專利名稱：一種羊棲菜多糖sfp－i及其分離純化方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種多糖。
背景技術(shù)：
羊棲菜(Sargassum Fusiforme，SF)屬褐藻門馬尾藻科植物，是我國(guó)豐富的經(jīng)濟(jì)海藻資源，藻體呈黃褐色，干時(shí)發(fā)黑，高30～200cm，肉質(zhì)，主軸圓柱形，直立，基部具短分枝，又名玉茜、胡須泡、海大麥等，系多年生的暖溫性海藻。在我國(guó)主要分布在廣東、山東、福建、浙江等沿海地區(qū)，并出口到日本等國(guó)，而我國(guó)的羊棲菜開發(fā)才剛剛起步，幾乎處于空白。
乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的、流行久遠(yuǎn)、傳播廣泛、嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。據(jù)估計(jì)目前全球范圍內(nèi)大約有3.5億的HBV慢性攜帶者。我國(guó)是乙型肝炎主要的流行區(qū)域，有超過(guò)10％的感染過(guò)HBV，HBV慢性攜帶者的人數(shù)幾乎占全球的一半，現(xiàn)患慢性乙型肝炎的病人已達(dá)到1000萬(wàn)。對(duì)HBV的防治已成為我國(guó)乃至世界傳染病控制的首要問(wèn)題之一。
藻類多糖具有較好的抗病毒作用已被大量的科學(xué)家所認(rèn)可。多糖作為羊棲菜的最主要成分，含量占細(xì)胞干重的40％左右，這就為利用羊棲菜開發(fā)新型抗病毒藥品或食品提供了必要條件。本發(fā)明從羊棲菜中分離純化獲得一種多糖，經(jīng)化學(xué)方法分析確定出化學(xué)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)證明該化學(xué)結(jié)構(gòu)的多糖具有明顯的抗乙肝病毒作用，可應(yīng)用于藥品或保健食品中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有乙型肝炎治療存在的問(wèn)題，提供一種從羊棲菜中分離的羊棲菜多糖SFP-I。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該羊棲菜多糖SFP-I分離純化的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該羊棲菜多糖SFP-I在制備抗乙肝病毒藥物或保健食品中的應(yīng)用。
一種羊棲菜多糖SFP-I，經(jīng)SepharoseCL-6B凝膠色譜柱層析，譜圖出現(xiàn)單一對(duì)稱峰，如圖1所示，表明純度已達(dá)到對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)、藥理研究的要求。SFP-I經(jīng)HPLC體系測(cè)定其分子量為1.2×105，經(jīng)氣相色譜圖分析，如圖2，SFP-I的單體組成含有巖藻糖、半乳糖、木糖，各單糖之間的摩爾比為1∶0.4∶0.39。經(jīng)紫外掃描圖譜，如圖3所示，除蛋白后的SFP-I在260nm和280nm附近均無(wú)蛋白質(zhì)和氨基酸的特征吸收峰，表明其不含蛋白質(zhì)。SFP-I的13C-NMR譜圖中，如圖4，端基碳的化學(xué)位移δ均在102ppm以下，其中δ97-102ppm信號(hào)峰為C1訊號(hào)，表明其構(gòu)型為α，這與IR譜圖(如圖5)、GC-MS譜圖(如圖6)分析結(jié)果是一致的。根據(jù)13C-NMR譜峰的指派，結(jié)合二糖、寡糖的化學(xué)位移表及文獻(xiàn)，以及高碘酸氧化和Smith降解結(jié)果，證明SFP-I多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)是以-3-α-L-Fuc-(1，4)-α-L-Fuc-(1-殘基形成糖鏈，平均每6個(gè)單糖殘基中含有2個(gè)α1→2分支，其重復(fù)單元可表示如下
上述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其步驟如下所示(1)取羊棲菜加水浸提，超濾水浸提液，收集被截留部分，減壓濃縮、用無(wú)水乙醇沉淀，冷凍干燥得羊棲菜粗多糖；(2)將羊棲菜粗多糖加水復(fù)溶，然后加入CaCl2溶液，離心，收集上清液；(3)上清液經(jīng)減壓濃縮，再加入乙醇，離心；(4)離心后取上清液，上清液中再加入乙醇，離心取沉淀物；(5)將沉淀物溶于水，按Sevag法脫游離蛋白，以DEAE-cellulose為載體柱層析，依次用0.3mol/L NaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集各洗脫液，各洗脫液透析、減壓濃縮、冷凍干燥得固體物；(6)將上述經(jīng)0.9mol/LNaCl洗脫所得的固體物溶于水，再進(jìn)一步用SepharoseCL-6B柱層析純化，流動(dòng)相為0.05mol/LNaCl溶液，流出液經(jīng)透析、減壓濃縮、冷凍干燥后得白色粉末狀羊棲菜多糖SFP-I。
上述步驟(1)所述的超濾水浸提液是用分子量為100000的超濾膜超濾水浸提液。
上述步驟(1)所述無(wú)水乙醇的用量是減壓濃縮后物體體積的3～8倍。
上述步驟(2)所述CaCl2溶液的濃度為4mol/L。
上述步驟(3)中上清液經(jīng)減壓濃縮，再加入乙醇，使溶液中乙醇濃度為30～40％。
上述步驟(4)中，離心后取上清液，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇濃度為85～90％。
