專利名稱：一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，特別涉及一種以新鮮豬腦為原料，制備高純度單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)的方法。
背景技術：
單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside,GMl)是一種含唾液酸的糖神經(jīng)鞘脂類物質(zhì)，是已知的唯一能穿透血腦屏障的神經(jīng)節(jié)苷脂。GMl最早由德國Klenk發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于哺乳類動物的細胞膜上，尤以神經(jīng)系統(tǒng)含量最為豐富，鑲嵌于細胞雙層脂質(zhì)膜結(jié)構中，是神經(jīng)細胞的重要組成成分之一，約占總脂質(zhì)的10%。GMl在人體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、生長、分化和再生過程中起著必不可少的作用。多年的實驗及臨床報道顯示， GMl可促進受損神經(jīng)恢復，具有促進“神經(jīng)重塑”作用，是參與神經(jīng)病變修復的主要物質(zhì)之
oGMl結(jié)構式及理化性質(zhì)1)GM1分子由I個唾液酸，I個葡萄糖，2個半乳糖，I個氨基半乳糖，I個神經(jīng)酰胺殘基構成。分子結(jié)構式見圖I。2)性狀類白色粉末，水中易溶，在甲醇中極微溶解，在無水乙醇中幾乎不溶或不溶；在0. lmol/L氫氧化鈉溶液中易溶，在0. lmol/L鹽酸溶液中極微溶解。3)熔點接近200°C時變黃，218°C左右變黑，240°C時仍未熔融。4)酸度(溶液的pH值)6. 5-7. 5。5)晶型本品為糖脂類物質(zhì)，無晶型結(jié)構。制備藥用GMl可從哺乳動物腦中提取，具有積極的工業(yè)價值。不同哺乳動物來源的腦組織中GMl的含量有差異，但有資料顯示豬腦組織提取的GMl與人源性GMl在結(jié)構和組成，特別是唾液酸的類型等方面完全一致。因此，從動物腦組織作為原料提取GM1，不會存在免疫原性和異常毒性反應。根據(jù)文獻報道，牛腦中GMl含量相對其它牲畜較高，但鑒于牛源性病毒，如瘋牛病等對人體健康的嚴重危害，一般選用相對較安全的豬腦為原料?？傮w來講，GMl制備包括神經(jīng)節(jié)苷脂混合物提取和GMl單一成份純化兩個步驟。從60年代起,提取總神經(jīng)節(jié)苷脂混合物方法中，以Folch的氯仿-甲醇抽提法,Tettamanti的四氫呋喃提取法，以及Suzuki及Svennerholm等建立的改良方法為主,均能取得一定的滿意效果。GMl 單一組份純化主要有 DEAE-cellulose, DEAE_SephadexA52, DEAE-sepharose，DEAE-dextran,Mono-Q和Q-sepharose等陰離子交換法,反相層析法，如娃膠柱(Iatrobead和unisil)，還有用S印-PakC18柱以及脂質(zhì)親和的LEPSEP-gel等。在整個提取過程中還常包括皂化處理，濃縮和沉淀處理，脫鹽和透析等復雜的過程，有應用a -環(huán)糊精或大孔徑樹脂直接吸附GMl的方法等。另外，從腦組織中提取的總神經(jīng)節(jié)苷脂主要是GMl (約占總質(zhì)量的21% )，⑶Ib (約占總質(zhì)量的36% )，⑶Ia(約占總質(zhì)量的40% )和GTlb (約占總質(zhì)量的19% )四種類型，還包含部分GM2，GM3，GM4，GQl等其他神經(jīng)節(jié)苷脂，不同組分之間主要差異在含NeuNAC型唾液酸的數(shù)目和連結(jié)位置上。因此，如將唾液酸進行降解(如酶解或酸水解)，可以使GTlb，⑶lb，⑶Ia轉(zhuǎn)化成GM1，從而使GMl的產(chǎn)量提高。有文獻和專利報道用唾液酸酶可以降解GT和GD型神經(jīng)節(jié)苷脂的末端唾液酸，部分轉(zhuǎn)化為GM1，用酸水解方法降解其末端唾液酸達到同樣的目的。
