專利名稱：一種促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法和其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)又名魏氏梭菌,是一種重要的人畜共患病的病原體，可引起多種畜禽疾病，如仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥等，也能引起人的氣性壞疽和食物中毒。人們根據(jù)其發(fā)病快的特征將其命名為“猝死癥”。發(fā)病動物多以發(fā)病急、病程短、病死率高為特征，往往未見任何前期癥狀就來不及治療而導(dǎo)致牲畜死亡，造成畜牧養(yǎng)殖業(yè)極大的經(jīng)濟(jì)損失。
孔繁德(孔繁德，陳瓊，我國家畜促死癥的病因與防治對策，《中國獸醫(yī)雜志》，1999年，(3):50-52)等研究認(rèn)為，“目前魏氏梭菌是家畜猝死癥的主要病原”，引起猝死癥的致病因子在于產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的外毒素。Haagsma (J.Haagsma.Pathogenetic anaerobic bacteria and the environment[J].Rev.sc1.tech.0ff.1nt.Eqiz.，1991，10(3):749-764)、柴同杰(柴同杰，馬瑞華，常維山，等.產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌病的流行致病機(jī)制探討，《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》，2001年，23 (I): 70-72)等研究指出，“魏氏梭菌的致病原因在于其分泌的毒素和代謝產(chǎn)物，無毒素產(chǎn)生則不會出現(xiàn)臨床癥狀”，“動物魏氏梭菌感染導(dǎo)致的猝死癥，主要由腸毒血癥造成機(jī)體主要器官的衰竭所致”。迄今已發(fā)現(xiàn)α，β，γ，δ，ε，η，θ，ι，κ，λ，μ，ν12種外毒素,其中，以α，β，ε，ι外毒素較為常見。根據(jù)產(chǎn)生外毒素種類的不同,將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為Α、B、C、D、E五種毒素型。每種毒素型菌均可產(chǎn)生α毒素。A型菌主要產(chǎn)α毒素；B型菌主要產(chǎn)α、β、ε毒素；C型菌主要產(chǎn)α、β毒素；B型菌、C型菌的致病因素主要為β毒素；D型菌主要產(chǎn)α、ε毒素，且ε毒素為主要的致病因子；E型菌主要產(chǎn)α、ι毒素，但其發(fā)病率較低。外毒素的化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，具有較好的免疫原性。根據(jù)魏氏梭菌的發(fā)病機(jī)理，制備不同型的魏氏梭菌毒素，然后將其滅活脫毒制成類毒素疫苗或?qū)㈩惗舅刂苽涑煽苟舅兀糜陬A(yù)防和治療畜禽的“猝死癥”，具有比菌苗更為高效、可靠的免疫效果。Uzal等(Uzal FA.,Kelly WR.Protection of goats against experimental enterotoxaemiaby vaccination with Clostridium perfringens type D epsilon toxoid.VeterinaryRecord，1998，142:722-725)以山羊?yàn)閷ο螅O(shè)置ε類毒素疫苗免疫組、商用菌苗免疫組和不免疫對照組，研究了魏氏梭菌類毒素疫苗的免疫效果。結(jié)果表明，類毒素免疫組抗體效價(jià)最高，攻毒后獲得保護(hù)；菌苗免疫組抗體效價(jià)較低，攻毒后有輕度的腹瀉；未免疫對照組攻毒后出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉等癥狀。柴同杰等(柴同杰，劉文波，魏氏梭菌類毒素疫苗研制及其免疫家兔抗體消長規(guī)律，《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》，2006年，28(1):101-104)制備類毒素疫苗免疫家兔，保護(hù)效果可靠。魏氏梭菌類毒素疫苗可有效控制魏氏梭菌病的流行，用類毒素制備的抗毒素血清還能夠用于患畜的緊急搶救治療。
大量生長繁殖產(chǎn)氣莢膜梭菌，使其分泌高效價(jià)的外毒素是制備高質(zhì)量類毒素疫苗的關(guān)鍵。目前，一般使用厭氣肉肝湯、厭氣肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌。這些培養(yǎng)基的配制工藝復(fù)雜，包括購肉、冷庫保存、剔選、絞碎、保溫消化、提清過濾等工序，需要消耗大量的人力、物力，且生產(chǎn)周期較長，并受肉品質(zhì)的影響而影響培養(yǎng)基質(zhì)量的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響疫苗的品質(zhì)。產(chǎn)氣莢膜梭菌的產(chǎn)毒素能力與細(xì)菌菌株、培養(yǎng)基組成有關(guān)，還與培養(yǎng)溫度、PH值、培養(yǎng)時(shí)間等培養(yǎng)條件相關(guān)。因此，研究適合產(chǎn)氣莢膜梭菌生長繁殖且良好產(chǎn)毒的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaCl3-6重量份，加水至1000重量份。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述培養(yǎng)基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaC15重量份,加水至1000重量份。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述培養(yǎng)基的pH值為7.0-8.5，優(yōu)選pH值為7.5-8.0。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌選自A型產(chǎn)氣莢膜梭菌、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優(yōu)選為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。
