專利名稱：減輕內(nèi)毒素的效應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于減輕病原體感染導(dǎo)致的腸毒素的效應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
人和動(dòng)物的胃腸道處于產(chǎn)生多種紊亂的危險(xiǎn)之中，所述紊亂包括衰老、病毒、細(xì)菌和/或它們的毒素引起的紊亂，或者其它物理或化學(xué)物質(zhì)濫用引起的紊亂等。
有幾種因素或者療法能夠減輕多種胃腸道紊亂的癥狀。其中土著菌群(稱作小型生物群)在調(diào)節(jié)腸道環(huán)境方面發(fā)揮著重要的作用。這些定居在腸道的非病原性微生物(稱作益生菌)與從所述微生物釋放或作為食物成分從膳食中攝取的益生分子一起提供了預(yù)防或治療胃腸紊亂(包括艱難梭菌(C.difficile)感染)的可能的手段。
已經(jīng)證實(shí)，人的腸道細(xì)菌調(diào)控腸道中艱難梭菌毒素A的產(chǎn)生，并且比起常規(guī)小鼠，毒素A更容易結(jié)合從無(wú)菌小鼠分離的腸膜，這表明土著微生物在艱難梭菌的發(fā)病中起重要作用。用于檢測(cè)由艱難梭菌引起的大腸炎和腹瀉的營(yíng)養(yǎng)方法的臨床研究表明乳桿菌(Lactobacillus GG)改善了入院的成人和嬰兒的大腸炎的癥狀。類似地，非病原性酵母(Saccharomycesboulardii)也在防止或治療成人和嬰兒中艱難梭菌引起的大腸炎和腹瀉中起積極作用。另外，RU 2168915公開(kāi)了一種肉制品作為針對(duì)兒童和虛弱的人中胃腸紊亂的治療性或預(yù)防性食品的用途，該肉制品包含預(yù)決定比例的牛肉、豬肉、漂白的牛肝、南瓜和奶油。所有以上的觀察都表明，針對(duì)艱難梭菌感染的營(yíng)養(yǎng)介入的領(lǐng)域仍然是開(kāi)放的。
發(fā)明概述本發(fā)明是涉及包含酵母提取物的口服組合物用于治療病原體感染導(dǎo)致的腸毒素效應(yīng)的用途。此類效應(yīng)包括由于肌動(dòng)蛋白絲分解引起的腸上皮完整性的破壞和所引起的緊密連接的破壞，以及毒素誘導(dǎo)的腸液分泌導(dǎo)致的腹瀉，和環(huán)加氧酶誘導(dǎo)作用介導(dǎo)的其它過(guò)程。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，“口服組合物”旨在表示任何可攝取的組合物，并且可以是營(yíng)養(yǎng)組合物、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物，或者藥物。例如，它也可以是藥物治療的佐劑。該口服組合物旨在應(yīng)用于遭受病原體感染產(chǎn)生的腸毒素效應(yīng)的人，包括嬰兒或早產(chǎn)嬰兒到老年人。它也可以用于遭受病原體感染產(chǎn)生的腸毒素效應(yīng)的動(dòng)物，如貓、狗、魚(yú)、兔、鼠、倉(cāng)鼠等等，以及更加一般地人類飼養(yǎng)的任意動(dòng)物，如馬、奶牛、家禽、綿羊等。
術(shù)語(yǔ)“酵母提取物”可以包括自溶酵母的水溶性部分，并優(yōu)選地含有維生素B復(fù)合物。它還覆蓋包含自溶的面包酵母的可溶性和不溶性部分，并且在這種情況下，它優(yōu)選還包含核黃素和泛酸。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，“酵母提取物”并包含該微生物并且不包含該微生物產(chǎn)生的酶。酵母提取物可能是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)提取物。用于本發(fā)明的適宜的、通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的酵母提取物的實(shí)例是BectonDickinson and Company公司提供的BD Bacto Yeast Extract。
術(shù)語(yǔ)“肉膏”旨在包括任何肉類的提取物，例如牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和/或火雞肉等等的提取物。它也可以來(lái)自上面提到的肉類的混合物。無(wú)論如何，它都將至少提供氮、氨基酸和碳。用于本發(fā)明的適宜的、通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的肉膏的實(shí)例是由Becton Dickinson and Company提供的BD Bacto Beef Extract。
