專利名稱：：整合蛋白α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血小板凝集領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及一種整合蛋白特異性抗體和肽，以及這些化合物用于抑制血小板凝集的用途。
背景技術(shù)：
：整合蛋白αIIbβ3抑制劑是一類新的抗血栓形成藥物，該抑制劑通過阻斷血纖維蛋白原與整合蛋白αIIbβ3的結(jié)合，進(jìn)而抑制血栓形成中關(guān)鍵的血小板之間的相互作用(參見Topol，E.J.，Byzova，T.V.，andPlow，E.F.(1999)PlateletGPIIb-IIIablockers.Lancet353，227-231；Coller，B.S.(1997)PlateletGPIIb/IIIaantagoniststhefirstanti-integrinreceptortherapeutics.JClinInvest99，1467-1471)。整合蛋白αIIbβ3抑制劑現(xiàn)在被用于治療非ST段抬高急性冠脈綜合征和進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動脈治療的病人(參見Proimos，G.(2001)PlateletaggregationinhibitionwithglycoproteinIIb-IIIainhibitors.JThrombThrombolysis11，99-110)。在這些抑制劑中，阿昔單抗(abciximab)(ReoPro，Centocor，Inc.，Malvern，Pennsylvania，andEliLilly&Company，Indianapolis，Indiana)(參見Coller，B.S.(1997)PlateletGPIIb/IIIaantagoniststhefirstanti-integrinreceptortherapeutics.JClinInvest99，1467-1471)，埃替非巴肽(eptifibatide)(INTEGRILIN，CORTherapeutics，Inc.，SouthSanFrancisco，California，andKeyPharmaceuticals，Inc.，Kenilworth，NewJersey)(參見Phillips，D.R.，andScarborough，R.M.(1997)Clinicalpharmacologyofeptifibatide.AmJCardiol80，11B-20B；Scarborough，R.M.(1999)Developmentofeptifibatide.AmHeartJ138，1093-1104)和替羅非班(tirofiban)(Aggrastat，Merck&Co.，Inc.，WhitehouseStation，NewJersey)(Vickers，S.，Theoharides，A.D.，Arison，B.，Balani，S.K.，Cui，D.，Duncan，C.A.，Ellis，J.D.，Gorham，L.M.，Polsky，S.L.，Prueksaritanont，T.，Ramjit，H.G.，Slaughter，D.E.，andVyas，K.P.(1999)Invitroandinvivostudiesonthemetabolismoftirofiban.DrugMetabDispos27，1360-1366)已經(jīng)在美國通過了臨床批準(zhǔn)。其中第一個獲得批準(zhǔn)并且應(yīng)用范圍最廣的藥劑阿昔單抗是一種具有鼠源可變區(qū)和人源恒定區(qū)的嵌合Fab。它通過和配基結(jié)合區(qū)域鄰近的表位結(jié)合進(jìn)而通過空間阻礙抑制血纖維蛋白原結(jié)合。阿昔單抗已經(jīng)被證實(shí)可以與整合蛋白αγβ3以及整合蛋白αMβ2發(fā)生交叉反應(yīng)(參見Scarborough，R.M.(1999)Developmentofeptifibatide.AmHeartJ138，1093-1104)。另一方面，埃替非巴肽和替羅非班則是能夠結(jié)合整合蛋白的RGD配基相互作用位點(diǎn)的小分子藥物，而且它們是αIIbβ3特異性的。和阿昔單抗相比，它們具有較低的親和力以及更短的半衰期。(參見Scarborough，R.M.(1999)Developmentofeptifibatide.AmHeartJ138，1093-1104；Vickers，S.，Theoharides，A.D.，Arison，B.，Balani，S.K.，Cui，D.，Duncan，C.A.，Ellis，J.D.，Gorham，L.M.，Polsky，S.L.，Prueksaritanont，T.，Ramjit，H.G.，Slaughter，D.E.，andVyas，K.P.(1999)Invitroandinvivostudiesonthemetabolismoftirofiban.DrugMetabDispos27，1360-1366；McClellan，K.J.，andGoa，K.L.)1998)Tirofiban.Areviewofitsuseinacutecoronarysyndromes.Drugs56，1067-1080)。急性血小板減少癥被認(rèn)為是使用αIIbβ3抑制劑治療方法的并發(fā)癥。在第一次被施用阿昔單抗的病人中，大約有0.5％-1％的病人出現(xiàn)嚴(yán)重的血小板減少癥(血小板濃度小于50×109/L)(參見Berkowitz，S.D.，Sane，D.C.，Sigmon，K.N.，Shavender，J.H.，Harrington，R.A.，Tcheng，J.E.，Topol，E.J.，andCaliff，R.M.(1998)Occurrenceandclinicalsignificanceofthrombocytopeniainapopulationundergoinghigh-riskpercutaneouscoronaryrevascularization.Evaluationofc7E3forthePreventionofIschemicComplications(EPIC)StudyGroup.JAmCollCardiol32，311-319；Jubelirer，S.J.，Koenig，B.A.，andBates，M.C.(1999)AcuteprofoundthrombocytopeniafollowingC7E3Fab(Abciximab)therapycasereports，reviewoftheliteratureandimplicationsfortherapy.AmJHematol61，205-208；Kereiakes，D.J.，Berkowitz，S.D.，Lincoff，A.M.，Tcheng，J.E.，Wolski，K.，Achenbach，R.，Melsheimer，R.，Anderson，K.，Califf，R.M.，andTopol，E.J.(2000)ClinicalcorrelatesandcourseofthrombocytopeniaduringpercutaneouscoronaryinterventionintheeraofabciximabplateletglycoproteinIIb/IIIablockade.AmHeartJ140，74-80)，而在第二次被施用阿昔單抗的病人中出現(xiàn)這種嚴(yán)重血小板減少癥的比例則為4％(參見Madan，M.，Kereiakes，D.J.，Hermiller，J.B.，Rund，M.M.，Tudor，G.，Anderson，L.，McDonald，M.B.，Berkowitz，S.D.，Sketch，M.H.，Jr.，Philips，H.R.，3rd，andTcheng，J.E.(2000)Efficacyofabciximabreadministrationincoronaryintervention.AmJCardiol85，435-440；Tcheng，J.E.，Kereiakes，D.J.，Braden，G.A.，Jordan，R.E.，Mascelli，M.A，Langrall，M.A.，andEffron，M.B.(1999)ReadministrationofabciximabinterimreportoftheReoProreadministrationregistry.AmHeartJ138，S33-38)。在替羅非班的臨床實(shí)驗(yàn)中，在施用替羅非班的病人中出現(xiàn)這種血小板減少癥的可能性為0.1％-0.5％，僅僅是未施藥病人中出現(xiàn)這種病癥的可能性的兩倍(參見TheRESTOREInvestigators.RandomizedEfficacyStudyofTirofibanforOutcomesandREstenosis(1997)EffectsofplateletglycoproteinIIb/IIIablockadewithtirofibanonadversecardiaceventsinpatientswithunstableanginaoracutemyocardialinfarctionundergoingcoronaryangioplasty.Circulation96，1445-1453；PlateletReceptorInhibitioninIschemicSyndromeManagement(PRISM)StudyInvestigators.(1998)Acomparisonofaspirinplustirofibanwithaspirinplusheparinforunstableangina.NEnglJMed338，1498-1505；PlateletReceptorInhibitioninIschemicSyndromeManagementinPatientsLimitedbyUnstableSignsandSymptoms(PRISM-PLUS)StudyInvestigators.(1998)InhibitionoftheplateletglycoproteinIIb/IIIareceptorwithtirofibaninunstableanginaandnon-Q-wavemyocardialinfarction.NEnglJMed338，1488-1497)。而在埃替非巴肽的臨床實(shí)驗(yàn)中，被施藥病人中出現(xiàn)血小板減少癥的可能性則與服用了安慰劑的對照組病人中出現(xiàn)的可能性近乎相等(參見McClure，M.W.，Berkowitz，S.D.，Sparapani，R.，Tuttle，R.，Kleiman，N.S.，Berdan，L.G.，Lincoff，A.M.，Deckers，J.，Diaz，R.，Karsch，K.R.，Gretler，D.，Kitt，M.，Simoons，M.，Topol，E.J.，Califf，R.M.，andHarrington，R.A.(1999)Clinicalsignificanceofthrombocytopeniaduringanon-ST-elevationacutecoronarysyndrome.TheplateletglycoproteinIIb/IIIainunstableanginareceptorsuppressionusingintegrilintherapy(PURSUIT)trialexperience.Circulation99，2892-2900)。在被施用埃替非巴肽的病人中，只有極少比例的病人會出現(xiàn)嚴(yán)重的，難以解釋的血小板減少癥(參見McClure，M.W.，Berkowitz，S.D.，Sparapani，R.，Tuttle，R.，Kleiman，N.S.，Berdan，L.G.，Lincoff，A.M.，Deckers，J.，Diaz，R.，Karsch，K.R.，Gretler，D.，Kitt，M.，Simoons，M.，Topol，E.J.，Califf，R.M.，andHarrington，R.A.(1999)Clinicalsignificanceofthrombocytopeniaduringanon-ST-elevationacutecoronarysyndrome.TheplateletglycoproteinIIb/IIIainunstableanginareceptorsuppressionusingintegrilintherapy(PURSUIT)trialexperience.Circulation99，2892-2900)。盡管最近有報道指出是第一次被施用阿昔單抗后人體內(nèi)被誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗-鼠源可變區(qū)片段的抗體導(dǎo)致了在該病人第二次施用阿昔單抗時產(chǎn)生的嚴(yán)重的血小板減少癥，但是在施用整合蛋白αIIbβ3抑制劑所引起的血小板減少癥的原因目前還不清楚(參見Curtis，B.R.，Swyers，J.，Divgi，A.，McFarland，J.G.，andAster，R.H.(2002)Thrombocytopeniaaftersecondexposuretoabciximabiscausedbyantibodiesthatrecognizeabciximab-coatedplatelets.Blood99，2054-2059)。整合蛋白αvβ3，αvβ5，αIIbβ3，和α5β1對于許多含有Arg-Gly-Asp(RGD)三肽的粘蛋白都有一定的結(jié)合能力。利用其這一特性，一種合成的在其HCDR3中含有一個RGD基序，而且側(cè)面連接有6個隨機(jī)化殘基的類粘蛋白人源抗體可以利用噬菌體展示技術(shù)從抗體庫中淘選出來(參見Barbas，C.F.，3rd，Languino，L.R.，andSmith，J.W.(1993)High-affinityself-reactivehumanantibodiesbydesignandselectiontargetingtheintegrinligandbindingsite.ProcNatlAcadSciUSA90，10003-10007)。其中最有效的抗體是Fab-9，它與整合蛋白αvβ3的結(jié)合能力要比和整合蛋白αvβ5和α5β1的結(jié)合能力強(qiáng)1000倍。盡管如此，這些淘選出來的抗體，包括Fab-9，都不能有效地區(qū)分兩種β3整合蛋白，αvβ3和αIIbβ3。因此，一個基序優(yōu)化的隨機(jī)肽庫被創(chuàng)建出來，以確定對Fab-9的HCDR3區(qū)域中RGD三肽基序的進(jìn)一步的加工和淘選是否可以產(chǎn)生一種對整合蛋白αvβ3或者αIIbβ3具有特異性結(jié)合能力的抗體(參見Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。盡管很多淘選出來的抗體表現(xiàn)出對整合蛋白αγβ3或者αIIbβ3具有一些選擇性，但是幾乎所有的抗體對于這兩種整合蛋白都具有結(jié)合能力。大部分淘選出來的抗體都具有一個相同的氨基酸序列(K/R)XD。有趣的是，RGD基團(tuán)的中間位置的氨基酸Gly可以被Val，Ala，Asn，Arg，Thr，Gln，Asp，Ser以及Trp所取代(參見Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。發(fā)明簡述本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案提供了一種分離并提純的血小板凝集肽抑制劑，所述肽包含9到大約50個氨基酸殘基并且具有選自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸殘基序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該肽包括SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該肽由SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列組成。在另一更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，該肽基本上由SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列組成。