上述步驟(5)所述的Sevag法中，氯仿和正丁醇的體積比為4∶1。
上述步驟(6)中所述的固體物用量為80～100mg。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明從羊棲菜中提取了一種羊棲菜多糖SFP-I，該多糖能夠有效抑制乙肝病毒，在制備用于預(yù)防和治療乙肝的藥物及保健食品中有著重要的應(yīng)用，其市場(chǎng)前景廣闊，價(jià)值高。


圖1為羊棲菜多糖SFP-I在SepharoseCL-6B凝膠色譜柱上的層析圖；圖2為糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖；圖3為羊棲菜多糖SFP-I除蛋白后的紫外掃描圖譜；圖4為羊棲菜多糖SFP-I的13C-NMR譜圖；圖5為羊棲菜多糖SFP-I的IR譜圖；圖6為羊棲菜多糖SFP-I的GC-MS譜圖；其中，在圖2中，A為標(biāo)準(zhǔn)單糖；B為SFP-I水解物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 羊棲菜多糖SFP-I的分離純化
(1)取1kg羊棲菜干品加水浸提，經(jīng)響應(yīng)面分析法優(yōu)化條件為提取溫度85℃、自然pH值、水料重量比為28∶1、浸提1次的條件下，外加40W超聲波，每次10min，間隔10min，浸提1h，羊棲菜粗多糖的得率可達(dá)21.09％(占原羊棲菜干品重量)。
(2)用100000分子量的超濾膜超濾水浸提液，選取2.0MPa為操作進(jìn)口壓力，室溫25℃作為超濾溫度。收集被截留部分，減壓濃縮至最小體積、用3～8倍無(wú)水乙醇沉淀，冷凍干燥得羊棲菜粗多糖，得率為15.01％。
(3)羊棲菜粗多糖用適量水復(fù)溶，然后加入4mol/L CaCl2溶液，離心，收集上清液。上清液經(jīng)減壓濃縮至最小體積，加入乙醇至溶液中乙醇濃度為30～40％，靜置后離心。離心后去沉淀，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇濃度為85～90％，離心得到沉淀，得率為3.63％。
(4)取沉淀0.15g溶于水，按Sevag法(氯仿∶正丁醇＝4∶1)脫游離蛋白，重復(fù)5次后，以DEAE-cellulose為載體柱層析，依次用0.3mol/LNaCl、0.6mol/L NaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集各洗脫液，各洗脫液透析、減壓濃縮、冷凍干燥得固體物。
(5)將上述經(jīng)0.9mol/LNaCl洗脫所得的固體物80-100mg溶于水，再進(jìn)一步用SepharoseCL-6B柱層析純化，流動(dòng)相為0.05mol/LNaCl溶液，流出液經(jīng)透析、減壓濃縮、冷凍干燥后得白色粉末狀羊棲菜多糖SFP-I，得率為0.22％。
實(shí)施例2 羊棲菜多糖SFP-I對(duì)2215細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA的抑制作用
2215細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA提取在25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2215細(xì)胞，接種后24h加入羊棲菜多糖，設(shè)5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml及細(xì)胞對(duì)照各1瓶。加藥后培養(yǎng)12d(每4d換藥液1次)，取細(xì)胞對(duì)照及羊棲菜多糖各濃度處理細(xì)胞各1瓶，每瓶加細(xì)胞裂解液600μL，經(jīng)37℃、2d裂解，11000g離心10min，吸取上清，加蛋白酶K至終濃度100μg/ml，56℃保存2h，收取上清，加等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1(V/V)，抽提2次，每次10min，10000g離心2min后，取上清，加兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA，真空抽干，重溶于TE緩沖液中作為樣品。將提取得到的DNA稀釋成6個(gè)稀釋度，即1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，用HBV-DNA探針作斑點(diǎn)雜交，用酶標(biāo)儀測(cè)定各點(diǎn)OD(570nm)值，計(jì)算不同濃度羊棲菜多糖對(duì)2215細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA的抑制率。HBV-DNA全基因探針的制備及膜的雜交、顯色均使用地高辛試劑盒。HBV-DNA全基因由大腸桿菌Am12經(jīng)EcoR酶切獲得。
用羊棲菜多糖SFP-I的3個(gè)稀釋濃度5.0mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml處理2215細(xì)胞，第12d分別提取DNA，稀釋成6個(gè)稀釋度，即1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，用HBV-DNA探針作斑點(diǎn)雜交，用酶標(biāo)儀測(cè)定各點(diǎn)OD(570nm)值，分析比較每批實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表1所示。
