專利名稱：：基于b7-1-pe40kdel外毒素融合基因的dna疫苗及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于免疫學和分子生物學領域，涉及一種基于B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途。本發(fā)明還涉及一種B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因、該外毒素融合基因編碼的外毒素融合蛋白、含有該外毒素融合基因的重組表達載體、以及含有所述重組表達載體的組合物。
背景技術：
：異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)和實體器官移植已廣泛應用于惡性血液病、某些遺傳性疾病、急性重度放射病、各種實體器官功能衰竭以及臟器惡性腫瘤等多種疾病的治療上。由于供-受者間組織相容性抗原(MHC)的差異，當然還有其它諸多已知與未知因素如次要組織相容性抗原(mHA)、組織特異性抗原以及非免疫學因素等等，不可避免的要發(fā)生宿主抗移植物(HVGD)和移植抗宿主病(GVHD或GVHR)，這是導致同種異體組織器官移植失敗與移植物慢性失功(GOT)的最重要、最根本的原因之一。隨著急需器官移植患者人數(shù)的不斷增加，供體缺乏的矛盾顯得日加突出。無論是在現(xiàn)在還是將來，以不完全相合或者半相合移植的病例都將成為造血干細胞移植和器官移植的主流和方向。傳統(tǒng)的防治方法是以破壞移植受體的全部免疫機能以至于喪失移植物抗白血病(GVL)、抗感染等作用為代價的，諸如使用大劑量多種免疫抑制劑或者去除移植物中全部T細胞。毫無疑問，解決GVHD和HVGD發(fā)生發(fā)展的根本出路或新的策略則在于能否有效地干預或抑制T細胞活化的始動環(huán)節(jié)，誘導特異性的免疫耐受，從而從根本上遏制“細胞因子風暴”的發(fā)生與發(fā)展。因此，一種理想高效的allo-HSCT和器官移植治療還應同時包含修正或改良T細胞對異基因抗原的初始反應的策略，而不是去除移植受體內(nèi)或供體移植物中所有的T細胞。也就是說，誘導對受體或供體的特異性免疫耐受僅是靶向性消除或抑制受體或供體T細胞對同種異基因抗原反應的能力，但仍保留該T細胞對其它抗原反應的正常功能。業(yè)已證實，供、受體的T細胞在造血干細胞移植或器官移植中起著雙重作用，既能夠有助于造血干細胞或器官的植活、控制條件性感染以及抗白血病效應；同時也是導致GVHD或HVGD的根本原因。這一系列的免疫反應是通過T細胞的識別、活化而完成的。T細胞活化需要兩種信號與T細胞受體結合信號和CM8共刺激信號。第一信號受第二信號調(diào)控，導致T細胞活化、部分活化或無反應。因此，通過阻斷T細胞受體信號或CM8介導的共刺激信號抑制T細胞活化是防治HVGD和aGVHD的重要策略。目前國際上主要采用CTLA4_Ig或B7抗體誘導特異性免疫耐受，達到防治HVGD和aGVHD的目的，并且已在大量體內(nèi)、外動物實驗的結果中得到證明。但其缺憾在于，所誘導的免疫耐受期限較短，且誘導無能的T細胞可經(jīng)旁路重新激活，從而導致治療失??；并且阻斷所采用的單抗多為鼠源性，其產(chǎn)生的免疫原性會影響療效。因此，提供一種具有良好的免疫耐受與治療性的治療或預防同種異體組織/器官移植排斥反應諸如移植物抗宿主病的DNA疫苗是本領域技術人員急需解決的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗和創(chuàng)造性的勞動，發(fā)現(xiàn)了一種B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因，并且驚奇地發(fā)現(xiàn)，轉染入真核細胞的重組表達載體PCDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL經(jīng)轉錄、翻譯和翻譯后修飾被分泌到胞外，pcDNA3.1/ko(+)-B7-l-PE40KDEL可在真核細胞中高效表達并且表達產(chǎn)物具有很好的靶向免疫抑制活性；發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗可以有效地預防和治療(例如小鼠)移植物抗宿主病。由此提供了下述發(fā)明本發(fā)明的一個方面涉及一種B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO2所示。