專利名稱：肌肉抑制素(gdf8)抑制劑和皮質(zhì)類固醇聯(lián)合用于治療神經(jīng)肌肉紊亂的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床病理生理學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及治療神經(jīng)肌肉紊亂，如肌營養(yǎng)不良的方法。本發(fā)明還涉及含有皮質(zhì)類固醇和生長和分化抑制劑的藥物制劑。
背景技術(shù)：
肌營養(yǎng)不良(MD)是進(jìn)行性遺傳的神經(jīng)肌肉紊亂，其特征是肌肉消瘦和肌無力(Emery(2002)The Lancet，359687-695)。許多形式的肌營養(yǎng)不良是致命的并且當(dāng)前不能治愈的。
杜興肌營養(yǎng)不良(DMD)是最常見的X-連鎖的神經(jīng)肌肉疾病。該疾病由編碼肌營養(yǎng)不良蛋白的DMD基因的突變引起。該蛋白質(zhì)的改變或者缺失導(dǎo)致異常肌纖維膜撕裂。近側(cè)肌肉中肌纖維直徑的異常改變(萎縮性和肥大纖維)和進(jìn)行性肌肉損傷是該疾病的標(biāo)志。受損的肌肉釋放細(xì)胞內(nèi)酶肌酸激酶(CK)。結(jié)果，DMD患者中血清CK水平特征為很高(最高達(dá)正常水平的10倍)。組織炎癥、肌纖維壞死和纖維脂肪組織對肌肉的更替的復(fù)合作用導(dǎo)致該病理生理級聯(lián)。
DMD基因的另一種等位基因變體導(dǎo)致MD的較輕的形式，其稱作貝克爾肌營養(yǎng)不良(BMD)。BMD在臨床上與DMD相似，但是癥狀的發(fā)作在生命中較晚出現(xiàn)。
已經(jīng)在MD中嘗試了許多藥理學(xué)試劑，但是沒有一種被證明可以有效抑制所述疾病的進(jìn)程。當(dāng)前的治療形式仍然處于理療和康復(fù)領(lǐng)域。
使用皮質(zhì)類固醇(例如，強(qiáng)的松和/或其衍生物)的許多試驗(yàn)已經(jīng)表明患有MD個體的改善，尤其短期改善。盡管皮質(zhì)類固醇減輕該疾病表型的確切機(jī)制還不清楚，但是認(rèn)為皮質(zhì)類固醇通過減輕炎癥、抑制免疫系統(tǒng)、改善鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、上調(diào)代償性蛋白質(zhì)的表達(dá)，和增加成肌細(xì)胞增殖來發(fā)揮作用(Khurana等人(2003)Nat.Rev.Drug Discovery2279-386)。然而，隨時間推移施用皮質(zhì)類固醇可以誘導(dǎo)肌萎縮，其主要影響近側(cè)肌肉——在DMD和BMD中受影響的相同的肌肉。皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)的肌肉和其他副作用限制了皮質(zhì)類固醇治療的長期有效性。
GDF-8是TGF-β超家族的成員并且作為肌肉生長的負(fù)調(diào)節(jié)劑起作用。類似于該超家族的其他成員，GDF-8以前體分子合成，但是在分泌前，該前體分子被切割成N-末端抑制性前肽和C末端活性成熟的GDF-8。前肽可以保持結(jié)合GDF-8，從而抑制成熟GDF-8的生物學(xué)活性。前肽必須從復(fù)合體解離以便GDF-8結(jié)合激活蛋白II型受體(ActRIIB)。結(jié)合后，ActRIIB啟動信號傳導(dǎo)級聯(lián)，最終導(dǎo)致成肌細(xì)胞發(fā)展的抑制。已經(jīng)表明在體內(nèi)GDF-8的抗體介導(dǎo)的抑制顯著增加正常成年小鼠中骨骼肌大小(Whittemore等人(2003)BBRC，300965-971)和減輕DMD的mdx小鼠模型中的營養(yǎng)不良表型(Bogdanovich等人(2002)Nature，420(28)418-421)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供治療特征是或者與肌肉功能減弱的危險相關(guān)的紊亂的方法和組合物。本發(fā)明的其他目的將在下面說明書中部分給出，并且部分從該說明書可以理解，或者可以通過實(shí)施本發(fā)明而知道。
本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn)和闡明在DMD的小鼠模型中，通過施用中和性抗-GDF-8抗體和強(qiáng)的松的治療相對于僅用強(qiáng)的松的治療更有效地增加肌肉量和強(qiáng)度。本發(fā)明還部分基于如下發(fā)現(xiàn)和闡明，即施用抗-GDF-8抗體和強(qiáng)的松減小了強(qiáng)的松誘導(dǎo)的肌萎縮。
因此，本發(fā)明提供了治療哺乳動物中神經(jīng)肌肉紊亂的方法。所公開的方法包括對易遭受或者患有神經(jīng)肌肉紊亂的受試者施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和至少一種皮質(zhì)類固醇，以便保持肌肉完整性或者功能的所希望的水平，所述肌肉完整性或者功能的所希望的水平可以通過例如，肌酸激酶(CK)的血清濃度、肌肉組織學(xué)、組織成像、日常生活的活動、肌肉強(qiáng)度和/或量來評估。通過本發(fā)明的方法治療的群體包括，但不限于，患有或者有危險患有肌肉營養(yǎng)不良(例如DMD或BMD)的患者和由于這些或者其他疾病正經(jīng)歷皮質(zhì)類固醇治療的受試者。
