專利名稱：一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑的制造方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療潰瘍性結(jié)腸炎的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑的制造方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種原因未明的直腸和結(jié)腸慢性炎癥性疾病，本病可發(fā)生于任何年齡，20～50歲為多見(jiàn)，男女發(fā)病率無(wú)明顯差別。本病在歐美較常見(jiàn)，其發(fā)病率與患者約為79～140/10萬(wàn)人；日本較低，約為3.7-54/10萬(wàn)人，我國(guó)尚未做過(guò)該項(xiàng)流行學(xué)調(diào)查，估計(jì)不低于日本。但近年來(lái)，炎癥性腸病有明顯上升的趨勢(shì)。該病輕型緩解率為70-80％；重型為50％；重型暴發(fā)型死亡率高達(dá)25％。尤其令人擔(dān)心的是，長(zhǎng)期慢性結(jié)腸炎會(huì)誘發(fā)癌變，其發(fā)生率為3～5％，發(fā)病20年以上者，癌變發(fā)生率達(dá)20％以上。UC的病因雖尚不明，許多研究提示本病可能與免疫、感染、遺傳、腸道菌群失調(diào)、食物過(guò)敏和精神因素等有關(guān)，大多數(shù)人認(rèn)為腸粘膜中杯狀細(xì)胞病理性減少與黏蛋白耗竭性減少是發(fā)病條件之一，而諸如菌群失調(diào)、食物過(guò)敏、精神因素是重要的誘發(fā)因素。
UC是一種反復(fù)發(fā)作的腸道慢性疾病，主要癥狀是腹痛、腹瀉、里急后重與排黏液血便。年輕時(shí)即發(fā)病，需忍受長(zhǎng)期的社會(huì)和心理負(fù)擔(dān)，治療是終身性的。國(guó)外前瞻性研究包括496例UC病人，在診斷后追蹤16個(gè)月，顯示一年復(fù)發(fā)率累積為50％，而且1％的復(fù)發(fā)病人表現(xiàn)有慢性復(fù)發(fā)病程。目前腎上腺糖皮質(zhì)類固醇激素仍為活動(dòng)期UC的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，但治療后仍有較高的復(fù)發(fā)率和死亡率。UC的內(nèi)科治療，目前尚無(wú)特效制劑，如上述腎上腺皮質(zhì)激素，5-氨基水楊酸、柳氮磺胺吡啶、滅滴靈、利福平等可緩解癥狀，但上述藥物均有一定副作用，病人難于耐受和堅(jiān)持治療，外科治療是切除整個(gè)結(jié)腸，多有后遺癥。而微生態(tài)制劑因其能調(diào)節(jié)腸道菌群和調(diào)節(jié)免疫，對(duì)UC有較好效果，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)在用微生態(tài)制劑治療UC的臨床研究中有所進(jìn)展，在科研方面有用培菲康治療UC，發(fā)現(xiàn)治療后擬桿菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯上升(崔海宏等.2003)；用普樂(lè)拜爾(雙歧桿菌四聯(lián)菌)治療了324例結(jié)腸炎患者，總有效率為91.4％(于元龍2003)；口服麗珠腸樂(lè)膠囊治療潰瘍性結(jié)腸炎30例，總有效率為90％(楊春輝等2004)。國(guó)外Ventur(1999)，等分組給無(wú)法耐受5-氨基水楊酸(5-ASA)的UC患者應(yīng)用乳酸桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌一年，結(jié)果20例患者中有15例緩解，且無(wú)任何副作用。此外，國(guó)內(nèi)尚有凝結(jié)芽孢桿菌TQ33一種新的功能性食品添加劑(趙虎山等報(bào)道1997)，給5例患有便秘和2例慢性結(jié)腸炎(腸易激綜合征)患者飲用有明顯的調(diào)理作用。但認(rèn)真分析該資料所述2例慢性結(jié)腸炎的癥狀應(yīng)為腸易激綜合征，而非潰瘍性結(jié)腸炎，理由是①2病例無(wú)典型UC癥狀描述；②無(wú)結(jié)腸炎鏡檢確診；③非國(guó)家衛(wèi)生部或藥管局批準(zhǔn)在國(guó)家臨床基地進(jìn)行的規(guī)范臨床試驗(yàn)。所以不能科學(xué)證明對(duì)結(jié)腸炎有療效。北京天施康醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司在解放軍總醫(yī)院等5家醫(yī)院用凝結(jié)芽孢桿菌活菌片治療急慢性腹瀉103例，總有效率分別為98％和90％，且未見(jiàn)不良反應(yīng)，表明該藥安全有效。腸道菌群培養(yǎng)治療后腸道有益菌乳酸菌和雙歧桿菌活菌數(shù)明顯增加，表明有調(diào)整腸道菌群失調(diào)作用。凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑既然對(duì)一般的感染性或非感染性急慢性腹瀉有很好的療效，那么對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎是否也有較理想的療效呢？