B7-1-PE40KDEL測定序列及開放閱讀框分析如下SEQIDNO1的堿基序列(1850個堿基)CGTTTMCTTMGCTTGGTACCTGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGC60TCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCMGGMGTGAMGMGTAG120CMCGCTGTCCTGTGGTCACMTGTTTCTGTTGMGAGCCGGCACAMCTCGCATCTACT180GGCAAAAGGAGMGMMTGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGMTATATGGCCCG240AGTACMGMCCGGACCATCTTTGATATTACTMTMCCTCTCCATTGTGATCCTGGCTC300TGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGMGTATGMAMGACGCTT360TCMGCGGGAACACCTGGCTGMGTGACGTTATCAGTCMAGCTGACTTCCCTACACCTA420GTATATCTGACTTTGAMTTCCMCTTCTAATATTAGMGGATMTTTGCTCMCCTCTG480GAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAMTGGAGMGMTTAAGTGCCATCA540ACACMCAGTTTCCCMGATCCTGAMCTGAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAMCTGGATT600TCMTATGACMCCMCCACAGCTTCATGTGTCTCATCMGTATGGACATTTMGAGTGA660ATCAGACCTTCMCTGGMTACAACCAAGCMGAGCATTTTCCTGATMCGGTGGCGGCG720GATCTGGAGGCGGTGGMGCGGTGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGCGGCAGCCTGG780CCGCGCTGACCGCGCACCAGGCTTGCCACCTGCCGCTGGAGACTTCCACCCGTCATCGCC840AGCCGCGCGGCTGGGMCMCTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCC900TCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGMCCAGGTCGACCAGGTGATCCGCMCGCCCTGG960CCAGCCCCGGCAGCGGCGGCGACCTGGGCGMGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAGGCCC1020GTCTTGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTCGTCCGGCAGGGCACCGGCA1080ACGACGAGGCCGGCGCGGCCMCGCCGACGTGGTGAGCCTGACCTGCCCGGTCGCCGCCG1140GTGMTGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTG1200GCGCGGAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGMCT1260GGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCMCTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCG1320TCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGMGCGTCGCAMGCATCGTCTTCGGCGGGGTGCGCG1380CGCGCAACCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGC1440TGGCCTACGGCTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATCCGCMCGGTG1500CCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCGAGCCTGCCGGGCTTCTACCGCACCAGCCTGA1560CCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGMCGGCTGATCGGCCATCCGCTGCCGC1620TGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGCCTGGAGACCATTCTCG1680GCTGGCCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCGATCCCCACCGACCCGCGCA1740ACATCGGCGGCGACCTCGACCCGTCCAGCATCCCCGACMGGMCAGGCGATCAGCGCCC1800TGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGAAGGACGAGCTGTAA1850上述序列中，帶下劃線的部分為KpnI酶切位點，加框部分為起始密碼子和終止密碼子。