術(shù)語(yǔ)“蛋白胨”意思是蛋白質(zhì)物質(zhì)的部分酶促或酸水解產(chǎn)物的任何可溶性混合物。蛋白質(zhì)起始材料的選擇并不關(guān)鍵，但是優(yōu)選酪蛋白、乳清蛋白和肉類蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，蛋白胨的分子量小于3kDa。用于本發(fā)明的適宜的、通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的蛋白胨的實(shí)例是Becton Dickinson andCompany公司提供的BD Bacto Peptone。
腸毒素是對(duì)腸粘膜起作用的細(xì)菌外毒素。它們可以由致病性細(xì)菌在腸內(nèi)產(chǎn)生。細(xì)菌腸毒素是有效的粘膜免疫原，其激活粘膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致多種疾病，包括食物中毒、普通腹瀉、大腸炎、慢性炎癥和痢疾。腸毒素也導(dǎo)致嚴(yán)重的粘膜潰瘍、出血性炎性滲出或者血性腹瀉。毒素誘導(dǎo)的疾病通常伴有腹部絞痛和直腸痛。腸毒素為液體分泌和腸炎的主要刺激物。它們?cè)谏掀ぜ?xì)胞表面的結(jié)合導(dǎo)致絲狀肌動(dòng)蛋白的解聚和緊密連接滲透性的增加，以及激活胞內(nèi)途徑并隨后合成和釋放液體分泌活化劑。毒素還誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎癥，通常特征為通過(guò)感覺(jué)腸神經(jīng)的激活以及感覺(jué)神經(jīng)肽的釋放在粘膜內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞的遷移以及腸細(xì)胞壞死，并伴有細(xì)胞因子的釋放和上皮細(xì)胞破壞。
致病性細(xì)菌可以是共生的微生物系統(tǒng)的一部分，即它們可以無(wú)害地存在于腸道，除非或者直到這個(gè)微生物系統(tǒng)的平衡遭到擾亂，例如，在用抗生素，尤其廣譜抗生素治療期間就可以發(fā)生所述擾亂。在此類情況下，這些“機(jī)會(huì)病原體”可以迅速生長(zhǎng)，占據(jù)腸道微生物系統(tǒng)并產(chǎn)生引起腸炎的毒素。此類細(xì)菌的例子包括艱難梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)，并且本發(fā)明的組合物特別適于治療此類細(xì)菌產(chǎn)生的毒素效應(yīng)。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明尤其適用于治療醫(yī)院感染。
其它產(chǎn)生腸毒素的細(xì)菌的例子包括大腸桿菌(E.coli)、杜氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmania donovani)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)、志賀桿菌(Shigellae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、或者產(chǎn)腸毒素的脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)(ETBF)。
艱難梭菌感染是入院患者大腸炎和腹瀉的主要原因，由于抗生素?cái)z入，這些患者的腸道小型生物群改變。艱難梭菌通過(guò)釋放兩種毒素毒素A和毒素B而引起腸炎。兩種毒素在人體都有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用，但是毒素A是液體分泌(從而導(dǎo)致腹瀉)和腸炎癥的主要刺激物。毒素A結(jié)合于上皮細(xì)胞表面，并通過(guò)有被小窩內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)。內(nèi)化導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白張力絲的解聚、肌動(dòng)蛋白結(jié)合的黏著斑的破壞、緊密連接的打開(kāi)、細(xì)胞的脫離和液體分泌增加。