到目前為止，在GMl的提取純化中，此類工藝往往存在諸多方面的不足，不利于工業(yè)化制備的開展，如操作步驟繁瑣，耗時長，有機溶劑用量巨大，危害性高，廢物處理困難，GMl的得率及純度偏低等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，該方法綠色環(huán)保，收率高；運用該方法制備的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂純度高。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，具體包括以下步驟A豬腦丙酮粉的制備將豬腦勻漿液進行脫水處理，并過濾，得腦渣；B總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液的制備將步驟A所得的腦渣用萃取緩沖液進行萃取，萃取的時間不少于40分鐘，所述萃取緩沖液為5倍體積的氯仿甲醇水(體積比為2-6 6-10 I 5);萃取完成后，過濾，得濾渣和濾液；將濾液調(diào)節(jié)PH值至10-11，并進行皂化反應，得皂化液；將皂化液進行濃縮，皂化液濃縮液中含有總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液；C酸水解將步驟B所得的總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液調(diào)節(jié)pH值至2-3，攪拌反應不少于I小時，加入相當于總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液3-6倍體積的丙酮，取沉淀，所述沉淀中含有單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。進一步，所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，在步驟A中，將豬腦進行勻漿，得豬腦勻漿液，在所述豬腦勻漿液中加入相當于豬腦體積5倍的丙酮進行脫水處理，并靜置不少于8小時，過濾，收集濾渣，將濾渣用蒸餾釜內(nèi)蒸餾干燥，收集腦渣。進一步，在步驟B中，所述萃取緩沖液由氯仿、甲醇和水按體積比為4 : 8 : 3組成的萃取緩沖液。進一步，在步驟B中，在濾渣中加入5倍體積萃取緩沖液，攪拌萃取60分鐘，過濾，取萃取液，合并萃取液和所述濾液，并加入相當于所述萃取液和所述濾液體積之和的20%的水，將濾液用氫氧化鈉粉調(diào)節(jié)PH值至10-11，并在60°C條件下進行皂化反應45分鐘，得皂化液；將皂化液進行濃縮，得皂化濃縮液，其含有總神經(jīng)節(jié)苷脂。進一步，在步驟B中，采用大孔樹脂吸附工序?qū)υ砘哼M行處理，具體的，預處理后的大孔樹脂裝柱，將皂化液上柱，流速100L/小時；上柱完畢后先用10倍柱體積的水沖洗樹脂，再以2-3個柱體積的體積分數(shù)為50%甲醇去雜質(zhì)，流速200L/小時；再以100%甲醇沖洗解吸至目的帶消失，流速100L/小時；蒸餾釜減壓濃縮，除去甲醇，得到總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液。進一步，將步驟B所得的神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2. 5，并在80攝氏度條件下反應2小時，得反應液；加入相當于反應液5倍體積的丙酮，-10°C條件下沉淀12小時，收集沉淀，所述沉淀為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗品。進一步，將所得單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗品用硅膠柱層析法純化處理，硅膠柱層析法中的流動相由體積比為45 40 5的氯仿、甲醇和水組成，其中按每IOkg單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗品和80L流動相的比例充分溶解，上樣，流速50L/小時，洗脫后，收集洗脫液，蒸餾釜減壓濃縮，除去溶劑，得濃縮液1，加入相當于濃縮液I體積10倍的丙酮，-10°C低溫沉淀12小時，過濾并收集沉淀，沉淀充分干燥，得單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂次粗品。進一步，在步驟C之后，還包括步驟D，唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的純化，具體為將單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂次粗品用硅膠柱析柱法進行純化，所述流動相為體積比為65 30 5的氯仿、甲醇和水組成，按每Ikg單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗品和5L流動相的比例充分溶解，上樣，流速為5L/小時，再用流動相以20L/小時勻速洗脫，以HPTLC (高效薄層色譜)檢測流出液，流出液中僅含單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂純品。