上述序列SEQIDNO1中的開放閱讀框為SEQIDNC:2(1827個堿基)t本發(fā)明的另一-方面涉及外_e素融合基因(SEQIDNO:1或SEQIDNO:2)所編碼的外毒素融合蛋白(SEQIDNO3)OSEQIDNO:3的氨基酸序列如下:(608個氨基酸，帶下劃線的部分為信號肽序列)MetGluThrAsdThrLeuLeuLeuTrDValLeuLeuLeuTrDValPro151015GlySerThrGlyAsdVallieHisValThrLysGluValLysGluVal202530AlaThrLeuSerCysGlyHisAsnValSerValGluGluProAlaGln354045ThrArglieTyrTrpGlnLysGluLysLysMetValLeuThrMetMet505560SerGlyAspMetAsnlieTrpProGluTyrLysAsnArgThrliePhe65707580AsplieThrAsnAsnLeuSerlieVallieLeuAlaLeuArgProSer859095AspGluGlyThrTyrGluCysValValLeuLysTyrGluLysAspAla100105110PheLysArgGluHisLeuAlaGluValThrLeuSerValLysAlaAsp115120125PheProThrProSerlieSerAspPheGluIleProThrSerAsnlie130135140ArgArglielieCysSerThrSerGlyGlyPheProGluProHisLeu145150155160SerTrpLeuGluAsnGlyGluGluLeuSerAlalieAsnThrThrVal165170175SerGlnAspProGluThrGluLeuTyrAlaValSerSerLysLeuAsp180185190PheAsnMetThrThrAsnHisSerPheMetCysLeulieLysTyrGly195200205HisLeuArgValAsnGlnThrPheAsnTrpAsnThrThrLysGlnGlu210215220HisPheProAspAsnGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly225230235240GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlySerLeuAlaAlaLeuThr0074]2452502550075]AlaHisGlnAlaCysHisLeuProLeuGluThrSerThrArgHisArg0076]2602652700077]GlnProArgGlyTrpGluGlnLeuGluGlnCysGlyTyrProValGln0078]2752802850079]ArgLeuValAlaLeuTyrLeuAlaAlaArgLeuSerTrpAsnGlnVal0080]2902953000081]AspGlnVallieArgAsnAlaLeuAlaSerProGlySerGlyGlyAsp0082]3053103153200083]LeuGlyGluAlalieArgGluGlnProGluGlnAlaArgLeuAlaLeu0084]3253303350085]ThrLeuAlaAlaAlaGluSerGluArgPheValArgGlnGlyThrGly0086]3403453500087]AsnAspGluAlaGlyAlaAlaAsnAlaAspValValSerLeuThrCys0088]3553603650089]ProValAlaAlaGlyGluCysAlaGlyProAlaAspSerGlyAspAla0090]3703753800091]LeuLeuGluArgAsnTyrProThrGlyAlaGluPheLeuGlyAspGly0092]3853903954000093]GlyAspValSerPheSerThrArgGlyThrGlnAsnTrpThrValGlu0094]4054104150095]ArgLeuLeuGlnAlaHisArgGlnLeuGluGluArgGlyTyrValPhe0096]4204254300097]ValGlyTyrHisGlyThrPheLeuGluAlaAlaGlnSerlieValPhe0098]4354404450099]GlyGlyValArgAlaArgAsnGlnAspLeuAspAlalieTrpArgGly0100]4504554600101]PheTyrlieAlaGlyAspProAlaLeuAlaTyrGlyTyrAlaGlnAsp0102]4654704754800103]GlnGluProAspAlaArgGlyArglieArgAsnGlyAlaLeuLeuArg0104]4854904950105]ValTyrValProArgSerSerLeuProGlyPheTyrArgThrSerLeu0106]5005055100107]ThrLeuAlaAlaProGluAlaAlaGlyGluValGluArgLeulieGly0108]5155205250109]HisProLeuProLeuArgLeuAspAlalieThrGlyProGluGluGlu0110]5305355400111]GlyGlyArgLeuGluThrlieLeuGlyTrpProLeuAlaGluArgThr0112]545550555560ValVallieProSerAlalieProThrAspProArgAsnlieGlyGly565570575AspLeuAspProSerSerlieProAspLysGluGlnAlalieSerAla580585590LeuProAspTyrAlaSerGlnProGlyLysProProLysAspGluLeu595600605本發(fā)明的還一方面涉及一種重組表達載體，其含有與選自pcDNA3.1Zeo(+)、pffLNEO,pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表達載體有效連接的B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的重組表達載體，其由B7-1-PE40KDEL基因與pcDNA3.1/Zeo(+)載體組成。