本發(fā)明的另一目的是提供一種促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)方法，包括下述步驟:
I)一級種子的培養(yǎng):將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于血平板，在33_37°C下培養(yǎng)16_24h，制得產(chǎn)氣莢膜梭菌的一級種子；
2)二級種子的培養(yǎng):從產(chǎn)氣莢膜梭菌的一級種子培養(yǎng)物中挑取有雙層溶血環(huán)的單菌落，將其接種于培養(yǎng)基中，在33-37°C下培養(yǎng)16-18h，制得產(chǎn)氣莢膜梭菌的二級種子；
3)發(fā)酵培養(yǎng):按照70% (v/v)在發(fā)酵罐中加入本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基體積計(jì)，加入0.1% (v/v)的消泡劑，高壓滅菌，將培養(yǎng)基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)的接種量接種產(chǎn)氣莢膜梭菌的二級種子，在33-37°C下和pH值6.5-8.0下培養(yǎng)5_7h，制得產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)物，優(yōu)選在116°C高壓蒸汽滅菌30min ；
其中，所述培養(yǎng)基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份,葡萄糖4-8重量份，NaC13-6重量份,加水至1000重量份，優(yōu)選所述培養(yǎng)基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaCl5重量份，加水至1000重量份。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)方法選自厭氧培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、靜置厭氧培養(yǎng)的任一種或其組合。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述培養(yǎng)基的pH值為7.0-8.5，優(yōu)選pH值為7.5-8.0。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌選自A型產(chǎn)氣莢膜梭菌、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優(yōu)選為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35_36°C。本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，發(fā)酵培養(yǎng)中采用氨水調(diào)節(jié)其pH值，優(yōu)選pH值7.0-7.4。本發(fā)明的另一目的在于將本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素或其提取物用于預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的相關(guān)疾病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素或其提取物經(jīng)滅活脫毒制成的類毒素用于制備用于預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的相關(guān)疾病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的相關(guān)疾病選自仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥、人氣性壞疽、食物中毒的任一種或其組合。本發(fā)明的另一目的在于提供外毒素提取物的滅活脫毒方法，包括下述步驟:在37°C條件下，在外毒素或其提取物中加入甲醛，混合均勻，使其終濃度為0.4%-0.5%，放置，即得，優(yōu)選放置3-8日，更優(yōu)選放置3-5日。本發(fā)明的另一目的在于提供一種產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗，所述的疫苗由滅活脫毒的毒素液與20%氫氧化招膠按體積比為5:1均勻混合而成。為了清楚地表述本 發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明對術(shù)語進(jìn)行如下界定:本發(fā)明所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素又稱產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)分泌毒素，是指從產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)菌液離心后獲得的毒素上清液。本發(fā)明所述的牛肉浸粉購自上海盛思生化科技有限公司，貨號為SSC004。本發(fā)明所述的大豆蛋白胨購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，貨號02-19。本發(fā)明所述的血平板購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，貨號024070。本發(fā)明采用小鼠最小致死量方法測定外毒素的含量。測定方法為:用生理鹽水將Iml培養(yǎng)物上清液作200倍稀釋，再以0.13ml,0.16ml,0.2ml,0.25ml,0.3ml,0.4ml對體重16 20g昆明小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，每組的實(shí)驗(yàn)動物數(shù)為2只。