這些效應(yīng)已經(jīng)在體外在培養(yǎng)的人上皮細(xì)胞系(例如T84結(jié)腸細(xì)胞系)中得到證明，其中在單細(xì)胞層上加入毒素A減小了跨上皮阻力并增加了單細(xì)胞層的通透性。艱難梭菌腸毒素在體內(nèi)顯示出誘導(dǎo)嚴(yán)重炎癥，其特征是當(dāng)豚鼠、兔或大鼠回腸暴露于毒素A時(shí)，粘膜中嗜中性粒細(xì)胞遷移和腸細(xì)胞。導(dǎo)致該急性炎癥反應(yīng)的機(jī)制似乎是感覺(jué)腸神經(jīng)的激活和感覺(jué)神經(jīng)肽的釋放。最近的研究還提出毒素A上調(diào)腸內(nèi)COX-2的表達(dá)。
胃腸病原體引起的損傷的最常見(jiàn)的后果之一是腹瀉。腹瀉是由致病性細(xì)菌(包括產(chǎn)生腸毒素的細(xì)菌)、寄生蟲(chóng)或病毒可以引起的腸道內(nèi)上皮細(xì)胞分泌的增加造成的。
COX-2是一種催化由花生四烯酸合成前列腺素的酶。COX-2的其它已知的催化底物包括二高-γ-亞麻酸(20∶3n∶6)和二十碳五烯酸(EPA，20∶5n-3)，分別產(chǎn)生PGE1和PGE3。已經(jīng)克隆了人COX-2基因，并且已經(jīng)描述了它的基因表達(dá)對(duì)不同元件，如cAMP、NF-κB和TGF-β、IL-1或TNF-α的應(yīng)答。
COX-2與多種炎癥相關(guān)，所述炎癥包括過(guò)敏反應(yīng)和腸炎癥。在其中涉及COX-2活性的腸炎癥腸紊亂中，有胃炎、炎性腸病、過(guò)敏性腸綜合征或腸癌。
優(yōu)選地，酵母提取物以口服組合物的形式給藥，所述組合物按體積計(jì)包含0.01％到0.5％酵母提取物。另外，該組合物可包含優(yōu)選0.3％到7％數(shù)量的蛋白胨。蛋白胨的合適來(lái)源包括乳清蛋白和充分水解的乳清蛋白，雖然也可以使用水解程度在15％到20％的乳清蛋白，但優(yōu)選平均肽大小不超過(guò)5個(gè)氨基酸的乳清蛋白。肉類蛋白質(zhì)是蛋白胨的備選來(lái)源，并且在肉類蛋白質(zhì)中優(yōu)選牛肉蛋白質(zhì)。組合物還可包含肉膏，優(yōu)選按體積計(jì)0.3％到7.0％的量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該口服組合物包含(按體積計(jì))0.5％的酵母提取物、1％肉膏和1％的蛋白胨。
本發(fā)明的口服組合物可以采取多種不同的食品形式。例如，當(dāng)目標(biāo)群體是嬰兒群體，它可以是嬰兒配方粉劑。它也可以是脫水的食品，例如湯。它還可以是腸組合物或者補(bǔ)充配方。當(dāng)遭受腸紊亂的個(gè)體是寵物時(shí)，該口服組合物可以是濕的或干的寵物食品。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的組合物摻入到藥物中時(shí)，它可以與任何合適的賦形劑摻和成任意藥用形式。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于遭受病原體感染(如通過(guò)腸道紊亂，腸上皮完整性的破壞和腹瀉證明)的個(gè)體攝取酵母提取物，與那些患有同樣疾病但是飲食中沒(méi)有添加酵母提取物的個(gè)體相比，有正?；囊后w分泌，較小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，和減輕的炎癥。
在本發(fā)明的構(gòu)架中，肉膏和/或蛋白胨也可以與酵母提取物結(jié)合從而對(duì)于遭受腸紊亂、損傷和應(yīng)激的患者的腸完整性取得提高的效果。
實(shí)施例下面的實(shí)施例用來(lái)闡明本發(fā)明范圍內(nèi)的一些產(chǎn)品和生產(chǎn)這些產(chǎn)品的方法。不認(rèn)為它們以任何方式限制本發(fā)明?？梢詫?duì)本發(fā)明進(jìn)行修改和修飾。也就是說(shuō)，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些實(shí)施例中許多變通方案用以覆蓋寬范圍的配方、成分、加工和混合物用以對(duì)于多種應(yīng)用合理地調(diào)節(jié)本發(fā)明化合物的天然發(fā)生的水平。