本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了一種可以與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。該抗體含有選自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列均包含在該抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)中。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)位于此抗體的重鏈上。本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的方案中，該抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)是HCDR3。在另一實(shí)施方案中，所述抗體選自此處指定為RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或RAD88的抗體并且與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體是一種人源抗體。本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了一種可以與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了本發(fā)明中的抗體，免疫球蛋白和肽的使用方法。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，此方法是抑制血小板凝集的方法，其包括將血小板與抑制有效量的肽相接觸，所述肽具有選自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述方法是抑制血小板凝集的方法，其包括將血小板與抑制有效量的抗體相接觸，所述抗體與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)并且包含選自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列是位于所述抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)上的。本發(fā)明同時提供了一種抑制血纖維蛋白原與血小板結(jié)合的方法，該方法包括將血小板與抑制有效量的肽相接觸，所述肽具有選自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸序列。本發(fā)明同時提供了一種抑制血小板凝集的方法，該方法包括將血小板與抑制有效量的抗體相接觸，所述抗體與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)并且包含選自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列是位于所述抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)上的。本發(fā)明也提供了具有整合蛋白αIIbβ3結(jié)合活性的抗體，其中所述結(jié)合與其它蛋白質(zhì)的結(jié)合活性競爭，所述其它蛋白質(zhì)包含三肽基序精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(RAD)的氨基酸殘基序列，并且所述結(jié)合是在標(biāo)準(zhǔn)競爭測定中進(jìn)行的。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是另外一種抗體，該抗體的決定簇互補(bǔ)區(qū)含有一種氨基酸殘基序列，該氨基酸序列選自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31，而且所述的結(jié)合是在標(biāo)準(zhǔn)競爭測定中進(jìn)行的。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案提供了一種一種藥用組合物，該藥用組合物包含血小板凝集肽抑制劑和適宜的藥用載體，該藥用組合物以適宜于靜脈給藥、動脈給藥、淋巴循環(huán)給藥、腹膜內(nèi)給藥、透皮給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥以及肺部給藥的形態(tài)存在。更進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及包含與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體和適宜的藥用載體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及使用血小板凝集肽抑制劑作為治療劑以防止在選自肺部栓塞、暫時性缺血發(fā)作(TIAs)、深靜脈栓塞、冠狀動脈旁路手術(shù)和在自體，非自體或者合成的脈管移植中放置人工瓣膜或脈管的手術(shù)的條件下的血栓形成。更進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及使用一種能夠與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體作為治療劑來防止血栓形成。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，血小板凝集肽抑制劑可以用作治療劑以防止在選自通過球囊、冠狀動脈粥樣斑塊切除術(shù)和激光血管成形術(shù)進(jìn)行的血管成形術(shù)過程中的血栓形成。更進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及使用一種能夠與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體作為治療劑來防止血栓形成。本發(fā)明還涉及一種處理受試者以治療或防止血栓形成性紊亂的方法，該紊亂選自肺部栓塞、暫時性缺血發(fā)作(TIAs)、深靜脈栓塞、冠狀動脈旁路手術(shù)和在自體，非自體或者合成的脈管移植中放置人工瓣膜或脈管的手術(shù)，該方法包括施用有效量的具有血小板凝集抑制活性的肽于受試者以達(dá)到期望的治療。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及處理受試者以治療或防止血栓形成性紊亂的方法，該方法包括施用有效量的與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體于受試者以達(dá)到期望的治療。本發(fā)明一方面提供了一種分離并提純的血小板凝集肽抑制劑，所述肽具有9到大約50個氨基酸殘基并且氨基酸殘基序列相應(yīng)于V(V/W)CRAD(K/R)RC(由SEQIDNO4，5，6和7示例)。該肽優(yōu)選包括SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列。更優(yōu)選地，該肽具有SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列。本發(fā)明另一方面提供了與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。該抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)域含有V(R/G)V(V/W)CRAD(R/K)RCYAMDV的氨基酸序列(由SEQIDNos8，25，26，28，29，30和31示例)。優(yōu)選地，該抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)位于該抗體的重鏈上；更加優(yōu)選的，該抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)為HCDR3。該抗體最優(yōu)選的為一種人源性抗體。示例和優(yōu)選的抗體為如下中的5種RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或者RAD88。本發(fā)明還涉及具有RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或者RAD88中任一個的免疫反應(yīng)性的抗體。本發(fā)明的另一方面提供了一種抑制血小板凝集的方法。該方法包括將血小板與抑制有效量的本發(fā)明的肽或者抗體相接觸的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了一種抑制血纖維蛋白原與血小板結(jié)合的方法。該方法包括將血小板與抑制有效量的本發(fā)明的肽或者抗體相接觸的步驟。附圖簡述在構(gòu)成說明書一部分的附圖中圖1表示篩選出的Fab只與人整合蛋白αIIbβ3結(jié)合，而不與其他的RGD結(jié)合的人整合蛋白結(jié)合。圖中所示為基于固定化的人整合蛋白αvβ3，αvβ5，αIIbβ3和α5β1的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及含有由pComb3X-轉(zhuǎn)染的E.Coli所表達(dá)的可溶性Fab的上清液。結(jié)合了HRP的大鼠抗-HA的單克隆抗體被用于探測。圖2表示的是FabRAD87結(jié)合到人血小板上，而不能結(jié)合到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)上。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果分析表明該FabRAD87只結(jié)合到同時表達(dá)整合蛋白αvβ3，αIIbβ3的人血小板上，而不能結(jié)合到主要表達(dá)整合蛋白αvβ3的HUVEC上。與此對比的，F(xiàn)ab阿昔單抗能夠結(jié)合到人血小板和人臍靜脈血細(xì)胞(HUVEC)上，這個結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了已被記載過的Fab阿昔單抗與兩種β3整合蛋白的交叉反應(yīng)性。y軸以線性刻度表示每次的計(jì)數(shù)，x軸以對數(shù)刻度表示的是熒光強(qiáng)度。圖3表示的是FabRAD87和源自篩選出來的HCDR3序列的合成的肽對整合蛋白αIIbβ3與纖維蛋白原之間反應(yīng)的抑制作用。生物素(酰)化的纖維蛋白原和下列物質(zhì)混合(A)不同濃度的FabRAD87，F(xiàn)ab阿昔單抗和混合的人IgG作為陰性對照；(B)合成肽鏈，然后再加入到固定在ELISA板上的整合蛋白αIIbβ3中。鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶被用于探測。圖中標(biāo)出了3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4表示的是FabRAD87在體外抑制血小板凝集。圖中所示的血小板凝集檢測反應(yīng)是從全血比濁法(lumi-aggregometer)得到的。每一次檢測反應(yīng)中，15μlFabRAD87(A)或者Fab阿昔單抗(B)溶液被混合入435μl的富含血小板血漿，使其最終濃度達(dá)到20nM到100nM之間。然后加入ADP至終濃度為20μM，接著監(jiān)測凝集10分鐘。3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果各點(diǎn)的平均值(plottedmeanvalues)和標(biāo)準(zhǔn)偏差如(C)所示。圖5表示的是來源于篩選出的HCDR3序列的合成肽在體外抑制血小板凝集。血小板凝集測定反應(yīng)如圖4中描述的那樣在特定濃度的肽的存在下進(jìn)行。值得注意的是3條具有RAD基序的環(huán)形肽強(qiáng)烈地抑制血小板凝集(A-C所示)，而一條含有RAD基序和2條含有一個逆向RAD基序的對照肽則沒有產(chǎn)生超過背景(D)的效果。在所有血小板凝集分析中，阿昔單抗Fab均作為陽性對照。圖6表示的是本發(fā)明中抗體的部分重鏈的氨基酸序列。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一種可以與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。術(shù)語“抗體”以及其不同的表述形式在這里是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子上免疫活性部位，比如含有抗體結(jié)合位點(diǎn)或互補(bǔ)位的分子。其中可以作為示例的抗體分子包括完整的免疫球蛋白分子，大體完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的部分，其中包括已知的被稱為Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2和F(v)的部分，單結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)，折疊的免疫球蛋白構(gòu)建體及其活性區(qū)段。本發(fā)明中的一種抗體是使用噬菌體展示技術(shù)合成并提純的(參見，例如國際申請WO94/18221)。下面實(shí)施例有關(guān)于該過程的詳細(xì)描述。優(yōu)選的抗體是人抗體。本發(fā)明還公開了一種具有整合蛋白αIIbβ3特異性的人抗體，該抗體源自一個新設(shè)計(jì)的合成的人抗體庫。首先，上述抗體庫中的兩個半胱氨酸殘基被從HCDR3區(qū)域中去除。HCDR3長度的減少以及二硫鍵的去除導(dǎo)致了HCDR3環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有了更大的結(jié)構(gòu)柔性。經(jīng)過配基結(jié)合測定實(shí)驗(yàn)中的觀察，來源于上述被選出的抗體HCDR3區(qū)的肽(CSFGRGDIRNC)(SECIDNO1)與其線性結(jié)構(gòu)GSFGRGDIRNG(SEQIDNO2)在配體結(jié)合上具有幾乎相同的效能，這一點(diǎn)支持二硫鍵的去除(參見Smith，J.W.，Hu，D.，Scatterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。第二步，我們選擇RAD，而不是RGD，作為整合蛋白結(jié)合核心基序，同時隨機(jī)選擇六個殘基側(cè)接。在對包含RGD區(qū)域的多肽的檢測實(shí)驗(yàn)中，一種包含有RAD區(qū)域的多肽GRADSP已經(jīng)被廣泛用作無活性的對照多肽(參見Wu，M.H.，Ustinova，E.，andGranger，H.J.(2001)Integrinbindingtofibronectinandvitronectinmaintainsthebarrierfunctionofisolatedporcinecoronaryvenues.JPhysiol532，785-791；Slepian，M.J.，Massia，S.P.，Dehdashti，B.，F(xiàn)ritz，A.，andWhitesell，L.)1998)Beta3-integrinsratherthanbetal-integrinsdominateintegrin-matrixinteractionsinvolvedinpostinjurysmoothmusclecellmigration.Circulation97，1818-1827；Guilherme，A.，Torres，K.，andCzech，M.P.