1;　　registerchar*p0,*p1;　　/*gettotalmatches,score　　*/　　i0=i1=siz0=siz1=0;　　p0=seqx+pp[1].spc;　　p1=seqx[1]+pp.spc;　　n0=pp[1].spc+1;　　n1=pp.spc+1;　　nm=0;　　while(*p0&amp;&amp;*p1){　　if(siz0){　　p1++;　　n1++;<!--SIPO<DPn="25">--><dpn="d25"/>　　siz0--;　　}　　elseif(siz1){　　p0++;　　n0++;　　siz1--;　　}　　else{　　if(xbm[*p0-′A′]&amp;xbm[*p1-′A′])　　nm++;　　if(n0++==pp.x[i0])　　siz0=pp.n[i0++];　　if(n1++==pp[1].x[i1])　　siz1=pp[1].n[i1++];　　p0++;　　p1++;　　}　　}　　/*pcthomology:　　*ifpenalizingendgaps,baseistheshorterseq　　*else,knockoffoverhangsandtakeshortercore　　*/　　if(endgaps)　　lx=(len0＜len1)len0:len1;　　else　　lx=(lx＜ly)lx:ly;　　pct=100.*(double)nm/(double)lx;　　fprintf(fx,"\n");　　fprintf(fx,"＜%dmatch%sinanoverlapof%d:%.2fpercentsimilarity\n",　　nm,(nm==1)"":"es",lx,pct);　　fprintf(fx,"＜gapsinfirstsequence:%d",gapx);...getmat　　if(gapx){　　(void)sprintf(outx,"(%d%s%s)",　　ngapx,(dna)"base":"residue",(ngapx==1)"":"s");<!--SIPO<DPn="26">--><dpn="d26"/>　　fprintf(fx,"%s",outx);　　fprintf(fx,",gapsinsecondsequence:%d",gapy);　　if(gapy){　　(void)sprintf(outx,"(%d%s%s)",　　ngapy,(dna)"base":"residue",(ngapy==1)"":"s");　　fprintf(fx,"%s",outx);　　}　　if(dna)　　fprintf(fx,　　"\n＜score:%d(match=%d,mismatch=%d,gappenalty=%d+%dperbase)\n",　　smax,DMAT,DMIS,DINS0,DINS1);　　else　　fprintf(fx,　　"\n＜score:%d(DayhoffPAM250matrix,gappenalty=%d+%dperresidue)\n",　　smax,PINS0,PINS1);　　if(endgaps)　　fprintf(fx,　　"＜endgapspenalized.leftendgap:%d%s%s,rightendgap:%d%s%s\n",　　firstgap,(dna)"base":"residue",(firstgap==1)"":"s",　　lastgap,(dna)"base":"residue",(lastgap==1)"":"s");　　else　　fprintf(fx,"＜endgapsnotpenalized\n");　　}　　staticnm;/*matchesincore--forchecking*/　　staticlmax;/*lengthsofstrippedfilenames*/　　staticij[2];/*jmpindexforapath*/　　staticnc[2];/*numberatstartofcurrentline*/　　staticni[2];/*currentelemnumber--forgapping*/　　staticsiz[2];　　staticchar*ps[2];/*ptrtocurrentelement*/　　staticchar*po[2];/*ptrtonextoutputcharslot*/　　staticcharout[2][P_LINE];/*outputline*/　　staticcharstar[P_LINE];/*setbystars()*/　　/*　　*printalignmentofdescribedinstructpathpp[]<!--SIPO<DPn="27">--><dpn="d27"/>　　*/　　static　　pr_align()　　pr_align　　{　　intnn;/*charcount*/　　intmore;　　registeri;　　for(i=0,1max=0;i＜2;i++){　　nn=stripname(namex[i]);　　if(nn＞lmax)　　lmax=nn;　　nc[i]=1;　　ni[i]=1;　　siz[i]=ij[i]=0;　　ps[i]=seqx[i];　　po[i]=out[i];}　　for(nn=nm=0,more=1;more;)　　{...pr_align　　for(i=more=0;i＜2;i++){　　/*　　*dowehavemoreofthissequence　　*/　　if(!*ps[i])　　continue;　　more++;　　if(pp[i].spc){/*leadingspace*/　　*po[i]++=′′;　　pp[i].spc--;　　}　　elseif(siz[i]){/*inagap*/　　*po[i]++=′-′;<!--SIPO<DPn="28">--><dpn="d28"/>　　siz[i]--;　　}　　else{/*we′reputtingaseqelement　　*/　　*po[i]=*ps[i];　　if(islower(*ps[i]))　　*ps[i]=toupper(*ps[i]);　　po[i]++;　　ps[i]++;　　/*　　*areweatnextgapforthisseq　　*/　　if(ni[i]==pp[i].x[ij[i]]){　　/*　　*weneedtomergeallgaps　　*atthislocation　　*/　　siz[i]=pp[i].n[ij[i]++];　　while(ni[i]==pp[i].x[ij[i]])　　siz[i]+=pp[i].n[ij[i]++];　　}ni[i]++;　　}　　}　　if(++nn==olen||!more&amp;&amp;nn){　　dumpblock();　　for(i=0;i＜2;i++)　　po[i]=out[i];　　nn=0;　　}　　}　　}　　/*　　*dumpablockoflines,includingnumbers,stars:pr_align()　　*/　　static<!--SIPO<DPn="29">--><dpn="d29"/>　　dumpblock()　　dumpblock　　{　　registeri;　　for(i=0;i＜2;i++)　　*po[i]--=′\0′;　　...dumpblock　　(void)putc(′\n′,fx);　　for(i=0;i＜2;i++){　　if(*out[i]&amp;&amp;(*out[i]！=′′||*(po[i])！=′′)){　　if(i==0)　　nums(i);　　if(i==0&amp;&amp;*out[1])　　stars();　　putline(i);　　if(i==0&amp;&amp;*out[1])　　fprintf(fx,star);　　if(i==1)　　nums(i);　　}　　}　　}　　/*　　*putoutanumberline:dumpblock()　　*/　　static　　nums(ix)　　nums　　intix;/*indexinout[]holdingseqline*/　　{　　charnline[P_LINE];　　registeri,j;　　registerchar*pn,*px,*py;<!--SIPO<DPn="30">--><dpn="d30"/>　　for(pn=nline,i=0;i＜1max+P_SPC;i++,pn++)　　*pn=′′;　　for(i=nc[ix],py=out[ix];*py;py++,pn++){　　if(*py==′′||*py==′-′)　　*pn=′′;　　else{　　if(i%10==0||(i==1&amp;&amp;nc[ix]!=1)){　　j=(i＜0)-i:i;　　for(px=pn;j;j/=10,px--)　　*px=j%10+′0′;　　if(i＜0)　　*px=′-′;　　}　　else　　*pn=′′;　　i++;　　}　　}　　*pn=′\0′;　　nc[ix]=i;　　for(pn=nline;*pn;pn++)　　(void)putc(*pn,fx);　　(void)putc(′\n′,fx);　　}　　/*　　*putoutaline(name,[num],seq,[num]):dumpblock()　　*/　　static　　putline(ix)　　putline　　intix;{　　...putline　　inti;　　registerchar*px;<!--SIPO<DPn="31">--><dpn="d31"/>　　for(px=namex[ix],i=0;*px&amp;&amp;*px!=′:′;px++,i++)　　(void)putc(*px,fx);　　for(;i＜lmax+P_SPC;i++)　　(void)putc(′′,fx);　　/*thesecountfrom1:　　*ni[]iscurrentelement(from1)　　*nc[]isnumberatstartofcurrentline　　*/　　for(px=out[ix];*px;px++)　　(void)putc(*px&amp;0x7F,fx);　　(void)putc(′\n′,fx);　　}　　/*　　*putalineofstars(seqsalwaysinout,out[1]):dumpblock()　　*/　　static　　stars()　　stars　　{　　inti;　　registerchar*p0,*p1,cx,*px;　　if(!*out||(*out==′′&amp;&amp;*(po)==′′)||　　!*out[1]||(*out[1]==′′&amp;&amp;*(po[1])==′′))　　return;　　px=star;　　for(i=lmax+P_SPC;i;i--)　　*px++=′′;　　for(p0=out,p1=out[1];*p0&amp;&amp;*p1;p0++,p1++){　　if(isalpha(*p0)&amp;&amp;isalpha(*p1)){　　if(xbm[*p0-′A′]&amp;xbm[*p1-′A′]){　　cx=′*′;　　nm++;<!--SIPO<DPn="32">--><dpn="d32"/>　　}　　elseif(!dna&amp;&amp;_day[*p0-′A′][*p1-′A′]＞0)　　cx=′.′;　　else　　cx=′′;　　}　　else　　cx=′′;　　*px++=cx;　　}　　*px++=′\n′;　　*px=′\0′;　　}　　/*　　*strippathorprefixfrompn,returnlen:pr_align()　　*/　　static　　stripname(pn)　　stripname　　char*pn;/*filename(maybepath)*/　　{　　registerchar*px,*py;　　py=0;　　for(px=pn;*px;px++)　　if(*px==′/′)　　py=px+1;　　if(py)　　(void)strcpy(pn,py);　　return(strlen(pn));　　}　　/*　　*cleanup()--cleanupanytmpfile<!--SIPO<DPn="33">--><dpn="d33"/>　　*getseq()--readinseq,setdna,len,maxlen　　*g_calloc()--calloc()witherrorcheckin　　*readjmps()--getthegoodjmps,fromtmpfileifnecessary　　*writejmps()--writeafilledarrayofjmpstoatmpfile:nw()　　*/　　#include"nw.h"　　#include＜sys/file.h＞　　char*jname="/tmp/homgXXXXXX";/*tmpfileforjmps*/　　FILE*fj;　　intcleanup();/*cleanuptmpfile*/　　longlseek();　　/*　　*removeanytmpfileifweblow　　*/　　cleanup(i)　　cleanup　　inti;　　{　　if(fj)　　(void)unlink(jname);　　exit(i);　　}　　/*　　*read,returnptrtoseq,setdna,len,maxlen　　*skiplinesstartingwith′;′,′＜′,or′＞′　　*seqinupperorlowercase　　*/　　char*　　getseq(file,len)　　getseq　　char*file;/*filename*/　　int*len;/*seqlen*/　　{　　charline[1024],*pseq;<!--SIPO<DPn="34">--><dpn="d34"/>　　registerchar*px,*py;　　intnatgc,tlen;　　FILE*fp;　　if((fp=fopen(file,"r"))==0){　　fprintf(stderr,"%s:can′tread%s\n",prog,file);　　exit(1);　　}　　tlen=natgc=0;　　while(fgets(line,1024,fp)){　　if(*line==′;′||*line==′＜′||*line==′＞′)　　continue;　　for(px=line;*px!=′\n′;px++)　　if(isupper(*px)||islower(*px))　　tlen++;　　}　　if((pseq=malloc((unsigned)(tlen+6)))==0){　　fprintf(stderr,"%s:malloc()failedtoget%dbytesfor%s\n",prog,tlen+6,file);　　exit(1);　　}　　pseq=pseq[1]=pseq[2]=pseq[3]=′\0′;　　...getseq　　py=pseq+4;　　*len=tlen;　　rewind(fp);　　while(fgets(line,1024,fp)){　if(*line==′;′||*line==′＜′||*line==′＞′)　　continue;　　for(px=line;*px!=′\n′;px++){　　if(isupper(*px))　　*py++=*px;　　elseif(islower(*px))　　*py++=toupper(*px);　　if(index("ATGCU",*(py-1)))　　natgc++;<!--SIPO<DPn="35">--><dpn="d35"/>　　}　　}　　*py++=′\0′;　　*py=′\0′;　　(void)fclose(fp);　　dna=natgc＞(tlen/3);　　return(pseq+4);　　}　　char*　　g_calloc(msg,nx,sz)　　g_calloc　　char*msg;/*program,callingroutine*/　　intnx,sz;/*numberandsizeofelements*/　　{　　char*px,*calloc();　　if((px=calloc((unsigned)nx,(unsigned)sz))==0){　　if(*msg){　　fprintf(stderr,"%s:g_calloc()failed%s(n=%d,sz=%d)\n",prog,msg,nx,sz);　　exit(1);　　}　　}　　return(px);　　}　　/*　　*getfinaljmpsfromdx[]ortmpfile,setpp[],resetdmax:main()　　*/　　readjmps()　　readjmps　　{　　intfd=-1;　　intsiz,i0,i1;　　registeri,j,xx;　　if(fj){　　(void)fclose(fj);<!--SIPO<DPn="36">--><dpn="d36"/>　　if((fd=open(jname,O_RDONLY,0))＜0){　　fprintf(stderr,"%s:can′topen()%s\n",prog,jname);　　cleanup(1);　　}　　}　　for(i=i0=i1=0,dmax0=dmax,xx=len0;;i++){　　while(1){　　for(j=dx[dmax].ijmp;j＞=0&amp;&amp;dx[dmax].jp.x[j]＞=xx;j--)　　;　　...readjmps　　if(j＜0&amp;&amp;dx[dmax].offset&amp;&amp;fj){　　(void)lseek(fd,dx[dmax].offset,0);　　(void)read(fd,(char*)&amp;dx[dmax].jp,sizeof(structjmp));　　(void)read(fd,(char*)&amp;dx[dmax].offset,sizeof(dx[dmax].offset));　　dx[dmax].ijmp=MAXJMP-1;　　}　　else　　break;　　}　　if(i＞=JMPS){　　fprintf(stderr,"%s:toomanygapsinalignment\n",prog);　　cleanup(1);　　}　　if(j＞=0){　　siz=dx[dmax].jp.n[j];　　xx=dx[dmax].jp.x[j];　　dmax+=siz;　　if(siz＜0){/*gapinsecondseq*/　　pp[1].n[i1]=-siz;　　xx+=siz;　　/*id=xx-yy+len1-1　　*/　　pp[1].x[i1]=xx-dmax+len1-1'　　gapy++;　　ngapy-=siz;　　/*ignoreMAXGAPwhendoingendgaps*/<!