我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究完全得到了證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎有很好的治療效果，即治療后，大鼠的結(jié)腸潰瘍病灶面積縮小，結(jié)腸濕重減輕，髓過(guò)氧化物酶活性下降，炎癥明顯減輕，為此我們特別注重該藥對(duì)UC療效的研究，為解除UC病人的痛苦、保障人們健康，開(kāi)發(fā)出凝結(jié)芽孢桿菌活菌制品治療UC的另一個(gè)新用途，將具有顯著的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。
專利方面據(jù)查國(guó)內(nèi)專利只有CN1371620“畜禽用微生態(tài)調(diào)節(jié)劑”中含有凝結(jié)芽孢桿菌等4個(gè)菌種，用于防治畜禽的腸道疾病，而凝結(jié)芽孢桿菌用于人的腸道病的防治的專利則為0。在國(guó)外有US6723326芽孢桿菌孢子(BC)和胞外產(chǎn)物(上清液和濾液)，局部用于哺乳類動(dòng)物皮膚和粘膜抑制細(xì)菌、真菌和病毒的生長(zhǎng)；EP1022023由凝結(jié)芽孢桿菌和賴氨酪組合成合適的食物整合劑用于治療腸道功能紊亂和菌群失調(diào)；WO0954982凝結(jié)芽孢桿菌和胞外產(chǎn)物口服治療腸道感染和嬰兒猝死綜合征；WO0134168乳酸菌孢子和外胞產(chǎn)物用于抑制病原菌感染；WO0061201利用凝結(jié)芽孢桿菌和胞外產(chǎn)物在使用衛(wèi)生用品時(shí)抑制表皮組織上細(xì)菌的生長(zhǎng)。綜上所述，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的有關(guān)專利，均未見(jiàn)關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌治療潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究的專利。為此，我們特別申請(qǐng)這一項(xiàng)專利。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種凝結(jié)芽孢桿菌活菌用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑。
本發(fā)明又一個(gè)目的是提供凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉的制備方法。
本發(fā)明人使用目前已公知的凝結(jié)芽孢桿菌和新篩選出的凝結(jié)芽孢桿菌菌株進(jìn)行了治療潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)包含凝結(jié)芽孢桿菌活菌粉的凝結(jié)芽孢桿菌制劑對(duì)于治療潰瘍性結(jié)腸炎均具有良好的效果，其中，所述新篩選出的凝結(jié)芽孢桿菌菌株得到較突出的優(yōu)異效果。本發(fā)明是在以上發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上完成的。
本發(fā)明所述一種治療炎癥性腸病的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑的制造方法和應(yīng)用指的是凝結(jié)芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、離心的菌泥經(jīng)干燥后得到活菌菌粉，再制成合適的劑型，供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用。潰瘍性結(jié)腸炎，其病變特征是病變多位于直腸和乙狀結(jié)腸，也可累及整個(gè)結(jié)腸。結(jié)腸鏡檢可見(jiàn)受累腸粘膜出血、水腫、糜爛或淺表潰瘍，上覆粘液及炎癥滲出物，常有出血，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞減少，隱窩萎陷扭曲，有膿腫形成。慢性期潰瘍可愈合形成瘢痕或形成假息肉。實(shí)驗(yàn)研究是指用右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)給SD大鼠灌胃加直腸注入法給藥，以誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎模型，然后再用凝結(jié)芽孢桿菌活菌片給造型大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療和評(píng)價(jià)其治療效果。應(yīng)用是指用凝結(jié)芽孢桿菌活菌片對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的病人進(jìn)行臨床治療，以觀察該活菌制劑對(duì)UC病人的療效和安全性。