觀察小鼠在24小時(shí)內(nèi)的存活情況，計(jì)算最小致死量(MLD)或Iml上清液含有的小鼠MLD數(shù)。若靜脈注射0.2ml能使小鼠致死，則MLD為(0.2/200) ml=0.001ml, Iml上清液含有的小鼠MLD數(shù)為1000，即1000小鼠MLD。本發(fā)明所述類毒素含量的計(jì)算方法為:若脫毒前外毒素含量為A，濃縮前、后的毒素上清體積分別為V1、V2，濃縮回收率按85%計(jì)，則濃縮后的類毒素含量為(AX Vl X 85%) /V2。除非另有說明，本發(fā)明涉及液體與液體之間的百分比時(shí)，所述的百分比為體積/體積百分比；本發(fā)明涉及液體與固體之間的百分比時(shí)，所述百分比為體積/重量百分比；本發(fā)明涉及固體與液體之間的百分比時(shí)，所述百分比為重量/體積百分比；其余為重量/重量百分比。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下述有益技術(shù)效果:1、本發(fā)明改進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)基組成，所述培養(yǎng)基含有牛肉浸粉、大豆蛋白胨、葡萄糖、NaCl等商品化生物化學(xué)試劑，具有培養(yǎng)基組成成份獲取方便，且其培養(yǎng)方法具有工藝簡便、質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短、制造成本低等優(yōu)點(diǎn)。2、本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基可在適宜環(huán)境下實(shí)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的靜置發(fā)酵培養(yǎng)，且相較于厭氣肉肝胃酶消化湯(培養(yǎng)時(shí)間為16_20h)的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間更短(僅需5-7h)，還利于促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素，其外毒素的含量可達(dá)到500-1200小鼠MLD/ml，具有極好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
3、本發(fā)明的外毒素或其提取物經(jīng)滅活脫毒后制成類毒素，可用于預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的相關(guān)疾病，所述的相關(guān)疾病選自仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥、人氣性壞疽、食物中毒的任一種或其組合。


圖1C型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素的SDS-PAGE蛋白電泳分析結(jié)果。
具體實(shí)施方式
以下將結(jié)合實(shí)施例具體說明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。
實(shí)施例1本發(fā)明培養(yǎng)基的組成及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明培養(yǎng)基的組成為:
牛肉浸粉 25g
大豆蛋白胨IOg
葡萄糖5g
NaCl5g
蒸餾水適量，將培養(yǎng)基定容至1000ml。
本發(fā)明培養(yǎng)基的制備方法，包括下述步驟:按照上述培養(yǎng)基組成稱取所需量的組份，均勻混合后，加入適量的蒸餾水，充分溶解后，用ION氫氧化鈉調(diào)pH值7.5-8.0，再加入蒸懼水定容至1000ml, 116°C滅菌30min,即得。
實(shí)施例2產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所述產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)方法，包括下述步驟:
I) 一級種子的培養(yǎng):將生產(chǎn)用凍干菌種C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2 (由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng))接種于血平板，于培養(yǎng)箱中33-37°C厭氧培養(yǎng)16-24h ；
2) 二級種子的培養(yǎng):挑取有雙層溶血環(huán)的單菌落，接種于本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中33-37°C靜置培養(yǎng)16-18h ；
3)發(fā)酵罐培養(yǎng):按發(fā)酵罐容積的70% (v/v)加入實(shí)施例1制得的培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基體積計(jì)，加入0.1% (v/v)的消泡劑，116°c高壓蒸汽滅菌30min，將培養(yǎng)基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)接種量接入二級種子，靜置培養(yǎng)，在35-36°C和pH7.0-7.4條件下培養(yǎng)5-7h,即得。
實(shí)施例3產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素的制備方法
產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素提取物的制備方法，包括下述步驟:將實(shí)施例2制得的產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)管式離心機(jī)(GQ105B，上海知正離心機(jī)有限公司生產(chǎn))，14800g離心，取上清，即得。