--SIPO<DPn="37">--><dpn="d37"/>　　siz=(-siz＜MAXGAP||endgaps)-siz:MAXGAP;　　i1++;　　}　　elseif(siz＞0){/*gapinfirstseq*/　　pp.n[i0]=siz;　　pp.x[i0]=xx;　　gapx++;　　ngapx+=siz;　　/*ignoreMAXGAPwhendoingendgaps*/　　siz=(siz＜MAXGAP||endgaps)siz:MAXGAP;　　i0++;　　}　　}　　else　　break;　　}　　/*reversetheorderofjmps　　*/　　for(j=0,i0--;j＜i0;j++,i0--){　　i=pp.n[j];pp.n[j]=pp.n[i0];pp.n[i0]=i;　　i=pp.x[j];pp.x[j]=pp.x[i0];pp.x[i0]=i;　　}　　for(j=0,i1--;j＜i1;j++,i1--){　　i=pp[1].n[j];pp[1].n[j]=pp[1].n[i1];pp[1].n[i1]=i;　　i=pp[1].x[j];pp[1].x[j]=pp[1].x[i1];pp[1].x[i1]=i;　　}　　if(fd＞=0)　　(void)close(fd);　　if(fj){　　(void)unlink(jname);　　fj=0;　offset=0;　　}}　　/*　　*writeafilledjmpstructoffsetoftheprevone(ifany):nw()<!--SIPO<DPn="38">--><dpn="d38"/>　　*/　　writejmps(ix)　　writejmps　　intix;　　{　　char*mktemp();　　if(!fj){　　if(mktemp(jname)＜0){　　fprintf(stderr,"%s:can′tmktemp()%s\n",prog,jname);　　cleanup(1);　　}　　if((fj=fopen(jname,"w"))==0){　　fprintf(stderr,"%s:can′twrite%s\n",prog,jname);　　exit(1);　　}　　}　　(void)fwrite((char*)&amp;dx[ix].jp,sizeof(structjmp),1,fj);　　(void)fwrite((char*)&amp;dx[ix].offset,sizeof(dx[ix].offset),1,fj);在本申請中術(shù)語″載體″，是指一種能夠輸送與其連接在一起的另一種核酸的核酸分子。載體的一種類型是″質(zhì)?！?，是指一種可以接入其他DNA節(jié)段的環(huán)狀雙股脫氧核糖核酸環(huán)。另一類型載體是噬菌體載體。另一類型載體是一種病毒載體，其中可以將其他的脫氧核糖核酸連接入該病毒的基因組。一些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞內(nèi)自動復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和游離的哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離的哺乳動物載體)當(dāng)導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞時可以整合入宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主基因組一同復(fù)制。另外，一些載體能指導(dǎo)可操作地連接于其上的基因的表達(dá)。本申請中所述的載體可稱為″重組表達(dá)載體″(或簡稱″重組載體″)。一般而言，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒形式。本申請中，“質(zhì)粒”和“載體”可以交互使用，因為質(zhì)粒是載體的最常見形式?！岸嗪塑账帷焙汀昂怂帷痹诒旧暾堉锌梢越换ナ褂茫侵溉我婚L度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者可以通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)引入聚合物的任一取代物。多核苷酸可以包括經(jīng)過修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在所述聚合物裝配之前或之后加入。所述核苷酸序列可以被非-核苷酸組分阻斷。多核苷酸還可以在合成后修飾，例如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其他類型的修飾包括，例如，″帽子″，將一個或多個天然生成核苷酸用類似物取代，核苷酸之間修飾例如，含不帶電連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidates)，氨基甲酸酯，等)和含帶電連接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)的修飾，含有附加基元，例如，蛋白質(zhì)(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-賴氨酸，等)的修飾，帶有嵌入劑(例如，吖啶，補骨脂素，等)的修飾，含有螯合劑(例如，金屬，放射性金屬，硼，氧化的金屬等)的修飾，含有烷化劑(alkylators)的修飾，帶有經(jīng)修飾連接(例如，α端基異構(gòu)核酸(anomericnucleicacid)，等)的修飾，以及未經(jīng)修飾形式的多核苷酸。另外，通常出現(xiàn)于糖類的任一羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團、磷酸(phosphate)基團取代，用常見保護基保護，或者經(jīng)過活化制備與其他核苷酸間的其他連接，或者可以偶聯(lián)至固相或半固相支持物。5′和3′末端的OH可以用長度為1-20個碳原子的胺或有機封端基團(organiccappinggroup)磷酸化或取代。另外還可以將其他羥基衍生至常規(guī)的保護基。多核苷酸還可以含有本領(lǐng)域普遍已知的核糖或脫氧核糖糖類的類似形式，包括，例如，2′-氧-甲基，2′-氧-烯丙基，2′-烯丙基-，2′-氟-或2′-疊氮基核糖，碳環(huán)形的糖類似物，α-端基異構(gòu)糖，差向立體異構(gòu)糖例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，非環(huán)形的類似物以及脫堿基的核苷類似物例如甲基核糖核苷。可以用其他連接基團替代一個或多個磷酸二酯鍵。這些其他的連接基團包括但不限于這樣的實例，其中磷酸酯基被P(O)S(″硫代酸酯基(thioate)″)，P(S)S(″二硫代酸酯基(dithioate)″)，″(O)NR2(″酰胺基團(amidate)″)，P(O)R，P(O)OR′，COCH2(″formacetal″)替代，其中R或R′各自獨立地為H或者取代或未被取代的烷基(1-20個C)，任選含有醚(-O-)鍵、芳香基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基(cycloalkenyl)或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。上述描述適用于所有本申請所述多核苷酸，包括RNA及DNA。在本申請中“寡核苷酸”通常是指單鏈，一般為合成的多核苷酸，其長度往往但非一定小于約200個核苷酸。術(shù)語″寡核苷酸″和″多核苷酸″互不排斥。上述對多核苷酸的描述同樣且完全適合于寡核苷酸。在本申請中，除非另有特別說明或者據(jù)上下文明顯看出外，術(shù)語“肝細(xì)胞生長因子”或“HGF”是指任一天然的或變體(其中包括天然生成的或合成的)HGF多肽，其能在允許該反應(yīng)發(fā)生的條件下活化HGF/c-met信號傳導(dǎo)途徑。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”廣義上可以交互使用，包括單克隆抗體(例如，全長或者完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如，迄今為止能表現(xiàn)預(yù)期生物活性的雙特異性抗體)以及抗體片段?？贵w可以是人抗體、人源化抗體和/或親和力成熟(affinitymatured)抗體?！翱贵w片段”只含有完整抗體的一部分，其中所述的部分優(yōu)選保留了當(dāng)其正常情況下存在于完整抗體時與其相關(guān)功能中的至少一種，優(yōu)選多種或全部。一個實施方案中，抗體片段含有完整抗體的抗原結(jié)合位點，因此保留了結(jié)合抗原的能力。另一個實施方案中，抗體片段，例如其中含有Fc區(qū)的抗體片段，保留了當(dāng)正常情況下存在于完整抗體中的與Fc區(qū)相關(guān)生物學(xué)功能中的至少一種，例如與FcRn結(jié)合，抗體半衰期調(diào)節(jié)，ADCC功能及補體結(jié)合功能。在本申請中術(shù)語″單克隆抗體″是指獲自基本均一的抗體群體的抗體，即，除了可能有的極少量天然發(fā)生的突變外，組成所述群的抗體個體都完全相同。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一的抗原。另外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，每一種單克隆抗體都只針對所述抗原上的單一決定簇。本申請中所述的單克隆抗體具體性地包括″嵌合″抗體，其中重鏈和/或輕鏈中的一部分與源自一個特定物種或者屬于一個特定抗體類或亞類的抗體的對應(yīng)序列等同或同源，其中重鏈和/或輕鏈中的其余部分與源自另一特定物種或者屬于另一特定抗體類或亞類的抗體的對應(yīng)序列等同或同源，以及所述抗體的片段，只要它們具有預(yù)期的生物活性即可(美國專利No.4,816,567；和Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851-6855(1984))。非-人(例如，鼠的)抗體的“人源化”形式是含有最小限度的源自非-人免疫球蛋白序列的嵌合抗體。大部分來說，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受抗體)，其中該接受抗體的高變區(qū)被來自非-人物種的高變區(qū)(供體抗體)的殘基所取代，例如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類，所述來自非-人物種的高變區(qū)具有期望的特異性、親和力、和能力(capacity)。在一些情況下，人免疫球蛋白的骨架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非-人殘基替代。另外，人源化抗體還可以包含在接受抗體或提供抗體中都未發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾進(jìn)一步地優(yōu)化了抗體的性能。通常，所述人源化抗體都基本上包含至少一個，通常為兩個可變區(qū)，其中的全部或者基本上全部的高變環(huán)出自非-人免疫球蛋白，而全部或基本上全部的骨架區(qū)(FR)為人免疫球蛋白序列。另外，所述人源化抗體還任選包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白恒定區(qū)。詳細(xì)內(nèi)容，參見Jonesetal.，Nature321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature332323-329(1988)；andPresta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。另外還可參見下列綜述及本申請中所引參考文獻(xiàn)VaswaniandHamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions231035-1038(1995)；HurleandGross，Curr.Op.Biotech.5428-433(1994)。“人的抗體”是指這樣的抗體，其具有的氨基酸序列對應(yīng)于通過人制備的和/或使用本申請中公開的用于制備人抗體的任一技術(shù)制備的抗體。人的抗體這一定義專門將含有非-人抗原-結(jié)合殘基的人源化抗體排除出去?！坝H和力成熟”抗體是指一個或多個CDRs中有一處或多處變化的抗體，變化導(dǎo)致該抗體的抗原親和力提高，與不含這些變化的親本抗體相比。優(yōu)選的親和力成熟抗體具有納摩爾或者甚至皮摩爾的目標(biāo)抗原親和力。親和力成熟抗體可以用本領(lǐng)域已知的方法制備。Marksetal.Bio/Technology10779-783(1992)描述了通過VH及VL結(jié)構(gòu)域改組(shuffling)的親和力成熟。CDR和/或骨架殘基的隨機誘變的描述見Barbasetal.ProcNat.Acad.Sci，USA913809-3813(1994)；Schieretal.Gene169147-155(1995)；Yeltonetal.J.Immunol.1551994-2004(1995)；Jacksonetal.，J.Immunol.154(7)3310-9(1995)；andHawkinsetal，J.Mol.Biol.226889-896(1992)。術(shù)語“拮抗劑”在本申請中取其最廣含義，包括能部分或完全封閉、抑制或中和其靶標(biāo)(例如，c-met)的一種或多種生物學(xué)活性的任一分子。例如，“封閉”抗體或“拮抗劑”抗體是指能抑制或減弱其所結(jié)合抗原(例如，c-met)的生物活性的抗體?！安“Y”是指能從使用本發(fā)明所述物質(zhì)/分子或方法的治療中受益的任一狀況。其中包括慢性和急性的病癥或疾病，包括預(yù)先讓所述哺乳動物患所述病癥的那些病理學(xué)情況。本申請中所治療病癥的非限制性實例包括惡性及良性腫瘤；非-血癌及淋巴的惡性腫瘤；神經(jīng)元的、神經(jīng)膠質(zhì)的、星形膠質(zhì)細(xì)胞的、下丘腦的以及其他腺體的，巨噬細(xì)胞的，上皮的，間質(zhì)的和囊胚腔的病癥；以及炎癥的、免疫學(xué)的及其他的血管生成-相關(guān)病癥。所述術(shù)語″癌癥″和″癌性的″是指或者用來描述通常以無限制的細(xì)胞生長/增殖為特征的哺乳動物生理狀態(tài)。癌癥的實例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤(blastoma)、肉瘤和血癌(leukemia)。所述癌癥的更具體的實例包括鱗狀細(xì)胞癌、小-細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸道癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰道癌、甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌和各種頭頸癌。本申請中的“自體免疫病”是指以自體組織作為攻擊目標(biāo)引發(fā)的非-惡性疾病或病癥。本申請中所述自體免疫疾病專門將惡性的或癌性的疾病或狀況排除在外，尤其要排除B細(xì)胞淋巴瘤、急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、多毛細(xì)胞白血病和慢性成髓細(xì)胞白血病。自體免疫疾病或病癥的實例包括，但不限于，炎性反應(yīng)例如炎性皮膚疾病包括牛皮癬和皮炎(例如特應(yīng)性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥；炎癥性腸病(例如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)相關(guān)反應(yīng)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合征；ARDS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；血管球性腎炎；過敏情況例如濕疹和哮喘及涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎性反應(yīng)的其他情況；動脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；全身性紅斑狼瘡(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病mellitis)；多發(fā)性硬化；Reynaud′s綜合征；自體免疫甲狀腺炎；變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；Sjorgen′s綜合征；青少年型糖尿病；常見于肺結(jié)核、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎的與細(xì)胞因子或T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性及遲發(fā)性過敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答；惡性貧血(Addison’s病)；白細(xì)胞滲出疾?。恢袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥或Coombs陽性貧血)；重癥肌無力；抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)疾??；抗-腎小球基底膜疾??；抗磷脂綜合征；過敏性神經(jīng)炎；Graves’疾??；Lambert-Eaton類重癥肌無力綜合征；pemphigoidbullous；天皰瘡；自體免疫多(種)內(nèi)分泌腺??；Reiter’s疾?。蝗砑娭本C合征(stiff-mansyndrome)；Behcet病；巨細(xì)胞性動脈炎；免疫復(fù)合物性腎炎；IgA腎?。籌gM多神經(jīng)?。幻庖咝匝“鍦p少性紫癜(ITP)或自體免疫血小板減少等等。在本申請中，“治療”是指臨床介入以求改變所治療個體或細(xì)胞的天然過程，并且可以用于預(yù)防或臨床病理學(xué)過程中。治療的預(yù)期效果包括防止疾病的發(fā)生或再發(fā)生，減輕癥狀，消除任一疾病的直接或間接病理結(jié)果，防止轉(zhuǎn)移，延緩病癥發(fā)展速度，改善或緩和疾病狀態(tài)，減輕或改善預(yù)后。一些實施方案中，本發(fā)明所述拮抗劑可用于延緩疾病或病癥發(fā)展?！