(1998)Cross-talkbetweeninsulinreceptorandintegrinalpha5betalsignalingpathways.JBiolChem273，22899-22903；Hautanen，A.，Gailit，J.，Mann，D.M.，andRuoslahti，E.(1989)EffectsofmodifcationsoftheRGDsequenceanditscontextonrecognitionbythefibronectinreceptor.JBiolChem264，1437-1442；Adderley，S.R.，andFitzgerald，D.J.(2000)GlycoproteinIIb/IIIaantagonistsinduceapoptosisinratcardiomyocytesbycaspase-3activation.JBiolChem275，5760-5766).However，thefactthatweselectedRADfromourmotifoptimizationlibrary)。盡管如此，從基序優(yōu)化庫中選擇RAD區(qū)域的情況說明側(cè)接的殘基決定了RAD基序能否與整合蛋白結(jié)合(參見Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。我們假定包含在隨機(jī)側(cè)接區(qū)域中的RAD基序可能增加了選出對于整合蛋白αIIbβ3具有特異結(jié)合力的抗體的可能性。這里我們使用噬菌體展示技術(shù)，從基于隨機(jī)化的HCDR3序列VGXXXRADXXXYAMDV(SEQIDNO3)的合成的人類抗體庫選出對于整合蛋白αIIbβ3具有特異結(jié)合力的單克隆抗體。選出的抗體的HCDR3含有一段具有極強(qiáng)一致性的氨基酸序列(V(V/W)CRAD(K/R)RC)(參見SEQIDNos4，5，6，7)，而且對整合蛋白αIIbβ3具有高特異性，而不與其他RGD結(jié)合整合蛋白如αvβ3，αvβ5和α5β1結(jié)合。同時該抗體，以及來源于其HCDR3區(qū)序列的三段合成多肽VWCRADRRC(SEQIDNO5)，VWCRADKRC(SEQIDNO6)和VVCRADRRC(SEQIDNO7)均強(qiáng)烈地抑制整合蛋白αIIbβ3和纖維蛋白原之間的反應(yīng)，進(jìn)而抑制離體的血小板凝集。據(jù)我們所知，這是第一個具有整合蛋白αIIbβ3特異性的完全人單克隆抗體并且可以有效抑制血小板凝集。本發(fā)明一方面提供了一種分離并提純的血小板凝集肽抑制劑，所述肽具有9到大約50個氨基酸殘基并且具有相應(yīng)于V(V/W)CRAD(K/R)RC(參見SEQIDNos4，5，6，7)的氨基酸序列。該肽優(yōu)選包括SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該肽具有SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列。另一方面，本發(fā)明提供了一種具有能夠與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。該抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)含有氨基酸序列V(R/G)V(V/W)CRAD(R/K)RCYAMDV(參見SEQIDNos8，25，26，28，29，30和31)。優(yōu)選的，該抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)位于抗體的重鏈上。更加優(yōu)選的，該抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)是HCDR3。最優(yōu)選的，該抗體是一種人抗體。示例性和優(yōu)選的抗體在這里被指定為如下抗體中的5種RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或RAD88。本發(fā)明還涉及具有RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或RAD88中任一個的免疫反應(yīng)性的抗體。本發(fā)明的另一方面也提供了一種抑制血小板凝集的方法，該方法包括將血小板與抑制有效量的本發(fā)明中的肽或抗體相接觸的步驟。本發(fā)明的另一方面也提供了一種抑制血纖維蛋白原與血小板發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的方法，該方法包括將血小板與抑制有效量的本發(fā)明中的肽或抗體相接觸的步驟。本發(fā)明的一個實(shí)施方案中提供了含有此處所述的結(jié)合位點(diǎn)，并且可以與預(yù)先選定的靶分子發(fā)生特異性結(jié)合的人單克隆抗體。本發(fā)明同時描述了可以產(chǎn)生這種抗體分子的細(xì)胞系，培養(yǎng)該細(xì)胞系的方法以及生產(chǎn)這種人單克隆抗體的方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，展示于噬菌粒顆粒表面的是一種融合蛋白，該融合蛋白包含一條免疫球蛋白的重鏈或輕鏈和絲狀噬菌體膜錨定蛋白。事實(shí)上，該展示蛋白是一種工程化的免疫球蛋白的輕鏈或重鏈，其中導(dǎo)入了結(jié)合位點(diǎn)。此外，在本發(fā)明的很多實(shí)施方案中，該展示蛋白是作為異源二聚體在噬菌體表面上被表達(dá)制備的，該異源二聚體由重鏈和輕鏈多肽組成，其中一個或另一個與膜錨定蛋白形成融合蛋白。因此，當(dāng)重鏈作為融合蛋白時，優(yōu)選實(shí)施方案中的展示蛋白包含F(xiàn)ab片段，其具有錨定重鏈和輕鏈。在其中一個實(shí)施方案中，本發(fā)明也提供了一種編碼上述人單克隆抗體的多核苷酸。該單克隆抗體含有此處所述的結(jié)合位點(diǎn)并且人單克隆抗體可以特異性地結(jié)合事先選定的靶分子。編碼該人單克隆抗體的核苷酸序列可以通過測序來鑒定氨基酸序列。DNA測序的方法已經(jīng)被廣泛使用而且該方法可以用來實(shí)施本發(fā)明中的實(shí)施方案。這些方法可能會使用如下酶DNA聚合酶I的Klenow片段，SEQUENASE(USBiochemical，ClevelandOhio)，Taq聚合酶(Pekin-Elmer)，熱穩(wěn)定性T7聚合酶(AmershamPharmaciaBiotech，PiscatawayN，J.)，或者是DNA聚合酶和糾錯外切酶的組合，如在ELONGASE擴(kuò)增系統(tǒng)中所使用(LifeTechnologies，GaithersburgMd.)。優(yōu)選的，序列被如下面的機(jī)器自動制備，這些機(jī)器包括HamiltonMICROLAB2200(Hamilton，RenoNev.)，Peltierthermalcycler200(PTC200；MJResearch，WatertownMass。)以及ABICATALYST800(Perkin-Elmer)。然后使用ABI373，377DNA測序系統(tǒng)(Perkin-Elmer)，MEGABACE1000DNA測序系統(tǒng)(MolecularDynamics，SunnyvaleCalif.)或者其他一些本領(lǐng)域已知的系統(tǒng)。最后再使用本領(lǐng)域中廣泛使用的算法對測序結(jié)果進(jìn)行分析(參見Ausubel，F(xiàn).M.(1997)ShortProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NewYorkN.Y.，unit7.7；Meyers，R.A.(1995)MolecularBiologyandBiotechnology，WileyVCH，NewYorkN.Y.，pp.856-853.)。本發(fā)明中產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞系的制備方法在這里進(jìn)行了詳細(xì)的描述首先使用噬菌粒載體誘變的方法，然后使用常規(guī)的篩選技術(shù)來檢測目的單克隆抗體的基本結(jié)合模式，以確定該抗體的結(jié)合位點(diǎn)是否存在。因此，如果一個待測的人單克隆抗體能夠與預(yù)先選出的靶分子結(jié)合，那么該待測人單克隆抗體就被認(rèn)為等同于本發(fā)明中的細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體。不經(jīng)過艱苦的試驗(yàn)，通過檢測一個人單克隆抗體是否能夠抑制本發(fā)明中人單克隆抗體與預(yù)先選出的靶分子之間的結(jié)合來證明該抗體是否等同于本發(fā)明中的單克隆抗體是有可能的。如果通過標(biāo)準(zhǔn)競爭性檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的人單克隆抗體對固相化的靶分子的結(jié)合降低，則表明待測單克隆抗體與本發(fā)明的抗體競爭那么就證明很有可能這兩種單克隆抗體可以結(jié)合相同的，或者是密切相關(guān)的表位。另外還有一種方法可以用來證明待測人單克隆抗體是否具有與本實(shí)驗(yàn)中人單克隆抗體或肽相同的特異性首先使用可以與本發(fā)明中人單克隆抗體或多肽發(fā)生特異反應(yīng)的靶分子來孵育該抗體或者多肽；然后加入待測的人單克隆抗體以檢測該待測人單抗與靶分子的結(jié)合力是否被抑制。如果該待測人單抗的結(jié)合力被抑制，那么證明該待測人單抗與本發(fā)明中的人單抗或肽具有相同的，或者功能等同的表位特異性。除此以外，還有一種方法可以用來證明待測人單克隆抗體是否具有與本實(shí)驗(yàn)中人單克隆抗體或多肽相同的特異性首先確定待測抗體的抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)的氨基酸序列。具有完全相同或者功能等同的氨基酸序列的CDR的抗體分子具有相同的結(jié)合特異性。氨基酸序列測序的方法在本領(lǐng)域眾所周知。一個抗體的免疫特異性，靶分子結(jié)合能力及其對于表位的親和性由與該抗體發(fā)生特異免疫反應(yīng)的表位來定義。這種表位特異性至少有一部分被該抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列所定義，還有部分地被輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列所決定。特別優(yōu)選的人單克隆抗體具有由大腸桿菌、真菌等微生物，雜交瘤細(xì)胞或者下面將要介紹到的質(zhì)粒載體所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特性。該領(lǐng)域中制備肽，多肽，蛋白質(zhì)以及抗體的方法均已經(jīng)熟知。短語“具有結(jié)合特異性”是指相當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w對預(yù)先選擇的靶分子具有相同或者近似的免疫反應(yīng)性，并且競爭與靶分子結(jié)合。術(shù)語“保守的變異”是指抗體肽鏈上的某個氨基酸被另外一個氨基酸所取代，產(chǎn)生的新的抗體仍然能夠特異性地結(jié)合預(yù)先選擇的目標(biāo)分子。類似的，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案涉及編碼上述重鏈和/或輕鏈的核苷酸序列及其互補(bǔ)序列?；パa(bǔ)序列是指在極為嚴(yán)緊的雜交實(shí)驗(yàn)條件下，能夠與上述核苷酸序列發(fā)生雜交反應(yīng)的核苷酸序列。人單克隆抗體與鼠單克隆抗體相比，具有特別的優(yōu)點(diǎn)，尤其是在作為用于人類的治療劑時。特定的，人單克隆抗體不會被作為“外來的”抗原而很快地被清理掉，而且不會像外來抗原或外來抗體一樣激活人體免疫系統(tǒng)。本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了由當(dāng)前方法制備的本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及截短的免疫球蛋白分子，其含有來自本發(fā)明的人單克隆抗體的Fab片段。沒有Fc受體的Fab片段是可溶的，而且在血漿中具有更長的半衰期，因此具有在治療劑方面的優(yōu)勢；而且在使用可溶性Fab的模式也具有診斷優(yōu)勢?？扇苄訤ab片段的制備在免疫學(xué)領(lǐng)域都已被熟知，而且有很多種方法可以用來制備該片段。這里描述了其中一種優(yōu)選的制備可溶性Fab片段的方法。優(yōu)選的，本發(fā)明的抗體可以與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，即和其他的整合蛋白分子相比，該抗體優(yōu)先與整合蛋白αIIbβ3特異性的結(jié)合。這里作為示例和優(yōu)選的抗體在這里被指定為RAD3，RAD4，RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或者RAD88。這些抗體的VH區(qū)的氨基酸序列如圖6所示。特別優(yōu)選的，該人單克隆抗體是指具有免疫反應(yīng)特異性的單克隆抗體，其具有成對出現(xiàn)的重鏈和輕鏈免疫球蛋白可變區(qū)的氨基酸序列，所述輕鏈?zhǔn)侵冈谶@里描述的輕鏈，而該重鏈具有一個如圖6中所示的氨基酸序列及其保守取代基。表2那些和表2相比具有較弱保守性的取代基可以通過挑選殘基進(jìn)行選擇，所述殘基在以下性質(zhì)的維持反面顯著不同(a)取代區(qū)肽鏈骨架結(jié)構(gòu)，比如片層和螺旋狀結(jié)構(gòu)；(b)目標(biāo)位點(diǎn)分子的電荷或者疏水性；或(c)側(cè)鏈的體積。一般認(rèn)為發(fā)生在下列結(jié)構(gòu)中的取代會最大程度上改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)(a)親水殘基，比如絲氨?；?，蘇氨酰基，取代為(或被取代為)一個疏水殘基，比如亮氨酰基，異亮氨酰基，苯丙胺?；?，纈氨?；滨；?b)一個半胱氨酸或脯氨酸取代為(或被取代為)別的殘基；(c)一個帶正電側(cè)鏈的殘基，如賴氨?；滨；蛘呓M胺?；?，取代為(或被取代為)一個帶負(fù)電側(cè)鏈的殘基，如谷氨?；?，天冬氨?；?；或者(d)一個有較大體積側(cè)鏈的殘基，如苯丙氨酸，取代為(或被取代為)一個不帶側(cè)鏈的殘基，如甘氨酸。有許多種方法，比如斯卡查德分析法(Scatchardanalysis)，可以與放射性免疫測定法相結(jié)合來測定抗體對一種整合蛋白的親和力。親和力是用一個結(jié)合常數(shù)Ka來表示的，Ka被定義為在平衡狀態(tài)下，整合蛋白-抗體復(fù)合物的摩爾濃度與游離抗原和游離抗體的摩爾濃度的比值。一個多克隆抗體制劑的組分會對不同的整合蛋白表位具有不同的親和性，因此該制劑的結(jié)合常數(shù)Ka是指該制劑組分對于整合蛋白的親和性或親和力的平均值。而一個單克隆抗體制劑的組分則對某一個特殊的整合蛋白表位具有單一的特異性，因此該制劑的結(jié)合常數(shù)Ka則是其親和力的真實(shí)量度。Ka值在109-1012L/mol的高親和力抗體制劑被優(yōu)先用于免疫測定，在此免疫測定過程中，整合蛋白-抗體復(fù)合物必須經(jīng)過一些十分劇烈的處理過程。而Ka值在106-107L/mol的低親和力抗體制劑則被優(yōu)先用于一些免疫純化或類似過程中，在這類過程中整合蛋白最終需要從抗原上解離，而且優(yōu)選以具有活性的形態(tài)存在。(參見Catty，D.(1988)Antibodies，VolumeIAPracticalApproach，IRLPress，Washington，D.C.；andLiddell，J.E.andCryer，A.(1991)APracticalGuidetoMonoclonalAntibodies，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)親和力同樣也可以用解離常數(shù)Kd來表述。