實(shí)施例1-組合物對(duì)緊密連接和肌動(dòng)蛋白絲的作用材料和方法人結(jié)腸細(xì)胞系T84(ATCC，CCL-248)在DMEM∶F12 1∶1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有20％FBS(胎牛血清)，2mM谷氨酰胺以及100U/ml青霉素-鏈霉素。人原代皮膚成纖維細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％FBS以及100U/ml青霉素-鏈霉素。
T84單細(xì)胞層以0.5×106個(gè)細(xì)胞/孔接種于六孔加樣板內(nèi)并培養(yǎng)3周。測(cè)量TEER(跨上皮電阻)的基線值，然后將培養(yǎng)基換成含有20％deMan-Rogosa-Sharpe溶液的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(在PBS中含有0.5％酵母提取物與1％牛肉膏和1％肉蛋白胨的溶液，以后將其稱為“MRS”)。37℃1小時(shí)后，在單細(xì)胞層的頂面加入艱難梭菌毒素A至終濃度100ng/ml，接著在37℃下1、2、4、6和24小時(shí)后測(cè)量TEER。對(duì)照單細(xì)胞層只暴露于培養(yǎng)基。對(duì)于每一種情況使用一式三份的樣品。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收集1ml頂面和1ml底側(cè)培養(yǎng)基，并根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)利用Cytotoxicity Detection Kit測(cè)量LDH釋放來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生活力。
將T84細(xì)胞或人原代成纖維細(xì)胞(2×105/室)接種在4室載玻片上，按照前述方法培養(yǎng)，與20％的MRS溶液孵育1小時(shí)后加入終濃度為500ng/ml的毒素A。6小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞，用3.7％的多聚甲醛固定，用PBS洗滌兩次，在-20℃用丙酮滲透5分鐘，以PBS-1％BSA(牛血清白蛋白)處理用來(lái)降低非特異標(biāo)記。在用200U/ml的羅丹明標(biāo)記的毒蕈肽標(biāo)記細(xì)胞后，通過(guò)熒光顯微術(shù)評(píng)估肌動(dòng)蛋白解聚和細(xì)胞變圓。
結(jié)果毒素A影響上皮細(xì)胞的緊密連接，該作用通過(guò)上皮單細(xì)胞層的跨上皮電阻(TEER)的降低來(lái)測(cè)量。為了評(píng)估MRS是否可以中和毒素A的毒性，在所述組合物存在或不存在的情況下，將T84單細(xì)胞層暴露于毒素A，并測(cè)量TEER。向T84單細(xì)胞層加入100ng/ml毒素A并孵育6小時(shí)后導(dǎo)致TEER減小到TEER對(duì)照值的1/3(309±8 vs.985±49Ωcm2)。加入20％的MRS溶液以及毒素A防止了TEER減小(1403±95 vs.309±8Ωcm2)，但是并不改變T84細(xì)胞的基線TEER值(1217±277Ωcm2vs.985±49Ωcm2)。沒(méi)有觀察到細(xì)胞生活力的變化，表明毒素A在6小時(shí)期限內(nèi)沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。以上結(jié)果表明酵母提取物與蛋白胨和肉膏的混合物能夠中和毒素A并保護(hù)T84單細(xì)胞層免于毒素A誘導(dǎo)的TEER減小。
為了確定MRS針對(duì)毒素A誘導(dǎo)的TEER減小的保護(hù)作用是否與導(dǎo)致細(xì)胞變圓的細(xì)胞骨架改變有關(guān)，單獨(dú)用毒素A或者聯(lián)合20％的MRS溶液處理T84細(xì)胞，并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)分析細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白。加入500ng/ml毒素A誘導(dǎo)T84細(xì)胞變圓，其通過(guò)單細(xì)胞層的蜂窩外觀可以證明，該外觀是由于肌動(dòng)蛋白解聚和包裝。組合加入20％的MRS溶液和毒素A部分地防止了由毒素A引起的肌動(dòng)蛋白解聚和隨后的細(xì)胞變圓，但是單獨(dú)加入毒素A時(shí)不影響細(xì)胞的細(xì)胞骨架。