專利名稱：神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體內(nèi)源性化合物的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡作用，更具體地，涉及神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡作用。另外，本發(fā)明還涉及神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b在制備預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡藥物中的應(yīng)用，以及在制備預(yù)防和治療鉀離子通道病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)退行性疾病是指人體的神經(jīng)元發(fā)生退行性變化而引起的一系列病癥，多發(fā)生在老年人群中，包括帕金森氏病(Parkinson’s disease.PD)、老年癡呆(Alzheimer’s disease，AD)、亨廷頓氏病(Huntingtondisease，HD)等疾病?，F(xiàn)有的神經(jīng)退行性疾病機(jī)制研究主要集中于膽堿能系統(tǒng)的功能損害，但這種損害很可能是神經(jīng)元損傷或死亡的結(jié)果，而不是起因，現(xiàn)有的治療方法也均僅為對癥治療。
神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)是維持和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞正常生存、生長和分化，在神經(jīng)損傷情況下促進(jìn)其再生的一類特定多肽或蛋白質(zhì)。包括神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)生長因子等分子成為當(dāng)前預(yù)防和治療一些神經(jīng)退行性疾病的一個熱點(diǎn)。然而這類分子均為大分子蛋白，不能通過血腦屏障，不宜外周給藥。當(dāng)然也有一些專利介紹一些有機(jī)小分子用來治療這類疾病，例如雷公騰屬提取物(中國專利申請?zhí)?010779.1)、麥芽酚(中國專利申請?zhí)?2118497.6)和吡唑并蒽酮類化合物(中國專利申請?zhí)?2114748.5)等。但是這些化合物是植物提取物或經(jīng)過化學(xué)合成而得到的，均會對人體有不良的毒副作用。
愈來愈多的證據(jù)表明神經(jīng)細(xì)胞凋亡在許多病理性神經(jīng)細(xì)胞死亡引起的Alzheimer’s、Parkinson’s、Huntington’s等神經(jīng)退化性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用(Pettmann 1998，Neuron 20，633-47；Mattson 2000，Nat Rev Mol Cell Biol.1，120-9)。在很多類型的細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡時在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生很多變化，如細(xì)胞體積縮小、核的濃縮以及細(xì)胞膜連接的碎片。其中細(xì)胞體積縮小是其凋亡的一個早期現(xiàn)象。大量研究已證明細(xì)胞體積縮小是由胞內(nèi)鉀離子通過鉀離子通道的外流引起的，提高細(xì)胞外的鉀離子濃度可以阻止這種離子的外流導(dǎo)致細(xì)胞死亡而引起的凋亡(Hughes和Cidlowski，1999，Adv Enzyme Regul 39，157-171)。雖然鉀通道異常活性帶來的損害發(fā)現(xiàn)時間不長，但已經(jīng)逐漸被越來越多的人認(rèn)識，并且逐漸有更多的研究顯示它與神經(jīng)元的損傷、凋亡甚至腦萎縮相關(guān)。鉀離子通道病(ion channel disease)是因鉀離子通道功能異常而引起的一組疾病，主要侵及神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)，心臟和腎臟等器官也可受累。
神經(jīng)節(jié)苷脂是存在人體內(nèi)的鞘脂類化合物家族中含有唾液酸基的一類膜質(zhì)分子。它們可以形成一種特殊的結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與下游效應(yīng)器之間的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白和受體的行為，參與信號傳導(dǎo)的過程(Hakomori(2003)Curr Opin Hematol.10，16-24；Miljan和Bremer(2002)Sci STKE.160，RE15)。對于神經(jīng)系統(tǒng)來說，這類分子的功能包括神經(jīng)元的生長，細(xì)胞營養(yǎng)和保護(hù)作用；也就是說神經(jīng)節(jié)苷脂對中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的受體的功能，支持系統(tǒng)以及信號傳遞機(jī)制均產(chǎn)生影響(Ledeen和Wu(1992)Trends Glycosci.Glycotech.4.174-187；Misasi等人(1997)Diabetes Metab Rev. 13，163-79)。神經(jīng)節(jié)苷脂類分子包括結(jié)構(gòu)類似的GM1，GM2，GM3，GD1b(雙唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂-GM1，單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂-GM2，單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂-GM3和單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂-GD1b)等。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明人通過深入的研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)源性物質(zhì)-神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b(式1)可以通過抑制神經(jīng)細(xì)胞鉀離子通道活性抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡。
