專利名稱：黃烷酮類糖苷及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃烷酮類糖苷。
背景技術(shù)：
黃酮類糖苷是一類廣泛存在于自然界的天然有機化合物，它們具有一系列重要的生理活性，例如3-糖基黃烷酮類糖苷可用于治療多種心血管類疾病，還可用作免疫性抑制劑。3，7，3’，4’-四羥基-3-L-鼠李吡喃糖基黃烷酮(Astilbin)及其類似物5，7，3’，5’-四羥基-3-L-鼠李吡喃糖基黃烷酮(Smitilibin)等3-糖基黃烷酮類糖苷在整體疾病模型上或細(xì)胞模型上顯示出選擇性的免疫抑制效應(yīng)，且無現(xiàn)有藥物常見的毒副作用。
然而，由于合成黃酮類糖苷的有效方法很少，大多數(shù)黃酮類糖苷主要依靠天然提取。迄今為止，已見報道的黃酮類糖苷的合成方法有以下三種方法一Horhammer和Wagner(1968)首次報道了7，4’-二芐氧基櫟精和α-乙酰溴葡萄二糖在Koenigs-Knorr的反應(yīng)條件下，以Ag2O作催化劑合成黃酮類糖苷
方法二Demetzos等(1990)報道了以4’，7-二芐氧基-3-羥基黃酮和α-乙酰溴葡萄吡喃糖為原料，在氯仿-氫氧化鉀水溶液中，用三乙基芐基溴化銨(TEBA)作相轉(zhuǎn)移催化劑合成黃酮類糖苷 方法三Ken Ohmori等于2000年報道了黃烷酮類糖苷的又一制備方法，其合成路線如下 以上這三種方法均存在有一定的局限性，方法一由于體系中有高濃度銀鹽使反應(yīng)后處理較困難；方法二的反應(yīng)時間長；方法三的反應(yīng)步驟多。

發(fā)明內(nèi)容
一類黃烷酮類糖苷化合物，它有如下結(jié)構(gòu)通式 R1＝H或 或HR3＝H或AcR4＝H、OH或OAc上述的糖苷化合物，其特征是當(dāng)R1＝H時， R3＝H或Ac，R4＝H、OH或OAc。
上述的糖苷化合物，其特征是
當(dāng) 時，R2＝H，R3＝H或Ac，R4＝H、OH或OAc。
一種上述黃烷酮類糖苷化合物的制法，它由下列步驟組成步驟一、將羥基黃烷酮與2，3，4-三乙?；?1-氧-L-鼠李吡喃糖基三氯乙亞胺或2，3，4，6-四乙酰基-1-氧-D-葡萄吡喃糖基三氯乙亞胺混合，經(jīng)真空干燥后，在混合物中加入無水二氯甲烷，體系經(jīng)液氮-乙醇浴冷卻至-42～-78℃，在氮氣保護(hù)下滴入三氟甲磺酸三甲硅酯，加畢，去冷浴，反應(yīng)體系逐漸回到室溫，用薄層層析監(jiān)測反應(yīng)完成后，體系中加入三乙胺終止反應(yīng)，減壓蒸去溶劑后得棕黃色粘稠狀液體，經(jīng)柱層析分離純化，得白色固體，步驟二、將步驟一得的白色固體溶于甲醇，通入氨氣至飽和，室溫下放置，薄層層析檢測體系中已無原料，減壓蒸去溶劑，得桔黃色至橙紅色固體或粘稠狀液體，柱層析分離純化，得白色固體，即為本發(fā)明的黃烷酮類糖苷化合物。
本發(fā)明的黃烷酮類糖苷化合物對于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)有明顯的抑制作用，對于經(jīng)2，4，6-三硝基氯苯和綿羊紅細(xì)胞活化的脾細(xì)胞有一定誘導(dǎo)其凋亡的活性，對于PCl-CS模型小鼠脾細(xì)胞分泌NO也有顯著的抑制作用。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的黃烷酮類糖苷化合物可以用于制備免疫抑制劑或治療包括器官移植、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎炎等自身免疫性疾病以及變態(tài)反應(yīng)性疾病等各種免疫性疾病的藥物。
具體實施例方式
實施例一、6-L-鼠李吡喃糖基黃烷酮(IV)的制備
1.6-(2，3，4-三乙?；?L-鼠李吡喃糖基)黃烷酮(III)的制備6-羥基黃烷酮(I)(0.484g，2.017mmol)和2，3，4-三乙?；?1-氧-L-鼠李吡喃糖基三氯乙亞胺(II)(0.884g，2.035mmol)混合，經(jīng)真空干燥2h后，混合物中加入54ml無水CH2Cl2，體系經(jīng)液氮-乙醇浴冷卻至-42℃，N2保護(hù)下滴入三氟甲磺酸三甲硅酯46μl，加畢，去冷浴，反應(yīng)體系逐漸回到室溫，總反應(yīng)時間約需3h，薄層層析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，體系中加入三乙胺終止反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去溶劑后得棕黃色粘稠狀液體，經(jīng)柱層析分離純化(淋洗劑為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1))得淡黃色固體0.370g，m.p.65～67℃，收率35.83％?