一種采用酶法提取集成絮凝技術(shù)純化草本植物多糖的方法
【專利說(shuō)明】一種采用酶法提取集成絮凝技術(shù)純化草本植物多糖的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種從草本植物中提取并純化植物多糖的方法，特別是涉及一種從中藥川牛膝中提取純化川牛膝多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]近年來(lái)研宄發(fā)現(xiàn)，多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤等藥理作用，可作為各種藥物和保健品的有效成分，對(duì)于預(yù)防和治療包括癌癥在內(nèi)的多種疾病都具有巨大潛力。
[0004]川牛膝是川產(chǎn)道地藥材之一，為莧科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan )的干燥根，具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋的功效。現(xiàn)代藥理研宄表明川牛膝中的主要化學(xué)成分有蛻皮留酮類、皂苷類、異黃酮類、脂肪酸類以及多糖類化合物等，其中，川牛膝多糖作為有效成分之一，已被證明可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、提高免疫力，發(fā)展前景十分廣闊。
[0005]由于植物類中藥有效成分復(fù)雜，怎樣從中有效獲取純度高的活性有效成分成為了工藝研宄工作者面對(duì)的重要課題，也是提高中藥療效、有效減少副反應(yīng)的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的提取技術(shù)，普遍存在提取效率低、能耗高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)；傳統(tǒng)的純化方法一一醇沉法則存在工藝流程長(zhǎng)、醇消耗量大、成本高等問(wèn)題。因此，一些新型、高效的提取分離純化技術(shù)，在近年的中藥研宄中陸續(xù)顯現(xiàn)出各自的優(yōu)勢(shì)。
[0006]植物細(xì)胞壁主要是由纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)。酶反應(yīng)具有高度專一性，采用合適的酶作為浸提輔助劑可以使細(xì)胞壁的組成成分進(jìn)行水解或降解，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使有效成分暴露、溶解、混懸或膠溶于溶劑中，從而有效提高提取效率。酶法提取因其區(qū)別于傳統(tǒng)提取工藝的反應(yīng)特異性強(qiáng)、條件溫和、提取時(shí)間短、提取率高、綠色節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，已成為中藥多糖提取的重要手段。
[0007]絮凝是指絮凝劑分子通過(guò)吸附多個(gè)微粒，形成架橋結(jié)構(gòu)，生成大顆粒，從而加速沉降使液體澄清的過(guò)程。中藥提取液中某些組分主要以帶同種Zeta電荷的膠體形式存在，在分散劑中做布朗運(yùn)動(dòng)，并具有一定的穩(wěn)定性。而絮凝過(guò)程就是通過(guò)與粒子表面發(fā)生靜電相互作用使粒子間產(chǎn)生碰撞、集聚等物理、化學(xué)途徑破壞體系的穩(wěn)定性，使提取液中的雜質(zhì)粒子沉降分離。與傳統(tǒng)方法相比，絮凝技術(shù)效率高且絮凝物易過(guò)濾，可降低成本，縮短生產(chǎn)周期，保證制劑的穩(wěn)定性與有效成分的含量。并且，多數(shù)絮凝劑主要是動(dòng)物提取物或天然食品，具有安全、無(wú)毒、易得等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種采用酶法提取集成絮凝技術(shù)純化草本植物多糖的方法，以滿足相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展的需求。
[0009]技術(shù)方案:采用生物酶輔助進(jìn)行提取，使植物細(xì)胞壁破裂分解，然后進(jìn)一步升溫回流，強(qiáng)化多糖浸出。后在提取液中加入絮凝劑進(jìn)行絮凝純化，除去高分子雜質(zhì)。具體步驟如下:
(1)將草本植物粉碎過(guò)篩，并用工業(yè)乙醇進(jìn)行回流預(yù)處理，作為后續(xù)原材料；
所述的草本植物為川牛膝；