逵行Я俊迨侵冈谝淮位蛞欢螘r間內(nèi)服用的實現(xiàn)預(yù)期治療或預(yù)防效果所需的量。本發(fā)明所述拮抗劑的治療有效量隨疾病狀況、年齡、性別和個體重量以及拮抗劑激發(fā)個體目的反應(yīng)的能力等因素不同而變化。另外治療有效量還指所述拮抗劑的治療有益效果超過其任一毒性或有害影響的量?！孱A(yù)防有效量″是指以一種或多種劑量方式或在一種段時間內(nèi)施用的實現(xiàn)預(yù)期預(yù)防效果所需的量。通常但非一定，由于預(yù)防劑量是用于疾病早期的受試者，因此預(yù)防有效量小于治療有效量。載體構(gòu)建編碼本申請所述多肽的多核苷酸序列可以使用常規(guī)重組技術(shù)獲得。目的多核苷酸序列可以從合適來源的細(xì)胞中分離并測序。抗體的來源細(xì)胞包括抗體產(chǎn)生細(xì)胞例如雜交瘤細(xì)胞。替代地，多核苷酸可以使用核苷酸合成儀或PCR技術(shù)合成。一旦獲得，將編碼所述多肽的序列插入能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)異源多核苷酸的重組載體。本領(lǐng)域可獲得的和已知的許多載體可用于本發(fā)明。合適載體的選擇主要取決于插入載體中核酸的大小以及該載體預(yù)轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞。每一載體可含有不同元件，取決于其功能(擴增或表達(dá)異源多核苷酸，或者同時擴增和表達(dá))以及其所要駐留的特定宿主細(xì)胞的兼容性。所述載體元件通常包括，但不限于復(fù)制起點(特別是當(dāng)所述載體插入原核細(xì)胞時)，篩選標(biāo)記基因，啟動子，核糖體結(jié)合位點(RBS)，信號序列，所插入的異源核酸以及轉(zhuǎn)錄終止序列。通常，含有復(fù)制子和源自于與宿主細(xì)胞相容的調(diào)控序列的質(zhì)粒載體用于這些所述宿主。所述載體通常帶有復(fù)制位點，以及能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，大腸桿菌通常用pBR322，一種源自大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。pBR322含有編碼氨芐青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，因此能提供用于鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡易方式。pBR322及其衍生物或者其他微生物質(zhì)?；蚴删w還可以含有或者經(jīng)過修飾后含有能夠被用于表達(dá)內(nèi)源蛋白的微生物使用的啟動子。此外，還可以使用含與宿主微生物相容的復(fù)制子及調(diào)控序列的噬菌體載體作為這些宿主的轉(zhuǎn)化載體。例如，噬菌體例如λGEM.TM.-11可用于制備能用于轉(zhuǎn)化敏感宿主細(xì)胞例如大腸桿菌LE392的重組載體。組成型或誘導(dǎo)型啟動子都可用于本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體情況需要選擇。被多種有效宿主細(xì)胞識別的大量啟動子都已為大家所熟知?？梢酝ㄟ^下述操作將所選啟動子可操作地連接于編碼本申請所述多肽的順反子DNA通過限制性內(nèi)切酶消化切除來源于DNA源的啟動子，將分離的啟動子序列插入所選載體。天然啟動子序列和多種異源啟動子都可用于直接擴增和/或表達(dá)靶基因。但是，優(yōu)選異源啟動子，因為與天然目標(biāo)多肽啟動子相比，異源啟動子通常能提供更高的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量。適合于原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、β-galactamase及乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)以及雜合啟動子例如tac或trc啟動子。但是，其他能夠在細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動子(例如其他已知的細(xì)菌或噬菌體啟動子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)公開，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用接頭或銜接子提供任一所需限制酶切位點，將其與編碼目標(biāo)輕鏈和重鏈的順反子可操作地連接在一起(Siebenlistetal.(1980)Cell20269)。一些實施方案中，重組載體中的每一順反子都含有分泌信號序列元件，指導(dǎo)表達(dá)多肽的跨膜易位。通常，所述信號序列可以是所述載體的元件，或者也可以是插入載體的目標(biāo)多肽DNA的一部分。本發(fā)明選用的信號序列應(yīng)該是能夠被宿主細(xì)胞識別并加工(即，被信號肽酶切割)。由于原核宿主細(xì)胞不能識別并處理異源多肽的天然信號序列，所以應(yīng)將該信號序列用例如選自下列的原核信號序列取代堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩(wěn)定性腸毒素II(STII)前導(dǎo)序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。適于表達(dá)多肽的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌和真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用的細(xì)菌的實例包括埃希氏菌屬(例如，大腸埃希氏菌)，芽胞桿菌屬(例如，枯草芽胞桿菌)，腸細(xì)菌屬，假單胞菌各個種類(例如，綠膿桿菌)，鼠傷寒沙門氏菌，Serratiamarcescans，克雷伯氏桿菌屬，變形桿菌屬，志賀氏菌屬，根瘤菌屬，vitreoscilla屬，或副球菌屬。優(yōu)選地，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞應(yīng)該分泌最小量蛋白水解酶，并且也可以根據(jù)需要向細(xì)胞培養(yǎng)物引入其他的蛋白酶抑制因子。多肽產(chǎn)物用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，然后培養(yǎng)于常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基根據(jù)誘導(dǎo)啟動子、篩選轉(zhuǎn)化子或擴增編碼目的序列的基因的需要作適應(yīng)性調(diào)整。轉(zhuǎn)染是指表達(dá)載體被宿主細(xì)胞攝入，而不論任一編碼序列實際上是否表達(dá)。許多轉(zhuǎn)染方法已經(jīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如，CaPO4沉淀和電穿孔。通常，當(dāng)指征該載體運行的任一信號在宿主細(xì)胞中發(fā)生時，可以識別出成功的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化是指將DNA作為染色體外元件或者通過染色體整合體導(dǎo)入原核宿主，從而使得該DNA能夠復(fù)制。根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞，采用適合該細(xì)胞的常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用氯化鈣的鈣處理方法通常用于基本上含有細(xì)胞壁屏障的菌體細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的另一方法可以使用聚乙二醇/DMSO。另外可以使用的技術(shù)為電穿孔。原核宿主細(xì)胞可以培養(yǎng)于適合于培養(yǎng)所選宿主細(xì)胞的任一本領(lǐng)域已知培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基的實例包括添加了必需營養(yǎng)添加劑的luria肉湯(LB)。所述培養(yǎng)基另外還可以含有篩選因子從而選擇性地保證含有表達(dá)載體的原核細(xì)胞的生長，篩選因子根據(jù)表達(dá)載體的構(gòu)成加以選擇。例如用添加了氨芐青霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)氨芐青霉素抗性基因的細(xì)胞。另外，還可以引入合適濃度的除碳源、氮源和無機磷酸鹽源之外的任一必需添加物，單獨或者以與另外的添加劑或培養(yǎng)基的混合物的形式引入，所述混合物例如氮源混合物。所述培養(yǎng)基可以任選含有一種或多種選自下列的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基醋酸鹽、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。所述原核宿主細(xì)胞適溫培養(yǎng)。例如，對于大腸桿菌的培養(yǎng)而言，優(yōu)選的溫度范圍為約20℃-約39℃，更優(yōu)選約25℃-約37℃，甚至更優(yōu)選約30℃。培養(yǎng)基的pH值可以是約5-約9范圍內(nèi)的任一pH，根據(jù)宿主而定。對于大腸桿菌而言，所述pH優(yōu)選約6.8-約7.4，更優(yōu)選約7.0。如果表達(dá)載體使用的是誘導(dǎo)型啟動子，那么應(yīng)該在適于活化該啟動子的條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。例如，如果使用PhoA啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄，那么可以將轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于誘導(dǎo)用的磷酸鹽-限制性培養(yǎng)基。多種其他誘導(dǎo)物也可使用，根據(jù)使用的載體構(gòu)建體而定，如本領(lǐng)域所知。微生物表達(dá)多肽可以分泌入宿主細(xì)胞的周質(zhì)然后從中回收。蛋白質(zhì)的回收通常包括裂解微生物，通常通過滲透休克、超聲處理或裂解等方式。一旦細(xì)胞被裂解，可以通過離心或過濾除去細(xì)胞碎片或全細(xì)胞。可以通過例如親合樹脂層析對蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化。替代地，可以將蛋白質(zhì)運載入培養(yǎng)基，然后從中分離。除去培養(yǎng)物中的細(xì)胞，然后過濾并濃縮培養(yǎng)物上清用于所制備蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化。表達(dá)多肽可以使用通常已知方法進(jìn)一步分離鑒定，例如免疫親合或離子交換柱進(jìn)行分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；硅石或DEAE等陽離子交換樹脂層析；色譜聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如SephadexG-75的凝膠過濾；疏水親合樹脂，使用固定于基質(zhì)上的合適抗原的配體親合以及Western印跡分析。除原核宿主細(xì)胞之外，真核宿主細(xì)胞系統(tǒng)也已為本領(lǐng)域所熟知。參見，例如，美國專利Nos.4,816,567。合適的宿主包括哺乳動物細(xì)胞系例如CHO，以及昆蟲細(xì)胞例如下文所述。多肽的純化可以通過純化獲得所制備多肽的基本上均質(zhì)的制劑用于進(jìn)一步的試驗和用途?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法。下列方法是合適的純化方法的舉例免疫親合或離子交換柱分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；硅石或DEAE等陽離子交換樹脂層析；色譜聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如SephadexG-75的凝膠過濾。本發(fā)明的方法本申請發(fā)現(xiàn)用所述結(jié)構(gòu)域干擾能調(diào)節(jié)HGF/c-met活性。各種物質(zhì)或分子(包括肽/多肽、抗體等)都可以用作治療劑。這些物質(zhì)或分子可以根據(jù)已知方法配制成藥物學(xué)上有用的組合物，其產(chǎn)物可以與藥物學(xué)可接受的載體介質(zhì)合并為混合物?？梢詫⒕哂幸蠹兌鹊幕钚猿煞峙c任選的生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制備出治療用制劑(Remington′sPharmaceuticalSciences16thedition，Osol，A.Ed.(1980))，以凍干劑型或水溶液形式貯存?zhèn)溆?。可接受的載體，賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量和濃度對于接受者是無毒的，并包括緩沖液例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其他碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；成鹽(salt-forming)反離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如TWEENTM，PLURONICSTM或PEG。用于體內(nèi)給藥的劑型必須經(jīng)過滅菌。這在凍干或重配之前或之后通過用過濾除菌膜過濾很容易實現(xiàn)。本申請中治療組合物通常置于一帶有滅菌入口的容器內(nèi)，例如，靜脈內(nèi)用溶液包(intravenoussolutionbag)或者帶有皮下注射針可穿透的塞子的藥瓶中。施用途徑采用已知方法，例如，注射或靜脈內(nèi)輸注，腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)或病變部位內(nèi)(intralesional)途徑，表面給藥，或者通過緩釋系統(tǒng)。本發(fā)明所述藥物組合物的劑量及預(yù)期濃度隨具體用途而定。合適劑量或給藥途徑的確定普通醫(yī)生可以適當(dāng)掌握。動物試驗為確定人治療用有效劑量提供了可靠指導(dǎo)?？梢愿鶕?jù)下列文獻(xiàn)記載的原理進(jìn)行有效劑量的種間調(diào)整Mordenti，J.andChappell，W.″Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics″InToxicokineticsandNewDrugDevelopment，Yacobietal.，Eds.，PergamonPress，NewYork1989，pp.42-96。當(dāng)體內(nèi)施用本發(fā)明的拮抗劑時，常規(guī)的劑量為約每天10ng/kg-100mg/kg哺乳動物體重或更多，優(yōu)選約1μg/kg/天-10mg/kg/天，根據(jù)施用途徑而定。具體劑量及遞送方法的指導(dǎo)文獻(xiàn)中有提供；參見，例如，美國專利Nos.4,657,760；5,206,344；或5,225,212?？梢韵氲降氖牵煌膭┬蛯τ诓煌闹委熁衔锛安煌牟“Y來說是有效的，靶向一種器官或組織的施用可能需要以與另一器官或組織所不同的方式遞送。當(dāng)治療需要一種物質(zhì)或分子的任一疾病或病癥的劑型需要以緩慢釋放的方式施用時，可以考慮使用該物質(zhì)或分子的微膠囊。用于緩慢釋放的重組蛋白質(zhì)的微膠囊已經(jīng)在下列物質(zhì)成功實現(xiàn)人生長激素(rhGH)、干擾素-(rhIFN-)、白細(xì)胞介素-2和MNrgp120。Johnsonetal.，Nat.Med.，2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，271221-1223(1993)；Horaetal.，Bio/Technology，8755-758(1990)；Cleland，″DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems，″inVaccineDesignTheSubunitandAdjuvantApproach，Powell和Newman，eds，(PlenumPressNewYork，1995)，pp.439-462；WO97/03692，WO96/40072，WO96/07399；和U.S.Pat.No.5,654,010。因其生物相容性及大范圍的生物可降解特性，這些蛋白質(zhì)的緩釋劑型都采用聚-乳酸-聚乙醇酸(PLGA)(poly-lacticcoglycolicacid)聚合物。PLGA、乳酸和羥基乙酸的降解產(chǎn)物可以很快地從人體清除。而且，該聚合物的可降解性可以根據(jù)其分子量及組成從數(shù)月調(diào)整至數(shù)年。Lewis，″Controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer，″inM.ChasinandR.Langer(Eds.)，BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekkerNewYork，1990)，pp.1-41。本發(fā)明還提供了篩選下述用途的化合物的方法鑒定能夠通過干擾c-metSema結(jié)構(gòu)域功能(例如，c-met二聚化、配體結(jié)合)抑制HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。篩選試驗設(shè)計為用于鑒定具有下列特征的化合物能與c-metSema序列結(jié)合或復(fù)合，或者能干擾c-metSema結(jié)構(gòu)域與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)之間相互作用。所述篩選試驗包括高通量篩選化學(xué)物質(zhì)/化合物文庫的試驗，使其特別適于鑒定藥物侯選物(例如，肽/多肽，小分子，抗體，等)。