本發(fā)明還提供了治療肌無力的方法和治療皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)的肌萎縮的方法。本發(fā)明包括治療心肌病的方法。
提供了用于本發(fā)明方法的施用方法和組合物。在所公開的方法中，GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇同時或者在交替重疊或者非重疊的間隔內(nèi)施用。
用于本發(fā)明方法的GDF-8抑制劑包括，但不限于，針對GDF-8的抗體；針對GDF-8受體的抗體；可溶性GDF-8受體和其片段(例如，如美國專利申請?zhí)?0/689,677中描述的ActRIIB融合多肽，包括其中ActRIIB連接免疫球蛋白的Fc部分的可溶性ActRIIB受體)；GDF-8前肽和其修飾形式(例如，WO 02/068650或者美國專利申請?zhí)?0/071,499中描述的，包括其中GDF-8前肽連接免疫球蛋白的Fc部分的形式和/或其中GDF-8在天冬氨酸(asp)殘基突變的形式，例如，鼠GDF-8前肽中的asp-99和GDF-8前肽中的asp-100)；GDF-8的小分子抑制劑；卵泡抑素(follistatin)(例如，美國專利號6,004,937中描述)或者含有卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如，美國專利申請?zhí)?0/369,736和10/369,738中描述的GASP-1或者其他蛋白質(zhì))；和影響GDF-8活化的金屬蛋白酶活性的調(diào)節(jié)劑，如美國專利申請?zhí)?0/662,438中描述的。
在一些實(shí)施方案中，GDF-8抑制劑是阻斷GDF-8結(jié)合其受體的單克隆抗體或者其片段。非限制的闡明性實(shí)施方案包括非人單克隆抗-GDF-8抗體，例如，鼠單克隆抗體JA-16(如美國專利申請?zhí)?0/253,532中描述的；ATCC保藏號PTA-4236)；其衍生物，例如，人源化抗體；和完全人單克隆抗-GDF-8抗體(例如，如美國專利申請?zhí)?0/688,925中描述的Myo29、Myo28和Myo22；ATCC保藏號分別為PTA-4741、PTA-4740和PTA-4739)或者其衍生物。
用于本發(fā)明方法的皮質(zhì)類固醇包括，但不限于，倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、糠酸毛他松、強(qiáng)的松、曲安奈德和它們的衍生物。
可以理解前面的一般描述和下面的詳細(xì)描述都僅是示例性和解釋性的并且不限制要求保護(hù)的本發(fā)明。
附圖簡述

圖1A和1B描繪從用抗-GDF-8中和抗體JA-16(60mg/kg，每周一次)和強(qiáng)的松(2mg/kg，每周3次)、僅強(qiáng)的松或僅載體對照治療4周的mdx小鼠的隔肌的組織學(xué)分析結(jié)果。圖1A顯示了試驗(yàn)結(jié)束時0-4等級的肌纖維萎縮的嚴(yán)重性。圖1B顯示了試驗(yàn)結(jié)束時受影響的(萎縮的)肌纖維的百分?jǐn)?shù)。每個條形代表一只小鼠。
發(fā)明詳述I.定義為了更容易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。在發(fā)明詳述全文中給出了額外的定義。
文中所用術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白或者其部分，并且包括包含抗原結(jié)合部位的任意多肽，而不管來源、產(chǎn)生方法和其他特征如何。作為非限制性實(shí)例，術(shù)語“抗體”包括人、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊和雞抗體。所述術(shù)語包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、非特異抗體、人源化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變抗體和CDR-移植抗體。對于本發(fā)明的目的，除非另外說明，所述術(shù)語還包括抗體片段，如Fab、F(ab′)2、Fv、seFv、Fd、dAb和保留抗原結(jié)合功能的其他抗體片段。
可以例如，通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein(1975)Nature，256495-499)、重組DNA方法(美國專利號4,816,567)或者使用抗體文庫的噬菌體展示技術(shù)(Clackson等人(1991)Nature，352624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.，222581-597)制備抗體。對于多種其他抗體產(chǎn)生技術(shù)，見AntibodiesA LaboratoryManual，編者Harlow等人，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。
術(shù)語“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指抗體分子的部分，其包含特異結(jié)合抗原的部分或全部或者與抗原的部分或全部互補(bǔ)的區(qū)域。當(dāng)抗原很大時，抗體可以僅結(jié)合抗原的特定部分。表位或者抗原決定簇是抗原分子的一部分，其負(fù)責(zé)與抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異相互作用。通過一個或多個抗體可變結(jié)構(gòu)域可以提供抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，由VH結(jié)構(gòu)域組成的所稱作的Fd抗體片段)?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。