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其含有本發(fā)明的任一項重組表達載體。本發(fā)明的還一方面涉及一種治療或預防移植物抗宿主病的DNA疫苗，其包含本發(fā)明的任一項重組表達載體。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的DNA疫苗，其還包含醫(yī)藥學上可接受的免疫佐劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的DNA疫苗，其用于以注射、粘膜、基因槍導入等方式實施免疫；具體的，其用于以至少一種選自靜脈注射、動脈注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔內(nèi)注射的方式實施免疫。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的DNA疫苗，其為可經(jīng)由注射或可經(jīng)由粘膜施用的水溶液劑或復溶用凍干粉針劑。本發(fā)明的又一方面，提供一種制備DNA疫苗的方法，其包括將包含SEQIDN0:1或2所示核苷酸序列的B7-1-PE40外毒素融合基因與pcDNA3.1/Zeo(+)載體有效連接的步驟。根據(jù)本發(fā)明所述制備DNA疫苗的方法，其包括以下步驟1)分別設計含有信號肽及KpnI酶切位點的上游引物P1，及含有確^CbaI酶切位點的下游引物P2，其中所述引物的序列如SEQIDNO4和SEQIDNO5所示；2)以原核表達載體pGEMT-B7-l-PE40KDEL質粒為模板，采用高保真的PfuDNA聚合酶進行PCR擴增；3)將PCR擴增產(chǎn)物回收，并用KpnI+Xbal雙酶切上述回收產(chǎn)物及pcDNA3.1/Zeo(+)載體，電泳后回收酶切產(chǎn)物；4)回收酶切產(chǎn)物；5)將雙酶切后的PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1/Zeo(+)載體連接；6)挑取具有Amp抗性的陽性菌落，提取質粒，雙酶切鑒定，菌株凍存；和7)培養(yǎng)菌株，提取并純化DNA疫苗治療用質粒，以及任選地，8)將所獲得的質粒與醫(yī)藥學上可接受的免疫佐劑混合。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的外毒素融合基因或者本發(fā)明的重組表達載體在制備治療或預防移植物抗宿主病的DNA疫苗中的用途。本發(fā)明的還一個方面涉及一種治療或預防移植物抗宿主病的方法，包括向受試者施用治療或預防有效量的本發(fā)明的DNA疫苗的步驟?？梢詫⒁惶斓膭┝吭谝惶熘幸淮涡匀拷o與受試者，也可以在一天內(nèi)將需要的劑量分成兩個、三個、四個或更多個小劑量以合適的間隔施用。所述小劑量可以配制成單元劑量形式，例如每個單元劑量形式含有日總劑量細分適宜次數(shù)的相應量。當然，也可以以一定的時間周期施用，例如一天施用一次、兩天施用一次、一周施用一次、一月施用一次、二月施用一次、三月施用一次、六月施用一次、一年施用一次、兩年施用一次等。圖1真核表達載體pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL構建示意圖，其中S表示信號肽序列。圖2瓊脂糖電泳分析B7-1-PE40KDELPCR擴增結果。泳道1，DNAmarker(DNA標志物)；泳道2，B7-1-PE40KDELPCR擴增產(chǎn)物。圖3瓊脂糖電泳分析KpnI+XbaI雙酶切重組質粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL結果。泳道1，DNAmarker；泳道2，XbaI單酶切重組質粒；泳道3，KpnI+XbaI雙酶切重組質粒。圖4轉染CH0-K1-RPE.40細胞后RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析。泳道1，DNA標志物；泳道2，轉染pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的CH0-K1-RPE.40細胞B7-1-PE40KDEL擴增結果；泳道3，β-actin的PCR擴增產(chǎn)物；泳道4，轉染pcDNA3.1空載體的CH0-K1-RPE.40細胞B7-1-PE40KDEL擴增結果；泳道5，未經(jīng)轉染的CH0-K1-RPE.40細胞B7-1-PE40KDEL擴增結果。