該試驗可以多種方式完成，包括蛋白-蛋白結(jié)合測定、生物化學(xué)篩選試驗、免疫測定和細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗，這些都已為本領(lǐng)域熟知。拮抗劑的全部試驗都是常規(guī)的，因為它們都要求藥物侯選物與c-metSema結(jié)構(gòu)域在足以保證c-met(Sema結(jié)構(gòu)域)與其結(jié)合伴侶間相互作用的條件和時間下接觸。結(jié)合試驗中，所述相互作用是結(jié)合，所述形成的復(fù)合體可以從反應(yīng)混合物中分離或檢測。一個具體的實施方案中，侯選物物質(zhì)或分子被固定于固體基質(zhì)上，例如，固定于微量滴定板，通過共價或非-共價連接。非-共價連接通常伴有下述操作用該物質(zhì)/分子的溶液包被所述物質(zhì)表面，然后使其干燥。替代地，可以使用一種固定的親合分子將其錨定至一固體表面，例如特異性針對該物質(zhì)/分子的抗體，如單克隆抗體。所述試驗可以通過下述操作完成將非-固定成分加至固定成分，例如含有錨定成分的包被表面，非-固定成分可用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記。當(dāng)所述反應(yīng)完成時，通過例如洗滌去除未-反應(yīng)的成分，然后對錨定在固體表面的復(fù)合體進(jìn)行檢測。當(dāng)最初的非-固定成分帶有可檢測標(biāo)記物時，檢測到標(biāo)記物固定在表面上說明發(fā)生了復(fù)合反應(yīng)。當(dāng)非-固定成分不帶標(biāo)記物時，可以通過例如使用能特異性地結(jié)合固定的復(fù)合體的標(biāo)記抗體對復(fù)合反應(yīng)進(jìn)行檢測。如果候選化合物與c-metsema結(jié)構(gòu)域相互作用但不結(jié)合，那么其與該結(jié)構(gòu)域間的相互作用可用熟知用于檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法進(jìn)行檢測。所述試驗包括常規(guī)方法，例如，交聯(lián)，共-免測沉淀法，以及通過梯度或?qū)游鲋?純化。此外，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用還可以通過使用酵母為基礎(chǔ)建立的遺傳系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測，該系統(tǒng)的描述見Fieldsandco-workers(FieldsandSong，Nature(London)，340245-246(1989)；Chienetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582(1991))asdisclosedbyChevrayandNathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895789-5793(1991)。許多轉(zhuǎn)錄活化因子，例如酵母GAL4都由兩個空間上獨立的模塊結(jié)構(gòu)域(modulardomains)組成，其中的一個作為DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，另一個為轉(zhuǎn)錄-活化結(jié)構(gòu)域。上述出版物描述的酵母表達(dá)系統(tǒng)(通常稱為″二元-雜合系統(tǒng)″)利用了這一特性，使用了兩種雜合蛋白，其中目標(biāo)蛋白融合于GAL4的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，侯選活化蛋白質(zhì)融合于活化結(jié)構(gòu)域。在GAL4-活化啟動子調(diào)控下的GAL1-lacZ報道基因的表達(dá)取決于通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的GAL4活性重構(gòu)。含有相互作用多肽的菌落可以使用β-半乳糖苷酶顯色底物進(jìn)行檢測。使用二元-雜合技術(shù)鑒定兩種特定蛋白質(zhì)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的成套試劑盒(MATCHMAKERTM)可購自Clontech。該系統(tǒng)還可以擴展用于參與特定蛋白質(zhì)相互作用的蛋白結(jié)構(gòu)域的作圖，以及精確定位(pinpoint)對這些相互作用至關(guān)重要的氨基酸殘基。干擾c-metSema結(jié)構(gòu)域與其伴侶間相互作用的化合物可以用下述操作測試通常，在足以實現(xiàn)這兩產(chǎn)物間相互作用及結(jié)合的條件和時間下，制備含有c-metSema序列或其部分與結(jié)合伴侶(例如，含有Sema，例如c-met胞外結(jié)構(gòu)域的另一多肽)的反應(yīng)混合物。為了測試侯選化合物抑制結(jié)合的能力，在有及無測試化合物存在條件下進(jìn)行反應(yīng)。此外，向第三反應(yīng)混合物加入安慰劑作為陽性對照?；旌衔镏谐霈F(xiàn)的測試化合物與c-metSema序列間的結(jié)合(復(fù)合物形成)用上述方法監(jiān)測。對照反應(yīng)中形成復(fù)合物而含測試化合物的反應(yīng)混合物中沒有形成，這表明該測試化合物能夠干擾c-metSema結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合伴侶間的相互作用。為了測定抑制因子(例如拮抗劑)，可以讓表達(dá)c-met的細(xì)胞與所篩查的是否具有與c-metSema結(jié)構(gòu)域功能相關(guān)的特定活性的化合物接觸，如果該化合物能夠抑制所述活性，表明該化合物是Sema結(jié)構(gòu)域(或其亞-結(jié)構(gòu)域)的拮抗劑，特性可以通過測定是否與c-metSema結(jié)構(gòu)域而不與無關(guān)分子特異性相互作用來進(jìn)一步證實。有效拮抗劑的其他具體實例包括能與c-metSema結(jié)構(gòu)域結(jié)合的寡核苷酸(可以是aptamer)，特別是抗體，包括但不限于，多-及單克隆抗體和抗體片段，單-鏈抗體，抗-獨特型抗體，以及所述抗體或片段的嵌合或人源化形式，以及人的抗體及抗體片段。替代地，一種有效拮抗劑可以是一種密切相關(guān)蛋白質(zhì)，例如能競爭性抑制野生型c-met作用的c-metSema結(jié)構(gòu)域突變形式。有效拮抗劑包括具有下述特征的小分子能與c-metSema結(jié)構(gòu)域和/或其結(jié)合伴侶上的c-metSema結(jié)合位點結(jié)合，從而封閉c-metSema結(jié)構(gòu)域的正常生物活性。小分子的實例包括，但不限于，肽或肽-樣分子，優(yōu)選可溶性的肽，和合成的非-肽酰的有機或無機化合物。這些小分子可以上述任一篩選試驗和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任一篩選技術(shù)進(jìn)行鑒定。如本申請所述，本發(fā)明的拮抗劑可以是一種肽或多肽。獲取所述肽或多肽的方法已為本領(lǐng)域所熟知，包括從肽或多肽文庫篩選合適目標(biāo)抗原的結(jié)合劑。一個實施方案中，合適的目標(biāo)抗原含有至少一部分c-metSema結(jié)構(gòu)域。肽和多肽文庫已為本領(lǐng)域所熟知，還可以根據(jù)本領(lǐng)域方法制備。參見，例如，Clarketal.，U.S.Pat.No.6,121,416；Bassetal.，U.S.Pat.No.5,688,666。融合于一種異源蛋白成分的肽或多肽文庫，例如噬菌體外殼蛋白，已為本領(lǐng)域所熟知，例如，描述見Clarketal.，Bassetal.，同上。一個實施方案中，能夠封閉c-metSema結(jié)構(gòu)域功能的肽含有氨基酸序列LDAQT(SEQIDNO1)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)和/或NVRCLQHF(SEQIDNO4)，或其變體。一個實施方案中，能封閉c-metsema結(jié)構(gòu)域功能的多肽含有全部或基本上全部的c-metsema結(jié)構(gòu)域。第一肽或多肽結(jié)合物的變體可以通過下述方法制備篩選肽或多肽變體獲得目的特征(例如，加強目標(biāo)親和力，加強藥物動力學(xué)，減少毒性，提高治療指數(shù)，等)。誘變技術(shù)已為本領(lǐng)域所熟知。另外，掃描(scanning)誘變技術(shù)(例如以丙氨酸掃描為基礎(chǔ))特別有助于對肽或多肽各個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)和/或功能重要性進(jìn)行測評。對本發(fā)明的候選物質(zhì)/分子調(diào)節(jié)HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或與所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的生物學(xué)活性的能力進(jìn)行測定，該測定可通過體內(nèi)或體外試驗測試所述物質(zhì)/分子的調(diào)節(jié)能力來完成，這些已為本領(lǐng)域熟知，例如，描述見Okigakietal.，Biochemistry(1992)，319555-9561；Matsumotoetal.，J.Biol.Chem.(1998)，27322913-22920；Dateetal.，F(xiàn)EBSLet.(1997)，4201-6；Lokkeretal.，EMBOJ.(1992)，112503-2510；Hartmanetal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA(1992)，8911574-11578?？贵w本發(fā)明進(jìn)一步還提供了包括使用抗體干擾c-met活化所需的一種或多種反應(yīng)的方法，例如c-met二聚化和/或配體與c-met的結(jié)合。列舉的抗體包括多克隆、單克隆、人源化、雙特異性及異源偶聯(lián)抗體。1.多克隆抗體本發(fā)明所述抗體包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。多克隆抗體可以通過向哺乳動物注射一種或多種免疫劑制備而得，如果需要再加上佐劑。通常，所述免疫劑和/或佐劑通過皮下或腹膜內(nèi)多點注射。所述免疫劑含有c-metSema結(jié)構(gòu)域(或其部分)或其融合蛋白。可以采用將所述免疫劑偶聯(lián)至已知對于所免疫動物來說具有免疫原性的蛋白質(zhì)。這類免疫原性蛋白質(zhì)的實例包括但不限于匙孔-血藍(lán)蛋白，血清白蛋白，牛甲狀腺球蛋白，和大豆胰蛋白酶抑制劑。可以使用的佐劑的實例包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰脂質(zhì)A，合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過度試驗即可選定。2.單克隆抗體替代地，本發(fā)明所述的抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以使用雜交瘤方法制備，例如文獻(xiàn)KohlerandMilstein，Nature，256495(1975)中描述的方法。雜交瘤方法中，通常用免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其他合適宿主動物的激發(fā)產(chǎn)生或能產(chǎn)生可特異性結(jié)合所述免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞。替代地，所述淋巴細(xì)胞可以體外免疫。所述免疫劑通常含有c-metSemthe結(jié)構(gòu)域(或其部分)或其融合蛋白。通常，如果期望是人源細(xì)胞時，則使用外周血單個核細(xì)胞(″PBLs″)，或者如果期望是非人源細(xì)胞時，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑，例如聚乙二醇，將所述淋巴細(xì)胞與無限增殖細(xì)胞系融合形成雜交瘤細(xì)胞[Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice，AcademicPress，(1986)pp.59-103]。無限增殖細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化后的哺乳動物細(xì)胞，特別是嚙齒動物、牛和人源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？梢詫⑺鲭s交瘤細(xì)胞培養(yǎng)于一合適的培養(yǎng)基，優(yōu)選含有一種或多種能抑制未融合的無限增殖細(xì)生長或存活的物質(zhì)。例如，如果所述親代細(xì)胞不含次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么雜交瘤的培養(yǎng)基通常含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT”培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止了HGPRT-缺陷細(xì)胞的生長。優(yōu)選地，無限增殖細(xì)胞系能高效融合，通過所選的抗體-產(chǎn)生細(xì)胞支持抗體的穩(wěn)定高水平表達(dá)，并且對于HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基是敏感的。更優(yōu)選地，無限增殖細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，可以獲自，例如，theSalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，CaliforniaandtheAmericanTypeCultureCollection，Manassas，Virginia。另外還公開了使用人骨髓瘤和小鼠-人雜交瘤細(xì)胞系制備人單克隆抗體[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeuretal.，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications，MarcelDekker，Inc.，NewYork，(1987)pp.51-63].然后測定生長著雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中是否存在抗c-metSema結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體。優(yōu)選地，所述通過雜交瘤細(xì)胞制備的結(jié)合特異性單克隆抗體可以通過免測沉淀法或通過體外結(jié)合試驗測定，例如放射性同位素(RIA，或酶聯(lián)免疫吸附測定)(ELISA)。這類技術(shù)及測定試驗本領(lǐng)域都已知。單克隆抗體的結(jié)合親和力可以通過例如下述方法測定theScatchardanalysisofMunsonandPollard，Anal.Biochem.，107220(1980).在鑒定出所需雜交瘤細(xì)胞后，可以對所述克隆進(jìn)行限制稀釋處理，常規(guī)方法培養(yǎng)[Goding，同上]。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括，例如，Dulbecco′sModifiedEagle′s培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基。替代地，所述雜交瘤細(xì)胞可以作為哺乳動物腹水體內(nèi)培養(yǎng)?？梢杂贸Ｒ?guī)免疫球蛋白純化方法，從培養(yǎng)基或腹水液中分離或純化出通過亞克隆篩選到的單克隆抗體，例如，蛋白質(zhì)A-Sepharose，羥磷灰石層析，凝膠電泳，滲透，或親和層析法。所述單克隆抗體還可用重組DNA方法制備，例如美國專利No.4,816,567中描述的方法。編碼單克隆抗體的DNA可以很容易地分離和測序，使用常規(guī)方法(例如，使用能與編碼鼠抗體重鏈及輕鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。表達(dá)本發(fā)明所述的抗體的雜交瘤細(xì)胞是所述DNA的合適來源。一旦分離后，將所述DNA插入表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染入不經(jīng)轉(zhuǎn)染不能產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，例如猿猴(Simian)COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，在該重組宿主細(xì)胞中實現(xiàn)單克隆抗體的合成。另外還可以對所述DNA進(jìn)行修飾，例如，通過用人重及輕鏈恒定區(qū)的編碼序列取代同源鼠的序列[(美國專利No.4,816,567；Morrisonetal.，同上]或者將免疫球蛋白編碼序列全長或部分共價連接于非-免疫球蛋白多肽。所述非免疫球蛋白多肽可以取代本發(fā)明所述的抗體的恒定區(qū)，或者也可以取代本發(fā)明所述抗體的抗原-結(jié)合位點的可變區(qū)，制備出嵌合的二價抗體。所述抗體可以是單價的抗體。用于制備單價抗體的方法已為本領(lǐng)域所熟知。例如，一種包括重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈及經(jīng)修飾的重鏈的方法。通常在Fc區(qū)中的任一點上截短重鏈從而阻止重鏈交聯(lián)。替代地，也可以將有關(guān)的半胱氨酸殘基用另一氨基酸殘基取代或者刪除從而阻止交聯(lián)。體外方法也適合用于制備單價抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知常規(guī)技術(shù)消化抗體制備其片段，尤其是Fab片段。