術(shù)語“抗-GDF-8抗體”或者“針對GDF-8的抗體”指特異結(jié)合GDF-8的至少一個表位的任意抗體。術(shù)語“GDF-8受體抗體”和“針對GDF-8受體的抗體”指特異結(jié)合GDF-8受體，如ActRIIB的至少一個表位的任意抗體。術(shù)語“中和抗體”指抗體，其是GDF-8抑制劑。
術(shù)語“特異相互作用”或者“特異結(jié)合”等等指兩個分子形成復(fù)合體，其在生理條件下是相對穩(wěn)定的。該術(shù)語還可應(yīng)用于例如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)μ囟ū砦惶禺悤r，所述表位可以存在于許多抗原上。特異結(jié)合的特征是高親和性和低到中等能力。非特異結(jié)合通常具有低親和性，具有中等到高能力。通常，當(dāng)親和性常數(shù)Ka高于106M-1，高于107M-1，或優(yōu)選高于108M-1時，認(rèn)為結(jié)合是特異的。如果必要，通過改變結(jié)合條件可以減小非特異結(jié)合而基本上不影響特異結(jié)合。此類條件是本領(lǐng)域已知的，并且技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)可以選擇適宜的條件。通常根據(jù)抗體的濃度、溶液的離子強(qiáng)度、溫度、允許結(jié)合的時間、不相關(guān)分子(例如，血清清蛋白、乳酪蛋白)的濃度等限定條件。
術(shù)語“肌肉功能”指肌肉執(zhí)行生理功能的能力，所述生理功能如收縮，其可以通過顫搐或者強(qiáng)直收縮期間產(chǎn)生的力的量來測量。用于評估肌肉功能的其他方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括，但不限于，測量肌肉量、抓握力量、血清CK水平、日常生活的活動、運(yùn)動或者強(qiáng)度試驗(yàn)、組織組織學(xué)(例如，E&A染色，或者膠原III染色)，或者組織成像。評估肌肉功能的非限制性闡明性方法在實(shí)施例中給出。
術(shù)語“GDF-8”指特異生長和分化因子-8，適宜時指結(jié)構(gòu)上或者功能上與GDF-8相關(guān)的因子，例如BMP-11和屬于TGF-β超家族的其他因子。該術(shù)語指GDF-8的全長未加工的前體形式以及翻譯后切割導(dǎo)致的成熟的和前肽形式。該術(shù)語還指GDF-8的任意片段和變體，其保持與如本文討論的成熟GDF-8相關(guān)的至少某些生物學(xué)活性，包括已經(jīng)修飾的序列。本發(fā)明涉及來自所有脊椎動物物種的GDF-8，包括，但不限于人、牛、雞、小鼠、大鼠、豬、綿羊、火雞、狒狒和魚(序列信息見例如，McPherron等人(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，9412457-12461)。
術(shù)語“成熟GDF-8”指從GDF-8前體蛋白質(zhì)的羧基末端結(jié)構(gòu)域切割的蛋白質(zhì)。成熟GDF-8可以作為單體、同型二聚體或者以GDF-8潛在復(fù)合體存在。取決于條件，成熟GDF-8可以在任意或者所有這些不同形式之間建立平衡。在其生物學(xué)活性形式中，成熟GDF-8也稱作“活性GDF-8”。
術(shù)語“GDF-8前肽”指從GDF-8前體蛋白質(zhì)的氨基末端結(jié)構(gòu)域切割的多肽。GDF-8前肽能夠結(jié)合成熟GDF-8上的前肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語“GDF-8潛在復(fù)合體”指成熟GDF-8同型二聚體和GDF-8前肽之間形成的蛋白質(zhì)復(fù)合體。認(rèn)為兩個GDF-8前肽結(jié)合同型二聚體中兩分子成熟GDF-8形成無活性的四聚體復(fù)合體。潛在復(fù)合體可以包括代替或者除了一個或多個GDF-8前肽以外的其他GDF抑制劑。
術(shù)語“GDF-8活性”指與活性GDF-8蛋白質(zhì)相關(guān)的一種或多種生理學(xué)生長調(diào)節(jié)或者形態(tài)發(fā)生活性。例如，活性GDF-8是骨骼肌量的負(fù)調(diào)節(jié)劑?；钚訥DF-8還可以調(diào)節(jié)肌肉特異酶(例如，肌酸激酶)的產(chǎn)生，刺激成肌細(xì)胞增殖，和調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞(preadipocyte)分化成脂肪細(xì)胞。測量體內(nèi)和體外GDF-8活性的示例性方法見例如，美國專利申請?zhí)?0/688,925。
文中所用的“GDF-8抑制劑”通常指下調(diào)GDF-8活性的任意化合物，并且包括能夠抑制GDF-8的活性、表達(dá)、加工或分泌的任意試劑。GDF-8抑制劑可以例如，影響前體分子的穩(wěn)定性或者向活性成熟形式的轉(zhuǎn)化；干擾GDF-8與一種或多種受體的結(jié)合；或者干擾GDF-8受體ActRIIB的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。此類抑制劑包括特異抑制GDF-8的蛋白質(zhì)、抗體、肽、肽模擬物(peptidomimetics)、核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA和其他小分子。可以說這樣的抑制劑“抑制”、“中和”或者“減小”GDF-8的生物學(xué)活性。