實(shí)施例4產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素的檢測
I)外毒素含量的測定
采用小鼠最小致死量方法測定外毒素的含量。實(shí)施例2培養(yǎng)后的產(chǎn)氣莢膜梭菌的外毒素含量可達(dá)到500-1200MLD/ml。
2 ) SDS-PAGE 蛋白電泳將實(shí)施例3制得的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果見圖1。電泳結(jié)果表明，實(shí)施例3制得的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素主要含有分子量約為43KD的α毒素和約為34KD的β毒素2條蛋白條帶。實(shí)施例5本發(fā)明類毒素疫苗的制備本實(shí)施例類毒素疫苗的制備方法，包括下述步驟:I)外毒素的滅活脫毒:在實(shí)施例3制得的外毒素上清中加入甲醛，使其終濃度為0.4%-0.5%，在37°C條件下作用3-8日，期間振蕩數(shù)次；2)外毒素的脫毒檢驗(yàn):將脫毒后的毒素液靜脈注射16_20g小鼠2只，每只0.4ml,觀察24小時(shí)，若均健活，即脫毒完全；若有死亡，則要繼續(xù)脫毒；3)類毒素的濃縮:采用Pellicon切向流超濾系統(tǒng)(改良聚醚砜膜包，貨號為P2B005A05)對類毒素進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的濃縮，并計(jì)算濃縮后的類毒素含量；4)類毒素疫苗的制備:取類毒素濃縮液與20%氫氧化鋁膠按5:1混合，制成疫苗，其中，類毒素含量為2000MLD/ml (以脫毒前計(jì)算)。實(shí)施例6本發(fā)明類毒素疫苗的評價(jià)試驗(yàn)I)安全檢驗(yàn)用體重1.5_2kg的健康家兔4只`，各肌肉注射疫苗4ml，觀察10日，觀察是否健活，有無局部或全身異常反應(yīng)。在觀察期內(nèi)，試驗(yàn)兔全部健活，食欲正常，體溫正常，接種部位無紅腫發(fā)熱現(xiàn)象，表明制備的類毒素疫苗安全性較好。2)效力試驗(yàn)①血清中和法用1.5-2.0kg健康家兔4只，各肌肉注射疫苗0.4ml，免疫后14日采血并分離血清。將4只家兔的血清等量混合，取混合血清Iml與等量的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素(含10小鼠MLD)混合，置37°C作用40分鐘后，靜脈注射體重16_20g小鼠2只，每只0.2ml ;同時(shí)，用同批小鼠2只，靜脈注射I小鼠MLD的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素作為對照組。觀察24小時(shí)，判定結(jié)果。統(tǒng)計(jì)各組小鼠的健活情況。結(jié)果顯示，對照組小鼠全部死亡，血清中和組小鼠全部健活，效力檢驗(yàn)合格。②懷孕母豬定量免疫、仔豬定量攻毒試驗(yàn)將4頭懷孕69-74日左右的初胎母豬設(shè)置為免疫組和不免疫對照組，每組2頭。免疫組于臨產(chǎn)前40-45日和15-20日各接種I次，每次每頭接種2ml。母豬分娩后，對免疫組和不免疫對照組母豬所產(chǎn)I日齡仔豬各取5頭，耳靜脈注射致死量的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，另設(shè)不免疫對照組母豬所產(chǎn)仔豬5頭為正常對照，攻毒后連續(xù)觀察14日，統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組仔豬的發(fā)病和保護(hù)情況。結(jié)果顯示，免疫母豬所產(chǎn)I日齡仔豬，經(jīng)耳靜脈注射致死量的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，連續(xù)觀察14日，各仔豬均健活，保護(hù)率均為100% ;對照組I日齡仔豬攻毒后在24小時(shí)內(nèi)全部死亡，結(jié)果見表I。表IC型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素攻毒試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaC13_6重量份，加水至1000重量份，優(yōu)選所述培養(yǎng)基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaC15重量份,加水至1000重量份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的pH值為7.0-8.5，優(yōu)選pH值為7.5—8.0 ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌選自A型產(chǎn)氣莢膜梭菌、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優(yōu)選為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。
4.一種促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)方法，包括下述步驟: 1)一級種子的培養(yǎng):將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于血平板，在33-37°C下培養(yǎng)16-24h，制得產(chǎn)氣莢膜梭菌的一級種子； 2)二級種子的培養(yǎng):從產(chǎn)氣莢膜梭菌的一級種子培養(yǎng)物中挑取有雙層溶血環(huán)的單菌落，將其接種于培養(yǎng)基中，在33-3 7°C下培養(yǎng)16-18h，制得產(chǎn)氣莢膜梭菌的二級種子； 3)發(fā)酵培養(yǎng):按照70%(v/v)在發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基體積計(jì)，加入0.1% (v/V)的消泡劑，高壓滅菌，將培養(yǎng)基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)的接種量接種產(chǎn)氣莢膜梭菌的二級種子，在33-37°C下和pH6.5-8.0下培養(yǎng)5_7h，制得產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)物，優(yōu)選在116 °C高壓蒸汽滅菌30min ； 其中，所述培養(yǎng)基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaC13-6重量份,加水至1000重量份,優(yōu)選所述培養(yǎng)基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉25重量份,大豆蛋白胨10重量份,葡萄糖5重量份，NaC15重量份，加水至1000重量份。