圖5=WesternBlot檢測B7-1-PE40KDEL融合蛋白在真核細胞中的分泌。泳道1，轉染pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL；泳道2，pcDNA3.1/Zeo(+)空載體。圖6經(jīng)Zeo篩選后獲得穩(wěn)定轉染CHO-Kl-RPE.40細胞株表達PEA的相對于定量結果。圖A，實時聚合酶鏈反應定量分析；圖B，擴增曲線；圖C，溶解曲線。圖7=PEA濃度檢測的標準曲線。圖8真核表達產(chǎn)物B7-1-PE40KDEL的選擇性細胞抑制活性比較。圖9瓊脂糖電泳分析pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL質粒肌肉注射后在血液中的表達情況。圖10:PE40KDELmRNA在血液中的相對定量表達。圖Ii采用流式細胞儀分析外周血⑶3+ra^+T細胞的部分代表圖。圖12融合毒素基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL肌注后體內(nèi)Q^8+T細胞清除狀況。圖13血清中PEA抗體濃度檢測的標準曲線。圖14受鼠出現(xiàn)典型GVHD體征，圖為典型的弓背㈧和脫毛⑶表型。圖15移植后各組小鼠體重變化。A:aGVHD模型組；B骨髓移植組；C脾細胞移植組；D單純照射組。圖16移植后嵌合體檢測Y染色體sry基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。泳道1，DNA標志物；泳道2，aGVHD模型組sry基因擴增；泳道3，骨髓移植組sry基因擴增；泳道4，脾細胞移植組sry基因擴增；泳道5，單純照射組sry基因擴增。圖17:aGVHD受鼠病理組織學切片(HE染色X100)。A小腸；B肝臟；C脾臟；D皮膚。圖18移植后各組GVHD小鼠的生存率。圖19移植后各組GVHD小鼠的體重變化。圖20移植后各組aGVHD小鼠WBC的變化。圖21外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各組aGVHD小鼠小腸的組織病理學改變(HE染色，40X)。A組(B7-1)，B組(B7-2)，C組(B7-1+B7-2)，D組(空載體組)，E組(CsA+MTX)，F(xiàn)組(aGVHD未治療組)。圖22外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各組aGVHD小鼠皮膚的組織病理學改變(HE染色，40X)。A組(B7-1)，B組(B7-2)，C組(B7-1+B7-2)，D組(空載體組)，E組(CsA+MTX)，F(xiàn)組(aGVHD未治療組)。圖23外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各組aGVHD小鼠肝臟的組織病理學改變(HE染色，40X)。A組(B7-1)，B組(B7-2)，C組(B7-1+B7-2)，D組(空載體組)，E組(CsA+MTX)，F(xiàn)組(aGVHD未治療組)。圖24外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各組aGVHD小鼠的生存曲線以及中位生存時間。圖25移植后各組嵌合體檢測Y染色體sry基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。泳道1，DNA標志物；泳道2，pcDNA3.1/B7-1-PE40治療組sry基因擴增；泳道3，pcDNA3.1/B7-2-PE40治療組sry基因擴增；泳道4，B7-1+B7-2治療組sry基因擴增；泳道5，pcDNA3.1輸注組sry基因擴增；泳道6，CsA+MTX輸注組sry基因擴增；泳道7，aGVHD模型組sry基因擴增。圖沈外毒素融合基因疫苗治療對aGVHD小鼠外周血⑶4+/⑶8+細胞比例的影響。圖27流式細胞術分析各組小鼠外周血中⑶3+⑶4+T以及⑶3+CD8+T細胞比例的部分代表性圖譜。圖28外毒素融合基因疫苗治療對aGVHD小鼠外周血CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例的影響圖四流式細胞術分析小鼠外周血中⑶4+⑶25+Treg細胞比例的部分代表性圖譜。圖30外毒素融合基因疫苗治療對aGVHD小鼠外周血⑶細胞比例的影響。圖31流式細胞術分析小鼠外周血中⑶細胞比例部分代表性圖譜。具體實施例方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1真核表達載體pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的構建1.材料與方法1.1質粒、細胞及主要試劑PGEMT-B7-1-PE40KDEL(2003.3.3)原核表達載體由本室構建。表達載體pcDNA3.1/Zeo(+)由我室保存。kocin、Trizol、Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司。Jurkat細胞系、Raji細胞系為本室保存。CHO-K1-RPE.40細胞系由MoehringJM和MoehringTJ構建，由SucicJoseph.