術(shù)語“中和”、“中和性”、“抑制性”和它們的同源詞指相對于不存在GDF-8抑制劑時GDF-8的活性，GDF-8抑制劑導(dǎo)致GDF-8活性的減小?；钚缘臏p小優(yōu)選為至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。評估GDF-8抑制劑的中和或者抑制性生物學(xué)活性的方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以例如，使用ActRIIB測定法(見，例如，Whittemore等人(2003)BBRC，300965-97；或美國專利申請?zhí)?0/253,532中描述的)和RGA測定法(如Tbies(2001)Growth Factors，18251-259或美國專利申請?zhí)?0/253,532中描述的)來進(jìn)行。
術(shù)語“治療有效劑量”或者“治療有效量”指導(dǎo)致患者中癥狀的預(yù)防、發(fā)生所述癥狀的危險降低或者減輕所述癥狀，或者導(dǎo)致所希望的生物學(xué)結(jié)果，例如，改善的肌肉功能、臨床癥狀發(fā)作延遲等等的化合物的量?？梢匀珉S后章節(jié)中描述的測定有效量。
術(shù)語“治療”、“治療方法”和它們的同源詞指治療或預(yù)防/預(yù)防性措施。需要治療的那些個體可以包括已經(jīng)患有特定醫(yī)學(xué)紊亂的個體以及可能最終患該紊亂的那些個體。治療包括本申請中描述的紊亂的任意癥狀的任意減輕。除了減少或者減輕癥狀外，治療還包括當(dāng)預(yù)期惡化時保持患者的當(dāng)前狀態(tài)，或者預(yù)防個體中癥狀的出現(xiàn)，在所述個體中預(yù)期癥狀、紊亂或者疾病發(fā)作。治療可以包括從正常水平降低或者減少一種或多種生理功能。治療還可以包括與狀況、紊亂或者疾病的預(yù)計的癥狀或者預(yù)計的進(jìn)展相比的減小。
II.用于本發(fā)明方法的成分在本發(fā)明的方法中，一種或多種GDF-8抑制劑與一種或多種皮質(zhì)類固醇聯(lián)合使用。
A.GDF-8抑制劑用于本發(fā)明方法的GDF-8抑制劑包括，但不限于，針對GDF-8的抗體；針對GDF-8受體的抗體；可溶性GDF-8受體和其片段(例如，如美國專利申請?zhí)?0/689,677中描述的ActRIIB融合多肽，包括其中ActRIIB連接免疫球蛋白的Fc部分的可溶性ActRIIB受體)；GDF-8前肽和其修飾形式(例如，WO 02/068650或者美國專利申請?zhí)?0/071,499中描述的，包括其中GDF-8前肽連接免疫球蛋白的Fc部分的形式和/或其中GDF-8在天冬氨酸(asp)殘基突變的形式，例如，鼠GDF-8前肽中的asp-99和GDF-8前肽中的asp-100)；卵泡抑素(例如，美國專利號6,004,937中描述)或者含有卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如，美國專利申請?zhí)?0/369,736和10/369,738中描述的GASP-1或者其他蛋白質(zhì))；和影響GDF-8活化的金屬蛋白酶活性的調(diào)節(jié)劑，如美國專利申請?zhí)?0/662,438中描述的。
在一些實(shí)施方案中，GDF-8抑制劑是阻斷GDF-8結(jié)合其受體的單克隆抗體或者其片段。非限制的闡明性實(shí)施方案包括非人單克隆抗-GDF-8抗體，例如，鼠單克隆抗體JA-16(如美國專利申請?zhí)?0/253,532中描述的；ATCC保藏號PTA-4236)；其衍生物，例如，人源化抗體；和完全人單克隆抗-GDF-8抗體(例如，如美國專利申請?zhí)?0/688,925中描述的Myo29、Myo28和Myo22；ATCC保藏號分別為PTA-4741、PTA-4740和PTA-4739)或者其衍生物。
在一些實(shí)施方案中，GDF-8抑制劑通過結(jié)合GDF-8或者GDF-8受體來阻斷GDF-8結(jié)合其受體。在多種實(shí)施方案中，GDF-8抑制劑是抗-GDF-8抗體，其具有對GDF-8的親和力，該親和力表達(dá)為親和性常數(shù)(Ka)，其中Ka為至少105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1。還預(yù)計用于人中的是作為任意脊椎動物物種的非人抗體的人源化形式和衍生物的抑制劑，如在本文引用的專利申請或者Antibody Engineering，編者Borrebaeck，第二版，OxfordUniversity Press，1995；和AntibodiesA Laboratory Manual，編者Harlow等人，Cold Spring Harbor Laboratory，1988中描述的。
B.皮質(zhì)類固醇用于本發(fā)明方法的皮質(zhì)類固醇包括，但不限于倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、強(qiáng)的松、糠酸毛他松、曲安奈德和它們的衍生物。
還可以使用本文公開的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。