；衔锝?jīng)1H-NMR、13C-NMR、IR及元素分析進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗證，結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)正確，數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300MHz，CDCl3)7.63(t，1H，J＝2.55Hz) 7.50～7.40(m，5H) 7.27～7.23(m，H)7.03(d，1H，J＝8.99Hz) 5.52～5.44(m，4H) 5.17(t，1H，J＝9.90Hz)4.02～3.97(m，1H) 3.13～2.86(m，2H) 2.21(s，3H) 2.07(s，3H) 2.04(s，3H)1.23(d，3H，J＝6.21Hz)13C-NMR(75MHz，CDCl3)191.91 170.46 170.40 170.34 157.73 150.65 150.59 139.06 139.04 129.24129.19 126.52 121.52 119.91 113.02 112.99 96.55 96.53 80.13 80.12 71.2969.97 69.23 67.69 44.91 44.89 21.26 21.16 21.11 17.82
IR(KBr)；cm-12984.91，2939.81，1750.13，1693.00，1616.93，1484.09，1437.13，1371.72，1278.03，1248.04，1223.08，1129.91，1056.22，984.37，905.02，828.42，813.72，762.52，699.87元素分析結(jié)果計算值C(％)63.28 H(％)5.47實測值C(％)65.31 H(％)5.402.6-L-鼠李吡喃糖基黃烷酮(IV)的制備化合物(III)(0.318g，0.621mmol)與CH3OH 20ml混合后，通入NH3至飽和，室溫下放置48h后，薄層層析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶5)監(jiān)測體系中已無原料，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去溶劑得桔黃色固體，經(jīng)柱層析分離純化得白色固體0.163g，m.p.72～73℃，收率68.00％?；衔锝?jīng)1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗證，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)正確，數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)7.54(d，2H，J＝7.73Hz) 7.48～7.41(m，4H) 7.31～7.27(m，1H)7.06(d，1H，J＝8.96Hz) 5.64～5.58(m，1H) 5.32(m，1H) 5.05(d，1H，J＝4.15Hz)4.88(d，1H，J＝5.57Hz) 4.75(d，1H，J＝5.18Hz) 3.85(m，1H) 3.66～3.63(m，1H)3.52～3.46(m，1H) 3.34～3.17(m，2H) 2.84～2.79(m，1H) 1.11(d，3H，J＝6.10Hz)13C-NMR(300MHz，DMSO-D6)192.30 157.20 157.18 151.21 151.17 139.81 129.39 127.43 127.12 127.07121.63 120.15 112.83 100.01 79.74 79.71 72.65 71.27 70.98 70.41 44.2918.74IR(KBr)；cm-13406.51，2931.66，1689.38，1617.28，1484.49，1437.19，1280.05，1219.42，1197.94，1123.74，1060.04，1020.05，982.68，911.92，808.63，760.72，698.22元素分析結(jié)果計算值C(％)65.28 H(％)5.70