進一步，將所述流出液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮(水浴溫度70°C，濃縮至原體積的1/40)，得濃縮液2，并加入相當于濃縮液2的10倍體積的丙酮，-10°C低溫至充分產(chǎn)生沉淀，收集沉淀，用純水溶解沉淀，上述步驟重復1-3次。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比有如下的明顯優(yōu)點和技術進步I)本發(fā)明豬腦丙酮粉的制備步驟中，所述的丙酮浸潰處理工藝，可去除豬腦組織中的大量水分，減少水溶性雜質(zhì)，利于大量膽固醇去除及豬腦組織細胞中內(nèi)含物增溶釋放，并可抑制豬腦組織中某些酶類對目的產(chǎn)物的降解，所得神經(jīng)節(jié)苷脂的產(chǎn)量和純度均為提高，更能節(jié)省有機溶劑用量，節(jié)約提取時間，提高效率，為后續(xù)工藝帶來方便。申請?zhí)枮?00710049500. 4的中國專利采用家畜腦組織與丙酮(I 10)混合后勻漿30min，梯度離心收集沉淀的方法，而未經(jīng)過12小時的浸潰處理。申請?zhí)枮?1126341. 5的中國專利提出用丙酮浸潰處理次數(shù)為3_6次，丙酮用量分別為3倍、2. 5倍、I. 5倍不等，每次24小時，用細布或壓濾機過濾。步驟繁瑣，操作難度和生產(chǎn)成本均較高，不利于丙酮回收和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。我們改進為用5倍體積丙酮浸潰處理12小時，過濾后，用蒸餾釜蒸餾達到干燥和回收丙酮的目的。處理后豬腦渣干重約為1/3濕重。2)本發(fā)明步驟二所述的總神經(jīng)節(jié)苷脂提取工藝，采用改良的“氯仿/甲醇/水萃取法”進行總神經(jīng)節(jié)苷脂粗提。申請?zhí)枮?201010141503. 2,200910177575. X,200710195019. 6 的中國專利公開了
未經(jīng)丙酮處理的新鮮豬腦分別經(jīng)“氯仿/甲醇/水”、“氯仿/甲醇”、“甲醇/水”進行萃取的技術方案，申請?zhí)枮?00710049500. 4的中國專利公開了用丙酮粉與“氯仿/甲醇/水”進行
萃取的工藝，采用一步法離心分離，收集上清。本發(fā)明所采用的為改良的“氯仿/甲醇/水萃取法”，具體的，取丙酮粉加入5倍體積的氯仿/甲醇/水(體積比為4 8 3)萃取液提取總脂，所得沉淀再用5倍體積的萃取液進行第2次提取，合并上清。補入20%的水靜置分層，分層上清為總脂提取液。大部份中性脂都分配進入下層有機相，上層水相中大部份為神經(jīng)節(jié)苷脂及部分磷脂。根據(jù)磷脂在堿性條件下易于與堿性物質(zhì)生成“皂類物質(zhì)”特點，本發(fā)明通過NaOH進行皂化反應沉淀磷月旨，皂化反應后通過定磷法測定上清液中含磷量已低于I %。選用本方法可達到更高的提取效率，且磷脂污染較小。3)本發(fā)明涉及大孔樹脂吸附和總神經(jīng)節(jié)苷脂酸水解的工藝，其目的是利用大孔樹酯吸附、分離神經(jīng)節(jié)苷脂混合體，富集GM1，并通過酸水解以獲得更高的GMl產(chǎn)量。本發(fā)明通過對不同濃度的鹽酸、磷酸、乙酸在不同PH和水解溫度條件下，對同一批次總神經(jīng)節(jié)苷脂水溶液進行水解，GMl的增值測定(TLC方法)結(jié)果顯示0. 2%鹽酸，pH2. 5，加熱至80°C攪拌反應2小時為最佳條件。4)本發(fā)明涉及GMl純化工藝，是經(jīng)過優(yōu)化的新型的柱層析純化分離方法。由于從豬腦組織中經(jīng)過有機相抽提，分配提取，皂化，大孔樹脂富集，酸水解后得到含GMl 35%左右的總神經(jīng)節(jié)苷脂混合物，其中尚含有少量的磷脂、硫酸脂、單脂肪酸等雜質(zhì)物質(zhì)。傳統(tǒng)的硅膠層析工藝周期長，一般30日左右一個批次，溶劑消耗巨大，收率欠佳。本發(fā)明操作方便，比一般硅膠純化能負載更多樣品，回收率高。經(jīng)過2次純化，可達到更好的精制，且周期短，成本低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)的開展。5)本發(fā)明對生產(chǎn)過程中有機溶劑和終產(chǎn)物廢料的處理，既能有效減少產(chǎn)品中的殘留雜質(zhì)，又可避免有機溶劑對環(huán)境的污染，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。