通過商業(yè)途徑可以以多種藥物制劑得到皮質(zhì)類固醇(Physician′sDesk Reference(PDR)2003，第57版，Medical Economics Company，2002)。例如，可以通過商業(yè)途徑得到可的松、氫化可的松(Cortef)、強(qiáng)的松(Deltasone、Meticorten、Orasone)、強(qiáng)的松龍(Delta-Cortef、Pediapred、Prelone)、去炎松(Aristocort、Kenaeort)、甲基強(qiáng)的松龍(Medrol)、地塞米松(Decadron、Dexone、Hexadrol)、倍他米松(Celestone)和去氟可特(Calcort)的經(jīng)口制劑。這些和其他皮質(zhì)類固醇的其他制劑可以用于本發(fā)明的方法中。
C.治療和預(yù)防方法本發(fā)明提供了治療哺乳動物受試者的方法，包括治療肌肉功能喪失、肌無力和/或皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)的肌萎縮的方法。
本發(fā)明的方法包括對哺乳動物施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和治療有效量的至少一種皮質(zhì)類固醇，其用量和施用時間段足夠治療至少一種肌肉功能喪失、肌肉量、肌無力、肌萎縮或者心肌病。所述方法可以用于治療神經(jīng)肌肉紊亂，如肌營養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中，相對于不存在GDF-8抑制劑或者皮質(zhì)類固醇時的相同治療，肌肉功能得到改善。所治療的肌肉包括，但不限于，腓腸肌、脛骨肌、前肌、四頭肌、指伸肌、心肌或者隔肌。
神經(jīng)肌肉疾病包括，但不限于，損害肌肉功能、導(dǎo)致肌肉損傷或者導(dǎo)致肌肉量和/或功能減小的任意急性或慢性疾病或紊亂。多種疾病或紊亂是已知的并且包括，例如，肌營養(yǎng)不良，如杜興肌營養(yǎng)不良、貝克爾肌營養(yǎng)不良、埃-德肌營養(yǎng)不良、肢帶肌營養(yǎng)不良、強(qiáng)直性脊柱綜合征、Ullrich綜合征、Fukuyama肌營養(yǎng)不良、Walker-Warburg綜合征、肌-眼-腦病、面肩胛肱骨肌營養(yǎng)不良、先天性肌營養(yǎng)不良、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良(Steinert氏病)、非營養(yǎng)不良性肌強(qiáng)直、周期性麻痹脊髓性肌萎縮、家族性肌萎縮性側(cè)索硬化癥、遺傳性運(yùn)動和感覺神經(jīng)病、Charcot-Marie-Tooth病、慢性炎性神經(jīng)病、遠(yuǎn)端肌病、肌管性/中央核性肌病、線狀體肌病、小核病(mini core disease)、中央軸空病、desminopathy、包涵體肌炎、線粒體肌病、先天性肌無力綜合征、脊髓灰質(zhì)炎后肌肉功能障礙和Emery(2002)The Lancet，359687-695；和Khurana等人(2003)Nat.Rev.Drug Disc.，2379-386中描述的病癥。患者可以表現(xiàn)出輕微、中等或者嚴(yán)重的肌無力、肌肉消瘦和對與這種紊亂相關(guān)的獨(dú)立走動的影響?；加谢蛘哂形ｋU患有這些紊亂的患者將從GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇受益。
通常，將從GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇的共同施用受益的患者將是顯示出血清CK活性2-10倍或以上的增加、陽性家族史、肌纖維直徑的異常變異、肌營養(yǎng)不良蛋白缺陷或者肌營養(yǎng)不良蛋白基因的突變、肌肉量喪失、肌無力、心肌病和/或肌強(qiáng)度喪失的患者。在Diagnostic Criteria for Neuromuscular Disorders，編者Emery，第二版，Royal Society of Medicine Press，1997中描述了診斷方法，包括適宜的遺傳試驗(yàn)。組合治療對于經(jīng)歷不同于神經(jīng)肌肉紊亂的紊亂的皮質(zhì)類固醇治療的受試者和/或有太長的皮質(zhì)類固醇使用史從而這些受試者表現(xiàn)出或者有危險減小肌肉功能，如特征是肌無力、肌肉量喪失和/或肌萎縮等等的受試者也是有益的。通常使用皮質(zhì)類固醇治療的紊亂的實(shí)例包括，但不限于，哮喘、變態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、皮膚紊亂(例如，炎性皮膚病、濕疹、牛皮癬等等)、紅斑狼瘡和其他慢性炎性狀況。
提供了用于本發(fā)明方法的施用方法和組合物。施用不限于任何具體遞送系統(tǒng)，并且可以包括但不限于，腸胃外(包括皮下、靜脈內(nèi)、髓內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)或者腹膜內(nèi)注射)、直腸、局部、經(jīng)皮或者經(jīng)口(例如，在膠囊、懸浮液或者片劑內(nèi))。可以以單劑或者以重復(fù)施用，和以多種生理上可接受的鹽形式的任一種，和/或使用可接受的藥物載體和/或添加劑作為藥物組合物的部分對個體施用。生理上可接受的鹽形式和標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑技術(shù)和賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如，Physician′s Desk Reference(PDR)2003，第57版，Medical EconomicsCompany，2002；和RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，編者Gennado等人，第20版，Lippincott，Williams &Wilkins，2000中描述的)。
將GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇同時或者連續(xù)地在重疊或非重疊間隔內(nèi)施用。在順序施用中，可以以任意順序施用GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇。在一些實(shí)施方案中，重疊或非重疊間隔的長度多于2、4、6、12、24或48周。
對于皮質(zhì)類固醇，處方醫(yī)生常規(guī)地選擇劑量和方案。例如，強(qiáng)的松以約0.1-2mg/kg體重/天，最通常0.5-1mg/kg/天，例如，0.75mg/kg/天使用。皮質(zhì)類固醇可以以平均每周一次劑量約1-14mg/kg體重施用，包括約1、2、5、7、10、12或15mg/kg體重/周，且處方醫(yī)生可以選擇適宜的施用頻率?？梢赃x擇單劑、連續(xù)或者定期的皮質(zhì)類固醇施用，包括每小時一次、每天一次、每周兩次、每周一次或者其他定期間隔。優(yōu)選地，每天經(jīng)口或者注射1-4次施用皮質(zhì)類固醇。皮質(zhì)類固醇劑量可以被最優(yōu)化為聯(lián)合治療，并且可以降低劑量以減小施用的嚴(yán)重副作用。
GDF-8抑制劑可以單獨(dú)或者以與皮質(zhì)類固醇或者另一種化合物的混合物施用。GDF-8抑制劑可以以約1μg/kg到25mg/kg的劑量施用，這取決于生理學(xué)、癥狀的嚴(yán)重性和疾病的發(fā)展?？梢赃x擇單劑、連續(xù)或者定期施用，所選的GDF-8抑制劑劑次之間的間隔可以為每小時一次、每天一次、每周兩次、每周一次、每月兩次、每月一次或者其他適宜的間隔。例如，可以通過靜脈內(nèi)(IV)輸注、腹膜內(nèi)或者皮下注射以每周施用一次在門診患者背景中以約0.1-10mg/kg劑量施用GDF-8抑制劑，如抗體。通常，由治療臨床醫(yī)生選擇GDF-8抑制劑的適宜的治療有效劑量，并且所述有效劑量可以為約1μg/kg到20mg/kg，1μg/kg到10mg/kg，1μg/kg到1mg/kg，10μg/kg到1mg/kg，10μg/kg到100μg/kg，100μg到1mg/kg，以及500μg/kg到5mg/kg。GDF-8抑制劑的示例性有效劑量包括約0.1、0.3、0.5、1、5、10或者20mg/kg/周。此外，可以使用實(shí)施例或者Physician′s Desk Reference(PDR)2003，第57版，Medical Economics Company，2002中指出的特定劑量。
D.測試化合物的治療功效的方法本發(fā)明還提供了在動物，例如嚙齒動物或者靈長類動物中測試治療化合物當(dāng)與至少一種GDF-8抑制劑和至少一種皮質(zhì)類固醇聯(lián)合施用時是否有效的方法。在一些實(shí)施方案中，評估化合物的功效的方法包括對第一個動物聯(lián)合施用所述化合物與GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇；對第二個動物施用GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇；施用后測定第一和第二個動物中肌肉功能水平；和比較肌肉功能水平。如果第一個動物中水平低于第二個動物中水平，那么表明所述化合物或者聯(lián)合是有效的。
在其他實(shí)施方案中，當(dāng)化合物與GDF-8抑制劑和/或皮質(zhì)類固醇聯(lián)合施用時，可以評估所述化合物治療肌營養(yǎng)不良的功效。
一些動物模型可以用于此類評估目的。例如，Torres等人(1987)Brain，110269-299，和Hoffman等人(1987)Science，238347-350已經(jīng)描述的mdx模型。在由于肌纖維膜損傷導(dǎo)致的mdx小鼠和DMD人中總是注意到CK的極高水平和肌營養(yǎng)不良蛋白的缺陷(Bulfield等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811189-1192；和Matsuda等人(1995)J.Biochem.(Tokyo)，118959-64)。作為另一實(shí)例，可以使用兩種其他動物模型utr-/-mdx小鼠(Gillis(2002)Neuromuscul.Disord.，12(1)90-84；和Deconick等人(1997)Cell，90729-738)和nu-/-mdx小鼠(Morrison等人(2000)Lab.Invest.，80881-891)。
實(shí)施例實(shí)施例1GDF-8中和抗體對營養(yǎng)不良肌肉的作用在DMD的mdx小鼠模型中試驗(yàn)了GDF-8的體內(nèi)抑制可以改善肌營養(yǎng)不良的能力。對5到7周齡雄性C57BL/10ScSn-mdx/j小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)以每周一次腹膜內(nèi)注射GDF-8中和性鼠抗體JA-16(60mg/kg，第一周兩倍給藥，n＝11)和僅載體(對照組，n＝10)治療12周。還將這些小鼠與沒有肌營養(yǎng)不良蛋白缺陷的相同背景品種(C57BL/10，n＝12)的小鼠進(jìn)行比較。