實測值C(％)65.12 H(％)5.72實施例二、6-D-葡萄吡喃糖基黃烷酮(VII)的制備 1.6-(2，3，4，6-四乙酰基-D-葡萄吡喃糖基)黃烷酮(VI)的制備6-羥基黃烷酮(I)(0.507g，2.113mmol)和2，3，4，6-四乙?；?1-氧-D-葡萄吡喃糖基三氯乙亞胺(V)(1.040g，2.111mmol)混合，經(jīng)真空干燥2h后，混合物中加入70ml無水CH2Cl2，體系經(jīng)液氮-乙醇浴冷卻至-78℃，N2保護(hù)下滴入三氟甲磺酸三甲硅酯45μl，加畢，去冷浴，反應(yīng)體系逐漸回到室溫，總反應(yīng)時間約需3h，薄層層析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，體系中加入三乙胺終止反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去溶劑后得棕黃色粘稠狀液體，經(jīng)柱層析分離純化(淋洗劑為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)得淡黃色固體0.610g，m.p.124～126℃，收率50.66％?；衔锝?jīng)1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗證，結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)正確，數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300MHz，CDCl3)7.54～7.41(m，6H) 7.23～7.19(m，1H) 7.03(d，1H，J＝8.96Hz) 5.50～5.44(m，1H)5.35～5.24(m，2H) 5.18～5.13(m，1H) 5.09～5.07(m，1H) 4.30～4.19(m，2H)3.94～3.91(m，1H) 3.09～2.88(m，2H) 2.15(s，3H) 2.10(s，3H) 2.08(s，3H)2.06(s，3H)13C-NMR(300MHz，CDCl3)
191.83 171.21 170.59 169.84 169.70 158.13 151.67 138.91 129.26 127.53127.45 126.53 126.51 126.49 119.94 113.01 112.99 99.85 99.79 80.14 80.1177.84 77.41 76.99 73.09 72.63 71.52 68.66 62.38 44.83 44.75 30.08 21.0921.05 20.99IR(KBr)；cm-12920.06，2850.81，1751.65，1686.55，1616.44，1484.85，1438.18，1375.98，1319.17，1284.75，1237.05，1088.86，1067.57，1035.30，904.69，864.67，841.50，801.22，765.85，700.62元素分析結(jié)果計算值C(％)61.05 H(％)5.26實測值C(％)61.07 H(％)5.412.6-D-葡萄吡喃糖基黃烷酮(VII)的制備化合物(VI)(0.525g，0.921mmol)與CH3OH 20ml混合后，通入NH3至飽和，室溫下放置48h后，薄層層析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶6)監(jiān)測體系中已無原料，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去溶劑得橙黃色固體，經(jīng)柱層析分離純化得白色固體0.223g，m.p.98～100℃，收率60.24％?；衔锝?jīng)1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗證，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)正確，數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300MHz，MeOH-D4)7.56～7.55(m，1H) 7.53～7.51(d，2H，J＝7.55Hz) 7.43～7.41(t，2H，J＝7.50Hz)7.38～7.36(m，2H) 7.04(d，1H，J＝9.05Hz) 5.53～5.50(dd，1H，J＝2.83，12.95Hz)4.88～4.86(m，1H) 3.92～3.89(m，1H) 3.75～3.72(m，1H) 3.50～3.41(m，4H)3.13～2.83(m，2H)13C-NMR(300MHz，MeOH-D4)192.92 152.54 139.52 128.69 128.59 126.78 126.75 126.36 121.14 119.28112.97 102.07 79.94 77.10 76.90 73.86 70.22 61.39 44.33 44.31IR(KBr)；cm-13406.31，2887.64，1686.76，1617.08，1485.34，1439.05，1284.11，1220.32，1199.77，1076.02，900.76，827.82，797.67，760.23，698.04元素分析結(jié)果計算值C(％)62.69 H(％)5.47