博士惠贈。PEA多抗購自Sigma公司；CD80單抗購自R&D公司。PVDF膜，AmiconUltra-4購自Millipore公司。ECL發(fā)光液購自Pierce公司。MTS(CellTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay)、PureYieiIdplasmidmidiprepsystem購自Promega公司。反轉錄試劑盒、SYBRPremixExTaqTM、KpnI酶、XbaI酶及T4連接酶購自TaKaRa公司。TMB底物顯色液、2XPfuPCRMasterMix購自TIANGEN公司。QIAquickGelExtractionKit購自QIAGEN公司。1.2主要儀器9700PCR儀(PerkinElmer)，Dll640紫外檢測儀(Beckman)，MiniII型蛋白電泳儀及蛋白半干電轉儀(Bio-fcid)，Gel-Pro3.1凝膠成像系統(tǒng)(MediaCybernetic)，550全自動酶標儀。實時熒光定量PCR儀(Stratagene，Mx3005P)。1.3真核表達載體pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的構建分別設計含有信號肽及KpnI酶切位點的上游引物P1，及含有^CbaI酶切位點的下游引物P2。信號肽序列參照invitrogen公司的pSecTag2-B載體的信號肽MurineIgk-chainV-J2-Csingnalp印tide，分泌性較強。引物序列如下上游引物Pl:5，GGTACCTATCGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTG3，(SEQIDNO:4，其中，下劃線部分為KpnI酶切位點，加框部分為起始密碼子，斜體部分為信號肽編碼序列)下游引物P2:P2:5’TCTAGATTACAGCTCGTCCTTCGGCGG3，(SEQIDNO:5，其中，下劃線部分為XbaI酶切位點)因加入信號肽后的Pl序列過長，故用SOE-PCR方法將Pl分成兩段引物進行重疊擴增。Pl-A5’CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTG3’(SEQIDN0:6)Pl-B5，GGTACCTATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCA3，(SEQIDNO7)以原核表達載體pGEMT-B7-l-PE40KDEL質粒為模板，采用高保真的PfuDNA聚合酶進行PCR擴增。擴增體系如下2XPfuPCRMasterMix12.5μ1Pl(20μΜ)0.5μ1Ρ2(20μΜ)0.5μ1pGEMT-B7-l-PE40KDEL(150)3μ1ddH208.5μ1總體積25μ1PCR反應條件如下96°C預變性5min，96°C變性lmin，63°C退火lmin，72°C延伸30個循環(huán)，后72°C延伸lOmin，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR擴增產(chǎn)物回收，并用KpnI+XbaI雙酶切上述回收產(chǎn)物及pcDNA3.1/Zeo(+)電泳后回收酶切產(chǎn)物。酶切體系如下IOXMBuffer2μ1XbaI1μ1KpnI1μ10.1%BSA2μ1回收PCR產(chǎn)物及pcDNA3·1/Zeo(+)14μ1載體總體積20μ1混勻后37°C水浴3h。將酶切產(chǎn)物按如下步驟回收1)用干凈刀片將目的條帶從瓊脂糖凝膠上切下放入1.5mlEp管中。2)稱量凝膠的重量，按IOOmg的凝膠加300μ1的BufferQG加入相應體積的溶膠3)50°C水浴孵育IOmin直至膠完全溶解，其間每2_;3min上下顛倒以徹底混勻。4)加入1倍體積的異丙醇，充分混勻。5)將樣品加入QIAquick柱，離心Imin0棄掉廢液，加0.5mlBufferQG,離心Imin06)棄掉廢液。加0.75ml的BufferPE，放置2_5min，離心Imin07)棄掉廢液，離心lmin。后將柱放于1.5ml的干凈Ep管中。8)將30μ1注射用水加入柱膜中央，放置Imin后離心Imin收集洗脫液。9)將雙酶切后的PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1/Zeo(+)載體連接，體系如下2XT4LigaseBuffer5μ1Τ4Ligase1μ1雙酶切PCR產(chǎn)物3μ1雙酶切pcDNA3.1/Zeo(+)1μ1總體積10μ1將連接管至于4°C冰水混合物中連接過夜。將連接產(chǎn)物按如下方法轉化入Dffia感受態(tài)菌中。具體操作如下1)將連接產(chǎn)物5μ1、試劑A20μ1用無菌水稀釋至100μ1，冰上備用。2)冰上融化入Dffia感受態(tài)菌(5min)，加入上述稀釋備用質粒。3)冰上放置20min，后室溫放置lOmin。鋪板，37°C過夜。挑取具有Amp抗性的陽性菌落，提取質粒，雙酶切鑒定(條件同前)，陽性者送TaKaRa公司測序確認。將鑒定序列正確的菌株凍存并大量培養(yǎng)，采用PureYieild質粒中提試劑盒大規(guī)模提取并純化基因治療用質粒。