表1 斑點(diǎn)雜交結(jié)果HBV-DNA檢測(cè)多糖濃度(mg/ml)細(xì)胞對(duì)照稀釋倍數(shù) 項(xiàng)目 52.5 1.25OD 0.36 0.44 0.65 0.56 0.68 0.70 0.86 0.791/2抑制率 60.90 55.71 37.60 42.30 17.58 19.90 - -1/4 OD 0.25 0.33 0.40 0.40 0.45 0.56 0.61 0.73
抑制率59.7057.9843.00 49.08 31.80 29.70- -OD0.23 0.24 0.280.310.450.53 0.46 0.521/8抑制率61.3068.7038.80 47.50 21.60 16.53- -OD0.11 0.16 0.120.150.270.31 0.34 0.211/16抑制率65.1459.2247.15 50.19 12.14 -- -OD0.12 0.09 0.130.120.140.21 0.22 0.311/32抑制率48.9064.2022.20 61.30 27.80 32.30- -OD0.09 0.05 0.130.050.170.09 0.14 0.161/64抑制率62.7172.8047.62 64.30 - 22.90- -X 59.7863.1039.39 52.45 15.57 20.23- -由表1可知，羊棲菜多糖SFP-I5mg/ml組HBV-DNA與細(xì)胞對(duì)照組HBV-DNA比較，平均抑制率達(dá)61.44％；2.5mg/ml組抑制率達(dá)45.92％；1.25mg/ml組抑制率為17.9％。由此說(shuō)明羊棲菜多糖在2215細(xì)胞中無(wú)毒濃度條件下可抑制HBV-DNA的復(fù)制，抑制作用呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種羊棲菜多糖SFP-I，其特征在于含有巖藻糖、半乳糖、木糖，其摩爾比為1∶0.4∶0.39，不含蛋白質(zhì)，分子量為1.2×105，糖鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)以-3-a-L-Fuc-(1，4)-a-L-Fuc-(1-殘基形成主鏈，其重復(fù)單元結(jié)構(gòu)為
2.權(quán)利要求1所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其步驟如下所示(1)取羊棲菜加水浸提，超濾水浸提液，收集被截留部分，減壓濃縮、用無(wú)水乙醇沉淀，冷凍干燥得羊棲菜粗多糖；(2)將羊棲菜粗多糖加水復(fù)溶，然后加入CaCl2溶液，離心，收集上清液；(3)上清液經(jīng)減壓濃縮，再加入乙醇，離心；(4)離心后取上清液，上清液中再加入乙醇，離心取沉淀物；(5)將沉淀物溶于水，按Sevag法脫游離蛋白，以DEAE-cellulose為載體柱層析，依次用0.3mol/L NaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集各洗脫液，各洗脫液透析、減壓濃縮、冷凍干燥得固體物；(6)將上述經(jīng)0.9mol/LNaCl洗脫所得的固體物溶于水，再進(jìn)一步用SepharoseCL-6B柱層析純化，流動(dòng)相為0.05mol/LNaCl溶液，流出液經(jīng)透析、減壓濃縮、冷凍干燥后得白色粉末狀羊棲菜多糖SFP-I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特征在于步驟(1)所述的超濾水浸提液是用分子量為100000的超濾膜超濾水浸提液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特征在于步驟(1)所述無(wú)水乙醇的用量是減壓濃縮后物體體積的3～8倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特征在于步驟(2)所述CaCl2溶液的濃度為4mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特征在于步驟(3)中上清液經(jīng)減壓濃縮，再加入乙醇，使溶液中乙醇濃度為30～40％。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特征在于步驟(4)中，離心后取上清液，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇濃度為85～90％。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特征在于步驟(5)所述的Sevag法中，氯仿和正丁醇的體積比為4∶1。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特征在于步驟(6)中所述的固體物用量為80～100mg。
10.權(quán)利要求1所述的羊棲菜多糖SFP-I在制備用于抗乙肝病毒的藥物或保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羊棲菜多糖SFP－I。本發(fā)明的羊棲菜多糖SFP－I，是一種以巖藻糖為主的雜多糖，單體組成含有巖藻糖、半乳糖、木糖，這三種單糖的摩爾比為1∶0.4∶0.39，不含蛋白質(zhì)，其分子量為1.2×10
文檔編號(hào)A61P1/16GK1651469SQ200410077730
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者李亞娜, 林永成, 佘志剛, 袁長(zhǎng)青 申請(qǐng)人:中山大學(xué)