另外還可以通過下述方法制備抗體從噬菌體展示文庫篩選能以合適/期望親和力結(jié)合的抗體或抗體片段。所述技術(shù)已為本領(lǐng)域所熟知，例如，公開于美國專利Nos.5,750,373；5,780,279；5,821,047；6,040,136；5,427,908；5,580,717，及其中的參考文獻(xiàn)。3.人及人源化抗體本發(fā)明所述的抗體還可以進(jìn)一步包括人源化抗體或人的抗體。非-人(例如，鼠的)抗體的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或抗體的其他的抗原-結(jié)合子序列)其中含有最低限度的源自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受抗體)，其中該接受抗體互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非-人物種的CDR所取代，例如小鼠、大鼠、和兔，所述來自非-人物種的CDR具有期望的特異性、親和力和其它能力(capacity)。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架殘基用相應(yīng)的非-人的殘基替代。人源化抗體還可以包含既非接受抗體也非輸入的CDR或骨架序列中的殘基。通常，所述人源化抗體都基本上包含至少一個，通常為兩個可變區(qū)，其中全部或者基本上全部的CDR區(qū)對應(yīng)于出自非-人免疫球蛋白的CDR區(qū)，而全部或基本上全部的FR區(qū)(FR)為人免疫球蛋白共有序列。另外，所述人源化抗體還最好包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白恒定區(qū)[Jonesetal.，Nature，321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)]。用于將非人抗體人源化的方法已為本領(lǐng)域所熟知。通常，人源化抗體具有一個或多個導(dǎo)入其中的來自非-人的氨基酸殘基。這些非人的氨基酸殘基通常稱為″輸入″殘基，通常取自“輸入”可變區(qū)。人源化可以基本上按照Winter及其同事的方法進(jìn)行[Jonesetal.，Nature，321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyenetal.，Science，2391534-1536(1988)]，用嚙齒動物的CDRs或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列。因此，所述“人源化”抗體是嵌合的抗體(U.S.PatentNo.4,816,567)，基本上其中小于整個人可變區(qū)的部分已經(jīng)被來自非人物種的相應(yīng)序列所取代。實際上，人源化抗體通常是人抗體，只不過是其中一些CDR殘基以及可能還有一些FR殘基被來自嚙齒動物抗體類似位點的殘基所取代。人抗體還可以使用各種本領(lǐng)域已知技術(shù)制備，包括噬菌體展示文庫[HoogenboomandWinter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marksetal.，J.Mol.Biol.，222581(1991)]。Cole等和Boerner等描述的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體(Coleetal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77(1985)andBoerneretal.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)]。類似地，可以通過下述方法制備人抗體將人免疫球蛋白基因座(loci)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物，例如，其中內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)被部分或全部滅活的小鼠。當(dāng)攻擊時，發(fā)現(xiàn)有人抗體產(chǎn)生，這在各個方面都與人體內(nèi)觀察到的十分類似，包括基因重排、裝配和抗體的所有組成成員。該方法描述參見，例如美國專利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及下列科技出版物Marksetal.，Bio/Technology10，779-783(1992)；Lonbergetal.，Nature368856-859(1994)；Morrison，Nature368，812-13(1994)；Fishwildetal.，NatureBiotechnology14，845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology14，826(1996)；LonbergandHuszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。另外還可以使用上述已知的篩選和/或誘變方法，使抗體親和力成熟(affinitymatured)。優(yōu)選的親和力成熟抗體具有比制備該親和力成熟抗體所用起始抗體(通常為鼠的、人源化或人的)高5倍，優(yōu)選10倍，更優(yōu)選20或30倍的親和力。4.雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選是人的或人源化的抗體。本發(fā)明中，其中的一種結(jié)合特異性針對c-metSema結(jié)構(gòu)域，另一種針對任一其他抗原。用于制造雙特異性抗體的方法已為本領(lǐng)域所知。通常，雙特異性抗體的重組制備是以2個免疫球蛋白重-鏈/輕-鏈對的共表達(dá)為基礎(chǔ)的，其中所述的2個重鏈具有不同的特異性[MilsteinandCuello，Nature，305537-539(1983)]。因為是免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機組合，所以這些雜交瘤(四體雜交瘤(quadromas))生產(chǎn)出10種不同抗體分子的有效(potential)混合物，其中只有1種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。這種正確分子的純化通常通過親和層析步驟完成。類似方法的描述見WO93/08829，公開于1993年5月，和Trauneckeretal.，EMBOJ.，103655-3659(1991)?？梢詫⒕哂心康慕Y(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合部位)融合于免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。優(yōu)選地，所述融合是與免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合，其中含有至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選地，具有其中含有輕鏈結(jié)合必需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少一種所述融合中。將編碼所述免疫球蛋白重鏈融合體以及如果需要還有免疫球蛋白輕鏈的DNAs插入不同的表達(dá)載體，然后共轉(zhuǎn)染入合適的宿主有機體。關(guān)于制備雙特異性抗體的進(jìn)一步詳細(xì)描述參見，例如，Sureshetal.，MethodsinEnzymology，121210(1986)。根據(jù)WO96/27011中描述的另一種方法，構(gòu)建一對抗體分子之間的接觸面，以使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的雜二聚體百分比最大化。優(yōu)選的接觸面至少含有抗體恒定區(qū)中CH3區(qū)的一部分。這種方法中，將來自第一抗體分子接觸面的一個或多個小的氨基酸側(cè)鏈替換為較大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)。通過將較大的氨基酸側(cè)鏈取代為較小側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)，在第二抗體分子接觸面上制造出與較大側(cè)鏈相同或類似大小的互補性“腔(cavities)”。這就為提高雜二聚體產(chǎn)量超過其它不想要的終末副產(chǎn)品例如同二聚體提供了一種方法。雙特異性抗體可以是制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已經(jīng)公開于文獻(xiàn)。例如，雙特異性抗體可以使用化學(xué)鍵制備。Brennanetal.，Science22981(1985)公開了一種方法，其中通過蛋白水解切割完整抗體產(chǎn)生F(ab’)2片段。為了穩(wěn)定鄰位二硫基化合物，阻止分子間二硫化物形成，將這些片段在二巰基化物復(fù)合劑(dithiolcomplexingagent)亞砷酸鈉存在下還原。然后，將制備的Fab’片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸鹽(酯)(TNB)衍生物。然后，通過用半胱胺還原將其中之一的Fab’-TNB衍生物復(fù)原為Fab’-硫醇，然后與等摩爾量的另一種Fab’-TNB衍生物混合形成所述雙特異性抗體。制備的雙特異性抗體可用作試劑用于酶的選擇性固定?？梢灾苯訌拇竽c桿菌回收Fab’片段，然后化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalabyetal.，J.Exp.Med.175217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab’)2分子的制備方法。每一Fab’片段都從大腸桿菌單獨分泌，然后體外進(jìn)行直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。因此，形成的雙特異性抗體能夠與過表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞結(jié)合，以及能夠激發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對人乳腺腫瘤目標(biāo)的裂解活性。直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)也已經(jīng)公開。例如，使用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelnyetal.，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992).通過基因融合將取自Fos和Jun蛋白質(zhì)的亮氨酸鋅拉鏈連接至兩種不同抗體的Fab′部分。在絞鏈區(qū)將抗體同源二聚體還原形成單體，然后再氧化生成抗體異源二聚體。該方法還可以用于制備抗體同源二聚體。Hollingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448(1993)公開的“雙抗體(diabody)”技術(shù)提供了另外一種制備雙特異性抗體的機制。所述片段含有借助接頭連接在一起的重-鏈可變區(qū)(VH)和輕-鏈可變區(qū)(VL)，該接頭太短因而不同能允許同一鏈上兩個結(jié)構(gòu)域之間配對。因此，一個片段的VH和VL結(jié)構(gòu)域不得不與互補的VL及VH結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。另外還公開了另一種策略，利用單-鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段。參見Gruberetal.，J.Immunol.1525368(1994)。2價以上的抗體也在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，可以制備三特異性抗體。Tuttetal.，J.Immunol.14760(1991).范例性的雙特異性抗體能夠與單一c-metSema結(jié)構(gòu)域上的兩個不同表位結(jié)合，或者與c-metSema結(jié)構(gòu)域上的表位和另一多肽上的表位結(jié)合。5.異源偶聯(lián)(Heteroconjugate)抗體異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由共價聯(lián)結(jié)的兩個抗體組成。這類抗體已經(jīng)被計劃用于，例如，將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向至不想要的細(xì)胞[(美國專利No.4,676,980]，及用于治療HIV感染[WO91/00360；WO92/200373；EP03089]?？梢泽w外使用已知的合成蛋白化學(xué)方法制備所述抗體，包括涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可以使用二硫化物(disulfide)交換反應(yīng)或者通過生成硫醚鍵，構(gòu)建免疫毒素。適于該目的的試劑的實例包括亞氨基硫醇鹽(酯)和甲基-4-巰基丁亞氨酸酯(mercaptobutyrimidate)以及美國專利No.4,676,980中公開的試劑。6.效應(yīng)子作用(EffectorFunction)構(gòu)建可以期望在效應(yīng)子作用方面對本發(fā)明所述的抗體進(jìn)行修飾，從而提高，例如，抗體治療癌癥的效力。例如，可以將半胱氨酸殘基導(dǎo)入Fc區(qū)，從而允許該區(qū)內(nèi)鏈間二硫鍵的形成。如此制備的同源二聚抗體提高內(nèi)化能力和/或增強補體-介導(dǎo)細(xì)胞殺傷以及抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caronetal.，J.ExpMed.，1761191-1195(1992)和以及Shopes，J.Immunol.，1482918-2922(1992)。抗腫瘤活性增強的同源二聚抗體也可以使用異源雙功能交聯(lián)物制備，描述見Wolffetal.CancerResearch，532560-2565(1993)。替代地，可以構(gòu)建具有雙Fc區(qū)因而提高補體溶解及ADCC能力的抗體。參見Stevensonetal.，Anti-CancerDrugDesign，3219-230(1989)。7.免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，它包含與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)的本文所述抗體，所述細(xì)胞毒制劑例如化療劑，毒素(例如細(xì)菌，真菌，植物或動物源性的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。上文已描述了用于產(chǎn)生此類免疫偶聯(lián)物的化療劑。可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutitesfordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(PhytolacaAmericana)蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑，白樹毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。多種放射性核素可用于制備放射性偶聯(lián)的抗體，實例包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re?？贵w和細(xì)胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亞胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亞胺酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二甲基己二酸亞氨酯)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science2381098(1987)所述制備。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見WO94/11026。另一個實施方案中，將抗體偶聯(lián)于一種″受體″(例如鏈霉親和素)用于腫瘤預(yù)靶向(pretargeting)，其中將所述抗體-受體偶聯(lián)物施用給患者，然后使用澄清劑(clearingagent)除去循環(huán)系統(tǒng)中的未結(jié)合偶聯(lián)物，之后施用″配體″(例如，親和素)，該“配體”偶聯(lián)于細(xì)胞毒性物質(zhì)(例如，放射性同位素)。8.免疫脂質(zhì)體另外還可將本申請公開的抗體配制成免疫脂質(zhì)體?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法制備含抗體的脂質(zhì)體，例如下列文獻(xiàn)中描述的方法Epsteinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwangetal.，Proc.NatlAcad.Sci.USA，774030(1980)；和美國專利Nos.4,485,045及4,544,545。增加循環(huán)時間的脂質(zhì)體的描述見美國專利No.5,013,556。特別有用的脂質(zhì)體可以通過反-相蒸發(fā)法制備，使用含有磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物。用規(guī)定大小孔徑的濾器擠出脂質(zhì)體得到具有預(yù)期直徑的脂質(zhì)體?？梢酝ㄟ^二硫化物-交換反應(yīng)，將本發(fā)明所述抗體Fab′片段偶聯(lián)至Martinetal.，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)中描述的脂質(zhì)體?？