提純的質粒溶解于生理鹽水中，260/280在1.82.0.濃度〉0.5μg/μ1。1.4重組質粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL在CH0-K1-RPE.40細胞的瞬時表達采用脂質體介導方法，將0.5X105-2X105CH0-K1-RPE.40細胞傳入6孔板(培養(yǎng)基為DMEM/F12，7.5%FBS,IX非必需氨基酸)，培養(yǎng)基加1。4μg質粒和10μ1Lipofectamine2000分別用250μIOPTI-MEMI培養(yǎng)基稀釋，兩者混合孵育20min，緩慢加入6孔板中。37°C、5%C02孵育他后，更換為完全DMEM培養(yǎng)基。4后收集培養(yǎng)細胞及上清，采用RT-PCR及Wfestern印跡進行檢測。1.5RT-PCR檢測轉染細胞中B7-1-PE40KDEL的mRNA轉染4后，將生長的CH0-K1-RPE.40細胞用PBS清洗兩次，參照說明書用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，然后逆轉錄合成cDNA，分別用上述引物PI、P2進行PCR擴增，并采用β-actin作為參比對照。反轉錄體系如下MgCl22μ110XRNAPCRBuffer1μ1dNTPMixture1μ1RNaseInhibitor0.25μ1AMV0·5μ1OligodT0.5μ1RNA4·75μ1總體積10μ1反應條件為42°C30min，99°C5min，5°C5min。PCR反應體系如下MgCl23μ110XLABuffer4μ1(MH2O31.75μ1LATaq0.25μ1Pl(20μm)0.5μ1P2(20μm)0.5μ1cDNA第一鏈10μ1總體積50μ1反應條件如下96°C預變性5min，96°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸3min，30個循環(huán)，后72°C延伸IOmin。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。β-actin引物序列為上游引物Pl:5，CTGTGGCATCCACGAAACTA3，(SEQIDNO8)下游引物P2:5ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3，(SEQIDNO:9)1.6Western印跡檢測轉染細胞B7-1-PE40KDEL蛋白的表達1)蛋白電泳轉染CH0-K1-RPE.40細胞4后，收集培養(yǎng)上清并濃縮。取15μ1樣品與15μ12XSDSLoadingBuffer混勻，煮沸5min，行SDS-PAGE蛋白電泳，80V電壓電泳至蛋白泳出積層膠，后行150V電泳至分離膠底部，斷開電源。蛋白電泳配方如下10%分離膠5%積層膠2)轉膜電轉至PVDF膜。PVDF膜選用Immobilon-P。在甲醇浸泡15s，水中泡2min,電轉液中泡20min，同時將濾紙及膠泡電轉液15min，按+(白色)/三層濾紙/膜/膠/三層濾紙/黑色。轉膜條件60mA40min。3)使用封閉液室溫封閉濁；4)加入以適當比例用封閉液稀釋的一抗，PEA多抗或⑶80單抗4°C過液；5)TBST洗滌3次，每次5min；6)加入用封閉液稀釋的HRP-抗兔或抗山羊IgG—抗，室溫孵育Ih；7)TBST洗滌3次，每次IOmin；8)采用ECL方法曝光顯影、定影。1.7重組質粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL穩(wěn)定轉染CH0-K1-RPE.40細胞采用脂質體介導方法，具體操作同1.4。轉染24h后，120稀釋轉染細胞，按800μg/ml濃度加入kocin，每隔3d換液一次，待抗性克隆逐漸增大后將其轉至M孔板，長滿后傳至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，并擴增多瓶。用實時熒光定量RT-PCR相對定量的方法進行鑒定，將陽性細胞克隆凍存?zhèn)溆谩?.8ELISA檢測穩(wěn)定轉染細胞B7_1_PE40KDEL蛋白表達量1)收集穩(wěn)定轉染細胞的4培養(yǎng)上清并濃縮?；萌?0μ1濃縮液按110稀釋后包被96孔板過夜，每孔100μ1，每組樣品設3個平行孔。3)封閉液封閉Ih。4)加入抗PEA多抗37°C孵育Ih?；糜肞BST洗板3次。6)加HRP-抗兔IgG37°C孵育Ih。7)PBST洗板3次。8)加入顯色液TMB，15min后用2mol/L的H2S04中止，測450nm吸光度值并計算相應濃度。9)以未轉染質粒的正常細胞培養(yǎng)液作為空白對照。采用PEA作為標準品繪制標準曲線(KirmanJR,SederRA.DNAvaccination:theanswertostable,protectiveT-cellmemory？CurrOpinImmunol,2003,15:471-476.)。