圖I :GM1化學結(jié)構式；圖2 :本發(fā)明制備產(chǎn)品的HPLC圖；圖3 :進口對照品的HPLC具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件進行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。大孔樹脂吸附層析法大孔吸附樹脂是以苯乙烯和丙酸酯為單體，加入乙烯苯為交聯(lián)劑，甲苯、二甲苯為致孔劑，它們相互交聯(lián)聚合形成了多孔骨架結(jié)構。樹脂一般為白色的球狀顆粒，粒度為20 60目，是一類含離子交換集團的交聯(lián)聚合物，它的理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶劑，不受無機鹽類及強離子低分子化合物的影響。樹脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附質(zhì))之間的范德華引力，通過它巨大的比表面進行物理吸附而工作，使有機化合物根據(jù)有吸附力及其分子量大小可以經(jīng)一定溶劑洗脫分開而達到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的。硅膠柱層析柱法硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。具體方法可參照中國藥典2000年版二部柱色譜法。實施例I豬腦選擇及預處理選取經(jīng)過動物防疫檢驗合格的新鮮豬腦或凍豬腦，去除腦膜及血管，用去離子水沖去血污，再漂洗3次，絞碎，勻漿。粉碎后用相當于試驗用豬腦5倍體積的丙酮，攪拌15分鐘，室溫靜置浸潰處理12小時。過濾，收集濾渣。濾渣移至蒸餾釜內(nèi)蒸餾干燥，收集干渣，得豬腦丙酮粉，密閉分裝，保存?zhèn)溆谩嵤├?總神經(jīng)節(jié)苷脂提取
攪拌罐內(nèi)泵入500L萃取緩沖液，再投入100千克豬腦丙酮粉，攪拌萃取60分鐘，過濾，收集沉淀和濾液，所述萃取緩沖液由氯仿、甲醇和水按體積比為4 8 3的比例混合。在所述沉淀中加入500L所述萃取緩沖液，攪拌萃取60分鐘，過濾，收集沉淀和萃取液。合并濾液和萃取液，在萃取液中加入相當于萃取液體積20%的水，混勻，得混合液；將混合液在室溫靜置分層12小時，取上清液。在所述上清液中加入NaOH粉末，使上清液中NaOH的質(zhì)量分數(shù)為0. 3%，攪拌溶解，pH值到10. 0-11. 0，60°C皂化反應45分鐘，皂化液冷卻備用。大孔樹脂預處理后，量取120L樹脂(約100千克)濕法裝柱，將上述皂化液上樣，流速100L/小時。上樣完畢后先用10倍柱體積的水沖洗樹脂，再以2-3個柱體積的體積分數(shù)為50%甲醇去雜質(zhì)，流速200L/小時。再以100%甲醇沖洗解吸至目的帶消失，流速100L/小時。蒸餾釜減壓濃縮，除去甲醇，得到總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液。實施例3 GMl粗品的提取
在60L實施例2制備的總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液中補入0. 2%鹽酸(即120ml)，調(diào)節(jié)至pH2. 5，得混合液。80°C攪拌反應2小時，冷卻至室溫，待用。加入相當于混合液5倍體積的丙酮，-10°C低溫沉淀12小時。離心，用200目濾布過濾收集沉淀，獲得含GMl粗品，GMl粗品中含有質(zhì)量分數(shù)為35% “粗品I”。對“粗品I”進行純化取粗硅膠300千克，用流動相氯仿/甲醇/水(氯仿、甲醇和水的體積比為45 40 5)濕法裝至I根80X IOOcm層析柱中。將“粗品I”按每IOkg用80L流動相充分溶解，上樣，流速50L/小時。以上述流動相洗脫，分部收集洗脫液，流速200升/小時，以HPTLC檢測流出液，合并含GMl流份。蒸餾釜減壓濃縮，除去溶劑，得到總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液。加入相當于總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液10倍體積丙酮，-10°C低溫沉淀12小時。用200目濾布過濾收集沉淀，沉淀用干燥箱60°C真空干燥5小時，即為“粗品2”。“粗品2”的硅膠柱層析精純化取層析硅膠10kg，用流動相氯仿/甲醇/水(氯仿、甲醇和水的體積比為65 30 5)濕法裝至I根22X100cm層析柱中，將“粗品2”按每I. 0千克用5. OL流動相充分溶解。上樣，流速5L/小時。再用流動相以20L/小時勻速洗脫，以HPTLC檢測流出液，合并僅含GMl流份。