優(yōu)選的結(jié)合力包括那些具有低于如下數(shù)值的Kd值10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M或10-13M。另一方面，本發(fā)明提供了一種可以抑制血小板凝集的肽。該肽具有9到約50個氨基酸殘基，而且該肽來源于本發(fā)明的抗體。優(yōu)選的，該肽包含有符合如下通式的氨基酸序列V(V/W)CRAD(K/R)RC(參見SEQIDNOs4，5，6，7)。作為示例的優(yōu)選的肽在下面實(shí)施例中進(jìn)行了闡明。本發(fā)明涉及用于實(shí)施這里所描述的治療方法的組合物。本發(fā)明的組合物包含一種生理上可接受的載體以及至少一種源于此處所述的人單克隆抗體和肽，該單克隆抗體或肽作為活性成分溶解或分散于組合物中。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物在施用于人作為治療之用的時候不具有免疫原性。術(shù)語“藥學(xué)可接受的”，“生理上可接受的”以及關(guān)于此的其他一些闡述方式，當(dāng)它們被用于形容組合物，載體，稀釋劑和試劑的時候，是可替交地使用的，而且它們代表這些材料是可以被施用于人，同時不會引起諸如惡心，頭暈，胃部不適等不良生理反應(yīng)。在本領(lǐng)域，關(guān)于含有溶解或分散于其中的活性成分的藥用組合物的制備方法已經(jīng)被廣泛了解。通常是把該藥用組合物制備成為無菌的注射劑，液體溶液或乳濁液，水化的或非水化的，盡管如此，也可以將該藥用組合物制備成適宜在用前制成溶液或者懸濁液的固態(tài)。該制劑也可以被乳化。因此，一種包含了抗體分子的組合物可以采取溶液，懸濁液，片劑，膠囊，緩釋劑，粉術(shù)或其他劑型。該活性組分可以和一些藥學(xué)上可接受，而且和該活性組分的活性不沖突的賦形劑混合，該活性組分應(yīng)該根據(jù)這里描述的治療方法來確定其合適的施用量。適合的賦形劑包括，舉例來說水，鹽溶液，葡萄糖，甘油，乙醇等及其組合。另外，如果需要的話，該組合物還可以包含微量的輔助劑，比如潤濕劑，乳化劑，pH緩沖液等可以增強(qiáng)該活性組分的效力的物質(zhì)。該發(fā)明中治療組合物可以包含組分的藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離端的氨基形成)，該酸加成鹽是由無機(jī)酸，例如鹽酸，磷酸，或者是諸如乙酸，酒石酸，苯乙醇酸等的有機(jī)酸形成的。由游離端羧基形成的鹽也可能來源于無機(jī)堿，比如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣和氫氧化鐵等；或者來源于有機(jī)堿，比如異丙胺，三甲胺，2-乙基乙醇，組氨酸和普魯卡因等。生理上可接受的載體在本領(lǐng)域是眾所周知的。示例性的液態(tài)載體是滅菌的水溶液，該水溶液可以除了活性組分和水以外不含有別的物質(zhì)，也可以含有具有生理pH值的磷酸鈉，或者生理鹽水，或者兩者都含有，比如磷酸鹽緩沖液。另外，該液態(tài)載體也可以含有多于一種的緩沖鹽類，以及諸如氯化鈉，氯化鉀，葡萄糖，丙二醇，聚乙二醇和其他溶質(zhì)。液態(tài)組合物也可以包括有或無水的液相，該液相舉例來說包括甘油，植物油，比如棉籽油，有機(jī)酯，比如乙基油酸，以及水油乳劑。一種治療組合物包含有本發(fā)明中的人單克隆抗體，通常其量為每重量總治療組合物至少0.1％重量的所述抗體。重量百分比是抗體的重量與總組合物的比率。因此，舉例來說，重量百分比0.1是指每100克總治療組合物中含有0.1克抗體。優(yōu)選地，一種含有抗體的治療組合物一般含有大約10微克(μg)每毫升(ml)到大約100毫克(mg)每毫升(ml)的抗體作為活性組分，更加優(yōu)選的，含有大約1mg/ml到大約10mg/ml。(即，大約0.1-1重量百分比)。在另一實(shí)施方案中，一種治療組合物包含有本發(fā)明中的肽，通常其量為每重量總治療組合物至少0.1％重量的所述肽。重量百分比是肽的重量與總組合物的比率。因此，舉例來說，重量百分比0.1是指每100克總治療組合物中含有0.1克肽。優(yōu)選地，一種含有肽的治療組合物一般含有大約10微克(μg)每毫升(ml)到大約100毫克(mg)每毫升(ml)的肽作為活性組分，更加優(yōu)選的，含有大約1mg/ml到大約10mg/ml。(即，大約0.1-1重量百分比)。本發(fā)明在另一方面提供了一種治療方法，該治療方法中使用的是本發(fā)明中的組合物和化合物。考慮到在病人體內(nèi)使用人單克隆抗體的益處，這里描述的抗體非常適合作為一種用于體內(nèi)的治療試劑，所述抗體可以用于阻斷或抑制那些能夠與該抗體結(jié)合的目標(biāo)分子的功能。這里描述的來源于該單克隆抗體的肽也可以用于本發(fā)明中的治療方法。該治療方法包括將確定含有目標(biāo)分子的樣品與含有治療有效劑量的本發(fā)明中的人單克隆抗體或肽的組合物相接觸，該單克隆抗體或肽能夠與該目標(biāo)分子結(jié)合。對于體內(nèi)模式來說，該治療方法包括給病人使用治療有效劑量的生理上可接受的組合物，該組合物含有本發(fā)明中的人單克隆抗體或肽。該單克隆抗體和肽的施用量的范圍是指足夠產(chǎn)生預(yù)期效果的劑量，該預(yù)期效果是指由目標(biāo)分子產(chǎn)生的疾病的癥狀得到改善。施用劑量不能大到產(chǎn)生不良副作用的程度，該不良副作用包括高血粘度綜合征，肺部水腫，充血性心臟衰竭以及類似病癥。一般地，施用劑量應(yīng)該因病人的年齡，情況，性別以及患病程度的不同而不同，該劑量可以由本領(lǐng)域中有經(jīng)驗(yàn)的人員決定。在發(fā)生并發(fā)癥的情況下，醫(yī)師可以調(diào)整該劑量。典型地，本發(fā)明中抗體的治療有效劑量是指在該抗體存在于一種生理上可接受的組合物中被施用時，足夠使其血漿濃度達(dá)到大約0.1微克(μg)每毫升(ml)到大約100μg/ml，優(yōu)選濃度為大約1μg/ml到大約5μg/ml，通常為5μg/ml的劑量。不同的描述是，該劑量可以在大約0.1mg/kg到大約300mg/kg之間變化，優(yōu)選劑量為大約0.2mg/kg到大約200mg/kg之間，最為優(yōu)選的劑量可以在大約0.5mg/kg到大約20mg/kg之間變化，每天一次或多次施藥，連續(xù)施藥一天或多天。典型地，本發(fā)明中肽的治療有效劑量是指在該肽存在于一種生理上可接受的組合物中被施用時，足夠使其血漿濃度達(dá)到大約0.1微克(μg)每毫升(ml)到大約100μg/ml，優(yōu)選濃度為大約1μg/ml到大約10μg/ml。不同的描述是，該劑量可以在大約0.1mg/kg到大約300mg/kg之間變化，優(yōu)選劑量為大約0.2mg/kg到大約200mg/kg之間，每天一次或多次給藥，連續(xù)給藥一天或多天。本發(fā)明中的人單克隆抗體或肽可以通過非腸道注射或者逐步滴注(gradualinfusionovertime)的方式給藥。雖然目標(biāo)分子在體內(nèi)一般可以通過全身施藥來達(dá)到，而且因此最為常用的方法就是通過靜脈注射該治療組合物，但是其他的組織和輸送方法在該目標(biāo)組織也可能含有目標(biāo)分子的時候也被使用。因此，本發(fā)明中的人單克隆抗體和肽可以通過靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，腔內(nèi)，透皮施藥，同時也可以通過蠕動裝置來輸送。包含了本發(fā)明中人單克隆抗體或肽的治療組合物一般采用靜脈的方法施藥，比如通過注射一個單位劑量的治療組合物。術(shù)語“單位劑量”在本發(fā)明的治療組合物參考使用時是指適宜以單一劑量施用于個體的物理上分散的單位，每一個單位包含有預(yù)先計(jì)算好的，能夠產(chǎn)生預(yù)期療效的活性物質(zhì)和需要的稀釋劑，即載體或媒介物。該組合物以一種和劑量形式相容的模式來施用，而且施用量為治療有效劑量。施用量取決于被治療的個體，該個體可以利用活性組分的系統(tǒng)的能力以及所需的治療效果?；钚越M分的精確施用量取決于醫(yī)師的判斷，而且每一個個體都是獨(dú)特的。盡管如此，合適的系統(tǒng)施用劑量范圍在這里被公開，而且該劑量決定于施用途徑。適宜的施藥方案同樣也是多種多樣的，但是典型的該適宜的施藥方案包括初次施藥后，每間隔一小時或幾個小時再通過隨后的注射或其他施用重復(fù)劑量。作為選擇，也可以使用連續(xù)的靜脈滴注以維持血液中的濃度在體內(nèi)具有治療效果。一種含有整合蛋白αIIbβ3結(jié)合位點(diǎn)的抗整合蛋白αIIbβ3的單克隆抗體或由此單克隆抗體衍生出的肽可以在體內(nèi)或體外用于調(diào)節(jié)血小板上整合蛋白αIIbβ3的功能。比如，該人單克隆抗體或肽可以被用在藥學(xué)上可接受的組合物，當(dāng)該組合物以有效劑量被施用于人體的時候，能夠抑制血小板凝集，因此可以降低血栓形成的可能性。因此，一種抑制血小板凝集的抗整合蛋白αIIbβ3的單克隆抗體在體內(nèi)的使用可以調(diào)節(jié)體內(nèi)任何由血小板凝集所導(dǎo)致的生理應(yīng)答，比如血液凝固和一些炎癥反應(yīng)。當(dāng)該方法在體內(nèi)實(shí)施時，有效劑量的抗體或肽的組合物通過靜脈內(nèi)給藥的方法施用于哺乳動物，該抗體或肽的組合物含有生理上可接受的稀釋劑以及可以與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生免疫反應(yīng)同時可以抑制血小板凝集的抗體分子。同時該哺乳動物被保持足夠時間，以使得抗體分子能夠和整合蛋白αIIbβ3發(fā)生免疫反應(yīng)而且形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物，同時也使得含有該肽的結(jié)合位點(diǎn)和整合蛋白αIIbβ3結(jié)合并形成一種肽-受體復(fù)合物，這樣一般的配基就不能夠和受體結(jié)合了。本發(fā)明中具有整合蛋白αIIbβ3特異性的抗體可以被用作一種抗血栓類治療劑。該抗體(或其片段)可以被用于抑制血小板凝集和血栓形成。該抗體也同樣可以被用于抑制由血小板凝集引起的周期性的流動變化，該過程可能早于血栓的形成或再形成。該抗體可以被用于許多種需要避免血栓形成或再形成(栓塞)的過程中。比如，該抗體可以被施用于個體(比如哺乳動物如人)，來避免肺部栓塞，暫時性缺血發(fā)作(TIAs)，深靜脈栓塞，冠狀動脈旁路手術(shù)以及在放置人工瓣膜或脈管(比如在自體，非自體的或者人造的脈管移植中)的手術(shù)中所引起的血栓形成。本發(fā)明中的抗體也可以被施用于個體來避免血管成形術(shù)中產(chǎn)生的血小板凝集和血栓形成，該血管成形術(shù)可以由氣囊，冠狀動脈粥樣斑塊切除術(shù)，激光血管成形術(shù)或其他的一些適宜方法來完成。抗體可以在血管成形術(shù)過程之前施用(早于血管成形術(shù)的)，血管成形術(shù)過程中施用或血管成形術(shù)后施用。這種治療方法可以避免血栓形成，并因此降低血管成形術(shù)后出現(xiàn)血栓形成并發(fā)癥的可能性，該并發(fā)癥包括諸如死亡，心肌梗塞或是需要進(jìn)行PTCA或冠狀動脈旁路手術(shù)的再發(fā)缺血事件。血小板凝集激活凝固級聯(lián)反應(yīng)，并產(chǎn)生一種更加穩(wěn)定的血纖維蛋白原網(wǎng)和栓塞塊，這些都可以使用溶血栓劑來使其溶解。該抗體可以被單獨(dú)施用于個體(如人)，或者是和一種溶血栓劑一起使用來防止或降低發(fā)生在溶血栓反應(yīng)之后的再栓塞的發(fā)生，并且加速斑塊的溶解速度。所述溶血栓劑包括比如一種纖維蛋白溶酶原活化劑(如組織纖維蛋白溶酶原活化劑，尿激酶或鏈激酶，重組的組織纖維蛋白溶酶原活化劑)或者是一種抗凝血劑或抗血小板藥物，比如阿司匹林，肝素或香豆素抗凝血劑(如warfarin)。該抗體或片段可以先于溶血栓劑或抗凝血劑施用，同時施用，或者是在溶血栓劑或抗凝血劑之后施用。該抗體或片段的施用量為足夠抑制能夠?qū)е略偎ㄈ纬傻难“迥Ｔ摽贵w或抗體的片段的有效劑量(如，抑制血小板凝集并因而抑制血栓形成的有效劑量)可以利用一種藥學(xué)上可接受的載體，比如滅菌鹽溶液，通過非腸道的方式給藥，優(yōu)選的方式是靜脈給藥。緩沖介質(zhì)也可以包含其中。該抗體制劑通常也可以包含添加劑，比如穩(wěn)定劑(如聚山梨醇酯80，USP/NF)。該抗體可以單劑量給藥，或連續(xù)給藥，或多樣給藥(例如，一次大量注射后進(jìn)行連續(xù)滴注)。作為選擇，該抗體可以通過一種控釋裝置(例如，通過一種多聚體給藥系統(tǒng)或膜片給藥系統(tǒng))或者其他的適宜方法來給藥。施藥量取決于很多因素，例如臨床癥狀，個體重量，是否施用其他藥物(例如溶血栓劑)等。本發(fā)明中具有整合蛋白αIIbβ3特異性的免疫球蛋白也可以被用于血栓成像。在此用途中一般優(yōu)選抗體片段。如前所述，嵌合的重鏈基因可以被設(shè)計(jì)成被截短的形態(tài)以合成一種嵌合的免疫球蛋白片段(例如Fab，F(xiàn)ab’或F(ab’)2)，并將該片段用于免疫熒光閃爍成像。這些分子可以用放射性同位素，如碘131，碘125，锝99或碘111等直接標(biāo)記，也可以通過偶聯(lián)的螯合劑，如DTPA來標(biāo)記，進(jìn)而產(chǎn)生放射免疫熒光閃爍造影劑。此外，也可以通過把放射性金屬結(jié)合功能域(螯合區(qū))通過工程學(xué)手段加入到該嵌合抗體位點(diǎn)以產(chǎn)生可以用來標(biāo)記的位點(diǎn)。因此，免疫球蛋白可以被設(shè)計(jì)成包含非人類血小板特異性的可變區(qū)，人恒定區(qū)(優(yōu)選為截短的)以及來自于金屬結(jié)合蛋白比如金屬硫蛋白的金屬結(jié)合功能域。該整合蛋白αIIbβ3特異性的免疫球蛋白被施用到疑有血栓的病人體內(nèi)。在該標(biāo)記的免疫球蛋白已經(jīng)充分定位于血栓位點(diǎn)以后，標(biāo)記產(chǎn)生的信號可以由一部光掃描裝置，例如伽瑪照相機(jī)來進(jìn)行探測。然后探測到的信號再轉(zhuǎn)變成血栓的影像。該影像使得對于血栓在體內(nèi)的定位以及合適治療方案的制定成為了可能。以下實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，并不以任何方式對本發(fā)明的說明書或權(quán)利要求進(jìn)行限制。實(shí)施例細(xì)胞系，蛋白質(zhì)和肽人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)是從Biowhittaker公司(Walkersville，MA)購買的，而且該細(xì)胞是在隨細(xì)胞一起購買的EGM-2培養(yǎng)基(Biowhittaker)中培養(yǎng)的。整合蛋白αIIbβ3是從酶研究實(shí)驗(yàn)室(SouthBend，IN)購買的。整合蛋白αvβ3和整合蛋白αvβ5是從Chemicon公司(Temecula，CA)購買的。人血纖維蛋白原是從Sigma-Aldrich公司(St，Louis，MO)購買的。本實(shí)驗(yàn)中所使用的肽是Peptron公司(Taejon，Korea)合成的。人血纖維蛋白原和肽都是使用EZ-link-PFP-生物素(Pierce，Rockford，IL)，同時按照公司提供的使用說明進(jìn)行生物素(酰)化的。阿昔單抗(ReoPro)是從EliLilly公司(Indianapolis，IN)購買的。文庫的建立使用TRIREAGENTRNA抽提試劑(MolecularResearchCenter，Cincinnati，OH)從六位健康的志愿者捐贈的骨髓中提取總RNA。第一鏈cDNA可以使用SUPERSCRIPT預(yù)擴(kuò)增系統(tǒng)(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)，利用寡(dT)引物法來合成。