本文中所用述語(yǔ)“劑型”是指將該藥物制成一定的劑型(固體或液體劑型)，以制劑的形式應(yīng)用于治療或預(yù)防。而制劑的有效性、安全性、合理性和精密性等則反映了藥品的質(zhì)量，決定了用藥的效果。
本文中使用的所有的百分比或比例均按重量或重量/容量或容量/重量計(jì)，除非另有說(shuō)明，而且，本文中所有的測(cè)量均是在25℃進(jìn)行，除非另有說(shuō)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人針對(duì)當(dāng)今全球醫(yī)藥界對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療都感到棘手的情況下，依據(jù)微生態(tài)有益菌對(duì)人體的腸道病(如腹瀉等)有很好的治療效果，故將凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉加入適宜的輔料制成片劑等劑型，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，以下是對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述。
本發(fā)明提供了凝結(jié)芽孢桿菌活菌用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物的用途。其中所述凝結(jié)芽孢桿菌活菌可是活菌制劑。這里所述的凝結(jié)芽孢桿菌可是任何凝結(jié)芽孢桿菌菌株，所述菌株包括但非僅限于Bacilluscoagulans TBC169和Bacillus coagulans，Hammer，1915。其中使用本發(fā)明人新篩選出的凝結(jié)芽孢桿菌菌株得到較突出的優(yōu)異效果，該新菌株為凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans，TBC169已在北京中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)No.1207。
本發(fā)明還提供了一種用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑，其特征在于所述制劑包括凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉及藥用載體，其中所述凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans，TBC169 CGMCC保藏號(hào)No.1207。其中所述藥用載體可是公知的任何藥用載體，尤其是微晶纖維素、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉中的任一種或多種的混合物。
其中所述凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉可由發(fā)酵產(chǎn)物通過(guò)各種已知方法來(lái)制備，優(yōu)選由凝結(jié)芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物通過(guò)干燥制備，所述干燥可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何干燥方法，只要其能保持凝結(jié)芽孢桿菌活性，優(yōu)選所述干燥通過(guò)冷凍干燥、噴霧干燥或烘干干燥或其結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在所述制劑中，優(yōu)選制劑總重量計(jì)該制劑中凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)不少于1.0×106cfu/g。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，以所述制劑總重量計(jì)，所述制劑包括的組分和含量為凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉0.05％至80％微晶纖維素 0％至90％甘露醇 0％至90％聚乙烯吡咯烷酮 0％至90％葡萄糖 0％至90％脫脂奶粉0％至90％淀粉0％至90％其中微晶纖維素、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、脫脂奶粉、和淀粉的含量不能同時(shí)為0％。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，其中以所述制劑總重量計(jì)，所述制劑包括的組分和含量為凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉0.5％至70％微晶纖維素 20％至90％甘露醇 5％至90％聚乙烯吡咯烷酮 5％至90％在本發(fā)明的再另一種實(shí)施方案中，其中以所述制劑總重量計(jì)，所述制劑包括的組分和含量為凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 0.05％至80％微晶纖維素 10％至70％葡萄糖 10％至90％在本發(fā)明的再另一種實(shí)施方案中，其中以所述制劑總重量計(jì)，所述制劑包括的組分和含量為凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 0.05％至70％葡萄糖 10％至90％脫脂奶粉 10％至90％淀粉 10％至90％優(yōu)選所述制劑的劑型為片劑、膠囊劑、散劑或顆粒劑。