實測值C(％)62.47 H(％)5.52實施例三、3-L-鼠李吡喃糖基黃烷酮(XII)的制備 1.3-羥基-4-黃烷酮二甲基縮醛(IX)的制備黃烷酮(VIII)(4.48g，0.02mol)與100ml絕對無水甲醇混合，冷卻至0℃，滴入氫氧化鉀(3.36g，0.06mol)與50ml甲醇的混合溶液，溶液呈棕黃色，攪拌下分批加入(分4～5份)碘苯二醋酸鹽(C6H5IO(Ac)2，7.0g，0.02mol)，時間約5分鐘，混合物在0℃下攪拌1小時后，撤去冰浴，室溫下攪拌過夜。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使脫去甲醇后，體系中加入100ml水及碳酸鉀中和，用乙醚萃取5次，每次約40ml。合并有機相，無水硫酸鎂干燥，過濾除去干燥劑后，溶液濃縮得無色固體，經(jīng)乙醚重結(jié)晶后得白色針狀晶體2.863g，m.p.92～94℃，收率50.06％。
1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)7.58～7.44(m，3H) 7.44～7.29(m，4H) 6.97～6.93(m，2H) 5.37(m，1H) 5.06(d，1H)3.99(m，1H) 3.36(s，3H) 3.12(s，3H)13C-NMR(75MHz，DMSO-D6)154.92 139.68 130.37 129.20 128.71 128.37 127.95 120.52 119.99 117.0097.30 78.66 67.44 67.33 49.05 48.77
2.3-羥基-4-黃烷酮(X)的制備3-羥基-4-黃烷酮二甲基縮醛(IX)(1.43g，0.005mol)與30ml乙醇混合，體系中加入10ml 3N鹽酸，室溫下攪拌30分鐘后，加入50ml水，繼續(xù)攪拌反應(yīng)15分鐘，加入固體碳酸鉀中和，用乙醚萃取4次，每次20ml，合并乙醚相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，脫去溶劑得白色絮狀固體1.187g，m.p.73～76℃，收率98.90％。
1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)7.86～7.82(dd，1H，J＝1.65，7.75Hz) 7.61～7.56(m，3H) 7.43～7.35(m，3H)7.16～7.13(m，2H) 5.66(d，1H，J＝2.40Hz)) 4.28(d，1H，J＝2.40Hz)13C-NMR(75MHz，DMSO-D6)192.31 161.48 137.38 136.98 128.86 128.15 127.79 122.39 120.06 119.27118.70 82.05 72.413.3-(2，3，4-三乙酰基-L-鼠李吡喃糖基)黃烷酮(XI)的制備3-羥基黃烷酮(X)(2.880g，0.012mol)和2，3，4-三乙?；?1-氧-α-L-鼠李吡喃糖基三氯乙亞胺(II)(5.638g，0.013mol)混合，經(jīng)真空干燥2h后，混合物中加入160ml無水CH2Cl2，體系經(jīng)液氮-乙醇浴冷卻至-42℃，N2保護(hù)下滴入三氟甲磺酸三甲硅酯298μl，加畢，去冷浴，反應(yīng)體系逐漸回到室溫，總反應(yīng)時間約需3h，薄層層析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，體系中加入三乙胺終止反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去溶劑后得棕黃色粘稠狀液體，經(jīng)柱層析分離純化(淋洗劑為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1))得白色固體4.678g，m.p.68～70℃，收率76.14％?；衔锝?jīng)1H-NMR、13C-NMR、IR及元素分析進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗證，結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)正確，數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300MHz，CDCl3)7.96～7.92(m，1H) 7.61～7.54(m，3H) 7.50～7.34(m，3H) 7.14～7.08(m，2H)5.53(d，0.4H，J＝1.97Hz) 5.42(d，0.6H，J＝1.73Hz) 5.15～4.74(m，3H)4.20～4.17(m，2H) 3.73～3.68(m，1H) 2.10～1.92(s，9H) 1.03(d，2H，J＝6.22Hz)0.78(d，1H，J＝6.22Hz)