然后使用引物neo-rad-f(GTGTATTACTGTGCGAGAGTGGGGNNKNNKNNKCGTGCCGACNNKNNKNNKTACGCTATGGACGTCTGGGGC)(參見SEQIDNO9的序列圖)，引物dpseq(AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC)(參見SEQIDNO10的序列圖)以及噬菌粒載體pCcomb3X-TT(參見Barbas，C.F.3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.)2001)PhageDisplayALaboratoryMannal，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)作為模板，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法對編碼如下片段的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)編碼部分FR3片段、隨機(jī)化HCDR3序列以及融合到重鏈恒定區(qū)I(CH1)的重鏈可變區(qū)VH)的FR4區(qū)域。在編碼重鏈可變區(qū)(VH)中FR1區(qū)到FR3區(qū)的cDNA的擴(kuò)增過程中，我們使用引物DP-47N-term(GCTGCCCAACCAGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTA)(參見SEQIDNO11的序列圖)和引物DP-47FR3(CACTCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGCTCT)(參見SEQIDNO12的序列圖)來對先前制備的人骨髓cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有的擴(kuò)增反應(yīng)都是使用Pharmacia公司(Piscataway，NJ)的Taq聚合酶，在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行的。兩個cDNA片段則使用疊加延伸PCR方法，用引物lead-VH(GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC)(參見SEQIDNO13的序列)和引物dp-Ex(GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC)(參見SEQIDNO14的序列)進(jìn)行連接。對于以前選出的存在于噬菌粒載體pCcomb3X-TT上的DPK-26人κ輕鏈cDNA，則使用引物ompseq(AAGACAGCTATCGCGATTGCAGTG)(參見SEQIDNO15中序列)和引物leadB(GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC))參見SEQIDNO16中序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。編碼重鏈片段的cDNA庫和輕鏈通過疊加延伸PCR反應(yīng)，使用引物ompseq和引物dp-Ex進(jìn)行融合。所形成的Fab編碼序列庫用SfiI(Roche，Indianapolis，IN)消化后連接到如噬粒載體pComb3X，然后再轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌ER2537菌株(NewEnglandBiolabs，BeverIy，MA)中(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。庫的篩選一共進(jìn)行了7輪的淘選過程(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。首先，前5輪進(jìn)行的是抗固定化人整合蛋白αIIbβ3的淘選過程，在該過程中使用包含100ng蛋白的50μl金屬緩沖液(25mMTris-HCl，pH7.5，137mMNaCl，1mMKCl，1mMMgCl2，1mMCaCl2和1mMMnCl2)作為包被液。Tween20濃度為0.05％的TBS(Tris-bufferedsaline)溶液作為漂洗液和胰蛋白酶(Becton-Dickson)濃度為10mg/ml的TBS溶液作為洗脫液。淘選過程中使用的是96孔板(Costar3690，Corning，NY)。在37℃時胰蛋白酶消化30分鐘。在第六輪淘選過程中，包含25ng蛋白的金屬離子緩沖液被用于包被，Tween20濃度為0.5％的TBS溶液作為漂洗液。在第七輪淘選過程中，包含12.5ng蛋白的金屬離子緩沖液被用于包被。第一輪中，96孔板被漂洗5次，第二輪和第三輪漂洗10次，其余四輪漂洗15次。每一輪淘選過程后產(chǎn)生的噬菌體池都使用噬菌體ELISA方法進(jìn)行測定，該噬菌體ELISA測定過程中使用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗-M13作為二級抗體。最后一輪淘選結(jié)束后，輸出培養(yǎng)皿里長出的單菌落所產(chǎn)生的噬菌體被使用噬菌體ELISA的方法來測試其對人整合蛋白αIIbβ3的結(jié)合情況。(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。輕鏈重排和篩選編碼Vκ和Vλ的cDNA從所制備的人骨髓cDNA中擴(kuò)增出來，該過程使用的是早先報道過的引物(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)，該引物包含可以與各種Vκ和Vλ家族N末端編碼序列雜交的有義引物，也包括可以與Vκ和Vλ的FR4區(qū)中C術(shù)端編碼序列雜交的反義引物，這些引物均為高度保守的(參見Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.，andFoeller，C.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，PublicHealthService，Natl.Inst.Health，Bethesda)。如所述制備Cκ和Cλ的編碼序列(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)，而且該編碼序列通過疊加延伸PCR的方法被分別融合到Vκ和Vλ的編碼序列，該過程使用的是引物RSC-F(GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGCTC)(參見SEQIDNO17中序列)和引物lead-B(GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC)(參見SEQIDNO18)。兩種克隆方案被用于從篩選出來的Fab中取代DPK-26人κ輕鏈。策略一中，DPK-26人κ輕鏈編碼cDNA用內(nèi)切酶SacI和XbaI(NewEnglandBiolabs)消化的方法，從最后一次淘選結(jié)束后得到的噬粒載體池中移除。接著用相同的限制性內(nèi)切酶消化人輕鏈編碼序列庫，并將其連接到準(zhǔn)備好的噬粒載體，然后再轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌ER2537菌株內(nèi)。第二種策略中，使用引物lead-VH和引物dpseq將重鏈片段編碼cDNA從最后一次淘選結(jié)束后得到的噬粒載體池中擴(kuò)增出來，然后再使用引物ompseq和dp-EX，通過疊加延伸PCR反應(yīng)將這些重鏈片段編碼cDNA和人輕鏈編碼序列庫融合起來。得到的Fab編碼庫用內(nèi)切酶SfiI消化，然后連接到如噬粒載體pComb3X，再使用先前描述的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌ER2537菌株中(具體參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。在這兩種輕鏈庫混合后進(jìn)行了3輪淘選，每次使用12.5ng包被的整合蛋白αIIbβ3。每一輪反應(yīng)中，樣品孔被漂洗15次。在最后一次淘選結(jié)束之后，噬菌體由輸出培養(yǎng)皿里長出的單菌落產(chǎn)生，同時使用所述噬粒ELISA的方法來檢測該噬菌體對整合蛋白αIIbβ3的結(jié)合情況(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。ELISA合成可溶性Fab的方法采用已經(jīng)出版的方法(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。簡要地，篩選出的菌落在5ml超級培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)6小時，加入IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，Sigma-Aldrich)至最終濃度1mM后培養(yǎng)過夜。Costar369096孔板的每一個樣品孔用含有100ng整合蛋白αIIbβ3的50μl金屬離子緩沖液在4℃下包被過夜。該96孔板中加入含有3％(w/v)脫脂乳的TBS包被液，然后37℃下孵育1小時進(jìn)行封閉。接下來，50μl被等體積的含有3％(w/v)脫脂乳的TBS溶液稀釋過的該培養(yǎng)基的上清液，50μl用含有3％(w/v)脫脂乳的TBS溶液稀釋到終濃度為1μg/ml的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的大鼠抗-HA單克隆抗體3F10(Roche)，以及50μlABTS底物溶液(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)被陸續(xù)加入樣品孔中。在加入反應(yīng)試劑之前，該96孔板應(yīng)該用含0.05％Tween20的TBS溶液洗滌5次。過程中的每一步該96孔板都要在37℃下孵育1小時。為了檢測篩選出Fab的交叉反應(yīng)性，在上述相同的條件下使用包被過的整合蛋白αvβ3，αvβ5和α5β1進(jìn)行平行試驗(yàn)。纖維蛋白原結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)Costar369096孔板的樣品孔用50μl含有100ng整合蛋白αIIbβ3的金屬離子緩沖液4℃包被過夜。該96孔板用水漂洗兩遍，并且用160μl含有3％(w/v)脫脂乳的TBS封閉液37℃下封閉1小時。該96孔板用水簡單漂洗以后，每一個樣品孔都加入了50μl含有Fab、提純的FabsRAD87和阿昔單抗的培養(yǎng)基上清液，或者是50μl混合了合成肽和1.2μM生物素酰化纖維蛋白原的含3％(w/v)脫脂乳的TBS溶液。Fab的最終濃度被調(diào)整為介于1.3×10-8M到8.0×10-7M之間；而上述合成肽的最終濃度被調(diào)整為介于8.9×10-8M到9.1×10-5M之間。所加入的試劑首先在37℃下孵育2個小時，再用水漂洗10次，然后用含0.05％Tween20的TBS溶液漂洗5次后加入50μl稀釋于含3％脫脂乳的TBS溶液中的0.5μg/ml的鏈(霉)親和素-辣根過氧化物酶(streptavidine-HRP)，于37℃下孵育1小時。如上漂洗后，再加入50μlABTS底物溶液(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。該實(shí)驗(yàn)每一種濃度重復(fù)三次，并計(jì)算結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。流式細(xì)胞術(shù)從一位健康的志愿者身上抽取外周血，并且收集在一個ACD試管(BectonDickinson，SanJose，CA)中。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)用0.05％(w/v)的胰蛋白酶，0.53mMEDTA(LifeTechnologies)處理5分鐘，再以500g轉(zhuǎn)速離心2分鐘收集，然后再懸浮于含1％(w/v)BSA的PBS溶液中。隨后向重懸于40μl含1％(w/v)BSA的PBS溶液，或者是重懸于40μl外周血中的細(xì)胞中加入FabRAD87或者Fab阿昔單抗。室溫下孵育40分鐘后用含1％(w/v)BSA的PBS溶液漂洗2次，然后加入10μl偶聯(lián)的FITC和抗-人IgG多克隆抗體(Sigma-Aldrich)，該抗體稀釋于750μl含1％(w/v)BSA的PBS溶液。加入該溶液后室溫下孵育20分鐘。用含1％(w/v)BSA的PBS溶液漂洗2次之后，可以使用來自BectonDickinson公司(SanJose，CA)的FACStar儀器進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。血小板凝集檢測人類外周血的采集如前所述。富含血小板的血漿(PRP)以轉(zhuǎn)速135g離心15分鐘的方法，從采集到的外周血中獲得。接下來以轉(zhuǎn)速1500g離心15分鐘產(chǎn)生了血小板含量較少的血漿(PPP)。通過混合PRP和PPP可以制備血小板濃度為300000-350000個/μl血漿的條件性(conditioned)血漿。溶解于15μlPBS的RAD87單克隆抗體，阿昔單抗和肽分別加入435μl的該血漿，以使得單克隆抗體的最終濃度20nM到100nM之間，肽的最終濃度為0.4μM到90μM之間。血小板凝集檢測是按照以前描述的方法并且使用全血比濁法(lumi-aggregometer)(Chrono-log，Havertown，RA)進(jìn)行的(參見Klinkhardt，U.，Kirchmaier，C.M.，Westrup，D.，Breddin，H.K.，Mahnel，R.，Graff，J.，Hild，M.，andHarder，S.(2000)DifferentialinvitroeffectsoftheplateletglycoproteinIIb/IIIainhibitorsabxicimaborSR121566Aonplateletaggregation.fibrinogenbindingandplateletsecretoryparameters.ThrombRes97，201-207)。監(jiān)測每種樣品的阻抗直到建立穩(wěn)定的基線(每分鐘的飄移量＜5mV)。為了誘導(dǎo)血小板凝集，加入9μl的ADP溶劑以使得達(dá)到的最終濃度為20μM。一對電極之間隨著時間增加而增加的電阻信號通過一個表面被傳輸?shù)絺€人電腦中并加以分析(AGGRO/LINK，Chrono-log)。親和性檢測FabsRAD87和阿昔單抗與整合蛋白αIIbβ3之間的解離常數(shù)是按照以前描述的方法，通過競爭性ELISA進(jìn)行測定(參見Djavadi-Ohaniance，L.，Goldberg，M.E.，andFirguet，B.(1996)Measuringantibodyaffinityinsolution.InAntibodyEngineering(McCafferty，J.，Hoogenboom，H.R.，andChiswell，J.，eds)pp.77-98，IRLPress，Oxford；Yi，K.，Chung，J.，Kim，H.，Kim，I.，Jung，H.，Kim，J.，Choi，I.，Suh，P.，andChung，H.(1999)Expressionandcharacterizationofanti-NCA-95scFv(CEA79scFv)inaprokaryoticexpressionvectormodifiedtocontainaSfiIandNotIsite.Hybridoma18，243-249)。簡要地說，Costar369096孔板的樣品孔都使用50μl含有250ng整合蛋白αIIbβ3的金屬離子緩沖液4℃下包被過夜。接著該96孔板用水漂洗5次，然后再用160μl含2％(w/v)BSA的PBS溶液37℃下封閉2小時。再加入提純的FabsRAD87或阿昔單抗到終濃度為2×10-10M。整合蛋白αIIbβ3的終濃度被調(diào)節(jié)為1×10-7M到1×10-10M之間。