所述的粉碎過(guò)篩后藥材粒徑為20~30目；
所述的預(yù)處理具體操作為:料液比1:5~1:20，回流l~2h，冷卻至室溫，抽濾后藥渣在65~75°C下熱風(fēng)干燥；
(2)將步驟(I)中得到的藥材顆粒按照料液比為1:40~1:60加入pH為4~6的去離子水，再加入纖維素酶，酶濃度為4~8mg/g (mg/g:酶的質(zhì)量/藥材顆粒的質(zhì)量)，酶解溫度保持在35~50°C，酶解時(shí)間為45~75min ；
(3)將步驟(2)中得到的混合物升溫至回流，提取30~90min，在室溫冷卻一段時(shí)間后置于冷水浴中冷卻，減壓抽濾，得到含有多糖的提取液；
(4)將步驟(3)中得到的提取液進(jìn)行濃縮，濃縮比4:1~12:1(mL/g:藥液體積/藥材顆粒的質(zhì)量)，并調(diào)節(jié)PH為3~7，在攪拌狀態(tài)下加入1%的殼聚糖溶液進(jìn)行絮凝純化，其中殼聚糖加入量為0.2-1.0mL/g(mL/g:殼聚糖溶液體積/藥材顆粒的質(zhì)量)，絮凝溫度為25~55°C，絮凝時(shí)間為0.5-2.5h ;將絮凝液在轉(zhuǎn)速1000r/min下離心過(guò)濾lOmin，得到純化后的多糖溶液；
(5)將步驟(4)中的多糖溶液干燥處理，即得到純度較高的草本植物多糖。
[0010]本發(fā)明集成酶法提取和絮凝純化技術(shù)提取草本植物多糖，可以提高提取效果，縮短生產(chǎn)周期，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，并且能最大限度地保持多糖活性。具體優(yōu)勢(shì)如下:
(1)本發(fā)明采用生物酶提取草本植物多糖，溶劑不涉及強(qiáng)酸強(qiáng)堿，提取時(shí)間較短，不會(huì)破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)和生物活性，有利于保持有效成分原有的藥效；
(2)雖然一些專利也采用酶法進(jìn)行有效成分提取，但純化藥液時(shí)往往采用傳統(tǒng)的醇沉工藝，相比于本發(fā)明而言耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，純化效果差；
(3)本發(fā)明的提取純化過(guò)程都是以水為溶劑，只加入少量的酶和絮凝劑，其中，絮凝劑選用的是FDA認(rèn)可的食品添加劑一一殼聚糖，整個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)經(jīng)濟(jì)環(huán)保安全。
[0011](4)本發(fā)明對(duì)影響提取分離純化的各個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，保證了草本植物多糖提取得率和純化程度的最大化。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
(1)將干燥的川牛膝粉碎至20目，按照料液比1:10在工業(yè)乙醇中回流lh，冷卻至室溫，抽濾后藥渣在75°C下熱風(fēng)干燥；
(2)稱取5g預(yù)處理后的川牛膝，置于圓底燒瓶中，加入pH為6的去離子水250mL，再加入纖維素酶20mg，混合均勻后在45°C水浴鍋中酶解75min ；
(3)將步驟(2)中得到的混合物升溫至回流，提取30min，在室溫冷卻一段時(shí)間后置于冷水浴中冷卻，減壓抽濾，得到含有川牛膝多糖的提取液，多糖得率為69.62% ；
(4)將步驟(3)中得到的川牛膝多糖提取液按照濃縮比10:1進(jìn)行濃縮，調(diào)節(jié)pH為4，在攪拌狀態(tài)下加入2mL 1%的殼聚糖溶液，恒溫45°C，絮凝1.5h ;將絮凝液在轉(zhuǎn)速1000r/min下離心過(guò)濾lOmin，得到純化后的川牛膝多糖溶液；
(5)將步驟(4)中的川牛膝多糖溶液干燥處理，即得到純化的川牛膝多糖。絮凝操作后多糖保留率為79.71%，蛋白質(zhì)脫除率為83.15%。
[0013] 實(shí)施例2
(1)將干燥的川牛膝粉碎至30目，按照料液比1:10在工業(yè)乙醇中回流lh，冷卻至室溫，抽濾后藥渣在75°C下熱風(fēng)干燥；
(2)稱取3g預(yù)處理后的川牛膝，置于圓底燒瓶中，加入pH為5的去離子水150mL，再加入纖維素酶24mg，混合均勻后在45°C水浴鍋中酶解60min ；
(3)將步驟(2)中得到的混合物升溫至回流，提取60min，在室溫冷卻一段時(shí)間后置于冷水浴中冷卻，減壓抽濾，得到含有川牛膝多糖的提取液，多糖得率為70.72% ；