13C-NMR(75MHz，CDCl3)189.12 188.69 170.27 170.19 170.16 170.12 170.08 169.87 161.71 161.62137.14 137.03 136.22 135.38 129.28 129.19 129.09 128.81 128.16 128.07127.20 127.00 122.53 122.43 119.56 119.11 118.69 118.66 98.54 93.3581.87 81.46 77.80 73.90 71.13 0.77 69.55 69.32 69.20 69.08 67.61 66.7521.09 21.02 20.99 17.52 17.23IR(KBr)；cm-12984.81，1749.66，1693.84，1609.02，1576.71，1466.32，1370.97，1311.21，1225.54，1139.16，1080.47，1039.88，982.78，918.12，883.86，839.61，763.54，699.29元素分析結(jié)果計算值C(％)63.28 H(％)5.47實測值C(％)65.22 H(％)5.514.3-L-鼠李吡喃糖基黃烷酮(XII)的制備化合物(XI)(0.605g，1.182mmol)與CH3OH 25ml混合后，通入NH3至飽和，室溫下放置48h后，薄層層析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶5)監(jiān)測體系中已無原料，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去溶劑得橙紅色粘稠狀液體，經(jīng)柱層析分離純化得白色固體0.331g，m.p.82～84℃，收率72.59％。化合物經(jīng)1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗證，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)正確，數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300MHz，MeOH-D4)7.86～7.83(m，1H) 7.59～7.53(m，3H) 7.48～7.40(m，3H) 7.13～7.03(m，2H)5.33(d，0.5H，J＝11.21Hz) 5.24(d，0.5H(J＝11.85Hz) 5.14(d，0.5H，J＝1.37Hz)4.73(d，0.5H，J＝11.90Hz) 4.69(d，0.5H，J＝11.31Hz) 4.29～4.20(m，0.5H)4.06～4.04(dd，0.5H，J＝1.63，3.20Hz) 3.91(d，0.5H，J＝1.29Hz)3.68(dd，0.5H，J＝3.30，9.58Hz) 3.47(dd，0.5H，J＝1.61，3.18Hz) 3.36～3.28(m，1H)3.19(t，0.5H，J＝9.58Hz) 2.05～1.94(m，0.5H) 1.18(d，1.5H，J＝6.20Hz)0.82(d，1.5H，J＝6.18Hz)13C-NMR(300MHz，MeOH-D4)
193.50 191.66 161.54 161.32 137.69 136.92 136.71 136.55 129.34 129.24128.75 128.73 127.78 127.68 127.21 127.06 122.14 122.08 120.42 120.08117.99 117.96 101.48 101.33 83.37 83.00 79.25 76.90 72.71 72.16 71.1470.92 70.87 70.67 69.62 69.09 17.06 16.91IR(KBr)；cm-13420.98，2931.80，1689.90，1607.95，1467.08，1382.48，1311.80，1231.90，1136.59，1100.63，1061.22，1028.71，980.16，838.96，796.89，761.66，696.77元素分析結(jié)果計算值C(％)65.28 H(％)5.70實測值C(％)65.37 H(％)5.85實施例四、3-D-葡萄吡喃糖基黃烷酮(XIV)的制備 1.3-(2，3，4，6-四乙?；?D-葡萄吡喃糖基)黃烷酮(XIII)的制備3-羥基黃烷酮(X)(1.448g，6.033mmol)和2，3，4，6-四乙?