由于T84單細(xì)胞層的空間結(jié)構(gòu)，這些效應(yīng)不容易被觀察到。為了更容易解釋，使用原代人皮膚成纖維細(xì)胞重復(fù)實(shí)驗(yàn)，該細(xì)胞形成平面單細(xì)胞層。在毒素A存在下6小時(shí)后，所有成纖維細(xì)胞都呈現(xiàn)出圓的外觀，表明細(xì)胞骨架的完全破壞。組合加入20％的MRS溶液和毒素A部分防止了肌動(dòng)蛋白解聚和細(xì)胞變圓。用毒素A和20％組合物處理過(guò)的成纖維細(xì)胞的形狀與對(duì)照成纖維細(xì)胞或者僅用所述組合處理的成纖維細(xì)胞的形狀相當(dāng)?shù)遣幌嗤?。因此MRS可以中和毒素A，部分防止由于肌動(dòng)蛋白解聚引起的細(xì)胞骨架改變及隨后的細(xì)胞變圓。
然后用0.5％酵母提取物溶液的20％溶液代替20％MRS溶液重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)，得到與20％MRS溶液相似的結(jié)果。
討論這里觀察到的保護(hù)作用的機(jī)制并沒(méi)有清楚地闡明并且可能是不同的。毒素A誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲聚合，導(dǎo)致細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白解聚。肌動(dòng)蛋白破壞是體外觀察到的細(xì)胞變圓以及緊密連接通透性增加的原因。毒素A對(duì)肌動(dòng)蛋白的作用是由于它對(duì)Rho家族蛋白質(zhì)的葡糖轉(zhuǎn)移酶的活性。毒素A能夠酶促轉(zhuǎn)移UDP葡萄糖的葡萄糖殘基至Rho、Rac和Cdc-42的蘇氨酸37，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白張力絲解聚、肌動(dòng)蛋白結(jié)合的黏著斑的破壞、緊密連接的開(kāi)放、細(xì)胞脫離以及增加的液體分泌。這些作用已經(jīng)在體外用T84細(xì)胞得到證明，其中在單細(xì)胞層上加入毒素A減小了跨上皮阻力并增加了單細(xì)胞層的通透性，這是由于上皮細(xì)胞中Rho蛋白質(zhì)的修飾。因此我們認(rèn)為酵母提取物干擾了Rho蛋白質(zhì)的信號(hào)通路，從而抑制了毒素A的作用。不希望被理論束縛，該干擾可以在葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移至Rho蛋白質(zhì)的上游或下游。
實(shí)施例2-組合物對(duì)產(chǎn)腸毒素的胃腸病原體引起的損傷的作用材料和方法
六周齡的雄性小鼠自由接受60mg/L慶大霉素、250mg/L萬(wàn)古霉素、300mg/L阿莫西林和10mg/L兩性霉素處理一周以便消滅腸道小型生物群。將這些小鼠分成3組i)對(duì)照組；ii)自由接受持續(xù)一周飲用水中20％MRS溶液的組；iii)用管飼法每各兩天給予兩次500μl組合物的組。在處理結(jié)束后，用30mg/kg體重的戊巴比妥鈉將動(dòng)物麻醉并放在溫暖的毯子(37℃)上，整個(gè)手術(shù)持續(xù)時(shí)間期間都在0.8-3％的異氟醚(isofiuoran)麻醉下進(jìn)行。通過(guò)正中線切口開(kāi)腹，暴露遠(yuǎn)端空腸。將兩段5厘米長(zhǎng)的空腸段用手術(shù)線進(jìn)行兩端雙結(jié)扎，從而形成間隔2cm的兩個(gè)腸袢。在其中一個(gè)中注射600μl PBS作為對(duì)照，另一個(gè)中注射600μl含有20μg毒素A的PBS。然后，將腸袢返回腹腔，縫合切口。讓小鼠恢復(fù)并對(duì)它們連續(xù)追蹤。4小時(shí)后，安樂(lè)處死動(dòng)物，分離腸袢，并記錄它們的重量與長(zhǎng)度的比率(mg/cm)，用來(lái)評(píng)估液體分泌。接著用冰預(yù)冷的PBS洗滌腸袢兩次，浸入RNAlaterTM中，在液氮中迅速冷凍后保存于-80℃。