獲得的含GMl流份，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮(水浴溫度70°C，濃縮至原體積的1/40)，除去溶劑，獲得濃縮液。加入相當于濃縮液10倍體積的丙酮，-10°C低溫沉淀12小時。除去澄清的丙酮上清液，用200目濾布過濾，收集沉淀，用純水溶解。再加入10倍體積丙酮，-10°C低溫沉淀12小時。過濾，收集沉淀，用無熱原純水溶解，_40°C低溫預凍8小時。置于低溫真空干燥機，冷凍干燥。粉碎機粉碎，60目篩網(wǎng)過篩。按1.0千克分裝到鋁塑袋，再裝到鋁聽，封蓋。從豬腦中提取GMl產(chǎn)率按質(zhì)量分數(shù)計為萬分之五。實施例4確證制備產(chǎn)品的化學結(jié)構一供確證化學結(jié)構用樣品的精制及純度檢測I樣品精制方法取實施例3制備的GMl樣品適量溶于體積分數(shù)為5%的甲醇中，用大孔樹脂吸附，水沖洗至清，80%甲醇沖2倍柱體積，用甲醇解吸附，收集含唾液酸洗脫液，濃縮，丙酮沉淀，60°C真空干燥至恒重即為精制品。2進口對照品制備方法
取阿根廷TRB藥廠生產(chǎn)GMl注射液(商品名施捷因，生產(chǎn)批號進口藥品注冊證號H20070242,生產(chǎn)批號=20176,生產(chǎn)日期2010年9月)20支(20mg/2ml/支)，用20ml大孔樹脂吸附，水洗約10個柱體積，然后用10個柱體積甲醇洗脫，減壓除去甲醇，用少量水溶解，加到丙酮中使之沉淀，離心收集沉淀，60°C真空干燥，得320mg白色粒狀固體。3樣品純度檢測方法高效液相色譜法(HPLC)儀器安捷倫HP1100，四元梯度泵，紫外檢測器(波長205nm)色譜柱大連依利特公司Bondatak C18柱,4. 6 X 250mm, IOu流動相乙腈體積分數(shù)為0. 03%三乙胺按體積比為8 2進行混合后，用磷酸調(diào)至 pH = 7. 5,1. Oml/min。 本品與對照樣品HPLC圖譜分別見圖2，圖3。檢測結(jié)果顯示樣品中GMl含量為98. 15%，對照品含量為100. 70%。二確定產(chǎn)品化學結(jié)構的方法I紅外吸收光譜(IR)儀器型號Bio-RadFTS-65A測定條件采用溴化鉀壓片法在4000 dOOCM—1范圍測定檢測依據(jù)傅立葉變換紅外吸收光譜分析方法通則制樣方法稱取樣品約lmg，加入干燥KBr粉未約150mg，研磨3次，每次I分鐘，在2 X IO^6Pa下壓片，測定紅外光譜。分析測試結(jié)果見表I。表I GMl紅外光譜吸收峰數(shù)據(jù)及歸屬
— 波數(shù)(cm-1)吸收強度振動類型
3399SVoh Vnh輕基及胺基
2922,2851SVch3 Vch2甲基及亞甲基
1643SVc=O酰胺羰基
1070SV^0碳一氧單健解析紅外光譜中3399CHT1處存在寬而強的峰，表明分子中存在多羥基，多胺基；2922,2851cm-1處的強吸收峰為典型的長鏈烷烴的特征吸收1643(^!^1為酰胺羰基的特征吸收1070(^-1為碳一氧單健伸縮振動，峰寬而強為多醚健多羥基。三核磁共振氫譜(1HNMR)、碳譜(13CNMR)儀器型號瓦里安公司UNITY INOVA 600核磁共振儀；檢測依據(jù)核磁共振波譜分析方法通則；檢定條件取約15mg樣品置于5mm樣品管中，加入溶劑DMS0-d6,以TMS為內(nèi)標,測定核磁共振氫譜。圖譜解析a. 6 0. 87，0. 88和15. 61為長鏈上的兩個端甲基的氫和碳信號。b. S I. 78，I. 91和23. 86，24. 32為兩個乙酰胺的甲基。
c. 6 I. 93和33. 08為長鏈上與雙鍵相鄰的亞甲基。d. 6 2. 03和37. 38為長鏈上與羰基相鄰的亞甲基。e. S I. 25 2. 03和25. 27 39. 16為長鏈上的亞甲基及E環(huán)上的一個亞甲基，總共29個。f. S 3. 10，3. 75，3. 90，52. 60，54. 45，54. 72 為與氮相鄰的次甲基(N-CH)。g. S 3. 10 4. 01和69. 15 82. 45為與氧相鄰的次甲基，共20個。h. 8 4. 17，4. 22，4. 29，4. 85，104. 26，105. 28，105. 44，106. 22 分別為與兩個氧相鄰