在治療之前、期間和之后監(jiān)控體重。治療組中的小鼠相對于載體對照組中的小鼠增重。結(jié)果在表1中顯示。
表1.總體重(g)平均值與SEM
給藥6和10周后還將小鼠進(jìn)行抓握試驗(yàn)。在4和10周時治療組中的小鼠分別比載體對照組中的小鼠具有高9％(p＝0.09)和19％(p＜0.05)的抓握力量。結(jié)果在表2中顯示。
表2.抓握力量(lb)平均值與SEM
為了定量治療和載體對照之間肌肉量的差異，將動物處死并解剖四頭肌和腓腸肌并稱重。治療組動物的四頭肌重量比對照大13％(0.371±0.009對0.317±0.008g；p＜0.05)。治療組動物的腓腸肌重量比對照大17％(0.223±0.008對0.197±0.005g；p＜0.0005)。
實(shí)施例2GDF-8中和性抗體和強(qiáng)的松對正常和營養(yǎng)不良肌肉的作用雄性C57BL/10ScSn-mdx/j和C57BL/10(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。在5-7周齡開始注射小鼠單克隆抗-GDF-8抗體JA-16、強(qiáng)的松(P-9901，Sigma)或者載體(花生油)4周。以60mg/kg/周的劑量用JA-16腹膜內(nèi)(IP)注射小鼠(第一周雙倍給藥)或者用強(qiáng)的松以2mg/kg，每周3次皮下(SC)注射。
在治療之前、期間和之后監(jiān)控體重和抓握力量。結(jié)果分別在表3和表4中顯示。
表3 總體重(平均值±SEM，g)
表4.抓握力量(平均值±SEM，lb)
在研究結(jié)束時，將小鼠處死并通過解剖和稱重腓腸肌和四頭肌來估計肌肉量。結(jié)果在表5中顯示。為了證實(shí)強(qiáng)的松的生物學(xué)活性，收集來自小鼠的單獨(dú)群組的血清并分析IL6和IL1β(Ani Lytics，Inc.，Gaithersburg，MD)。發(fā)現(xiàn)在用強(qiáng)的松治療的小鼠的血清中兩種細(xì)胞因子都減少。
表5.肌肉重量(平均值±SEM，g)
因此，結(jié)果表明在肌營養(yǎng)不良中，施用GDF-8的抑制劑，即抗-GDF-8抗體和強(qiáng)的松可以相對于僅用強(qiáng)的松或者載體的治療有效增加肌肉量和強(qiáng)度。
此外，在這些研究中，JA16加強(qiáng)的松治療(實(shí)施例2)的效果大于僅用JA16治療的效果(實(shí)施例1)。四周治療后與載體相比體重的增加對于JA16加上強(qiáng)的松的治療比僅JA16的治療更顯著。用JA16加強(qiáng)的松治療4周后抓握力量與載體對照相比的增加比僅用JA16治療6或10周后的增加更大。用JA16加強(qiáng)的松治療4周后相對于載體對照的肌肉量的增加比僅用JA16治療12周后的增加更大。
實(shí)施例3GDF-8中和性抗體對強(qiáng)的松誘導(dǎo)的肌萎縮的作用在如實(shí)施例2中所述治療的小鼠中，如實(shí)施例1中所述通過組織學(xué)檢查隔肌。通過獨(dú)立的病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室評估形態(tài)學(xué)改變，該實(shí)驗(yàn)室不了解治療組分配。在0到4的等級上分配嚴(yán)重性等級(0＝無；1＝最??；2＝輕微；3＝中等；4＝顯著)。結(jié)果在圖1A(嚴(yán)重性得分)和圖1B(萎縮的肌纖維的百分?jǐn)?shù))。結(jié)果表明施用抗-GDF-8抗體和強(qiáng)的松減小強(qiáng)的松誘導(dǎo)的肌萎縮。
實(shí)施例4治療肌營養(yǎng)不良作為治療人類中MD的實(shí)例，聯(lián)合強(qiáng)的松或者強(qiáng)的松龍施用Myo29抗體。在表6中概述了非限制性示例性治療方案和結(jié)果。通過治療醫(yī)生可以確定其他治療方案，其中皮質(zhì)類固醇和GDF-8抑制劑的劑量范圍和施用如上述。
表6
將引用的所有出版物和專利和通過保藏號或者數(shù)據(jù)庫參考號鑒定的序列完整引用作為參考。
權(quán)利要求
1.治療肌肉功能減弱的哺乳動物的方法，其包含對所述哺乳動物施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和治療有效量的至少一種皮質(zhì)類固醇，其用量和施用時間段足以治療肌肉功能的減弱。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過選自肌肉量、肌肉收縮力、血清CK濃度或者肌肉形態(tài)學(xué)的至少一種參數(shù)評估至少一種肌肉的肌肉功能。
3.權(quán)利要求1的方法，其中治療其功能的肌肉選自腓腸肌、脛骨前肌、四頭肌、指長伸肌、心肌或者隔肌的至少一種。
4.權(quán)利要求1的方法，其中治療所述哺乳動物導(dǎo)致所述哺乳動物的體重增加。
5.權(quán)利要求1的方法，其中治療所述哺乳動物導(dǎo)致抓握力量增加。
6.治療肌無力的方法，其包括對哺乳動物施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和治療有效量的至少一種皮質(zhì)類固醇，其用量和施用時間段足以治療肌肉強(qiáng)度的喪失。