梢匀芜x地在脂質(zhì)體中含有化療劑(例如阿霉素)。參見Gabizonetal.，J.NationalCancerInst.，81(19)1484(1989)。9.抗體的藥物組合物上文所述篩選試驗鑒定出的抗體及其他分子可以藥物組合物形式施用，用于治療各種病癥。如果用完整抗體作為抑制因子，那么優(yōu)選使用具有內(nèi)化的抗體。但是，脂轉(zhuǎn)染物或脂質(zhì)體還可用于將本發(fā)明所述物質(zhì)/分子遞送入目的細(xì)胞。當(dāng)使用抗體片段時，優(yōu)選使用較小的抑制性片段。例如，可以根據(jù)抗體的可變區(qū)序列，設(shè)計出符合下列要求的肽分子即保留了結(jié)合c-metSema結(jié)構(gòu)域和/或干擾c-metSema結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合伴侶間相互作用的能力。這類肽可以化學(xué)合成和/或通過DNA重組技術(shù)制備。參見，例如，，Marascoetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。本發(fā)明所述劑型還可含有一種以上的所治療特定癥狀必需的活性化合物，優(yōu)選不會彼此抵觸具有互補活性的化合物。替代地，或者另外地，所述組合物可以含有能增強其功能的物質(zhì)，例如，細(xì)胞毒性物質(zhì)、細(xì)胞因子、化療劑或生長-抑制劑。這類分子適合以對預(yù)定目標(biāo)有效的量聯(lián)合出現(xiàn)。還可以將活性成分包埋在制備的微膠囊中，例如，通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合，例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚甲基異丁烯酸酯微膠囊中，膠體藥物發(fā)送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒，和納米膠囊)中或者巨乳劑(macroemulsions)中。所述技術(shù)描述見Remington′sPharmaceuticalSciences，同上。用于體內(nèi)給藥的劑型必須經(jīng)過滅菌。這一點通過用無菌過濾膜過濾很容易實現(xiàn)。可以制備緩慢釋放制劑。緩慢釋放制劑的合適的實例包括內(nèi)含抗體的固態(tài)疏水聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)為有形物體，例如，薄層，或微膠囊。緩慢釋放基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美國專利No.3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物例如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物與醋酸亮丙瑞林(leuprolide)組成的可注射微球體)，和聚-D-(-)-3-羥丁酸。盡管乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸等聚合物可使分子釋放時間在100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間則較短。當(dāng)包封抗體在體內(nèi)長時間存在時，在37℃濕潤環(huán)境它們會變性或聚集，引起生物活性的損失和免疫原性的改變?？梢愿鶕?jù)選擇機理的不同制定合理策略進(jìn)行穩(wěn)定化處理。例如，如果聚集機理是由于硫代-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，可以通過下述操作實現(xiàn)穩(wěn)定化修飾巰基殘基，從酸性溶液凍干，控制濕度，使用合適添加劑，和開發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物(polymermatrixcomposition)。制品本發(fā)明的另一方面，提供了含可用于治療、預(yù)防和/或診斷上述病癥材料的制品。所述制品包含容器以及該容器上的或連接到該容器之上的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括，例如，瓶，小藥瓶，注射器，等。所述容器可以各種材料制成的，例如玻璃或塑料。所述容器裝有自身或與其他組合物聯(lián)用時能有效治療、預(yù)防和/或診斷病癥的組合物，帶有一滅菌入口(例如，所述容器可以是一種靜脈內(nèi)用溶液包(intravenoussolutionbag)或者帶有皮下注射針可穿透的塞子的藥瓶)。所述組合物中至少一種活性物質(zhì)是本發(fā)明的拮抗劑。所述標(biāo)簽或包裝插頁標(biāo)明所述組合物可用于選擇治療的病癥，例如癌癥。而且，所述制品可以包含(a)其中裝有組合物的第一容器；該組合物含有本發(fā)明的拮抗劑；和(b)其中裝有組合物的第二容器；該組合物含有其他細(xì)胞毒性劑。本發(fā)明這種實施方案中的制品還可以進(jìn)一步包含一包裝說明書，標(biāo)明所述第一和第二組合物可用于治療特定的病癥，例如癌癥。替代地，或另外地，所述制品還可以進(jìn)一步包含第二(或第三)容器，其中裝有藥物學(xué)-可接受的緩沖液，例如滅菌劑注射用水(BWFI)，磷酸鹽緩沖鹽水，Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。進(jìn)一步還可以包括根據(jù)商業(yè)需要及用戶需求而定的其他物質(zhì)，包括其他緩沖液，稀釋劑，濾膜，針，和注射器。下面是本發(fā)明所述方法和組合物的實施例。當(dāng)然，根據(jù)上文提供的一般說明，還可以實施各種其他實施方案。實施例材料&方法構(gòu)建體和重組蛋白質(zhì)使用常規(guī)PCR方法構(gòu)建胞外亞-結(jié)構(gòu)域缺失的c-met。使用的引物為含有Sema起始部分、PSI、第一IPT或第四IPT結(jié)構(gòu)域、側(cè)面帶有KpnI位點的N-末端引物，和直至第959位Met殘基且側(cè)翼帶有StuI位點的C-末端引物。用c-Met作為模板，使用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen)，按照廠商建議，將每一克隆的PCR片段插入pCR-BluntII-TOPO載體。通過DNA測序?qū)λ隹寺∵M(jìn)行驗證。然后通過KpnI和EcoRV在C-末端添加一標(biāo)簽將構(gòu)建體亞克隆入pcDNA3.1V5/His載體(Invitrogen)。通過HindIII和KpnI位點在每一克隆的N-末端都添加上Met的信號肽。用HindIII和EcoRV消化每一克隆，然后通過HindIII和PmeI亞克隆入pRK5TKneo載體。對EC-WTFlag和EC-WTV5/His克隆而言，含HindIII位點的N-末端引物與至Met第595位殘基側(cè)翼帶有StuI位點的C-末端引物配對使用。將EC-WTV5/His通過HindIII/StuI亞克隆入pcDNA3.1V5/His的HindIII/EcoRV位點，然后亞克隆入pRK5Tkneo，如上所述。對EC-WTFlag而言，將PCR片段連接入pCR-BluntII-TOPO載體。將含F(xiàn)lag標(biāo)簽的寡核苷酸序列插入StuI和KpnI之間。然后通過HindIII和EcoRV/ScaI將EC-WTFlag亞克隆入pRK5Tkneo。R.Schwall(Genentech)提供了重組的HGF和抗-Met5D5-Fab。用哺乳動物細(xì)胞制備scHGF，此前已有描述(Peek等，2002)。為了獲得重組Sema和PSI結(jié)構(gòu)域，在編碼MET受體第25-567位殘基的區(qū)域上進(jìn)行PCR擴增。在C-末端添加8xHis標(biāo)簽和NotI位點，將N-末端直接融合至昆蟲細(xì)胞分泌信號pAcGP67A(BDBiosciences)的C-末端。PCR產(chǎn)物用SpeI和NotI消化后亞克隆入pAcGP67A。將純化后的質(zhì)粒DNA(pAcGP67A加METsema和PSI結(jié)構(gòu)域)轉(zhuǎn)染入Sf9昆蟲細(xì)胞，按照廠商提供的方法(BDBiosciences)。就表達(dá)而言，以5×105個細(xì)胞/mL密度培養(yǎng)于ESF921培養(yǎng)基(ProteinExpression，LLC)中的1L的Hi5昆蟲細(xì)胞用10mL病毒原液轉(zhuǎn)染，27℃孵育72小時。然后3000g離心15分鐘除去上清中的細(xì)胞。向上清中加入1mMNiCl2、5mMCaCl2和50mMTrispH8.0。過濾上清，通過重力自流動向2mLNi-NTA柱(Qiagen)上樣，然后用20mL洗滌緩沖液(50mMTrispH8.0，500mMNaCl，5mM咪唑)洗滌。蛋白質(zhì)用含有50mMTris8.0、300mMNaCl、250mM咪唑的緩沖液洗脫。單獨制備重組Sema結(jié)構(gòu)域的嘗試沒有得到此前報道的蛋白質(zhì)Sema3A(Antipenko等，2003)。免測沉淀和Western印跡分析細(xì)胞系獲自美國典型微生物保藏中心(ATCC)。將293細(xì)胞維持培養(yǎng)于添加了10％FBS(Sigma)、青霉素/鏈霉素(GIBCO)和谷氨酰胺的DMEM中。A549、H441和MDA-MB-435細(xì)胞維持培養(yǎng)于添加了10％FBS、青霉素/鏈霉素(GIBCO)和谷氨酰胺的50∶50DMEM/F12(Cellgro)中。按照廠商提供的說明書，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，用1-12μg指定構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24小時后，收獲細(xì)胞，用含完全蛋白酶抑制劑雞尾片(Completeproteaseinhibitorcocktailtablet)和磷酸酶抑制劑雞尾(cocktail)2(分別購自Roche和Sigma)1％NP40裂解緩沖液。對于Met酪氨酸磷酸化和MAPK磷酸化試驗而言，用0.5％BSA讓細(xì)胞血清-饑餓2小時。用10μg/ml抗-Met5D5-Fab或rSema處理后的細(xì)胞在裂解前再繼續(xù)孵育1小時。離心除去細(xì)胞碎片，上清用ProteinASepharose(Sigma)或ProteinG-Plus瓊脂糖微珠(SantaCruz)預(yù)澄清1小時。然后取500μg裂解物用10μg5D5抗體(Genentech)或35μlMet(C-28)瓊脂糖偶聯(lián)物(SantaCruz)進(jìn)行免疫沉淀，4℃振蕩過夜。對于HGF結(jié)合試驗而言，取500μg裂解物用5μgscHGF或HGF孵育，然后用1μgV5抗體免疫沉淀。加入蛋白A或G微珠再過2小時后，免疫沉淀物用1％NP40裂解緩沖液洗滌3遍。加入含10mMDTT的2X加樣緩沖液后，將樣品進(jìn)行4-12％Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，用5％脫脂奶或BSA封閉1小時，然后4℃下振動過夜，用下列物質(zhì)進(jìn)行探測1∶5000V5(Invitrogen)，1∶10000C-末端Met(C-12)(SantaCruz)，1∶1000MAPK(CellSignaling)，1∶500HGF-α(145)(SantaCruz)，1∶1000P-MAPK(CellSignaling)，1∶1000His(CellSignaling)，或1∶1000磷酸酪氨酸4G10(Upstate)抗體?？剐∈蠡蛲肐gG二抗(Amersham)按1∶5000稀釋使用。通過加強的化學(xué)發(fā)光(ECL-Plus，Amersham)對蛋白質(zhì)進(jìn)行了檢測。共價親和力交聯(lián)分析對此前公開方法(Blechman等，1995)調(diào)整后進(jìn)行交聯(lián)試驗。A549，H441，MDA-MB-435，和293細(xì)胞用0.5％BSA血清饑餓兩小時。除去培養(yǎng)基代之以PBS。按照廠商提供的說明書，用遞增濃度的交聯(lián)劑硫代-EGS(Pierce)對細(xì)胞進(jìn)行處理。類似地，將293細(xì)胞置于6-孔平板，然后用0.1-4μg指定構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用Lipofectamine2000(invitrogen)。24時后，用PBS替換培養(yǎng)基，用硫代-EGS進(jìn)行細(xì)胞交聯(lián)。然后，用含蛋白酶和磷酸酶抑制因子的1％NP40裂解緩沖液裂解細(xì)胞。然后將溶于還原性加樣緩沖液中的10μg裂解物立即進(jìn)行8％或4-12％Tris-甘氨酸凝膠電泳分析，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5％奶封閉1小時。用1∶1000MetC-12(SantaCruz)或1∶5000V5抗體對膜進(jìn)行探測，4℃振動過夜。用1∶5000的二抗孵育后，用ECL-Plus對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。用EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His共轉(zhuǎn)染，然后同上所述進(jìn)行交聯(lián)。取500μg交聯(lián)后的裂解物用V5或Flag抗體免疫沉淀，8％Tris-甘氨酸凝膠電泳分析，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并用1∶5000V5或1∶1000Flag(Sigma)抗體免疫沉淀。蛋白質(zhì)用ECL-Plus檢測。劃痕(Scrape)試驗將H441細(xì)胞以4.5×104個細(xì)胞/孔的密度種植于裝有含10％FBS的50∶50DMEM/F12的96-孔平板內(nèi)。次日，在每一孔匯合的單層上作單一劃痕，按照此前描述方法(Lorenzatoetal.，2002)。然后用含0.5％BSA的培養(yǎng)基孵育孔，然后用模擬物、10μg/ml5D5，10μg/mlSema或100ng/mlHGF處理。對劃痕進(jìn)行監(jiān)測，每天拍照。代表性的結(jié)果顯示2天。遷移試驗對此前公開方法(Coltellaetal.，2003)調(diào)整進(jìn)行跨孔(transwell)移動試驗。將含0.5％BSA的培養(yǎng)基中的1.2×105個MDA-MB-435細(xì)胞種植于事先用10μg/mlIV型膠原纖維(Sigma)包被過的每一跨孔(Costar)的上部腔室。向上部腔室加入模擬物、10μg/ml抗-Met5D5-Fab，或10μg/mlSema。作為陽性對照，另外向模擬物-處理孔的下部腔室添加100ng/mlHGF。次日，這些孔用4％多聚甲醛固定，用0.5％龍膽紫染色。已經(jīng)移動到下部腔室的細(xì)胞用10％乙酸溶解，用微量培養(yǎng)板閱讀儀測量560nm處的吸光度。結(jié)果Sema結(jié)構(gòu)域是Met受體交聯(lián)所必需的為了測定Met胞外結(jié)構(gòu)域在受體二聚化及活化中所起的作用，制備了亞-結(jié)構(gòu)域缺失的Met，如圖1所示。每一缺失突變體都在N-末端側(cè)翼帶有信號肽(S.P.)，C-末端跨膜區(qū)帶有V5/His標(biāo)簽。使用硫代-EGS單個測定Met缺失突變體的交聯(lián)能力。將用遞增濃度sulfo-EGS處理過的加V5/His標(biāo)簽的缺失突變體的轉(zhuǎn)染體進(jìn)行裂解，轉(zhuǎn)染體裂解后用4-12％SDS-PAGE電泳分析。在未經(jīng)sulfo-EGS處理的樣本中，EC-WT-V5/His表現(xiàn)為處理后的單體(EC-M，～90kD)和未經(jīng)處理的(*，～120kD)蛋白質(zhì)。檢測到了EC-WT交聯(lián)，表現(xiàn)為從較低(EC-M，～90kD)變?yōu)榱溯^高的遷移二聚體(EC-D，～180kD)，如圖2A所示。不含Sema結(jié)構(gòu)域的Met變體沒有出現(xiàn)類似移動。值得注意的是，正如所料，未經(jīng)處理的EC-WT(*)Met沒有出現(xiàn)交聯(lián)，因為硫代-EGS是細(xì)胞膜不透性的。當(dāng)出現(xiàn)在細(xì)胞表面上時，胞內(nèi)的Met單-鏈前體受到蛋白水解切割(Giordanoetal.，1989)。因為硫代-EGS有限的通透性，所以選擇其作為交聯(lián)劑，對交聯(lián)的膜-插入處理后的Met受體的效力進(jìn)行了測定。為了查明膜-結(jié)合胞外Met是否形成同型二聚體，用EC-WT-V5/His與EC-WT-Flag共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用硫代-EGS交聯(lián)。裂解細(xì)胞，用V5抗體免疫沉淀，8％SDS-PAGE凝膠電泳分析，然后用Flag或V5抗體進(jìn)行免疫印跡試驗。免疫印跡結(jié)果顯示含有EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His的較高的移動形式(EC-D，～180kD)，說明兩種形式的EC-WT都發(fā)生了交聯(lián)及共免疫沉淀。使用Flag抗體的反相免測沉淀得到類似結(jié)果(圖2B)。另外在V5免疫沉淀物中檢測到了剩余的未交聯(lián)的EC-WTFlag(EC-M)，但是隨著加入的硫代-EGS的增加變?yōu)檩^高的移動形式(圖2B)?？傊?，交聯(lián)試驗表明當(dāng)sema結(jié)構(gòu)域存在時形成了胞外的膜-結(jié)合Met同源二聚體。HGF和scHGF(R494E)結(jié)合Sema結(jié)構(gòu)域HGF以非活性單-鏈前體的形式分泌，被細(xì)胞外蛋白酶切割為α和β鏈(Nakaetal.，1992)。切割得到的二硫鍵連接的HGF的α和β鏈能以高親和力結(jié)合Met受體(Bottaroetal.，1991；Naldinietal.，1991)。對Met缺失突變體的結(jié)合HGF的能力進(jìn)行了測試。用EC-WT，ΔS，ΔP，ΔIPT3，TM或模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖3A)，與HGF孵育細(xì)胞裂解物。