；?1-氧-D-葡萄吡喃糖基三氯乙亞胺(V)(2.983g，6.033mmol)混合，經(jīng)真空干燥2h后，混合物中加入80ml無水CH2Cl2，體系經(jīng)液氮-乙醇浴冷卻至-78℃，N2保護(hù)下滴入三氟甲磺酸三甲硅酯150μl，加畢，去冷浴，反應(yīng)體系逐漸回到室溫，總反應(yīng)時間約需3h，薄層層析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，體系中加入三乙胺終止反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去溶劑后得棕黃色粘稠狀液體，經(jīng)柱層析分離純化(淋洗劑為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)得白色固體2.792g，m.p.158～160℃，收率81.19％?；衔锝?jīng)1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗證，結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)正確，數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300MHz，CDCl3)7.85(d，1H，J＝7.43Hz) 7.58～7.51(m，3H) 7.45～7.38(m，3H)7.11(d，2H，J＝7.84Hz) 5.40(s，1H) 5.09～4.89(m，3H) 4.59(d，1H，J＝8.03Hz)4.08～4.01(m，3H) 3.60～3.57(m，1H) 2.12(s，3H) 2.01(s，3H) 1.95(s，3H)1.56(s，3H)13C-NMR(300MHz，CDCl3)190.42 170.99 170.49 169.66 169.14 161.04 136.55 135.69 128.97 128.82127.87 127.50 122.26 118.37 100.70 81.48 80.70 73.30 72.27 71.10 68.5861.98 21.08 20.87 20.59IR(KBr)；cm-12955.16，1744.74，1703.47，1608.84，1464.93，1375.87，1313.02，1229.13，1056.85，928.81，762.41，741.64，701.54元素分析結(jié)果計算值C(％)61.05 H(％)5.26實測值C(％)60.98 H(％)5.412.3-D-葡萄吡喃糖基黃烷酮(XIV)的制備化合物(XIII)(0.174g，0.305mmol)與CH3OH 20ml混合后，通入NH3至飽和，室溫下放置48h后，薄層層析(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶6)監(jiān)測體系中已無原料，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去溶劑得橙黃色固體，經(jīng)柱層析分離純化得白色固體0.107g，m.p.85～87℃，收率87.00％?；衔锝?jīng)1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗證，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)正確，數(shù)據(jù)如下1H-NMR(300MHz，MeOH-D4)7.87～7.84(m，1H) 7.64～7.53(m，3H) 7.42～7.30(m，3H) 7.13～7.00(m，2H)5.49(t，1H，J＝10.04Hz) 5.12～5.07(dd，1H，J＝3.88，10.04Hz)4.74～4.65(d，0.5H，J＝7.76Hz) 3.82～3.71(m，1.5H) 3.61～3.46(m，1H)3.44～3.07(m，4H)13C-NMR(300MHz，MeOH-D4)193.04 192.77 161.47 161.44 136.97 136.93 136.66 136.06 128.82 128.58128.27 128.22 128.14 128.10 127.84 127.24 121.99 120.32 120.09 118.02117.95 103.20 101.78 83.12 82.86 77.57 77.53 77.17 76.87 76.81 76.5074.41 73.45 70.47 70.18 61.89 61.58IR(KBr)；cm-13407.03，2887.76，1691.68，1607.45，1579.56，1465.25，1327.68，1284.52，1234.35，1151.84，1076.04，1023.71，870.66，761.15，697.94元素分析結(jié)果計算值C(％)62.69 H(％)5.47實測值C(％)62.55 H(％)5.38實施例五、藥理試驗一、本發(fā)明的黃酮苷類化合物對單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(sMLR)的影響取BALB/c及C57BL/6小鼠，按常規(guī)無菌制備脾細(xì)胞。