式1因此，本發(fā)明的目的是提供神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b在抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一目的是提供神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b在制備預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡藥物中的應(yīng)用。所述神經(jīng)退行性疾病包括帕金森氏病、老年癡呆、亨廷頓氏病等。
本發(fā)明還有一個目的是提供神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b在制備預(yù)防和治療鉀離子通道病的藥物中的應(yīng)用。
實驗證明，與現(xiàn)有的抗調(diào)亡劑相比神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b能夠以明顯較小的量達(dá)到相當(dāng)?shù)目拐{(diào)亡效果。因此神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b是一種新的更有效的調(diào)亡抑制劑，并且在制備預(yù)防或治療神經(jīng)退行性疾病和鉀離子通道病的藥物中具有潛在應(yīng)用。由于神經(jīng)節(jié)苷脂是人體內(nèi)存在的膜脂類分子的一種，因此用這類分子作為藥物的毒副作用無疑將會很小。
附圖簡述

圖1.不同神經(jīng)節(jié)苷脂類分子對海馬神經(jīng)細(xì)胞鉀通道電流的影響。
圖2.神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b的抗凋亡作用。(A)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中不加任何凋亡劑和保護(hù)劑時海馬神經(jīng)細(xì)胞的照片；(B)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.3μM STS培養(yǎng)24小時時海馬神經(jīng)細(xì)胞的照片；(C)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入TEA(四乙胺，5.0mM)和0.3μM STS培養(yǎng)24小時海馬神經(jīng)細(xì)胞的照片；(D)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10μM GD1b和0.3μM STS培養(yǎng)24小時海馬神經(jīng)細(xì)胞的照片。
圖3.神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b和TEA對海馬神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡作用的統(tǒng)計學(xué)比較。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例詳細(xì)描述本發(fā)明。
1. 實驗材料1)實驗動物24小時以內(nèi)的新生SD(Sprague-Dawley)大鼠，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所和北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供；2)實驗試劑胎牛血清購自美國HyClone公司，DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)(高糖)及胰蛋白酶，NeurobasalTM-A培養(yǎng)基、B-27添加劑購自美國Gibco公司，多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、L-谷氨酰胺以及GM1、GM2、GM3和GD1b等神經(jīng)節(jié)苷脂均購自Sigma公司(G7641，G8397，G5642，G8146)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
3)實驗儀器Double patch clamp(雙探頭膜片鉗)EPC10 HEKA公司膜片鉗Cole Parmer CPX-600超聲儀，List medical electronic D-1600Darmstadt-13，L/M-3P-A電極拉制儀；List-medical electronic D-64242 ID03 L/M-CPZ101 ZEISS電極拋光儀Axiovert 135 ZEISS(德國)倒置熒光顯微鏡VS-1300-U潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。