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)方法選自厭氧培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、靜置厭氧培養(yǎng)的任一種或其組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4-5任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，發(fā)酵培養(yǎng)中采用氨水調(diào)節(jié)其pH值，優(yōu)選pH 值為 7.0-7.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)基的pH值為7.0-8.5，優(yōu)選pH值為 7.5-8.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法,發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35-36°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌選自A型產(chǎn)氣莢膜梭菌、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優(yōu)選為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。
10.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素提取物，由下述方法制備得到:將權(quán)利要求4-9任一項(xiàng)制得的產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)物在4°C條件下14800g離心，取上清，即得。
11.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素提取物的制備方法，包括下述步驟:將將權(quán)利要求4-9任一項(xiàng)制得的產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)物在4°C條件下14800g離心，取上清，即得。
12.權(quán)利要求4-11任一項(xiàng)制得的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素或其提取物用于預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的相關(guān)疾病的藥物或疫苗中的應(yīng)用，優(yōu)選所述產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素或其提取物經(jīng)滅活脫毒制成的類毒素用于預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的相關(guān)疾病的藥物或疫苗中的應(yīng)用，所述的相關(guān)疾病選自仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥、人氣性壞疽、食物中毒的任一種或其組合。
13.—種外毒素提取物的滅活脫毒方法，包括下述步驟:在37°C條件下，在權(quán)利要求10所述的外毒素提取物中加入甲醛，混合均勻，使其終濃度為0.4%-0.5%，放置，即得，優(yōu)選放置3-8日，更優(yōu)選放置3-5日。
14.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗，所述的疫苗由類毒素液與20%氫氧化鋁膠按體積比為5:1均勻混合 而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)外毒素的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法和其應(yīng)用。本發(fā)明所述培養(yǎng)基由牛肉浸粉、大豆蛋白胨、葡萄糖、NaCl和蒸餾水組成，產(chǎn)氣莢膜梭菌在適宜環(huán)境下厭氧靜置發(fā)酵培養(yǎng)，外毒素的含量可達(dá)到500-1200小鼠MLD/ml。外毒素經(jīng)滅活脫毒制成的類毒素用于預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的相關(guān)疾病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明培養(yǎng)基具有原料易得，制備工藝簡便、質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短，外毒素產(chǎn)量高，制造成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12P21/00GK103160555SQ20131008623
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者熊媛媛, 蔣玉文, 漆世華, 黃濤, 鄭佳, 朱薇, 謝紅玲, 溫文生 申請人:武漢中博生物股份有限公司