本發(fā)明還提供了一種用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟1)接種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中接種凝結(jié)芽孢桿菌菌種，進(jìn)行培養(yǎng)或多級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)；2)將上述步驟1)中液態(tài)培養(yǎng)物離心，收集濕菌泥，并將所述菌泥干燥、粉碎，得到干燥菌粉；3)將上述步驟2)所得干燥菌粉與藥用載體混合，制成最終劑型。
其中所述多級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)優(yōu)選為三級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)。
在各級(jí)培養(yǎng)中培養(yǎng)溫度為30℃至55℃，各級(jí)培養(yǎng)時(shí)間為6小時(shí)至72小時(shí)。
其中所述擴(kuò)增培養(yǎng)中的第一級(jí)培養(yǎng)所使用的菌種優(yōu)選按如下方法制備將固體凝結(jié)芽孢桿菌菌種按重量比1∶1至1∶10的比例溶于生理鹽水中，在50-80℃水浴活化5-15分鐘。
本發(fā)明人新篩選出的凝結(jié)芽孢桿菌菌株特征凝結(jié)芽孢桿菌TBC169為兼性厭氧菌，在酪胨培養(yǎng)基(瓊脂)上長(zhǎng)出灰白色或乳白色邊緣不整齊菌落，革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體為桿形，大部分菌體中央或偏一端有卵園形芽孢、不膨脹。發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖，不水解淀粉，觸酶、吲哚、V-P反應(yīng)陽(yáng)性、硝酸鹽還原陰性，牛奶凝固。適宜PH4.0-7.5，生長(zhǎng)適宜溫度為30℃-55℃，芽孢能耐受巴斯德滅菌，穩(wěn)定性極好，能室溫保存。
以下以實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但所述實(shí)施例不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限定。
實(shí)施例1凝結(jié)芽孢桿菌菌粉制備取凝結(jié)芽孢桿菌菌種管一支，溶于已滅菌裝有10ml生理鹽水和適量玻璃珠的100ml三角瓶中，活化10分鐘，用1ml無(wú)菌吸管吸取1ml菌懸液接種裝有50ml擴(kuò)增培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置搖擺床內(nèi)37℃恒溫振蕩(190rpm)培養(yǎng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)接裝有450ml擴(kuò)增培養(yǎng)基2500ml檔板三角瓶中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，鏡檢無(wú)雜菌后再轉(zhuǎn)接于裝有4.5L擴(kuò)增培養(yǎng)基的種子罐中，好氧培養(yǎng)(充氣量3∶1)24小時(shí)，鏡檢無(wú)雜菌后轉(zhuǎn)接有45L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃好氧培養(yǎng)(充氣量3∶1)24小時(shí)，鏡檢芽孢率達(dá)80％以上，停止培養(yǎng)。用連續(xù)離心機(jī)，12000rpm離心。收集濕菌泥，稱重，按1∶1(w/v)添加適量脫脂奶粉后，干燥，粉碎，常溫保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2凝結(jié)芽孢桿菌活菌片、膠囊制造依據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌菌粉的活菌數(shù)，按如下比例添加微晶纖維素、甘露醇和聚乙烯吡咯酮，使活菌數(shù)不低1.0×106cfu/g，壓片。制造技術(shù)可參見(jiàn)在此參考的“片劑和膠囊劑”《實(shí)用藥物制劑技術(shù)》第1版，人民衛(wèi)生出版社，第1-30頁(yè)(1999)。
凝結(jié)芽孢桿菌活菌片的配方成份 ％(重量)凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 1.00份微晶纖維素55.00份甘露醇25.00份聚乙烯吡咯酮 19.00份將上述組份中1-4組份充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓罄贸Ｒ?guī)壓片技術(shù)按單位劑量壓成片劑。
