專利名稱：大批量高純度神經節(jié)苷脂化合物的制備方法
技術領域：
已知神經節(jié)苷脂類化合物(Gangliosides)，具有非常重要的生物功能，約有40～50多種，哺乳動物鮮腦組織約有20種，其化學結構基本相同，幾種主要成分，其差別僅是分子中所含唾液酸(Sialic acides)數目多少不同，另有大部分種類糖鏈的組成與連接位置有所不同。
由于這類化合物種類多、含量少、分子組成、結構、物理化學性質等因素十分相近，至今尚缺乏簡便、高效、大批量制備高純度神經節(jié)苷脂的新工藝?，F列出四種主要神經節(jié)苷脂的分子結構圖，請參考GANGLIOSIDES-STRUCTURE GM1I，II，III，IV，AGD1aI，II，III，IV，A，BGD1bI，II，III，IV，A，CGT1bI，II，III，IV，A，B，CStructures of the four major gangliosides of mammalian brain.
注Gm1，Gd1a，Gd1b，Gt1b這4種化合物占神經節(jié)苷脂全成分的80～90％
本發(fā)明皆以豬鮮腦組織為原料，利用新型大孔樹脂，建立了一套簡便、有效、提取、分離、純化，制備大批量高純度神經節(jié)苷脂的生產工藝，并用此工藝制備的化合物，做成針劑進行了幾項動物藥理試驗，以驗證生物活性，并與進口產品做了純度對比實驗。
本發(fā)明不僅適用于神經節(jié)苷脂全成分制備，也適用于單一成分GM1的制備(但需要上柱前增加一步簡單處理)。
背景技術：
神經節(jié)苷脂化合物早期階段的提取、分離幾乎都是使用1957年Folch等發(fā)明的分層技術[Folch et al.(1957)J.B.C.226，497-509]，此方法一直沿用至今。此后雖不斷有修正、改進，但在使用上，并沒有大的改變。
直到1976年T.Momoi等[T.Momoi(1976)B.B.A.441，488-497]首次報道了使用DEAE-Sephadex A-25及多孔硅膠球Iatrobeads等，分離、純化神經節(jié)苷脂的技術，明顯提高了分離、純化的效果。但此類工藝最大缺點是處理過程復雜、產率低、成本高。若進一步純化，則需使用制備型TLC及相應的優(yōu)質硅膠柱層析技術。

發(fā)明內容
1980年起，我們開始總結各類制備神經節(jié)苷脂不同方法的優(yōu)缺點，當時正興起新型大孔樹脂的科研，有多種試制的小量樹脂樣品，可供選擇試用。我們根據不同型號樹脂與被分離物的理化性質匹配程度，經多次篩選發(fā)現一種大孔樹脂(暫時定名227號)，在一定條件下，對神經節(jié)苷脂有很好的選擇性分離純化作用，最后確定使用227號樹脂，用于神經節(jié)苷脂科研至今。
我們利用此技術，制備出數十克純品，進行了多項生物活性試驗，均取得良好結果(見實審參考資料1，2，3)，為成果鑒定會準備了條件。
1.實審參考資料1.中國科學院科學基金委員會1985年7月1日，科學基金工作簡報?？蒲谐晒b定會評價“此項工藝屬國內外首創(chuàng)”。
2.實審參考資料2.神經節(jié)苷脂薄層譜(1984.2)，與進口針劑做了對比。
3.實審參考資料3.神經節(jié)苷脂對小鼠巨噬細胞的激活實驗。
本發(fā)明適于大批量制備高純度混和全成分，也適于單一成分。至今尚未見有更先進的相關文獻和專利的報道；即僅通過一次新型大孔樹脂柱處理，就能有效完成神經節(jié)苷脂的分離、純化、脫鹽、濃縮等過程，短時間內即可制備出大批量、高純度產品。