即無菌取出小鼠脾臟，置于冷的5ml Hank’s液中，小心擠壓獲得脾細(xì)胞懸液，300g離心5min后，用0.17M Tris-0.75％NH4Cl去除紅細(xì)胞，再用冷的RPMI-1640(GIBCO)培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素和10％滅活無菌的新生牛血清)洗滌兩次。將來自C57BL/6的脾細(xì)胞用1×10-6g/ml的絲裂霉素C處理1h后，用冷的RPMI-1640洗兩遍，配成2×106cells/ml的細(xì)胞懸液。BALB/c小鼠的脾細(xì)胞配成2×107cells/ml的細(xì)胞懸液。將來自BALB/c小鼠的脾細(xì)胞50μl(1×106)與絲裂霉素C處理的C57BL/6的脾細(xì)胞50μl(1×105)混合培養(yǎng)96h，用MTT法檢測細(xì)胞增殖。即在終止培養(yǎng)前4h向細(xì)胞中加入20μl MTT(5mg/ml)培養(yǎng)基溶液，培養(yǎng)結(jié)束后，300g離心10min，棄上清，加入200μl二甲亞砜，振蕩，使沉淀完全溶解，540nm處測吸光度。刺激指數(shù)(SI)按下面公式計算SI＝(ODC57+BALB/c-ODC57 alone)/ODBALB/c alone結(jié)果如表1所示，astilbin在高濃度顯著抑制了混合淋巴細(xì)胞的增殖，化合物XII也有明顯的抑制作用，而化合物IV，VII表現(xiàn)出一定的抑制趨勢。其中，astilbin和化合物XII作用最強，化合物IV，XIV，VII的作用均較弱。
表1 藥物對sMLR的影響Control10e-7 10e-6 10e-5astilbin 2.04±0.671.47±0.53*2.07±0.64XII 2.54±0.561.83±0.35*1.83±0.59IV 2.87±0.373.19±0.502.29±0.35 1.99±0.45XIV 2.02±0.832.20±0.99 2.34±1.07VII 2.01±0.651.99±0.58 1.90±0.52*P＜0.05 vs control.藥物濃度為g/ml。
二、本發(fā)明的黃酮苷類化合物對2，4，6-三硝基氯苯(PCl)所致小鼠耳腫脹及綿羊紅細(xì)胞所致小鼠足腫脹模型中脾細(xì)胞凋亡的影響2，4，6-三硝基氯苯(PCl)所致小鼠耳腫脹(PCl-CS)小鼠剃去腹毛，涂1％PCl的無水乙醇溶液100μl致敏，5d后用1％PCl的橄欖油溶液30μl涂于右耳兩面進(jìn)行攻擊，6h后無菌取脾細(xì)胞，與不同濃度藥物于37℃共孵。
綿羊紅細(xì)胞所致小鼠足腫脹(SRBC-DTH)在無菌的條件下將SRBC用生理鹽水洗三次，洗滌完畢后配成2.5×108/ml的生理鹽水溶液，在小鼠左后足趾皮下注射該溶液40μl致敏，5d后在右后足趾皮下注射濃度為2.5×109/ml SRBC的生理鹽水溶液40μl進(jìn)行攻擊，6h后無菌取脾細(xì)胞，與不同濃度藥物于37℃共孵。
PI染色用流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡常規(guī)制備正常及各種不同活化狀態(tài)的小鼠脾細(xì)胞，與不同濃度藥物于37℃共孵12h，離心收獲細(xì)胞，PBS洗兩次，加入PI(100μg/ml)100μl，RNAse(100μg/ml)1μl，Triton X-100(1％)1μl，室溫下避光作用40min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，CELLQuest軟件分析subG1峰比例(細(xì)胞凋亡百分率)。
結(jié)果如表2所示，與對照組相比，astilbin和化合物XII均明顯誘導(dǎo)了來自2，4，6-三硝基氯苯和綿羊紅細(xì)胞活化的脾細(xì)胞的凋亡，化合物XII的作用與astilbin相當(dāng)。