凝結(jié)芽孢桿菌活菌膠囊的配方成份 ％(重量)凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 15.00份份微晶纖維素25.00份葡萄糖60.00份將上述組份中1～3組中充分拌勻，然后利用常規(guī)灌裝膠囊技術(shù)按單位劑量制成膠囊。
實(shí)施例3凝結(jié)芽孢桿菌活菌散劑制造依據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌菌粉的活菌數(shù)，按如下比例添加脫脂奶粉，葡萄糖、淀粉，使活菌數(shù)不低于1.0×106cfu/g裝袋。制造技術(shù)可參見(jiàn)在此參考的“散劑”《實(shí)用藥物制劑技術(shù)》第1版，人民衛(wèi)生出版社，第1～30頁(yè)(1999)。
凝結(jié)芽孢桿菌活菌散劑的配方成份 ％(重量)凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 20.00份份脫脂奶粉 30.00份葡萄糖 30.00份淀粉 20.00份將上述組份中1～4組份中充分拌勻，然后利用常規(guī)散劑灌裝技術(shù)按單位劑量壓袋制成散劑。
關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌顆粒劑的制造，在此就不再贅述。
大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎模型的制作和治療60只大鼠，試驗(yàn)前在無(wú)菌情況下，從大鼠肛門采大便作正常腸道菌群培養(yǎng)，然后其中10只大鼠作為正常對(duì)照，50只大鼠參照吳小平等報(bào)道的大鼠UC造型方法，加以改進(jìn)，即用3％右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液給空腹大鼠灌胃(ig)(1ml/100g)，每天1次，共7天，最后一次，從肛門加注DSS 1ml/只至直腸內(nèi)，7天后采大便用作菌群分析。然后處死其中10只，剖腹取結(jié)腸，測(cè)定結(jié)腸濕重(g/100g體重)，甲醛固定。用愛(ài)爾新藍(lán)溶液染色，肉眼觀測(cè)潰瘍和糜爛部分的點(diǎn)數(shù)，用卡尺測(cè)量其中一個(gè)最大的藍(lán)染點(diǎn)的藍(lán)染面積(cm2)，證實(shí)UC形成后，將大鼠分為4組，每組10只，分別用凝結(jié)芽孢桿菌活菌片(BC)107cfu、106cfu/ml、柳氮磺胺吡啶(SASP)0.02g/ml和生理氯化鈉溶液(NS)，ig，一天2次，共21天，21天后取大便作腸道菌群分析。之后稱體重，處死全部大鼠，按上法處理結(jié)腸標(biāo)本，測(cè)相應(yīng)指標(biāo)，并采取腸組織塊制成5％勻漿，采用髓過(guò)氧化物酶測(cè)試盒，用紫外分光析儀測(cè)定髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性(U/g·濕片)。
腸道菌群培養(yǎng)分析，分別在造型前、造型后和治療結(jié)束后，在無(wú)菌操作下，分別采取從大鼠肛門擠出的新鮮大便，稱重后10倍稀釋，取10-2、10-3、10-4，各稀釋勻漿液0.1ml，接種到含有適宜培養(yǎng)基的平板上，涂勻，需氧菌在37℃培養(yǎng)48小時(shí)，厭氧菌在37℃培養(yǎng)72小時(shí)，鏡檢計(jì)數(shù)活菌數(shù)。治療結(jié)果用DSS灌胃加直腸注入法給藥后可形成典型的實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎，經(jīng)用BC、SASP和NS進(jìn)行21天治療后的結(jié)果顯示，各組中大鼠的體重增加，以BC107cfu/ml增重明顯(p＜0.05)；各治療組中大鼠的結(jié)腸濕重、腸潰瘍和/或糜爛點(diǎn)數(shù)、面積、MPO活性與造型組或造型+生理氯化鈉溶液組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05或＜0.01)即表明BC片對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性UC有顯著治療作用，為臨床用藥提供了科學(xué)依據(jù)；腸道菌群培養(yǎng)分析，UC造型前和治療后均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，BC在腸道中定植。
用凝結(jié)芽孢桿菌活菌片治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床研究本研究方法如下。
●病例選擇 按鄭芝田主編《胃腸病學(xué)》中潰瘍性結(jié)腸炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除腸道惡性病變。有明顯出血、穿孔、痢疾、梗阻者不納為試驗(yàn)對(duì)象，選擇符合診斷標(biāo)準(zhǔn)患者400余例作為受試對(duì)象，讓患者簽署知情同意書(shū)。