的次甲基，共4個。i. 6 5. 36，5. 54，133. 12，133. 22 為雙鍵的質(zhì)子和碳。 j. 6 103. 67為與兩個氧相鄰的季碳。k. 8 172. 51，173. 44，173. 53，174. 08 為 4 個羰基碳。I. S 8. 16，7. 57，7. 51為3個胺基質(zhì)子，S 5. 92，4. 33 5. 17為眾多的羥基質(zhì)子。四質(zhì)譜(MS)分析儀器型號Micromass公司Q-T0F-2型質(zhì)譜儀檢測依據(jù)質(zhì)譜分析方法通則測定條件電噴霧離子源(ESI)，源溫80°C，掃描范圍50 2000 U。本品及對照品(括號內(nèi)數(shù)據(jù))的正離子電噴霧(ESI)質(zhì)譜圖中，主要信號峰有m/zll63. 8191 (1163. 8191)、m/zll91. 8621 (對照品未標出)、m/zl277. 8757 (1277. 8464)、m/zl546. 9957 (1546. 9634)、m/zl568. 9618 (1568. 9618)及 m/zl597. 0140 (1596. 9813)等。本樣品為兩個單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂同系物的鈉鹽，其單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂部分的元素組成分別為C73H131N3O31 (M18)和C75H135N3O31 (M20)，分子量分別為1545.8766，1573. 9079。準分子離子峰本品譜中m/z 1546. 9618為第一個成分的準分子離子M18+H+峰，與樣品中第一個成分的分子量計算值1545. 8766相符。m/z 1568. 9618為M18+Na+峰。m/z1597. 0140為M2Q+Na+峰。對照品譜中也有相同的信號峰。糖苷鍵斷裂后形成的碎片峰ESI譜通常不出現(xiàn)碎片峰，但本品和進口對照品MS譜中均可明顯看到在寡糖鏈分枝處斷裂產(chǎn)生的碎片峰，可能是由于糖環(huán)上同側(cè)相臨的兩個羥基上連接體積較大的取代基，因位阻而引起的張力使此處的糖苷鍵容易斷裂。裂解部位m/zll63.8191(1163. 8191)為 M18-Gal_GalNAc+H+ 峰；1191. 8621 為M20-Gal-GalNAc+H+ 峰。m/zl277. 8757 (1277. 8464)為 M18_Neu5Ac+Na+ 峰；m/zl305. 8579 (對照品)為 M2(l_Neu5Ac+Na+ 峰?？傊?，樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及圖譜與進口對照品基本相同。本品的紅外、核磁、質(zhì)譜數(shù)據(jù)均符合GMl化學結(jié)構，且與進口對照品數(shù)據(jù)一致，確證本品為GMl。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟 A豬腦丙酮粉的制備 將豬腦勻漿液進行脫水處理，并過濾，得腦渣； B總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液的制備 將步驟A所得的腦渣用5倍量萃取緩沖液進行萃取，萃取的時間不少于40分鐘，所述萃取緩沖液由氯仿、甲醇和水按體積比為2-6 6-10 I 5;萃取完成后，過濾，得濾渣和濾液；將濾液調(diào)節(jié)pH值至10-11,并進行皂化反應,得皂化液；將皂化液進行濃縮,皂化液濃縮液中含有總神經(jīng)節(jié)昔脂濃縮液； C酸水解 將步驟B所得的總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液調(diào)節(jié)pH值至2-3，攪拌反應不少于I小時，加入相 當于總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液3-6倍體積的丙酮，取沉淀，所述沉淀中含有單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。
2.根據(jù)權利要求I所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，在步驟A中，將豬腦進行勻漿，得豬腦勻漿液，在所述豬腦勻漿液中加入相當于豬腦體積5倍的丙酮進行脫水處理，并靜置不少于8小時，過濾，收集濾渣，將濾渣用蒸餾釜內(nèi)蒸餾干燥，收集腦渣。
3.根據(jù)權利要求I所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，在步驟B中，所述萃取緩沖液由氯仿、甲醇和水按體積比為4 8 3組成的萃取緩沖液。
4.根據(jù)權利要求3所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，在步驟B中，在濾渣中加入相當于濾渣體積5倍的萃取緩沖液，攪拌萃取60分鐘，過濾，取萃取液，合并萃取液和所述濾液，并加入相當于所述萃取液和所述濾液體積之和的20%的水，將濾液用氫氧化鈉粉調(diào)節(jié)PH值至10-11，并在60°C條件下進行皂化反應45分鐘，得皂化液；將皂化液進行濃縮，得皂化濃縮液，其含有總神經(jīng)節(jié)苷脂。