用V5抗體免疫沉淀，然后4-12％SDS-PAGE電泳分析，α鏈-HGF抗體檢測發(fā)現(xiàn)HGF只與EC-WT結(jié)合(圖3B)。HGF不結(jié)合其它Met缺失突變體的結(jié)果說明Sema結(jié)構(gòu)域是HGF結(jié)合所必需的。含有R494E突變的單鏈HGF[scHGF(R494E)]能夠結(jié)合并抑制Met受體的活化(Lokkeretal.，1992)。另外還對scHGF(R494E)結(jié)合Met胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了測試。裂解轉(zhuǎn)染后的Met缺失突變體，用scHGF(R494E)孵育，按照上述方法進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)顯示scHGF(R494E)只結(jié)合EC-WT，而不結(jié)合Sema缺失變體(圖3C)。這些結(jié)果與共免疫沉淀試驗相互印證，其中HGF和scHGF(R494E)都能與重組EC-Met和Sema結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合(數(shù)據(jù)未給出)。因此，這些數(shù)據(jù)與觀察結(jié)果是一致的，Met的Sema結(jié)構(gòu)域是HGF的相互作用位點(Gherardietal.，2003)。這些數(shù)據(jù)還表明Met的Sema結(jié)構(gòu)域也是scHGF(R494E)結(jié)合的相互作用位點。5D5單克隆抗體能結(jié)合Met的Sema結(jié)構(gòu)域現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)抗-Met5D5的Fab片段(抗-Met5D5-Fab)能抑制HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。參見，例如，美國專利Nos.5,686,292；5,646,036；6,207,152&6,214,344。通過與抗-Met5D5的共-免測沉淀試驗，對Met缺失構(gòu)建體進(jìn)行測試。如前所述用Met缺失構(gòu)建體或模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些細(xì)胞裂解物用抗-Met5D5免疫沉淀，然后用His抗體進(jìn)行免疫印跡測試。如圖3E所示，只有含Sema的EC-WT才結(jié)合抗-Met5D5。裂解物中檢測到了全部的轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)(圖3D)，內(nèi)源Met被抗-Met5D5免疫沉淀(圖3F)。因此，所述數(shù)據(jù)表明抗-Met5D5能結(jié)合Met的Sema結(jié)構(gòu)域。由于抗-Met5D5-Fab可作為拮抗劑，所以可用作下列功能研究中的對照。腫瘤細(xì)胞系中的內(nèi)源Met交聯(lián)由于這些數(shù)據(jù)表明Sema結(jié)構(gòu)域與兩種功能有關(guān)，即結(jié)合HGF和受體二聚化，所以對MetSema結(jié)構(gòu)域在排除了HGF結(jié)合的二聚化方面的作用進(jìn)行檢測。除非另有說明，后面的所有試驗都在HGF存在條件下進(jìn)行。通過RT-PCR和Western印跡，對HGF在293(胚腎)、H441(肺腺癌)、A549(肺癌)和MDA-MB-435(乳腺癌)細(xì)胞系中的表達(dá)水平進(jìn)行了測定。MDA-MB-435和H441細(xì)胞沒有可檢測的HGFRNA或蛋白質(zhì)，盡管A549和293細(xì)胞表達(dá)HGFRNA并且在裂解物和條件培養(yǎng)基中有少量可檢測的HGF蛋白(數(shù)據(jù)未給出)。為了測定各種腫瘤細(xì)胞系表達(dá)的Met在無HGF存在下能否交聯(lián)，在試驗過程中將這些細(xì)胞維持在含0.5％BSA的無血清培養(yǎng)基中。如前所述用硫代-EGS交聯(lián)這些細(xì)胞系，裂解物用4-12％SDS-PAGE電泳分析，然后用Met抗體進(jìn)行免疫印跡分析。在無交聯(lián)劑存在時，Met表現(xiàn)為處理后的(Met-M)和未經(jīng)處理的(*)蛋白質(zhì)，這與此前EC-WT交聯(lián)試驗中觀察到的一樣(圖2A)。每一細(xì)胞系中，甚至在只有0.1mM硫代-EGS存在下，也都出現(xiàn)了Met-M向較高的移動形式(Met-D)的變動(圖4)。隨著交聯(lián)劑濃度的升高，由Met-M到MetD形式的變動增加。與我們此前觀察到的一致，細(xì)胞內(nèi)的未經(jīng)處理的Met在硫代-EGS處理時并非發(fā)生交聯(lián)。相反，用100ng/mlHGF孵育A549細(xì)胞，出現(xiàn)了如前所述的交聯(lián)。Met免疫印跡試驗發(fā)現(xiàn)HGF存在時，與無HGF存在時看到的Met-D相比出現(xiàn)了更高的移動形式(圖4)。這些數(shù)據(jù)表明在無HGF存在時已經(jīng)形成了交聯(lián)的Met二聚體，由于與HGF結(jié)合而進(jìn)一步變動。用rSema和抗-Met5D5-Fab抑制腫瘤細(xì)胞中的Met信號傳導(dǎo)由于這些數(shù)據(jù)表明Sema結(jié)構(gòu)域是Met二聚化所必需的，制備含Met受體Sema和PSI結(jié)構(gòu)域的重組Sema(rSema)蛋白(參見材料和方法部分)，測試其對Met信號傳導(dǎo)的功能性影響。用遞增濃度的rSema處理人腫瘤細(xì)胞，對HGF刺激時的Met酪氨酸磷酸化及促有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的下游活化進(jìn)行測試。對A549細(xì)胞實施血清饑餓，在HGF存在下用遞增濃度的rSema孵育?；厥占?xì)胞裂解物，用C-末端Met抗體免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗體進(jìn)行免疫印跡分析。與HGF單獨刺激相比，在HGF存在下加以遞增量的rSema處理，出現(xiàn)了Met磷酸化減少(圖5A和5B)。類似地，配體存在下用遞增量的rSema處理時，MAPK磷酸化也減少。另外以類似方式用rSema和HGF處理H441和MDA-MB-435細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)磷酸-MAPK呈現(xiàn)劑量依賴性減少(圖5A和5B)。此外，還對無HGF存在時rSema抑制Met活化進(jìn)行了測試。作為對比，在功能試驗中使用了能作為Met受體拮抗體的抗-Met5D5-Fab。將A549細(xì)胞經(jīng)受血清-饑餓，然后用抗-Met5D5-Fab或rSema進(jìn)行處理。與模擬物處理的對照相比，用rSema或抗-Met5D5-Fab處理導(dǎo)致配體非依賴性的Met磷酸化及磷酸-MAPK水平的抑制(圖5C和5D)。類似地，H441和MDA-MB-435細(xì)胞系另外還在無HGF存在下用抗-Met5D5-Fab和rSema處理；MAPK磷酸化減少所遵循的趨勢與此前在A549細(xì)胞上觀察到的類似。這些結(jié)果表明rSema不僅能抑制配體依賴性及非依賴性的Met磷酸化，而且還能影響下游的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外還對Met缺失突變體減弱內(nèi)源Met信號傳導(dǎo)的能力進(jìn)行了測定。用所述Met缺失突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖5E)；裂解物用C-末端Met抗體免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗體作免疫印跡分析。與模擬物處理的對照相比，EC-WT轉(zhuǎn)染子表現(xiàn)出Met酪氨酸磷酸化和磷酸-MAPK的減少(圖5F和5G)。Sema缺失的轉(zhuǎn)染子盡管表現(xiàn)出了磷酸-Met一定程度的減少，但是并沒有出現(xiàn)下游的MAPK磷酸化的減少(圖5F和5G)。綜合來看，這些結(jié)果證實了Sema結(jié)構(gòu)域是Met活化所必需的，進(jìn)一步驗證了此前的rSema抑制Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的試驗結(jié)果(圖5A-D)。細(xì)胞移動被rSema和抗-Met5D5-Fab抑制用H441細(xì)胞進(jìn)行劃痕(Scrape)試驗，測量Met介導(dǎo)的細(xì)胞運動力(Lorenzatoetal.，2002)。在第0天對每一孔中高密度培養(yǎng)的H441細(xì)胞進(jìn)行劃痕，試驗過程細(xì)胞維持在含0.5％BSA的無血清培養(yǎng)基中(圖6)。細(xì)胞用10μg/mlrSema或5D5或100ng/mlHGF處理作為陽性對照或者模擬物處理。第2天時，模擬物處理孔的裂隙完全閉合，而rSema處理的細(xì)胞中的裂隙仍然存在(圖6)。抗-Met5D5Fab處理的細(xì)胞中的裂隙變小，但仍然可見。HGF處理后的細(xì)胞到第1天時閉合了裂隙，在第2天仍然如此。這些觀察結(jié)果在4個獨立試驗中都一致。這些數(shù)據(jù)表明沒有HGF存在，rSema和抗-Met5D5-Fab都抑制內(nèi)源性Met活化介導(dǎo)的細(xì)胞運動力。為了測試無配體存在下rSema對細(xì)胞運動力的影響，用0，0.1，0.5，或52μg/mlrSema加20ng/mlHGF處理細(xì)胞。單用HGF處理后的細(xì)胞第1天時裂隙完全閉合。相反，在HGF存在時用rSema處理的細(xì)胞呈劑量依賴性方式保持裂隙(數(shù)據(jù)未給出)。這些數(shù)據(jù)表明在HGF存在下，rSema抑制Met介導(dǎo)的細(xì)胞運動。用MDA-MB-435細(xì)胞檢測Met趨動的細(xì)胞遷移的跨孔實驗(transwellassay)。無HGF存在時，模擬物處理后細(xì)胞的移動情況如圖7所示。這種移動隨著rSema，和抗-Met5D5-Fab的加入程度變小。向這些細(xì)胞加入HGF導(dǎo)致移動增加了3倍。這些數(shù)據(jù)與H441細(xì)胞系的劃痕(Scrape)試驗結(jié)果相關(guān)。另外，還用細(xì)胞運動力及移動試驗對H441和MDA-MB-435細(xì)胞中Akt的活化進(jìn)行了測試。試驗發(fā)現(xiàn)在HGF存在下，隨著rSema濃度的增大，Akt磷酸化呈劑量依賴性減少。這些數(shù)據(jù)與下列結(jié)果相關(guān)在配體存在下，rSema能夠抑制Met-介導(dǎo)的細(xì)胞運動力。總之，這些試驗結(jié)果都支持了下述結(jié)論Sema結(jié)構(gòu)域拮抗劑，例如含Sema序列的重組多肽不僅能夠抑制Met活化，而且在配體依賴及非依賴環(huán)境下都能阻斷細(xì)胞運動力及移動的下游反應(yīng)。討論Sema結(jié)構(gòu)域位于semaphorins及其配體plexins的胞外區(qū)，充當(dāng)受體/配體識別位點(Tamagnoneetal.，1999)。近期出版的Sema3A和Sema4D的晶體結(jié)構(gòu)表明這些Sema結(jié)構(gòu)域形成7葉片的(seven-bladed)β-螺旋(propeller)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對于同源二聚化很重要(Antipenkoetal.，2003；Loveetal.，2003)。本申請?zhí)峁┑捏w外及體內(nèi)試驗證據(jù)有力的支持了Sema結(jié)構(gòu)域在Met受體二聚化中的作用。數(shù)據(jù)表明Met交聯(lián)只發(fā)生在Sema結(jié)構(gòu)域存在的條件下，說明Sema結(jié)構(gòu)域在受體二聚化中發(fā)揮著必不可少的作用。此外，無HGF存在時出現(xiàn)的Met交聯(lián)表明這些腫瘤細(xì)胞系中的Met受體在無配體刺激時也能二聚化。Sema3A晶體結(jié)構(gòu)表明Sema結(jié)構(gòu)域中的4個相互作用的“環(huán)”對于建立Sema3A二聚體之間的接觸面發(fā)揮重要作用(Antipenkoetal.，2003)。Sema3A序列與Met對齊結(jié)果顯示其中的1個“環(huán)”位置靠近MetSema結(jié)構(gòu)域中R307和S308之間的蛋白水解切割位點，這表明了它在Met二聚化中的重要性。本申請?zhí)峁┑募?xì)胞試驗表明無HGF存在時，Sema結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Met受體的同嗜的相互作用。值得注意的是，此前的報道認(rèn)為Met還可與CD44v6，α6β4整聯(lián)蛋白和plexinB1相互作用(Giordanoetal.，2002；Orian-Rousseauetal.，2002；Trusolinoetal.，2001)。本申請所述結(jié)果為下列觀點提供了支持Met通過這些高度保守的Sema結(jié)構(gòu)域與plexinB1結(jié)合在一起。此外，Met和semaphorins的過表達(dá)已發(fā)現(xiàn)于癌癥和侵入性轉(zhuǎn)移，因而可以進(jìn)一步推定任一有效的相互作用都能由Sema結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)。但是，這些分子的作用以及這些病理環(huán)境中介導(dǎo)異聚相互作用的機制得益于進(jìn)一步的研究。CD44v6和α6β4有無包含Sema結(jié)構(gòu)域還不得而知。因此，通過Sema和/或PSI或IPT結(jié)構(gòu)域與其他蛋白基序間的相互作用可能對于啟動特異性生物反應(yīng)很重要(BertottiandComoglio，2003)，因此不能作為一種可能性被排除。對于RTKs例如成纖維細(xì)胞生長因子受體2(FGFR2)和RET，每一受體胞外結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸間的二硫鍵都與受體二聚化有關(guān)(Robertsonetal.，2000)。對于Met受體，本申請?zhí)峁┑臄?shù)據(jù)表明無論是富含半胱氨酸PSI結(jié)構(gòu)域還是四個IPT結(jié)構(gòu)域在無Sema結(jié)構(gòu)域時都沒有出現(xiàn)交聯(lián)，表明這些區(qū)域并非是Met二聚化所必需的。另外，盡管Met的PSI結(jié)構(gòu)域缺失，Met與plexinB1間的相互作用都不改變(Giordanoetal.，2002)。盡管本申請的功能試驗中使用的rSema含有Sema和PSI結(jié)構(gòu)域(參看材料和方法)，本申請的交聯(lián)試驗和報道的plexinB1中PSI結(jié)構(gòu)域缺失(Giordanoetal.，2002)有力證明無PSI結(jié)構(gòu)域時，Sema結(jié)構(gòu)域在這些相互作用中發(fā)揮著主要作用。值得注意的是，制備內(nèi)在PSI或IPT缺失的嘗試導(dǎo)致本發(fā)明試驗未使用的未-處理的Met的表達(dá)，因此，在Met二聚體形成或一些其他機制中，例如報道的EGFR二聚化自動抑制中，PSI和IPT結(jié)構(gòu)域是否發(fā)揮作用還有待明確(Fergusonetal.，2003)。胞外Met晶體結(jié)構(gòu)的解析將有助于更進(jìn)一步了解這些復(fù)合體相互作用。RTKs的配體-受體復(fù)合體結(jié)晶圖研究已經(jīng)提供了幾種框架性的觀點(structuralinsights)。Flt-1和TrkA都利用配體的二聚化達(dá)到受體的二聚化和活化(Wiesmannetal.，1997；Wiesmannetal.，1999)。對于FGFR，與FGF配體結(jié)合的肝素能驅(qū)動受體二聚化(Plotnikovetal.，1999)。相反，EGF:EGFR(表皮生長因子受體)復(fù)合體通過受體同源二聚化，與配體-配體間相互作用無關(guān)(Garrettetal.，2002；Ogisoetal.，2002)。Met與HGF的相互作用不甚清晰，盡管近期報道提出Met、HGF及肝素以1∶1∶1復(fù)合體存在(Gherardietal.，2003)。我們的細(xì)胞試驗與報道的這些體外試驗結(jié)果不同，由于細(xì)胞成分例如細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)存在于我們的實驗中，可能對體內(nèi)受體二聚化有一定影響。由于ECM含有層粘連蛋白及其他參與細(xì)胞相互作用的成分(GiancottiandRuoslahti，1999)，因此很可能所有促進(jìn)Met二聚化的蛋白還沒有得以鑒定。本發(fā)明證明，Sema結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂cHGF的相互作用已足夠，這與先前的觀察(Gherardi等，2003)一致，并且rSema能抑制配體驅(qū)動的Met活化。因此，很可能rSema可以通過結(jié)合HGF有效地抑制HGF-依賴性的Met活化。另外，還發(fā)現(xiàn)HGF依賴的Met過表達(dá)腫瘤會成為rSema的靶標(biāo)，方式與RonSema結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的配體-依賴性受體活化相似(Angelonietal.，2003)。本申請?zhí)峁┑臄?shù)據(jù)表明Sema-HGF相互作用位點不同于Met二聚化界面，因為交聯(lián)試驗表明配體-非依賴性的Met二聚體當(dāng)與HGF結(jié)合時進(jìn)一步移動(圖4)。這些數(shù)據(jù)說明二聚化界面與HGF相互作用位點是不-重疊的。此外，本申請還發(fā)現(xiàn)Sema結(jié)構(gòu)域?qū)τ谝阎猚-met拮抗劑抗體，抗-Met5D5-Fab的結(jié)合是必需的。