(4)將步驟(3)中得到的川牛膝多糖提取液按照濃縮比8:1進(jìn)行濃縮，調(diào)節(jié)pH為4，在攪拌狀態(tài)下加入1.2mL 1%的殼聚糖溶液，恒溫45°C，絮凝0.5h ;將絮凝液在轉(zhuǎn)速100r/min下離心過(guò)濾lOmin，得到純化后的川牛膝多糖溶液；
(5)將步驟(4)中的川牛膝多糖溶液干燥處理，即得到純化的川牛膝多糖。絮凝操作后多糖保留率為86.11%，蛋白質(zhì)脫除率為70.73%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種采用酶法提取集成絮凝技術(shù)純化草本植物多糖的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將草本植物粉碎過(guò)篩，并用工業(yè)乙醇進(jìn)行回流預(yù)處理，作為后續(xù)原材料； (2)將步驟(I)中得到的藥材顆粒加入酶，并用水?dāng)嚢杌旌虾竺附庖欢〞r(shí)間； (3)將步驟(2)中得到的混合物升溫至回流，提取一段時(shí)間，冷卻至室溫后減壓抽濾，得到含有多糖的提取液； (4)將步驟(3)中得到的提取液進(jìn)行濃縮，在攪拌狀態(tài)下加入殼聚糖溶液進(jìn)行絮凝純化，然后離心，得到純化后的多糖溶液； (5)將步驟(4)中的多糖溶液干燥處理，即得到純度較高的草本植物多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(I)中粉碎過(guò)篩后的藥材粒徑為20~30目，預(yù)處理料液比為1:5~1:20，回流l~2h，冷卻至室溫，抽濾后藥渣在65~75°C下熱風(fēng)干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)中藥材顆粒的液固比為1:40~1:60，溶劑去離子水pH為4~6，酶種類為纖維素酶，酶濃度為4~8mg/g (mg/g:酶的質(zhì)量/藥材顆粒的質(zhì)量)，酶解溫度保持在35~50°C，酶解時(shí)間為45~75min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)中提取時(shí)間為30~90min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(4)中濃縮比4:1?12:1(mL/g:藥液體積/藥材顆粒的質(zhì)量)，殼聚糖加入量為0.2?1.0mL/g (mL/g為殼聚糖溶液體積/藥材顆粒的質(zhì)量)，絮凝溫度為25?55°C，藥液pH為3?7，絮凝時(shí)間為0.5?2.5h，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000r/min，離心時(shí)間為lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1~5任一所述的方法，其特征在于，所述草本植物為川牛膝。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用酶法提取集成絮凝技術(shù)純化草本植物多糖的方法，該方法包括如下內(nèi)容：在粉碎后的藥材顆粒中加入酶，用水?dāng)嚢杌旌?，酶解一定時(shí)間；將所得混合物升溫至回流，提取一段時(shí)間，冷卻至室溫后減壓抽濾，得到含有多糖的提取液；將提取液進(jìn)行濃縮，在攪拌狀態(tài)下加入殼聚糖溶液進(jìn)行絮凝純化，然后離心，得到純化后的多糖溶液，干燥后獲得純度較高的草本植物多糖。本發(fā)明采用生物酶提取技術(shù)，對(duì)草本植物細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)進(jìn)行一定程度的水解破壞，該方法提取效率高，且能最大限度保持多糖活性；絮凝劑選用的是FDA認(rèn)可的食品添加劑——?dú)ぞ厶?，能很好地除去蛋白類高分子雜質(zhì)，純化效果好，成本低廉，使整個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)經(jīng)濟(jì)環(huán)保安全。
【IPC分類】C08B37-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104558232
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510017963
【發(fā)明人】韓偉, 劉傲霞, 谷旭晗, 成悅, 夏玉婷, 羅文鋒, 滿寧
【申請(qǐng)人】華東理工大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月14日