結(jié)果艱難梭狀芽孢桿菌感染可導(dǎo)致腹瀉和大腸炎，多數(shù)發(fā)生于醫(yī)院和家中的老年人患者，他們因服用抗生素而導(dǎo)致腸道小型生物群改變。為了評(píng)估本發(fā)明的組合物和其組分是否可以在體內(nèi)中和毒素A的效應(yīng)，使用了小鼠模型。為了模擬在人體引發(fā)艱難梭狀芽孢桿菌感染的條件，將小鼠用抗生素處理一周，目的是改變它們的腸道小型生物群。在抗生素處理結(jié)束后1天，一組小鼠自由接受20％的MRS溶液持續(xù)一周。在該期限結(jié)束時(shí)，形成腸袢并注射PBS或20μg毒素A。4小時(shí)的孵育后，對(duì)照小鼠的腸袢當(dāng)注射毒素A時(shí)與注射PBS的腸袢相比顯示增加的液體分泌(121.9±31.7vs.64.6±13.5mg/cm)。相比，在接受MRS一周的小鼠中，注射毒素A或PBS的腸袢中沒(méi)有觀察到液體分泌的差異(73.6±8.3vs.66.8±10.8mg/cm)。當(dāng)用管飼法對(duì)小鼠施用2劑500μl的20％MRS溶液時(shí)，得到相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，用酵母提取物、蛋白胨和肉膏處理可以防止毒素A在表現(xiàn)出腸道小型生物群受損的受試者中的不利效應(yīng)。
為了確定該組合物是否通過(guò)直接失活毒素A來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用，將20％MRS溶液或作為對(duì)照的PBS與毒素A混合1小時(shí)后將混合物注射到用抗生素處理一周的小鼠的腸袢中。對(duì)照(PBS)與MRS注射的腸袢之間在毒素A誘導(dǎo)的液體分泌水平上沒(méi)有顯著差異。此結(jié)果表明，所述組合物不是通過(guò)直接結(jié)合和失活毒素A來(lái)中和毒素A的作用，所述直接結(jié)合和失活可以導(dǎo)致毒素切割或者毒素結(jié)合表位的掩蔽。
討論MRS組合物保護(hù)小鼠免于毒素A引起的腸液分泌。雖然不希望被理論束縛，但是我們相信酵母提取物的保護(hù)作用并不是因?yàn)榍懈疃舅谹的酶活性，有以下兩個(gè)主要原因i)所用的溶液總是高壓滅菌的，它將導(dǎo)致溶液中含有的任何酶(例如蛋白酶)的失活且ii)在注射入小鼠的腸袢前與毒素A混合并孵育的該組合物不能抑制腸液分泌。因此，我們相信酵母提取物的保護(hù)活性是因?yàn)樵撊芤捍嬖谟坞x分子(例如氨基酸或肽)，這些分子可以結(jié)合腸上皮細(xì)胞上的毒素A受體并防止毒素A的結(jié)合和激活相關(guān)的信號(hào)通路。
實(shí)施例3-組合物對(duì)COX-2表達(dá)的影響材料和方法用實(shí)施例2中描述的相同方法。從小鼠腸袢提取RNA，并通過(guò)RT-PCR評(píng)價(jià)COX-2mRNA表達(dá)。用200U Supercript II酶逆轉(zhuǎn)錄總RNA(1μg)。用5’-CACAGTACACTACATCCTGACC-3’作為正義引物，5’-TCCTCGCTTCTGATTCTGTCTTG-3’作為反義引物，擴(kuò)增小鼠COX-2的400bp片段。用5’-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’作為正義引物，5’-ATGGATGACGATATCGCT-3’作為反義引物從相同的RT混合物擴(kuò)增β-肌動(dòng)蛋白的700bp片段作為內(nèi)部對(duì)照。為了排除DNA污染，直接對(duì)RNA樣品進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物加入1％瓊脂糖凝膠，照相，相片用于條帶強(qiáng)度的光密度定量。根據(jù)內(nèi)部對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化確定COX-2和對(duì)應(yīng)的β-肌動(dòng)蛋白mRNA信號(hào)的比值，并相對(duì)于“未處理樣品”(給予水并注射PBS)的比值表達(dá)，對(duì)未處理樣品設(shè)定分值1。
結(jié)果已知COX-2參與毒素A介導(dǎo)的液體分泌，為了確定COX-2是否也參與組合物的保護(hù)作用，通過(guò)RT-PCR評(píng)估COX-2mRNA表達(dá)。由于不同的處理導(dǎo)致COX-2表達(dá)的改變相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白表示。在對(duì)照小鼠的腸袢內(nèi)注射20μg毒素A誘導(dǎo)COX-2mRNA表達(dá)增加3.6倍。用該組合物處理小鼠一周導(dǎo)致毒素A引起的COX-2增加減小了一半。在蛋白胨或牛肉膏處理的情況下，毒素A誘導(dǎo)的腸COX-2表達(dá)完全正常化到基礎(chǔ)水平，而在酵母提取物處理下，毒素A誘導(dǎo)的腸COX-2表達(dá)減小到1/2.3。該組合物或其組分都不能顯著改變COX-2mRNA表達(dá)的基礎(chǔ)水平。當(dāng)采用管飼法時(shí)，該組合物或它的組分也能抵消毒素A誘導(dǎo)的COX-2mRNA增加。