這些混合物被孵育過夜，以達(dá)到平衡狀態(tài)。96孔板用水簡單漂洗以后，再加入抗體-抗原混合物到樣品孔中，然后室溫下孵育2小時。該96孔板先用0.05％Tween20的PBS液漂洗3次，然后加入200ng/ml偶聯(lián)的辣根過氧化物酶和抗-人IgG抗體(Pierce)。室溫下孵育1小時后，該96孔板用0.05％Tween20的PBS液漂洗5次，然后加入50μlABTS底物溶液(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。在37℃孵育2小時以后，加入50μl3N鹽酸溶液終止反應(yīng)。每個樣品孔的吸光度值由酶標(biāo)反應(yīng)分析儀，在405nm波長下測量。y軸為v/[Ag]，x軸為v的Scatchard曲線可以繪制出來。[Ag]為游離抗原的濃度；v為已結(jié)合的抗體的比例，該比例數(shù)值是由規(guī)定濃度的可溶性抗原的吸光度值與該可溶性抗原不存在時的吸光度值的比值。該Scatchard曲線中一條直線的斜率等于1/Kd。天然/合成的人Fab庫的建立和篩選本研究的目的是通過在HCDR3區(qū)域中移植一個兩端都側(cè)接3個隨機(jī)氨基酸殘基的RAD基序來構(gòu)建合成的人抗體，該抗體可以區(qū)別整合蛋白αIIbβ3和其它RGD結(jié)合整合蛋白，尤其是整合蛋白αvβ3。第一步，我們利用一個RAD基序，而不是RGD基序，作為中心識別序列。第二步，移除早期研究中中心識別序列周圍存在的一個二硫鍵CX9C。第三步，該合成的HCDR3序列庫被移植入從人骨髓cDNA中擴(kuò)增出來的天然的人VH序列庫中。因此，除了通過將HCDR3隨機(jī)化以外，也通過將VH區(qū)多樣化來建立二級文庫多樣性。一個含有隨機(jī)HCDR3序列VGXXXRADXXXYAMDV(參見SEQIDNO3)的人抗體庫在噬粒載體pComb3X中建立起來，該序列中的X指代20種天然氨基酸中的任一種。使用人重鏈可變區(qū)基因DP-47特異引物和從6名健康志愿者體內(nèi)采集的人骨髓cDNA作為模板，采用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增編碼重鏈可變區(qū)中FR1至FR3片段的VH。天然/合成的重鏈雜交體起初是和初始選擇的DPK-26人κ輕鏈配對的。得到的Fab庫被克隆入噬粒載體pComb3X后產(chǎn)生出1×109獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌株的多樣性。從未篩選的庫中隨機(jī)挑出的克隆證實(shí)了VH和HCDR3序列的多樣性。使用固定化的人整合蛋白αγβ3進(jìn)行7次淘選后，80％以上的被選擇克隆都連結(jié)上整合蛋白αIIbβ3。如噬菌體ELISA中分析結(jié)果所示(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。基于輕鏈重排技術(shù)，篩選出的重鏈片段編碼序被進(jìn)行第二輪的篩選過程。為實(shí)現(xiàn)該目的，該DPK-26人κ輕鏈被人κ和λ輕鏈庫所取代，該輕鏈庫是從人骨髓cDNA擴(kuò)增得到的。產(chǎn)生的天然人輕鏈庫再一次被克隆入噬粒載體pComb3X中，得到包含7×108個獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌株的多樣性。三輪在固定化的人整合蛋白αIIbβ3上的淘選過程以后，如噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，所有的篩選出來的克隆都結(jié)合上了整合蛋白αIIbβ3。接下來將10株顯示最強(qiáng)結(jié)合能力的克隆個體作DNA測序分析。除了一個以外，其它所有克隆的HCDR3區(qū)都含有一個二硫鍵限制性環(huán)形結(jié)構(gòu)，該環(huán)形結(jié)構(gòu)具有保守序列V(V/W)CRAD)K/R)RC(參見SEQIDNO4和表2)。其中一個例外克隆RAD1具有相應(yīng)的序列THSRADRRE(參見SEQIDNO19和表2)。所有的克隆都顯示具有DP-47VH重鏈片段。其中4個克隆含有初始的DPK-26人κ輕鏈，6個克隆顯示含有由天然人輕鏈庫衍生出來的人κ或λ輕鏈。篩選出的人Fab的生物化學(xué)性質(zhì)和功能描述用ELISA的方法檢測篩選出的10個克隆所表達(dá)的Fab對于RGD-結(jié)合整合蛋白的反應(yīng)性。所有的Fab都很牢固地與人整合蛋白αIIbβ3結(jié)合，但是不與人整合蛋白αγβ3，α5β1，和αγβ5結(jié)合(參見圖1)。為了檢測其對于表達(dá)在人血小板表面的天然整合蛋白αIIbβ3的反應(yīng)性，這些Fab接下來都用流式細(xì)胞儀分析。所有篩選出的Fab均被發(fā)現(xiàn)可以和人血小板結(jié)合，而非相關(guān)的Fab則不與血小板結(jié)合。由于整合蛋白αIIbβ3和血小板之間的反應(yīng)部分由RGD基序介導(dǎo)的，所以我們接下來檢測篩選出的Fab是否能夠抑制這種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)。為了實(shí)現(xiàn)這個目的，我們進(jìn)行了基于固定化整合蛋白αIIbβ3的，生物素(酰)化的纖維蛋白原以及辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的競爭性ELISA測定。篩選出的Fab以不同濃度與生物素(酰)化纖維蛋白原混合，接下來再與固定化的整合蛋白αIIbβ3一起孵育。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素被用于檢測與固定化的整合蛋白αIIbβ3結(jié)合的生物素(酰)化的纖維蛋白原。所有篩選的Fab都顯示出對整合蛋白αIIbβ3和纖維蛋白原之間相互作用的強(qiáng)力抑制。我們接下來的研究對象是顯示出與整合蛋白αIIbβ3極強(qiáng)結(jié)合能力的FabRAD87。FabRAD87被大腸桿菌表達(dá)后用上面所述的方法進(jìn)行提純(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示FabRAD87只結(jié)合人血小板，而不與主要表達(dá)整合蛋白αγβ3的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合(如圖2所示)。與之對比的，F(xiàn)ab阿昔單抗(ReoPro，EliLily，Indianapolis，IN)則與血小板和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞都能結(jié)合(如圖2所示)，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Fab阿昔單抗與兩種β3整合蛋白的交叉反應(yīng)性(參見Bougie，D.W.，Wilker，P.R.，Wuitschick，E.D.，Curtis，B.R.，Malik，M.，Levine，S.，Lind，R.N.，Pereira，J.，andAster，R.H.(2002)Acutethrombocytopeniaaftertreatmentwithtirofibanoreptifibatideisassociatedwithantibodiesspecificforligand-occupiedGPIIb/IIIa.Blood100，2071-2076)。在一種半數(shù)抑制濃度(IC50)值為8.0×10-8M的劑量依賴型方案中，F(xiàn)abRAD87阻斷了整合蛋白αIIbβ3和纖維蛋白原之間的反應(yīng)。平行實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ab阿昔單抗的半數(shù)抑制濃度(IC50)值為9.0×10-8M(參見圖3A和表3)。基于競爭性ELISA實(shí)驗(yàn)(參見Suzuki，K.，Sato，K.，Kamohara，M.，Kaku，S.，Kawasaki，T.，Yano，S.，andIizumi，Y(2002)Comparativestudiesofahumanizedanti-glycoproteinIIb/IIIamonoclonalantibody，YM337，andabciximaboninvitroantiplateleteffectandbindingproperties.BiolPharmBull25，1006-1012；Co，M.S.，Yano，S.，Hsu，R.K.，Landolfi，N.F.，Vasquez，M.，Cole，M.，Tso，J.T.，Bringman，T.，Laird，W.，Hudson，D.，andetal.(1994)Ahumanizedantibody單價FabRAD87和整合蛋白αIIbβ3之間反應(yīng)的Kd值為3.3×10-9M(如表3所示)。相同的測定顯示，單價Fab阿昔單抗和整合蛋白αIIbβ3之間反應(yīng)的Kd值為1.1×10-9M，與已公布的6.2×10-9M不同(如表3所示)(參見Tam，S.H.，Sassoli，P.M.，Jordan，R.E.，andNakada，M.T.(1998)Abciximab(ReoPro，chimeric7E3Fab)demonstratesequivalentaffinityandfunctionalblockadeofglycoproteinIIb/IIIaandalpha(v)beta3integrins.Circulation98，1085-1091)。由于整合蛋白αIIbβ3和纖維蛋白原之間的反應(yīng)是血小板凝集中的關(guān)鍵步驟，因此我們接下來檢測FabRAD87是否能夠在體外抑制血小板凝集。通過把ADP加入到由人類外周血制備的條件性血漿中，至最終濃度為20μM。FabRAD87被發(fā)現(xiàn)能夠強(qiáng)烈抑制血小板凝集，其EC50值為60nM或3μg/ml(如圖4和表3所示)。在一個平行實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)血小板凝集反應(yīng)被5μM的ADP誘導(dǎo)發(fā)生時，F(xiàn)ab阿昔單抗的EC50值為45nM，而在以往的報道中，該EC50值為34nM(參見Klinkhardt，U.，Kirchmaier，C.M.，Westrup，D.，Breddin，H.K.，Mahnel，R.，Graff，J.，Hild，M.，andHarder，S.(2000)DifferentialinvitroeffectsoftheplateletglycoproteinIIb/IIIainhibitorsabxicimaborSR121566Aonplateletaggregation，fibrinogenbindingandplateletsecretoryparameters.ThrombRes97，201-207)。源于篩選出的HCDR3序列的合成肽的生物化學(xué)和功能描述四種九肽被使用化學(xué)方法合成，該九肽的序列來源于篩選出的結(jié)合整合蛋白αIIbβ3的Fab中HCDR3區(qū)的序列。該系列包含3種環(huán)狀肽，VWCRADKR(參見SEQIDNO6)，VWCRADRRC(參見SEQIDNO5)和VVCRADRRC(參見SEQIDNO7)，以及一種線形肽THSRADRRE(參見SEQIDNO19)。使用上面描述過的競爭性ELISA測定法，所有的環(huán)形肽均被發(fā)現(xiàn)可以在微摩爾級濃度范圍內(nèi)抑制整合蛋白αIIbβ3和纖維蛋白原之間的反應(yīng)。該線形肽以及3個對照肽在相同的濃度范圍內(nèi)均不能抑制整合蛋白αIIbβ3和纖維蛋白原之間的反應(yīng)(參見圖3B)，該對照肽中兩個含有反轉(zhuǎn)的RAD基序，VVCDARRRC(參見SEQIDNO20)和THSDARRRE(參見SEQIDNO21)，另一個包含非相關(guān)序列。結(jié)合能力最強(qiáng)的兩個環(huán)形肽——VWCRADRRC(參見SEQIDNO5)和VWCRADKRC(參見SEQIDNO6)的IC50值分別為1.2×10-6M和4.2×10-6M。而來源于FabRAD87的環(huán)形肽VVCRADRRC的IC50值為1.1×10-5M，該值比FabRAD87的IC50值高兩個數(shù)量級。圖5表示的是使用不同濃度的VWCRADRRC(參見SEQIDNO5)(A)，VVCRADRRC(參見SEQIDNO7)(B)，VWCRADKR(參見SEQIDNO6)(C)以及一種對照肽(D)進(jìn)行的體外血小板凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果。很明顯地，三種環(huán)形肽在90μM濃度下可以完全抑制血小板凝集，而線形肽和對照肽則不能抑制該凝集作用。與整合蛋白αIIbβ3/纖維蛋白原反應(yīng)測定結(jié)果一致的是，環(huán)形肽VWCRADRRC(參見SEQIDNO5)——唯一一個可以在9μM(參見圖5A)這樣的低濃度下抑制血小板凝集的肽，再一次被發(fā)現(xiàn)其抑制能力是最強(qiáng)的。雖然其潛在的施用效果和阿昔單抗一樣均為抗血栓類藥物，但是我們這里討論的RAD抗體仍然具有一些很獨(dú)特的性質(zhì)。首先，它們是人源抗體，這樣引起病人體內(nèi)免疫應(yīng)答的可能性就會很低。第二，和RGD肽和模擬肽(peptidomimetic)(參見Xiong，J.P.，Stehle，T.，Zhang，R.，Joachimiak，A.，F(xiàn)rech，M.，Goodman，S.L.，andArnaout，M.A.(2002)CrystalstructureoftheextracellularsegmentofintegrinalphaVbeta3incomplexwithanArg-Gly-Aspligand.Science296，151-155)一樣，該RAD抗體可以直接阻斷整合蛋白αIIbβ3上的RGD結(jié)合位點(diǎn)。與之形成對比的，阿昔單抗不含有RGD或類RGD基序，因此它與整合蛋白αIIbβ3的結(jié)合原理被認(rèn)為是通過空間或變構(gòu)阻礙，而不是通過對RGD結(jié)合位點(diǎn)的直接阻斷與屏蔽。第三點(diǎn)，RAD抗體與整合蛋白αIIbβ3特異性地結(jié)合，而阿昔單抗卻不能區(qū)分整合蛋白αγβ3和整合蛋白αIIbβ3。阿昔單抗的交叉反應(yīng)性與我們的早期合成的整合蛋白結(jié)合抗體相類似。(參見Barbas，C.F.，3rd，Languino，L.R.，andSmith，J.W.(1993)High-affinityself-reactivehumanantibodiesbydesignandselectiontargetingtheintegrinligandbindingsite.ProcNatlAcadSciUSA90，10003-10007；Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。原因不明的嚴(yán)重的血小板減少癥是施用整合蛋白αIIbβ3抑制劑時最主要的安全問題。如前面提到的那樣，據(jù)報道，阿昔單抗中人抗-鼠可變區(qū)結(jié)構(gòu)域是在阿昔單抗二次給藥后病人產(chǎn)生嚴(yán)重血小板減少癥的最主要的原因。(參見Curtis，B.R.，Swyers，J.，Divgi，A.，McFarland，J.G.，andAster，R.H.(2002)Thrombocytopeniaaftersecondexposuretoabciximabiscausedbyantibodiesthatrecognizeabciximab-coatedplatelets.Blood99，2054-2059)。該發(fā)現(xiàn)使得通過將其CDR移植入人可變結(jié)構(gòu)域中的方法使得abcximab進(jìn)一步人源化成為必需(參見Rader，C.，Ritter，G.，Nathan，S.，Elia，M.