2.實驗方法1)海馬神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)是根據(jù)文獻(xiàn)的無血清培養(yǎng)方法(Brewer等，1993，J Neurosci Res.35，567-76)。首先冰浴出生24小時內(nèi)的SD大鼠3分鐘，75％酒精浸泡3分鐘后，斷頭取腦，隨后反相鋪置于冰盒的培養(yǎng)皿和濾紙上分離海馬組織。用無血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡分離出的組織，將組織吸出，加入適量的0.25％胰蛋白酶，37℃溫浴7分鐘，然后以冰冷的DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清)終止消化作用，再加入DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清)，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散，經(jīng)300目篩網(wǎng)過濾。臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞存活率，并將細(xì)胞懸液調(diào)至1×105個細(xì)胞/mL。用吸管將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基緩慢加入預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的(37℃過夜)玻璃片上，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7小時后換成NeurobasalTM-A培養(yǎng)基、B-27添加劑和L-谷氨酰胺的培養(yǎng)液，隔日換成NeurobasalTM-A培養(yǎng)基、B-27添加劑，以后用NeurobasalTM-A培養(yǎng)基、B-27添加劑培養(yǎng)細(xì)胞，待7日后細(xì)胞長出軸突即可用于實驗。
2)膜片鉗的實驗操作鉀通道全細(xì)胞的膜片鉗實驗是根據(jù)文獻(xiàn)(Hamill OP，Marty A，NeherE，Sakmann B，Sigworth FJ.Improved patch-clamp techniques forhigh-resolution current recording from cells and cell-freemembrane patches.Pflugers Arch.1981 Aug；391(2)85-100)，使用EPC-10HEKA公司的產(chǎn)品操作的。使用List medical electronic D-1600Darmstadt-13，L/M-3P-A電極拉制儀將K-Series Borosilicate GlassCapillaries(World Precision Instruments)拉成兩個電極，隨后使用List-medical electronic D-64242電極拋光儀進(jìn)行熱拋光得到電極。電極內(nèi)液為KCl 140mM，MgCl22mM，CaCl22mM，EGTA 1mM，Na2ATP2mM，Hepes 10mM，用KOH調(diào)pH為7.2-7.4，電極外液為NaCl 140mM，KCl 5mM，MgCl22mM，CaCl22mM，Hepes 10mM，葡萄糖10mM，用NaOH調(diào)pH為7.2-7.4，電極進(jìn)入細(xì)胞外液時電阻約為4-10MΩ。在實驗過程中，控制電壓[Holding potential(HP)]-120mV，掃描時間為200ms，控制電壓為從-90～70mV(每20mV遞增)，檢測神經(jīng)細(xì)胞的鉀離子通道電流的I-V曲線。所有的實驗是在室溫下進(jìn)行的。
3)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的檢測方法神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是用Staurosporine(Sigma S4400，在DMSO中1mM)1μM溶于細(xì)胞培養(yǎng)基中來誘導(dǎo)，本文采用兩種檢測方法來觀看神經(jīng)細(xì)胞凋亡后細(xì)胞核的變化(Platoshyn等，(2002)，Am J Physiol Cell Physiol.283，C1298-305)。
A)DAPI染色法細(xì)胞用多聚賴氨酸固定于玻璃片上，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗一次，隨后用95％的乙醇固定5分鐘，用一種能夠穿透細(xì)胞膜的熒光試劑DAPI(4’，6-diamidinophenylindole)(美國Roche公司)(貯液1mM，H2O)染色，DAPI(5μM)溶于PBS中，三分鐘后即可用熒光顯微鏡觀看，用激發(fā)波長340/380nm的光源，在顯微鏡下可以看到發(fā)射波長為460nm的藍(lán)色光。
B)TUNEL方法吸走培養(yǎng)基加入固定液(4％的多聚甲醛于PBS中，pH7.4)于15-25℃放置一小時，用PBS洗玻璃片上細(xì)胞，加入0.1％Triton X-100(溶于0.1％檸檬酸鈉溶液)冰浴2分鐘(2-8℃)穿破細(xì)胞膜，用PBS洗兩次，吸走溶液，加入適量TUNEL反應(yīng)液(Roche公司產(chǎn)品)于樣品上，蓋上蓋玻片，樣品放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育60分鐘，37℃避光，取出玻璃片，用PBS洗三次，放在熒光顯微鏡下察看，激發(fā)波長為450-500nm(例如488nm)，檢測波長為515-565nm(綠色)。
實施例1 神經(jīng)節(jié)苷脂類化合物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞鉀離子通道活性的影響我們首先探索了一些神經(jīng)節(jié)苷脂類化合物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞鉀離子通道電流的影響。本文通過全細(xì)胞的實驗來研究了一些神經(jīng)節(jié)苷脂類分子對鉀通道的電流的影響；依據(jù)實驗材料和方法所述獲得海馬神經(jīng)細(xì)胞，我們采用的對海馬神經(jīng)元細(xì)胞的刺激電壓是從-90到+70mV，待形成全細(xì)胞之后穩(wěn)定電流10-15分鐘，向細(xì)胞外液中分別加入神經(jīng)節(jié)苷脂類分子GM1、GM2、GM3，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、GM2、GM3在相同的濃度時(10μM)對神經(jīng)細(xì)胞的鉀離子通道電流的I-V曲線無明顯的影響；在相同電壓刺激情況下(最大電壓刺激時，如圖1所示)，加藥前后通道的最大電流也無明顯變化。然而，盡管分子結(jié)構(gòu)與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、GM2、GM3類似，神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b卻有明顯的鉀離子通道活性抑制作用。它對海馬神經(jīng)細(xì)胞鉀離子通道電流的抑制作用具有一定的濃度依賴性(數(shù)據(jù)未顯示)，在10μM時的抑制作用可以達(dá)到30％左右。結(jié)果顯示，本發(fā)明的神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b能夠有效調(diào)節(jié)細(xì)胞鉀離子通道活性，在制備預(yù)防和治療鉀離子通道病的藥物方面具有重要應(yīng)用前景。