●治療方法 受試對(duì)象采用隨機(jī)對(duì)照方法進(jìn)行分組治療，其中試藥組患者300例，口服凝結(jié)芽孢桿菌活菌片6片/次，一天3次；對(duì)照組患者100例，口服金雙歧片，6片/次，一天3次，療程21-30天。擬在4個(gè)國(guó)家藥品臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
●療效評(píng)定項(xiàng)目，根據(jù)患者治療前后的腹瀉、腹痛、里急后重、排黏液血便等癥狀改善情況及腸鏡檢查治療前后潰瘍病灶縮小情況進(jìn)行療效評(píng)定。
●療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)發(fā) 臨床治愈潰瘍面完全消失，但局部仍有輕度發(fā)紅，無(wú)明顯水腫，自覺(jué)癥狀全部消失或基本消失；顯效潰瘍面基本消失，仍有炎癥、主要癥狀消失；有效潰瘍病灶縮小50％以上，主要癥狀明顯減輕；無(wú)效潰瘍病灶縮小不及50％，自覺(jué)癥狀無(wú)改善。
●安全性評(píng)定 根據(jù)患者用藥后有無(wú)主訴的不良反應(yīng)及有關(guān)檢查，如血象、肝腎功能檢查等有無(wú)異常評(píng)定。
對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用評(píng)價(jià)治療方法，見(jiàn)前述，此處略去。
治療結(jié)果，治療后UC大鼠的結(jié)腸濕重明顯減輕，潰瘍點(diǎn)數(shù)和面積顯著減少或縮小，MPO活性顯著下降，炎癥明顯改善或消失，治療效果非常顯著，見(jiàn)表1表1 大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎DSS造型和治療(x±SD)

與造型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01，與造型生理鹽水組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01。
2個(gè)凝結(jié)芽孢桿菌菌株治療大鼠UC的效果比較治療方法(1)大鼠UC造模型和檢測(cè)項(xiàng)目及方法同前。(2)給藥方法，分凝結(jié)芽孢桿菌TBC169和凝結(jié)芽孢桿菌(日本株，從日本三共株式地社生產(chǎn)的“有孢子性乳酸菌制劑”中分離培養(yǎng)的菌株)和生理鹽水3組，每組UC造型大鼠10只，分別用107cfu/ml活菌液和生理鹽水灌胃，一天2次，共21天。
治療結(jié)果，治療后2組UC大鼠的結(jié)腸濕重均有減輕，潰瘍點(diǎn)數(shù)和面積都有減少或縮小，MPO活性皆有下降，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)表2。
組間比較，TBC169菌株組的各個(gè)參數(shù)與日本菌株組的參數(shù)比較雖無(wú)顯著性差異，但也都偏小，治療效果更好些。
結(jié)論，本結(jié)果表明TBC169菌株比日本菌株具有較突出的優(yōu)異治療效果，見(jiàn)表2。
表2 凝結(jié)芽孢桿菌2個(gè)菌株治療大鼠UC的效果比較(x±SD)

與生理鹽水組比較，**P＜0.0權(quán)利要求
1.凝結(jié)芽孢桿菌活菌用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述凝結(jié)芽孢桿菌活菌為活菌制劑。
3.如權(quán)利要求1或2的用途，其中所述凝結(jié)芽孢桿菌包括凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans，TBC 169株，CGMCC保藏號(hào)No.1207。
4.一種用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑，其特征在于所述制劑包括凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉及藥用載體。
5.如權(quán)利要求4的制劑，其中所述藥用載體是微晶纖維素、甘露醇、葡萄糖、脫脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉中的任一種或多種的混合物。
6.如權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉是由凝結(jié)芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物離心，得濕菌泥經(jīng)干燥制備的，所述干燥通過(guò)冷凍干燥、噴霧干燥或烘干干燥或其結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
7.如權(quán)利要求6的制劑，其中以制劑總重量計(jì)該制劑中凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)不少于1.0×106cfu/g。