，Gout，I.，Jungbluth，A.A.，Cohen，L.S.，Welt，S.，Old，L.J.，andBarbas，C.F.，3rd(2000)Therabbitantibodyrepertoireasanovelsourceforthegenerationoftherapeutichumanantibodies.JBiolChem275，13668-13676)。盡管如此，如果不能根據(jù)該抗體結(jié)構(gòu)方面的具體信息而作出結(jié)構(gòu)方面較好的改變，那么這種CDR移植方案則有可能產(chǎn)生一些結(jié)合能力較大程度減小的抗體，比如最近在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的抗-整合蛋白αIIbβ3的抗體YM337(參見Suzuki，K.，Sato，K.，Kamohara，M.，Kaku，S.，Kawasaki，T.，Yano，S.，andIizumi，Y(2002)Comparativestudiesofahumanizedanti-glycoproteinIIb/IIIamonoclonalantibody，YM337，andabciximaboninvitroantiplateleteffectandbindingproperties.BiolPharmBull25，1006-1012；Co，M.S.，Yano，S.，Hsu，R.K.，Landolfi，N.F.，Vasquez，M.，Cole，M.，Tso，J.T.，Bringman，T.，Laird，W.，Hudson，D.，andetal.(1994)AhumanizedantibodyspecificfortheplateletintegringpIIb/IIIa.Jlmmunol152，2968-2976)。由于RAD抗體完全由人源序列組成，除了合成的HCDR3以外，該RAD抗體被預(yù)期比嵌合或人源化的抗體具有更少的免疫原性。我們的RAD抗體的人抗獨(dú)特型抗體的誘導(dǎo)是有可能的。由于循環(huán)的抗獨(dú)特型抗體可以與血小板整合蛋白αIIbβ3競爭地結(jié)合RAD抗體，而不是通過RAD抗體結(jié)合到血小板的表面，因此設(shè)想其不會引起嚴(yán)重的血小板減少癥是合理的。最近的一個有趣的發(fā)現(xiàn)就是在施用tirofiban和eptifibatide這類小分子藥物后出現(xiàn)嚴(yán)重血小板減少癥的病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種人抗體，該人抗體在與tirofiban或eptifibatide混合時，可以選擇性識別整合蛋白αIIbβ3(參見Bougie，D.W.等)。在這種情況下，RAD抗體通過誘導(dǎo)整合蛋白αIIbβ3表面的免疫原性表位的展示而導(dǎo)致血小板減少癥的可能性還是存在的，因?yàn)檫@些RAD抗體的結(jié)合方式與小分子藥物是相同的。包含LJ-CP3，OPG2和PAC-1在內(nèi)的一些對整合蛋白αIIbβ3具有特異性的鼠單克隆抗體的HCDR3區(qū)中包含RYD基序(參見Puzon-McLaughlin，W.，Kamata，T.，andTakada，Y.)2000)Multiplediscontinuousligand-mimeticantibodybindingsitesdefinealigandbindingpocketinintegrinalpha(IIb)beta(3).JBiolChem275，7795-7802；Kamata，T.，Irie，A.，Tokuhira，M.，andTakada，Y.(1996)CriticalresiduesofintegrinalphaIIbsubunitforbindingofalphaIIbbeta3)glycoproteinIIb-IIIa)tofibrinogenandligand-mimeticantibodies(PAC-1，OP-G2，andLJ-CP3).JBiolChem271，18610-18615；Prammer，K.V，Boyer，J.，Ugen，K.，Shattil，S.J.，andKieber-Emmons，T.(1994)BioactiveArg-Gly-Aspconformationsinanti-integrinGPIIb-IIIaantibodies.Receptor4，93-108；Tomiyama，Y.，Brojer，E.，Ruggeri，Z.M.，Shattil，S.J.，Smiltneck，J.，Gorski，J.，Kumar，A.，Kieber-Emmons，T.，andKunicki，T.J.(1992)AmolecularmodelofRGDligands.AntibodyDgenesegmentsthatdirectspecificityfortheintegrinalphaIIbbeta3.JBiolChem267，18085-18092；Niiya，K.，Hodson，E.，Bader，R.，Byers-Ward，V.，Koziol，J.A.，Plow，E.F.，andRuggeri，Z.M.(1987)IncreasedsurfaceexpressionofthemembraneglycoproteinIIb/IIIacomplexinducedbyplateletactivation.Relationshiptothebindingoffibrinogenandplateletaggregation.Blood70，475-483；Bennett，J.S.，Hoxie，J.A.，Leitman，S.F.，Vilaire，G.，andCines，D.B.(1983)Inhibitionoffibrinogenbindingtostimulatedhumanplateletsbyamonoclonalantibody.ProcNatlAcadSciUSA80，2417-2421)。這些鼠單克隆抗體與整合蛋白αIIbβ3之間的結(jié)合可以完全被RGD肽完全阻斷，這說明它們的RYD基序介導(dǎo)了該鼠抗體和RGD結(jié)合位點(diǎn)之間的直接反應(yīng)。有趣的是，HCDR3區(qū)中包含一個RYD基序鼠單克隆抗體，16N7C2，卻不能區(qū)分各種β3整合蛋白(參見Deckmyn，H.，Stanssens，P.，Hoet，B.，Declerck，P.J.，Lauwereys，M.，Gansemans，Y，Tornai，I.，andVermylen，J.(1994)Anechistatin-likeArg-Gly-Asp(RGD)-containingsequenceintheheavychainCDR3ofamurinemonoclonalantibodythatinhibitshumanplateletglycoproteinIIb/IIIafunction.BrJHaematol87，562-571)。因此，與我們合成的RAD基序相類似的，在一些情況下，天然的RYD基序被用于選擇性識別整合蛋白αIIbβ3。盡管如此，與合成的RAD抗體比較而言，LJ-CP3，OPG2和PAC-1的HCDR3區(qū)都沒有一個可以作為類-RGD基序的二硫鍵(Tomiyama，Y，Brojer，E.，Ruggeri，Z.M.，Shattil，S.J.，Smiltneck，J.，Gorski，J.，Kumar，A.，Kieber-Emmons，T.，andKunicki，T.J.(1992)AmolecularmodelofRGDligands.AntibodyDgenesegmentsthatdirectspecificityfortheintegrinalphaIIbbeta3.JBiolChem267，18085-18092)，這說明或者通過VDJ區(qū)重組的方法得到的結(jié)構(gòu)多樣性存在局限性，或者該方法是一種抗-HCDR3區(qū)二硫鍵的篩選方法。先前我們用于篩選人抗體的方法通常是使用合成的移植的RGD基序或是一種HCDR3中的類-RGD基序來與整合蛋白αγβ3和αIIbβ3結(jié)合(參見Barbas，C.F.，3rd，Languino，L.R.，andSmith，J.W.)1993)High-affinityself-reactivehumanantibodiesbydesignandselectiontargetingtheintegrinligandbindingsite.ProcNatlAcadSciUSA90，10003-10007；Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChenu269，32788-32795；Barbas，C.F.，3rd(1993)Recentadvancesinphagedisplay.CurrOpinBiotechnol4，526-530)。篩選出的抗體對其中任一種整合蛋白都不具有專有的特異性。在篩選具有更高特異性的抗體的嘗試過程中，我們使用一種隨機(jī)化設(shè)計(jì)的HCDR3序列VGXXXRADXXXYAMDV(參見SEQIDNO3)建立了一個新的合成人源抗體庫。除了使用RAD基序取代RGD基序以外，新庫最大的不同點(diǎn)在于移除了舊庫中的一個包圍整合蛋白結(jié)合位點(diǎn)的CX9C二硫鍵及其側(cè)位殘基。有趣的是，新庫針對抗-整合蛋白αIIbβ3抗體的篩選過程產(chǎn)生了一種新的基序展示(motif-displaying)的CX5C型二硫鍵，該二硫鍵被發(fā)現(xiàn)存在于90％的篩選出的抗體序列中。這個稍小的環(huán)形結(jié)構(gòu)，在以前的CX9C型二硫鍵的篩選中，如果有可能的話，那么很有可能產(chǎn)生一種很獨(dú)特的對整合蛋白αIIbβ3的選擇性。篩選出的存在HCDR3區(qū)域中的序列XXXRADXXX(參見SEQIDNO22)基序在結(jié)構(gòu)方面的限制促使我們對于其抗體折疊到功能特性方面都進(jìn)行深入研究。3種在CX5C型二硫鍵中展示RAD基序的合成肽VWCRADRRC(參見SEQIDNO5)，VWCRADKRC(參見SEQIDNO6)和VVCRADRRC(參見SEQIDNO7)都可以抑制所篩選的RAD抗體與整合蛋白αIIbβ3之間的結(jié)合，纖維蛋白原與整合蛋白αIIbβ3之間的結(jié)合以及抑制血小板凝集。但線性合成肽THSRADRRE(參見SEQIDNO19)則不具有這種抑制能力?？拐系鞍爪罥Ibβ3的肽拮抗劑已經(jīng)用噬菌體展示的方法從肽庫中篩選出來了(參見O′Neil，K.T.，Hoess，R.H.，Jackson，S.A.，Ramachandran，N.S.，Mousa，S.A.，andDeGrado，W.F.(1992)IdentificationofnovelpeptideantagonistsforGPIIb/IIIafromaconformationallyconstrainedphagepeptidelibrary.Proteins14，509-515；Koivunen，E.，Wang，B.，andRuoslahti，E.(1995)PhagelibrariesdisplayingcyclicpeptideswithdifferentringsizesligandspecificitiesoftheRGD-directedintegrins.Biotechnology(NY)13，265-270；Koivunen，E.，Restel，B.H.，Rajotte，D.，Lahdenranta，J.，Hagedorn，M.，Arap，W.，andPasqualini，R.(1999)Integrin-bindingpeptidesderivedfromphagedisplaylibraries.MethodsMolBiol129，3-17)。CX5C，CX6C，CX7C和CX9C的約束型的肽庫也被使用。盡管如此，只有CX6C和CX7C肽庫產(chǎn)生了整合蛋白αIIbβ3的結(jié)合體。篩選出的序列可以被分類成2組那些含有RGD基序的和那些含有類-RGD基序的，其中RGD中的甘氨酸或精氨酸殘基被取代。處于中心位置的甘氨酸被一些不同的氨基酸殘基，比如絲氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，丙氨酸，谷氨酰胺，組氨酸和蛋氨酸等所取代。兩種肽CRADVPLC(參見SEQIDNO23)和CMSRADRPC(參見SEQIDNO24)含有RAD基序。從整合蛋白αIIbβ3篩選出來的含有RGD的序列與那些從整合蛋白αγβ3與α5β1篩選出來的序列不同，在與該RGD基序直接相連的靠近C術(shù)端的地方含有較豐富的芳香殘基，比如色氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。另外，一些存在于RGD基序外的序列含有1或2個堿性殘基。盡管如此，該篩選出來的肽鏈序列中，沒有一個和我們篩選的HCDR3序列VWCRADKRC(參見SEQIDNO6)，VWCRADRRC(參見SEQIDNO5)和VVCRADRRC(參見SEQIDNO7)有相似之處。值得注意的是包含我們的CX5C核心共有序列CRAD(K/R)RC的CX5C肽庫不能產(chǎn)生任何整合蛋白αIIbβ3結(jié)合肽，這說明在我們的篩選出來的HCDR3序列N-末端的VW或VV殘基在與整合蛋白αIIbβ3之間的相互作用中起著關(guān)鍵的作用。肽鏈和抗體庫的噬菌體展示技術(shù)在研究和發(fā)展的各種應(yīng)用中已經(jīng)成為一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork；Kay，B.K.，Kasanov，J.，andYamabhai，M.(2001)Screeningphage-displayedcombinatorialpeptidelibraries.Methods24，240-246；Sidhu，S.S.(2000)Phagedisplayinpharmaceuticalbiotechnology.CurrOpinBiotechnol11，610-616)?？贵w免疫球蛋白可變區(qū)中的肽庫融合了這些技術(shù)，同時在抗體，肽和類肽類藥物的發(fā)現(xiàn)之間提供了一種具有迷惑力的聯(lián)系。這里我們示范了這種制備新的特異性抗-受體肽鏈和抗體的方法的有效性。抗體支架中生物活性物質(zhì)和/或結(jié)合肽的放置或它們在支架中的制備為用作生物工具或治療劑的免疫學(xué)試劑的快速開發(fā)作準(zhǔn)備(參見Barbas，C.F.，3rd(1993)Recentadvancesinphagedisplay.CurrOpinBiotechnol4，526-530)。經(jīng)常地，肽本身在體內(nèi)就具有可變的活性，而且它們的結(jié)合可能很難被監(jiān)控，盡管如此，肽在抗體中的展示有可能會解決其探測問題，以及肽鏈蛋白質(zhì)水解和它們的快速清除相關(guān)聯(lián)的問題，因?yàn)樵摽贵w和抗體片段顯示出相對可預(yù)測的藥代動力學(xué)行為。在必要的時候，比如在癌癥的治療中，作為免疫效應(yīng)分子偶聯(lián)的結(jié)果，抗體的Fc區(qū)可以賦予肽序列細(xì)胞殺傷功能。我們相信，該方法能夠應(yīng)用于具有結(jié)合活性的多種肽以快速制備有用的免疫試劑(參見Brown，K.C.(2000)Newapproachesforcell-specifictargetingidentificationofcell-selectivepeptidesfromcombinatoriallibraries.CurrOpinChemBiol4.16-21)。雖然本發(fā)明參照示范性的實(shí)施方案來特別說明或描述，那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將明白其中形式和細(xì)節(jié)上的可作的不同變化而不脫離本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員或理解本發(fā)明描述的人，將明白如何利用本發(fā)明提及的其它適合的技術(shù)和方法進(jìn)行不同形式的應(yīng)用。因此，本發(fā)明是可以被實(shí)施的，而不是僅限于這里特定的描述。