1.9真核表達產(chǎn)物B7-1-PE40KDEL的選擇性細胞毒作用檢測(5ml)(2ml)ddH2030%丙烯酰胺1.5MTris-HCl(PH8.8)1.OMTris-HCl(PH6.8)10%SDS10%過硫酸銨TEMED1.90ml1.70ml1.30ml0.25ml0.05ml0.05ml0.002ml1.40ml0.33ml0.02ml0.02ml0.002ml1將高表達⑶觀的人淋巴瘤細胞系Jurkat、鑒定陽性的pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL穩(wěn)定轉染CH0-K1-RPE.40細胞以lX105/ml濃度共培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，于37°C、5%CO2培養(yǎng)條件下孵育48h，加入20μ1MTS,Ih后測定490nm吸光度值計算細胞毒活性。以低表達⑶觀的人Burkitt’s淋巴瘤細胞系Raji作為陰性對照。細胞死亡率按如下公式計算細胞死亡率=(1-穩(wěn)定轉染CH0-K1-RPE.40細胞與靶細胞共培養(yǎng)孔中的存活細胞/未轉染CH0-K1-RPE.40細胞與靶細胞共培養(yǎng)孔中的存活細胞)X100%.2.結果2.lpcDNA3.1/B7_1_PE40KDEL真核表達載體的構建為使B7-1-PE40KDEL融合基因可在真核細胞中表達，一個含有B7-1-PE40KDEL以及Zeo抗性基因的真核表達載體pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL按圖1所示構建。用所設計的PCR引物擴增人B7-1-PE40KDEL，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見預期大小為1850bp的特異性條帶(圖2)。將雙酶切回收后產(chǎn)物克隆入真核表達載體pcDNA3.l/Zeo(+)的KpnI和^CbaI酶切位點，構建成pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL重組質粒，經(jīng)質粒提取、雙酶切后電泳(圖3)和測序鑒定結果(圖4，測序圖見附錄1)，得到陽性克隆。測序顯示信號肽之后的堿基序列沒有發(fā)生點突變和移碼突變，與原核表達質粒PRSETA-B7-1-PE40KDEL中的基因序列完全一致，與人B7-1以及PE40蛋白一、二級結構比對結果見表1。表1:B7-1-PE40KDEL融合蛋白與B7-1及PE40蛋白一、二級結構比較權利要求1.一種B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。2.權利要求1所述的外毒素融合基因所編碼的外毒素融合蛋白。3.一種重組表達載體，其含有與選自pcDNA3.lZeo(+)、pWLNE0、pSV2CAT、p0G44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表達載體有效連接的B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因。4.根據(jù)權利要求1所述的重組表達載體，其由B7-1-PE40KDEL基因與pcDNA3.1/Zeo(+)載體組成。5.一種組合物，其含有權利要求3或4所述的重組表達載體。6.一種治療或預防同種異體組織/器官移植排斥反應諸如移植物抗宿主病等的DNA疫苗，其包含權利要求3或4所述的重組表達載體。7.根據(jù)權利要求6所述的DNA疫苗，其還包含醫(yī)藥學上可接受的免疫佐劑。8.根據(jù)權利要求6或7的DNA疫苗，其用于以注射、粘膜、基因槍導入等方式實施免疫；具體的，其用于以至少一種選自靜脈注射、動脈注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔內(nèi)注射的方式實施免疫。9.根據(jù)權利要求6或7的DNA疫苗，其為可經(jīng)由注射或可經(jīng)由粘膜施用的水溶液劑或復溶用凍干粉針劑。10.權利要求1所述的外毒素融合基因或者權利要求3或4所述的重組表達載體在制備治療或預防同種異體組織/器官移植排斥反應諸如移植物抗宿主病等的DNA疫苗中的用途。全文摘要本發(fā)明屬于免疫學和分子生物學領域，涉及一種基于B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途。具體地，所述DNA疫苗含有一種重組表達載體，所述重組表達載體含有與選自pcDNA3.1Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表達載體有效連接的B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因。本發(fā)明還涉及一種B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因、該外毒素融合基因編碼的外毒素融合蛋白、含有該外毒素融合基因的重組表達載體、以及含有所述重組表達載體的組合物。本發(fā)明的DNA疫苗具有良好的治療或預防同種異體組織/器官移植排斥反應諸如移植物抗宿主病的效果。文檔編號A61K48/00GK102161998SQ20111002398公開日2011年8月24日申請日期2011年1月14日優(yōu)先權日2011年1月14日發(fā)明者奚永志,駱媛申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院