8.如權(quán)利要求4至7任一項(xiàng)的制劑，其中以所述制劑總重量計(jì)，所述制劑包括的組分和含量為凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 0.05％至80％微晶纖維素0％至90％甘露醇0％至90％聚乙烯吡咯烷酮0％至90％葡萄糖0％至90％脫脂奶粉 0％至90％淀粉 0％至90％其中微晶纖維素、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、脫脂奶粉、和淀粉的含量不能同時(shí)為0％。
9.如權(quán)利要求8的制劑，其中以所述制劑總重量計(jì)，所述制劑包括的組分和含量為凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 0.5％至70％微晶纖維素 20％至90％甘露醇 5％至90％聚乙烯吡咯烷酮 5％至90％
10.如權(quán)利要求8的制劑，其中以所述制劑總重量計(jì)，所述制劑包括的組分和含量為凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 0.05％至80％微晶纖維素10％至70％葡萄糖10％至90％
11.如權(quán)利要求8任一項(xiàng)的制劑，其中以所述制劑總重量計(jì)，所述制劑包括的組分和含量為凝結(jié)芽孢桿菌活菌菌粉 0.05％至70％葡萄糖 10％至90％脫脂奶粉 10％至90％淀粉 10％至90％
12.如權(quán)利要求8所述的制劑，其中所述制劑的劑型為片劑、膠囊劑、散劑或顆粒劑。
13.如權(quán)利要求4的制劑的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟1)接種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中接種凝結(jié)芽孢桿菌菌種，進(jìn)行多級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)；2)將上述步驟1)中液態(tài)培養(yǎng)物離心，收集濕菌泥，并將所述菌泥干燥、粉碎，得到干燥菌粉；3)將上述步驟2)所得干燥菌粉與藥用載體混合，制成最終劑型。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述多級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)為三級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)。
15.如權(quán)利要求14的方法，在各級(jí)培養(yǎng)中培養(yǎng)溫度為30℃至55℃，各級(jí)培養(yǎng)時(shí)間為6至72小時(shí)。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中所述擴(kuò)增培養(yǎng)中的第一級(jí)培養(yǎng)所使用的菌種按如下方法制備將固體凝結(jié)芽孢桿菌菌種按重量比1∶10或1∶100的比例溶于生理鹽水中，在50-80℃水浴活化5-15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新篩選出的治療潰瘍性結(jié)腸炎的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑的制造方法和應(yīng)用，它包括該凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑治療大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎的療效，在臨床上，則采用凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎病人進(jìn)行治療和評(píng)價(jià)其有效性和安全性。本發(fā)明還包括凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑的配方和制造方法、制劑中活菌數(shù)含量、藥用載體和制劑的劑型等內(nèi)容。本發(fā)明的特點(diǎn)是該活菌制劑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療有效安全，制劑穩(wěn)定性好，可室溫保存。病人可長(zhǎng)期服用，無(wú)不良反應(yīng)。為潰瘍性結(jié)腸炎患者的治療提供了一種新手段，為凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑開(kāi)辟一個(gè)治療潰瘍性結(jié)腸炎的新用途。
文檔編號(hào)A61K9/48GK1788737SQ200410098660
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2004年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月15日
發(fā)明者崔云龍 申請(qǐng)人:北京天施康醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司, 青島東海藥業(yè)有限公司