由于抗-Met5D5-Fab還能抑制配體-非依賴性的受體活化，如本申請試驗顯示那樣，所以除HGF競爭之外，抗-Met5D5-Fab可以通過空間位阻阻斷受體二聚化。同樣地，rSema也能抑制配體非依賴性及依賴性的Met活性，表明rSema可以用作有效的Met抑制劑。類似的抑制活性對c-kit受體已有報道(Levetal.，1992)。在本試驗提供的配體非依賴環(huán)境中，MetSema結(jié)構(gòu)域在二聚化中的作用不同于Ronsema結(jié)構(gòu)域的作用。盡管RonSema結(jié)構(gòu)域能夠競爭結(jié)合MSP抑制Ron活性，但是它不能抑制Ron受體的二聚化(Angelonietal.，2003)。本申請的功能性試驗是在有或無HGF存在下進(jìn)行的，說明MetSema結(jié)構(gòu)域?qū)ε潴w依賴性和配體非依賴性的受體活化都能抑制。這些數(shù)據(jù)表明盡管Met與Ron的結(jié)構(gòu)基元及結(jié)合相互作用類似，體內(nèi)環(huán)境可能確定了不同的同嗜的相互作用。本申請證明MetSema結(jié)構(gòu)域不僅是配體依賴性Met受體活化的強效抑制劑，而且也是配體非依賴性Met受體活化的強效抑制劑。本申請的數(shù)據(jù)表明Met的Sema結(jié)構(gòu)域能阻止腫瘤細(xì)胞中的受體活化，從而抑制MAPK磷酸化、細(xì)胞運動力及遷移。這些試驗結(jié)果提供了通過定向Met的Sema結(jié)構(gòu)域作用治療與HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸失調(diào)相關(guān)腫瘤的可能性，包括但不限于使用Sema結(jié)構(gòu)域自身作為生物治療藥物。部分參考文獻(xiàn)列表Angeloni，D.，Danilkovitch-Miagkova，A.，Miagkov，A.，Leonard，E.J.，andLerman，M.I.(2003).ThesolublesemadomainoftheRonreceptorinhibitsMSP-inducedreceptoractivation.JBiolChem.Antipenko，A.，Himanen，J.P.，vanLeyen，K.，Nardi-Dei，V.，Lesniak，J.，Barton，W.A.，Rajashankar，K.R.，Lu，M.，Hoemme，C.，Puschel，A.W.，andNikolov，D.B.(2003).Structureofthesemaphorin-3Areceptorbindingmodule.Neuron39，589-598.Bardelli，A.，Longati，P.，Gramaglia，D.，Stella，M.C.，andComoglio，P.M.(1997).Gab1couplingtotheHGF/MetreceptormultifunctionaldockingsiterequiresbindingofGrb2andcorrelateswiththetransformingpotential.Oncogene15，3103-3111.Bertotti，A.，andComoglio，P.M.(2003).TyrosinekinasesignalspecificitylessonsfromtheHGFreceptor.TrendsBiochemSci28，527-533.Bladt，F(xiàn).，Riethmacher，D.，Isenmann，S.，Aguzzi，A.，andBirchmeier，C.(1995).Essentialroleforthec-metreceptorinthemigrationofmyogenicprecursorcellsintothelimbbud.Nature376，768-771.Blechman，J.M.，Lev，S.，Barg，J.，Eisenstein，M.，Vaks，B.，Vogel，Z.，Givol，D.，andYarden，Y.(1995).Thefourthimmunoglobulindomainofthestemcellfactorreceptorcouplesligandbindingtosignaltransduction.Cell80，103-113.Boix，L.，Rosa，J.L.，Ventura，F(xiàn).，Castells，A.，Bruix，J.，Rodes，J.，andBartrons，R.(1994).c-metmRNAoverexpressioninhumanhepatocellularcarcinoma.Hepatology19，88-91.Bottaro，D.P.，Rubin，J.S.，F(xiàn)aletto，D.L.，Chan，A.M.，Kmiecik，T.E.，VandeWoude，G.F.，andAaronson，S.A.(1991).Identificationofthehepatocyte，growthfactorreceptorasthec-metproto-oncogeneproduct.Science251，802-804.Bussolino，F(xiàn).，DiRenzo，M.F.，Ziche，M.，Bocchietto，E.，Olivero，M.，Naldini，L.，Gaudino，G.，Tamagnone，L.，Coffer，A.，andComoglio，P.M.(1992).Hepatocytegrowthfactorisapotentangiogenicfactorwhichstimulatesendothelialcellmotilityandgrowth.JCellBiol119，629-641.Coltella，N.，Manara，M.C.，Cerisano，V.，Trusolino，L.，DiRenzo，M.F.，Scotlandi，K.，andFerracini，R.(2003).RoleoftheMET/HGFreceptorinproliferationandinvasivebehaviorofosteosarcoma.FasebJ17，1162-1164.Cooper，C.S.，Park，M.，Blair，D.G.，Tainsky，M.A.，Huebner，K.，Croce，C.M.，andVandeWoude，G.F.(1984).Molecularcloningofanewtransforminggenefromachemicallytransformedhumancellline.Nature311，29-33.DiRenzo，M.F.，Olivero，M.，Giacomini，A.，Porte，H.，Chastre，E.，Mirossay，L.，Nordlinger，B.，Bretti，S.，Bottardi，S.，Giordano，S.，andetal.(1995).Overexpressionandamplificationofthemet/HGFreceptorgeneduringtheprogressionofcolorectalcancer.ClinCancerRes1，147-154.Ferguson，K.M.，Berger，M.B.，Mendrola，J.M.，Cho，H.S.，Leahy，D.J.，andLemmon，M.A.(2003).EGFactivatesitsreceptorbyremovinginteractionsthatautoinhibitectodomaindimerization.MolCell11，507-517.Furge，K.A.，Zhang，Y.W.，andVandeWoude，G.F.(2000).Metreceptortyrosinekinaseenhancedsignalingthroughadapterproteins.Oncogene19，5582-5589.Garrett，T.P.，McKern，N.M.，Lou，M.，Elleman，T.C.，Adams，T.E.，Lovrecz，G.O.，Zhu，H.J.，Walker，F(xiàn).，F(xiàn)renkel，M.J.，Hoyne，P.A.，etal.(2002).Crystalstructureofatruncatedepidermalgrowthfactorreceptorextracellulardomainboundtotransforminggrowthfactoralpha.Cell110，763-773.Gherardi，E.，Youles，M.E.，Miguel，R.N.，Blundell，T.L.，Iamele，L.，Gough，J.，Bandyopadhyay，A.，Hartmann，G.，andButler，P.J.(2003).FunctionalmapanddomainstructureofMET，theproductofthec-metprotooncogeneandreceptorforhepatocytegrowthfactor/scatterfactor.ProcNatlAcadSciUSA.Giancotti，F(xiàn).G.，andRuoslahti，E.(1999).Integrinsignaling.Science285，1028-1032.Giordano，S.，Corso，S.，Conrotto，P.，Artigiani，S.，Gilestro，G.，Barberis，D.，Tamagnone，L.，andComoglio，P.M.(2002).Thesemaphorin4DreceptorcontrolsinvasivegrowthbycouplingwithMet.NatCellBiol4，720-724.Giordano，S.，DiRenzo，M.F.，Narsimhan，R.P.，Cooper，C.S.，Rosa，C.，andComoglio，P.M.(1989).Biosynthesisoftheproteinencodedbythec-metproto-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與c-met的結(jié)合能抑制HGF依賴性或非依賴性的c-met活化。16.權(quán)利要求1-15中任一項所述的拮抗劑，其中該拮抗劑與細(xì)胞內(nèi)c-met的結(jié)合能抑制該細(xì)胞的增殖，分散，形態(tài)發(fā)生和/或運動。17.權(quán)利要求1-16中任一項所述的拮抗劑，其中該拮抗劑包含其中含有至少一部分c-metSema結(jié)構(gòu)域或其變體的肽。18.權(quán)利要求17所述的拮抗劑，其中所述肽含有至少一種選自下列的序列LDAQT(SEQIDNO1)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)和NVRCLQHF(SEQIDNO4)。19.權(quán)利要求17所述的拮抗劑，其中所述肽基本上由至少一種選自下列的序列組成LDAQT(SEQIDNO1)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)和NVRCLQHF(SEQIDNO4)。20.權(quán)利要求17所述的拮抗劑，其中所述肽含有序列LTEKRKKRS(SEQIDNO2)。21.權(quán)利要求17所述的拮抗劑，其中所述肽基本上由LTEKRKKRS(SEQIDNO2)組成。22.一種組合物，其中含有權(quán)利要求1-21任一項所述拮抗劑和載體。23.權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述載體是藥物學(xué)上可接受的。24.一種編碼權(quán)利要求1-21任一項所述拮抗劑的核酸，其中所述拮抗劑包括多肽。25.權(quán)利要求24所述的核酸，其中所述拮抗劑包括抗體或其片段。26.一種載體，其中含有權(quán)利要求24或25所述的核酸。27.一種宿主細(xì)胞，其中含有權(quán)利要求26所述的載體。28.一種制品，其中包含一種容器；及裝在所述容器中的組合物，其中所述組合物含有權(quán)利要求1-21中任一項所述的拮抗劑。29.權(quán)利要求28所述制品，其中還包含用于指導(dǎo)向受試者施用所述拮抗劑的說明書。30.一種試劑盒，其中包含第一容器，其中裝有含權(quán)利要求1-21中任一項所述拮抗劑的組合物；及第二容器，其中含有緩沖液。31.權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述緩沖液是藥物學(xué)上可接受的。32.權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中還包含用于指導(dǎo)向受試者施用所述拮抗劑的說明書。33.一種篩選或鑒定c-met拮抗劑的方法，該方法包括讓侯選物質(zhì)與一種其中含有至少一部分c-metSema結(jié)構(gòu)域的靶分子接觸，從而將能特異性地結(jié)合所述靶分子的物質(zhì)選定為c-met拮抗劑。34.權(quán)利要求33所述的方法，其中讓所選物質(zhì)與表達(dá)c-met的細(xì)胞接觸，對所述細(xì)胞中c-met二聚化的抑制情況進(jìn)行檢測或定量。35.權(quán)利要求34所述的方法，其中c-met二聚化的抑制用c-met活化量的減少指示。36.權(quán)利要求35所述的方法，其中c-met的活化量用c-met相關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的量指示。37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)用蛋白質(zhì)磷酸化指示。38.一種調(diào)節(jié)受試者體內(nèi)c-met活化的方法，該方法包括向受試者施用c-metSema結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)物，從而調(diào)節(jié)c-met活性。39.一種能抑制c-met活化的細(xì)胞增殖的方法，該方法包括讓細(xì)胞或組織與權(quán)利要求1-21中任一項所述拮抗劑接觸，從而抑制與c-met活化相關(guān)的細(xì)胞增殖。40.一種治療受試者與c-met活化失調(diào)相關(guān)病理狀況的方法，該方法包括向所述受試者施用權(quán)利要求1-21中任一項所述的拮抗劑，從而抑制c-met活化。41.一種用于抑制表達(dá)c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者的細(xì)胞生長的方法，該方法包括讓所述細(xì)胞與權(quán)利要求1-21中任一項所述拮抗劑接觸，從而引發(fā)對所述細(xì)胞生長的抑制。42.一種對患有含表達(dá)c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者的細(xì)胞的癌性腫瘤的哺乳動物進(jìn)行治療性處理的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用治療有效量的權(quán)利要求1-21中任一項所述拮抗劑，從而有效治療所述哺乳動物。43.一種治療或防止細(xì)胞增殖病癥的方法，該細(xì)胞增殖病癥與c-met表達(dá)或活性升高或者肝細(xì)胞生長加快或者兩者相關(guān)，所述方法包括向確實需要治療的受試者施用有效量的權(quán)利要求1-21任一項所述c-met拮抗劑，從而有效治療或防止所述細(xì)胞增殖病癥。44.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的增殖病癥是癌癥。45.一種用于抑制細(xì)胞生長的方法，其中所述細(xì)胞的生長至少部分取決于c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者的生長加強作用，所述方法包括讓所述細(xì)胞與權(quán)利要求1-21中任一項所述拮抗劑接觸，從而有效地抑制所述細(xì)胞的生長。46.一種治療哺乳動物腫瘤的方法，其中所述腫瘤生長至少部分取決于c-met或肝細(xì)胞生長因子或兩者的生長加強作用，所述方法包括讓所述細(xì)胞與權(quán)利要求1-21中任一項所述拮抗劑接觸，從而有效地治療所述腫瘤。47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述的細(xì)胞是癌細(xì)胞。48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述癌細(xì)胞還進(jìn)一步接受放療或化療。49.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述癌細(xì)胞選自乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳頭狀癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、頭及頸部鱗狀癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞以及血癌細(xì)胞。50.權(quán)利要求47所述的方法，其中與相同組織來源的正常細(xì)胞相比，所述癌細(xì)胞以更高豐度表達(dá)c-met或肝細(xì)胞生長因子或者兩者。51.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述肝細(xì)胞生長因子表達(dá)于不同的細(xì)胞。52.權(quán)利要求47所述的方法，其中與相同組織來源的正常細(xì)胞相比，所述癌細(xì)胞中的c-met活化增強。53.權(quán)利要求47所述的方法，該方法能引發(fā)所述細(xì)胞的死亡。54.權(quán)利要求40-53中任一項所述的方法，其中在無所述拮抗劑存在時c-met活化的發(fā)生不依賴于配體的存在。55.權(quán)利要求40-53中任一項所述的方法，其中在無所述拮抗劑存在時c-met的活化是配體依賴性的。全文摘要本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)HGF/c－met信號傳導(dǎo)途徑的組合物和方法，具體而言，使用能夠干擾c－met多聚化的c－met拮抗劑調(diào)節(jié)c－met二聚化和/或配體與c－met的結(jié)合。文檔編號A61K38/08GK1922208SQ20048004157公開日2007年2月28日申請日期2004年12月10日優(yōu)先權(quán)日2003年12月11日發(fā)明者戴尼利·M·威克拉馬辛格,莫妮卡·康－貝爾特蘭申請人:健泰科生物技術(shù)公司