以上的描述是闡述性而非限制性的。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，通過了解以上的描述，很顯然能夠?qū)嵤┰S多其他的方案。因此本發(fā)明的范圍因決定于權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍，以及與其等價的整個權(quán)利范圍。序列表<110>斯克利普斯研究院<120>整合蛋白ALPHA.IIB.BETA.3特異性抗體和肽<130><160>24<210>1<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>1CysSerPheGlyArgGlyAspIleArgAsnCys1510<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>2GlySerPheGlyArgGlyAspIleArgAsnGly1510<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><221>unsure<222>3，4，5，9，10，11<223>隨機(jī)DNA序列<400>3ValGlyXaaXaaXaaArgAlaAspXaaXaaXaaTyrAlaMetAsp151015Val<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>4ValValCysArgAlaAspLysArgCys15<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>5ValTrpCysArgAlaAspArgArgCys15<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>6ValTrpCysArgAlaAspLysArgCys15<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>7ValValCysArgAlaAspArgArgCys15<210>8<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>8ValArgValValCysArgAlaAspArgArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>9<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><221>aorgorcort<222>25，26，28，29，31，32，43，44，46，47，49，50<223>隨機(jī)DNA序列<400>9gtgtattactgtgcgagagtggggnnknnknnkcgtgccgacnnknnknnktacgctatg60gacgtctggggc<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10agaagcgtagtccggaacgtc<210>11<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>11gctgcccaaccagccatggccgaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggta<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>12cactctcgcacagtaatacacggccgtgtcctcggctct<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13ggccatggctggttgggcagc<210>14<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>14gaggaggaggaggaggagagaagcgtagtccggaacgtc<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15aagacagctatcgcgattgcagtg<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16ggccatggctggttgggcagc<210>17<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>17gaggaggaggaggaggaggcggggcccaggcggccgagctc<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18ggccatggctggttgggcagc<210>19<211>9<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>19ThrHisSerArgAlaAspArgArgGlu15<210>20<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>20ValValCysAspAlaArgArgArgCys15<210>21<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>21ThrHisSerAspAlaArgArgArgGlu15<210>22<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>unsure<222>1，2，3，7，8，9<223>隨機(jī)DNA序列<400>22XaaXaaXaaArgAlaAspXaaXaaXaa15<210>23<211>8<212>PRT<213>人工序列<400>23CysArgAlaAspValProLeuCys15<210>24<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>24CysMetSerArgAlaAspArgProCys15<210>25<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>25ValArgValValCysArgAlaAspLysArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>26<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>26ValArgValTrpCysArgAlaAspArgArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>27<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>27ValArgValTrpCysArgAlaAspLysArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>28<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>28ValGlyValValCysArgAlaAspArgArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>29<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>29ValGlyValValCysArgAlaAspLysArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>30<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>30ValGlyValTrpCysArgAlaAspArgArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>31<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>31ValGlyValTrpCysArgAlaAspLysArgCysTyrAlaMetAsp151015Val權(quán)利要求1.一種分離并提純的包含9到大約50個氨基酸殘基的肽，該肽具有選自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸殘基序列，并且該肽具有抑制血小板凝集的活性。2.權(quán)利要求1的肽，該肽包括SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列。3.權(quán)利要求2的肽，該肽由SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列組成。4.權(quán)利要求2的肽，該肽基本上由SEQIDNo5-7中任一個的氨基酸殘基序列組成。5.一種與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體，該抗體包含選自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31的氨基酸殘基序列，其中所述氨基酸殘基序列包含在該抗體的決定簇互補(bǔ)區(qū)中。6.權(quán)利要求5的抗體，其中決定簇互補(bǔ)區(qū)位于該抗體的重鏈上。7.權(quán)利要求5的抗體，其中決定簇互補(bǔ)區(qū)是HCDR3。8.權(quán)利要求5的抗體，其選自此處指定為RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或RAD88的抗體并且與整合蛋白αIIbβ3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。9.權(quán)利要求5的抗體，其是一種人源抗體。10.一種抗體，其具有權(quán)利要求8中抗體的免疫反應(yīng)性。11.一種抑制血小板凝集的方法，該方法包括將血小板與抑制有效量的權(quán)利要求1的肽相接觸。12.一種抑制血小板凝集的方法，該方法包括將血小板與抑制有效量的權(quán)利要求5的抗體相接觸。13.一種抑制纖維蛋白原與血小板結(jié)合的方法，該方法包括將血小板與抑制有效量的權(quán)利要求1的肽相接觸。14.一種抑制血小板凝集的方法，該方法包括將血小板與抑制有效量的權(quán)利要求5的抗體相接觸。15.一種具有整合蛋白αIIbβ3結(jié)合活性的抗體，其中所述結(jié)合與其它蛋白質(zhì)的結(jié)合活性競爭，所述其它蛋白質(zhì)包含三肽基序精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(RAD)的氨基酸殘基序列，并且所述結(jié)合是在標(biāo)準(zhǔn)競爭測定中進(jìn)行的。16.權(quán)利要求15的抗體，其中所述其它蛋白質(zhì)是另外一種抗體，該抗體的決定簇互補(bǔ)區(qū)含有一種氨基酸殘基序列，該氨基酸序列選自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31，而且所述的結(jié)合是在標(biāo)準(zhǔn)競爭測定中進(jìn)行的。17.一種分離并提純的編碼一種肽的多核苷酸，該肽包含9到約50個氨基酸殘基而且具有選自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸殘基序列，并且該肽具有抑制血小板凝集的活性。18.一種包括權(quán)利要求17的多核苷酸的載體。19.一種包括權(quán)利要求18的載體的宿主細(xì)胞。20.一種使用多核苷酸制備蛋白質(zhì)的方法，該方法包括a)在蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求19中的宿主細(xì)胞；b)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含選自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸序列。21.一種藥用組合物，該藥用組合物包含權(quán)利要求1的肽和適宜的藥用載體，該藥用組合物以適宜于靜脈給藥、動脈給藥、淋巴循環(huán)給藥、腹膜內(nèi)給藥、透皮給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥以及肺部給藥的形態(tài)存在。22.一種藥用組合物，該藥用組合物包含權(quán)利要求5的抗體和適宜的藥用載體，該藥用組合物以適宜于靜脈給藥、動脈給藥、淋巴循環(huán)給藥、腹膜內(nèi)給藥、透皮給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥以及肺部給藥的形態(tài)存在。23.一種藥用組合物，該藥用組合物包含權(quán)利要求15的抗體和適宜的藥用載體，該藥用組合物以適宜于靜脈給藥、動脈給藥、淋巴循環(huán)給藥、腹膜內(nèi)給藥、透皮給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥以及肺部給藥的形態(tài)存在。24.權(quán)利要求1中的肽，該肽用作治療劑以防止在選自肺部栓塞、暫時性缺血發(fā)作(TIAs)、深靜脈栓塞、冠狀動脈旁路手術(shù)和在自體，非自體或者合成的脈管移植中放置人工瓣膜或脈管的手術(shù)的條件下的血栓形成。25.權(quán)利要求5的抗體，該抗體用作治療劑以防止在選自肺部栓塞、暫時性缺血發(fā)作(TIAs)、深靜脈栓塞、冠狀動脈旁路手術(shù)和在自體，非自體或者合成的脈管移植中放置人工瓣膜或脈管的手術(shù)的條件下的血栓形成。26.權(quán)利要求15的抗體，該抗體用作治療劑以防止在選自肺部栓塞、暫時性缺血發(fā)作(TIAs)、深靜脈栓塞、冠狀動脈旁路手術(shù)和在自體，非自體或者合成的脈管移植中放置人工瓣膜或脈管的手術(shù)的條件下的血栓形成。27.權(quán)利要求1的肽，該肽用作治療劑以防止在選自通過球囊、冠狀動脈粥樣斑塊切除術(shù)和激光血管成形術(shù)進(jìn)行的血管成形術(shù)過程中的血栓形成。28.權(quán)利要求5的抗體，該抗體用作治療劑以防止在選自通過球囊、冠狀動脈粥樣斑塊切除術(shù)和激光血管成形術(shù)進(jìn)行的血管成形術(shù)過程中的血栓形成。29.權(quán)利要求15的抗體，該抗體用作治療劑以防止在選自通過球囊、冠狀動脈粥樣斑塊切除術(shù)和激光血管成形術(shù)進(jìn)行的血管成形術(shù)過程中的血栓形成。30.一種處理個體以治療或防止血栓形成性紊亂的方法，該紊亂選自肺部栓塞、暫時性缺血發(fā)作(TIAs)、深靜脈栓塞、冠狀動脈旁路手術(shù)和在自體，非自體或者合成的脈管移植中放置人工瓣膜或脈管的手術(shù)，該方法包括施用一定量的權(quán)利要求1的肽于個體以達(dá)到治療效果。31.一種處理個體以治療或防止血栓形成性紊亂的方法，該紊亂選自肺部栓塞、暫時性缺血發(fā)作(TIAs)、深靜脈栓塞、冠狀動脈旁路手術(shù)和在自體，非自體或者合成的脈管移植中放置人工瓣膜或脈管的手術(shù)，該方法包括施用一定量的權(quán)利要求5的抗體于個體以達(dá)到治療效果。32.一種處理個體以治療或防止血栓形成性紊亂的方法，該紊亂選自肺部栓塞、暫時性缺血發(fā)作(TIAs)、深靜脈栓塞、冠狀動脈旁路手術(shù)和在自體，非自體或者合成的脈管移植中放置人工瓣膜或脈管的手術(shù)，該方法包括施用一定量的權(quán)利要求15的抗體于個體以達(dá)到治療效果。全文摘要本發(fā)明涉及一種整合蛋白α文檔編號A61K39/395GK1901930SQ200480040119公開日2007年1月24日申請日期2004年12月3日優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日發(fā)明者C·F·巴巴斯,鐘振浩申請人:斯克利普斯研究院