本發(fā)明遠比其它工藝先進，大部分有機溶劑尚可回收和套用，樹脂容易再生，全過程污染小，產品成本低廉，非常適于工業(yè)化生產。
(混和純品每克成本約150元，GM1每克約250元)
具體實施例方式一.通過下述實例，可有助于理解本發(fā)明的基本內容(1)本發(fā)明是根據神經節(jié)苷脂的組成、結構與性質，選擇粒度為30-300目、平均孔徑為60-300的大孔樹脂。
(2)實驗處理過程溫度為0-60℃，PH為1.5-6.5。
(3)實驗材料加氯仿、甲醇(1∶1V/V或1∶2V/V)，高速勻漿，調溶劑比例，加水分出上層，適當調節(jié)后直接通過大孔樹脂柱，洗脫。
(4)洗脫液減壓濃縮，即可達到分離、純化的目的。
(5)經樹脂柱一次處理，產品純度與進口針劑純度相當[見實審參考資料2.神經節(jié)苷脂薄層譜(1984年2月)]。
(6)每Kg豬鮮腦組織可提取1.2-1.5克全成分純品，經TLC檢測，與意大利進口針劑純度相同。單一成分GM1可提取約0.8-1克，純度與Sigma標準品相同。(神經節(jié)苷脂制品國外皆用牛腦，我們一直用豬腦為原料)。
二.本發(fā)明制備的產品活性檢測實例(樣品純度皆＞98％)(1)對小鼠巨噬細胞有極顯著的激活作用[見實審參考資料3](2)使用20只同批純種萊亨母雞，用有機磷神經毒劑TOCP中毒，待實驗組雞只兩腿皆癱瘓后，隨機分成兩組，一組作對照，另一組注射神經節(jié)苷脂(20mg/只、天)，共給藥30天，一兩個月后，已癱瘓的雞只逐漸開始恢復，多數能站立、活動，并有幾只產蛋，證明本發(fā)明提取的神經節(jié)苷脂，有顯著緩解TOCP毒性的生物活性。
我們還為一些科研單位提供神經節(jié)苷脂針劑，用于兔坐骨神經搭橋(解放軍301醫(yī)院骨科)、狗脊髓半橫切(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經科)，皆取得顯著效果，并在成果鑒定會上作了報告。
權利要求
一種適于大批量、提取、分離、純化，制備神經節(jié)苷脂(Gangliosides)的方法，其特征是1.含神經節(jié)苷脂類化合物的勻漿提取液，或化學合成、化學修飾物的后期純化，0-60℃靜置，調PH1.5-6.5，調溫度5-60℃，即可供大孔樹脂柱上柱用。
2.根據權利要求1.所述，選擇已純化的大孔樹脂，其特點是樹脂粒度為30-300目、平均孔徑為60-300的樹脂，裝柱，供層析用。
3.根據權利要求1.和權利要求2.所述范圍，可試選出分離、純化的最佳匹配條件，進行樹脂柱分離，即可達到分離純化的目的。
4.根據權利要求3.無論含神經節(jié)苷脂混合成分，或單一成分樣品的分離、純化，上述要求皆適用。
全文摘要
本發(fā)明是以高等動物腦細胞為原料，加溶劑勻漿、分層。將神經節(jié)苷脂(Gangliosides)提取液，僅通過一次新型大孔樹脂柱處理，即可達到有效分離、純化、脫鹽及濃縮制備高純度神經節(jié)苷脂的目的，產品純度可＞98％。已知神經節(jié)苷脂化合物，具有廣泛的生物活性，國外已有藥廠生產神經節(jié)苷脂針劑用于臨床，主要功能是治療和改善受損傷的外周及中樞神經系統(tǒng)疾病。本發(fā)明首次使用新型大孔樹脂，利用樹脂的組成、結構特性，能去除有害物質，分離出有效成分并保持其生物活性。多年實踐證明，本工藝屬國內外首創(chuàng)，遠比現行工藝先進，適于工業(yè)化生產。
文檔編號C07H1/06GK1814610SQ20051001317
公開日2006年8月9日 申請日期2005年2月2日 優(yōu)先權日2005年2月2日
發(fā)明者商宗一 申請人:商宗一