7.治療皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)的肌萎縮的方法，其包括對哺乳動物施用足以治療皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)的肌萎縮的治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑。
8.治療神經(jīng)肌肉紊亂的方法，其包括對患有或者有危險患有神經(jīng)肌肉紊亂的哺乳動物施用治療有效量的至少一種GDF-8抑制劑和治療有效量的至少一種皮質(zhì)類固醇，其用量和施用時間段足以治療所述神經(jīng)肌肉紊亂。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述神經(jīng)肌肉紊亂是肌營養(yǎng)不良。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述肌營養(yǎng)不良是杜興肌營養(yǎng)不良。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述肌營養(yǎng)不良是貝克爾肌營養(yǎng)不良。
12.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述哺乳動物是人。
13.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述皮質(zhì)類固醇選自(a)倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、糠酸毛他松、強(qiáng)的松或曲安奈德的至少一種；(b)倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、糠酸毛他松、強(qiáng)的松或曲安奈德的至少一種的衍生物；或(c)倍氯美松雙丙酸酯、布地縮松、氫化可的松、地塞米松、丙酸氟地松、糠酸毛他松、強(qiáng)的松或曲安奈德的至少一種的藥學(xué)上可接受的鹽的至少一種。
14.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述皮質(zhì)類固醇是強(qiáng)的松或者強(qiáng)的松龍。
15.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述皮質(zhì)類固醇以0.1到2.0mg/kg/天的劑量施用。
16.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中經(jīng)口施用所述皮質(zhì)類固醇。
17.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述GDF-8抑制劑選自針對GDF-8的抗體、針對GDF-8受體的抗體、可溶性GDF-8受體、GDF-8前肽、GDF-8的小分子抑制劑、卵泡抑素或者含有卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述針對GDF-8的抗體選自JA-16、Myo29、Myo28或Myo22。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述GDF-8前肽在天冬氨酸殘基處突變。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述GDF-8前肽連接免疫球蛋白的Fc部分。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述GDF-8受體是ActRIIB。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述GDF-8受體連接免疫球蛋白的Fc部分。
23.權(quán)利要求17的方法，其中所述GDF-8抑制劑是卵泡抑素。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述含有卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)是GASP-1。
25.權(quán)利要求17的方法，其中所述GDF-8抑制劑是小分子抑制劑。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法導(dǎo)致所述哺乳動物的心肌病的治療。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇的施用是同時的。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇的施用是順序的。
28.權(quán)利要求8的方法，其中所述GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇的施用是同時的。
29.權(quán)利要求8的方法，其中所述GDF-8抑制劑和皮質(zhì)類固醇的施用是順序的。
全文摘要
本公開內(nèi)容提供了治療哺乳動物中神經(jīng)肌肉紊亂的方法。所公開的方法包括對易受或者患有神經(jīng)肌肉紊亂的受試者施用治療有效量的GDF－8抑制劑和皮質(zhì)類固醇，從而保持肌肉功能的所希望的水平。
文檔編號A61P21/00GK1829532SQ200480022134
公開日2006年9月6日 申請日期2004年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月2日
發(fā)明者L·－A·懷特穆爾, 李湘萍 申請人:惠氏公司