5.根據(jù)權利要求4所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，在步驟B中，采用大孔樹脂吸附工序?qū)υ砘禾幚慝@得總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液，具體為皂化液上樣后，先用10倍柱體積的水沖洗樹脂；再以2-3個柱體積的體積分數(shù)為50%甲醇去雜質(zhì)，流速200L/小時；再以100%甲醇沖洗解吸，流速100L/小時。蒸餾釜減壓濃縮，除去甲醇。
6.根據(jù)權利要求5所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，將步驟B所得的神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2. 5，并在80攝氏度條件下反應2小時，得反應液；加入相當于反應液5倍體積的丙酮，-10°C條件下沉淀12小時，收集沉淀，所述沉淀為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗品。
7.根據(jù)權利要求6所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，將所得單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗品用硅膠柱層析法純化處理，300kg粗硅膠濕法裝至080X IOOcm層析柱中，流動相由體積比為45 40 5的氯仿、甲醇和水組成，其中按每IOkg單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗品和80L流動相的比例充分溶解，上樣，流速50L/小時，洗脫后，收集洗脫液，蒸餾釜減壓濃縮，除去溶劑，得濃縮液1，加入相當于濃縮液I體積10倍的丙酮，-10°C低溫沉淀12小時，過濾并收集沉淀，沉淀充分干燥，得單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂次粗品。
8.根據(jù)權利要求7所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，在步驟C之后，還包括步驟D，唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的硅膠柱層析法純化，具體為，IOkg層析硅膠濕法裝至①22 X IOOcm層析柱中，所述流動相為體積比為65 30 5的氯仿、甲醇和水組成，按每Ikg單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗品和5L流動相的比例充分溶解，上樣，流速為5L/小時，再用流動相以20L/小時勻速洗脫，以高效薄層色譜檢測流出液，流出液中僅含單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂純品。
9.根據(jù)權利要求8所述的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，其特征在于，將所述流出液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70°C減壓濃縮至原體積的1/40，得濃縮液2，并加入相當于濃縮液2的10倍體積的丙酮，-10°C低溫至充分產(chǎn)生沉淀，收集沉淀，用純水溶解沉淀，上述步驟重復1-3次。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備高純度單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)的方法，具體包括豬腦丙酮粉的制備、總神經(jīng)節(jié)苷脂濃縮液的制備和酸水解步驟；本發(fā)明所得神經(jīng)節(jié)苷脂的產(chǎn)量和純度均為提高，更能節(jié)省有機溶劑用量，節(jié)約提取時間，提高效率，為后續(xù)工藝帶來方便。
文檔編號C07H1/08GK102731584SQ20121007604
公開日2012年10月17日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權日2012年3月21日
發(fā)明者姚靜, 張憲, 李豫儉, 楊琴飛, 石延賓, 胡偉, 魏勇, 黃洪濤 申請人:瀘州瑞興化學工業(yè)有限公司, 重慶紫禾醫(yī)藥技術開發(fā)有限公司