討論毒素A結(jié)合至上皮細(xì)胞后，它表現(xiàn)為引起炎癥，包括嗜中性粒細(xì)胞遷移和腸細(xì)胞壞死以及絨毛的破壞。這些效應(yīng)是感覺(jué)腸神經(jīng)激活后感覺(jué)神經(jīng)肽(如物質(zhì)P和降鈣素基因相關(guān)肽)的釋放介導(dǎo)的。除了在NK-1R的腸上皮上表達(dá)外，SP的受體在感染艱難梭狀芽孢桿菌的動(dòng)物和人中顯著增加。近期的研究還提出艱難梭狀芽孢桿菌的毒素A上調(diào)腸內(nèi)COX-2的表達(dá)。COX-2是環(huán)加氧酶的可誘導(dǎo)的同種型，它介導(dǎo)前列腺素E2(PGE2)(已知增加腸液分泌的物質(zhì))的合成，從而導(dǎo)致腹瀉。盡管不希望被理論束縛，但是我們相信酵母提取物抑制了這些途徑的任一種，從而中和毒素A。我們的結(jié)果表明，酵母提取物抑制了腸的毒素介導(dǎo)的COX-2誘導(dǎo)。如果我們的溶液抑制或減少毒素與它的腸細(xì)胞受體的結(jié)合，那么所述抑制可以是由于毒素A介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制，其中所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致COX-2激活。
權(quán)利要求
1.酵母提取物的用途，用于生產(chǎn)治療產(chǎn)生腸毒素病原體的感染效應(yīng)的口服組合物。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述效應(yīng)包括腸上皮完整性的破壞、腹瀉和其他COX-2介導(dǎo)的效應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述病原體是艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、杜氏利什曼原蟲(chóng)、霍亂弧菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、志賀桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌和/或產(chǎn)生腸毒素的脆弱擬桿菌。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述口服組合物包含按體積計(jì)0.01％到0.5％的酵母提取物。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述口服組合物還包含蛋白胨，優(yōu)選其量為按體積計(jì)0.3％到7％。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述蛋白胨為乳清蛋白的水解產(chǎn)物，其平均肽大小不超過(guò)5個(gè)氨基酸。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述口服組合物還包含肉膏，優(yōu)選其量為按體積計(jì)0.3到％7。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述口服組合物是藥物治療的佐劑。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述口服組合物是嬰兒配方或者腸組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含酵母提取物的口服組合物的用途，用于生產(chǎn)治療病原細(xì)菌(例如艱難梭菌)引起的感染效應(yīng)的口服組合物。此類效應(yīng)可以包括腸上皮完整性的破壞、腹瀉以及其他COX－2介導(dǎo)的效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1889966SQ200480036943
公開(kāi)日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月13日
發(fā)明者I·科爾蒂希杜拉, G·福特保羅斯, G·貝爾貢澤利 申請(qǐng)人:雀巢技術(shù)公司