實施例2 神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b對由Staurosporine(STS)引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用本實施例研究了神經(jīng)節(jié)苷脂類化合物GD1b對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。在本實驗中，依據(jù)上述材料和方法所述獲得海馬神經(jīng)細(xì)胞，以0.3μMSTS來誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，在加入凋亡劑之前30分鐘先分別加入10μMGD1b于細(xì)胞培養(yǎng)基中，同時分別以細(xì)胞培養(yǎng)基中沒有加入相關(guān)神經(jīng)節(jié)苷脂類化合物和加入5mM的常規(guī)細(xì)胞調(diào)亡抑制劑TEA分別作空白對照和陽性對照，通過使用DAPI染色方法的照片顯示，我們發(fā)現(xiàn)加入GD1b一組的神經(jīng)細(xì)胞核要明顯比沒有加入GD1b的一組的狀態(tài)要好一些，凋亡小體的數(shù)目也要少一些(圖2)，表明神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b對STS誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有明顯的保護(hù)作用。對調(diào)亡細(xì)胞作統(tǒng)計學(xué)計數(shù)分析，如圖3所示，在0.3μM的STS濃度誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡下，10μM的微摩爾級GD1b即能達(dá)到與5mM的毫摩爾級TEA接近的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡效果，而在1.0μM更高濃度的STS誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡下，10μM的微摩爾級GD1b的抗調(diào)亡效果更要優(yōu)于5mM的毫摩爾級TEA。
綜上所述，GD1b是一種新的高效神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡抑制劑，其通過抑制鉀離子通道活性來抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡，因此在制備預(yù)防或治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中具有潛在應(yīng)用。另外，GD1b可以調(diào)節(jié)細(xì)胞鉀離子通道活性，由此在制備預(yù)防和治療鉀離子通道病的藥物方面具有重要應(yīng)用。由于GD1b本身是人體內(nèi)源物質(zhì)，因此其不會引起人體不良毒副作用。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b在抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b通過抑制神經(jīng)細(xì)胞鉀離子通道活性來抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡。
3.神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b在制備預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b通過抑制神經(jīng)細(xì)胞鉀離子通道活性來抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的應(yīng)用，其中所述神經(jīng)退行性疾病包括帕金森氏病、老年癡呆、亨廷頓氏病。
6.神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b在制備預(yù)防和治療鉀離子通道病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人體內(nèi)源性化合物的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡作用，更具體地，涉及調(diào)節(jié)鉀離子通道活性的神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡作用。另外，本發(fā)明還涉及神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b在制備預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡藥物中的應(yīng)用，以及在制備預(yù)防和治療鉀離子通道病的藥物中的重要應(yīng)用。
文檔編號A61P25/14GK1634090SQ20041008851
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者戚智, 陳雪松, 池少鵬, 楊微, 劉明娜, 衛(wèi)濤濤, 楊福愉 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所