表2 藥物誘導(dǎo)來自2，4，6-三硝基氯苯和綿羊紅細(xì)胞活化的脾細(xì)胞的凋亡細(xì)胞凋亡百分率(％) PCl-CS SRBC-DTHControl 10.9 20.2Astilbin23.1 32.6XII 21.4 31.9三、本發(fā)明的黃酮苷類化合物對2，4，6-三硝基氯苯所致小鼠耳腫脹(PCl-CS)模型小鼠脾細(xì)胞分泌NO水平的影響細(xì)胞上清中NO的測定采用Griess法。待測上清與Griess液(1％磺胺，0.1％N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，2.5％磷酸)等體積混合，室溫放置10min，檢測540nm處的吸光度。以亞硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
造PCl-CS小鼠模型，取攻擊后6h的脾細(xì)胞，調(diào)成5×105cells/孔種于96孔板，在不同濃度藥物及空白培養(yǎng)基溶液的共存下置37℃，5％ CO2，培養(yǎng)72h，300g離心10min后，吸取上清用Griess反應(yīng)檢測培養(yǎng)上清中NO水平。
結(jié)果如表3所示，PCl-CS模型小鼠脾細(xì)胞較正常小鼠脾細(xì)胞釋放了更多的NO，astilbin及化合物XII均顯著抑制了脾細(xì)胞釋放NO的水平。其中，化合物XII的作用最強。
表3 藥物對PCl-CS小鼠脾細(xì)胞分泌NO的影響NO(uM) NormalControl10e-6 10e-5 10e-4astilbin 70.4±13.255.3±5.0*48.4±12.6**XII84.2±6.6 59.7±5.8*43.3±9.3**IV17.5±8.6 89.9±8.777.9±13.272.3±10.569.1±2.9*XIV84.2±3.9 70.4±3.8 66.6±8.2*VII80.4±7.1 82.3±7.1 79.2±5.8*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.藥物濃度為g/ml。
綜上所述，本發(fā)明的黃酮苷類化合物XII對于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)有明顯的抑制作用，對于經(jīng)2，4，6-三硝基氯苯和綿羊紅細(xì)胞活化的脾細(xì)胞有一定誘導(dǎo)其凋亡的活性，對于PCl-CS模型小鼠脾細(xì)胞分泌NO亦有顯著的抑制作用。這些結(jié)果表明，黃酮苷類化合物XII可作為免疫抑制劑，有可能用于治療包括器官移植、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎炎等自身免疫性疾病以及變態(tài)反應(yīng)性疾病等各種免疫性疾病。
權(quán)利要求
1.一類黃烷酮類糖苷化合物，其特征是它有如下結(jié)構(gòu)通式
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖苷化合物，其特征是當(dāng)R1＝H時， R3＝H或Ac，R4＝H、OH或OAc。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖苷化合物，其特征是當(dāng) 時，R2＝H，R3＝H或Ac，R4＝H、OH或OAc。
4.一種權(quán)利要求1所述黃烷酮類糖苷化合物的制法，其特征是它由下列步驟組成步驟一、將羥基黃烷酮與2，3，4-三乙?；?1-氧-L-鼠李吡喃糖基三氯乙亞胺或2，3，4，6-四乙?；?1-氧-D-葡萄吡喃糖基三氯乙亞胺混合，經(jīng)真空干燥后，在混合物中加入無水二氯甲烷，體系經(jīng)液氮-乙醇浴冷卻至-42～-78℃，在氮氣保護(hù)，滴入三氟甲磺酸三甲硅酯，加畢，去冷浴，反應(yīng)體系逐漸回到室溫，用薄層層析監(jiān)測反應(yīng)完成后，體系中加入三乙胺終止反應(yīng)，減壓蒸去溶劑后得棕黃色粘稠狀液體，經(jīng)柱層析分離純化，得白色固體，步驟二、將步驟一得的白色固體溶于甲醇，通入氨氣至飽和，室溫下放置，薄層層析檢測體系中已無原料，減壓蒸去溶劑，得桔黃色至橙紅色固體或粘稠狀液體，柱層析分離純化，得白色固體，即為本發(fā)明的黃烷酮類糖苷化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃烷酮類糖苷化合物在制備免疫抑制劑或治療各種免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一類黃烷酮類糖苷化合物，它有如下結(jié)構(gòu)通式本發(fā)明的黃烷酮類糖苷化合物對于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)有明顯的抑制作用，對于經(jīng)2，4，6－三硝基氯苯和綿羊紅細(xì)胞活化的脾細(xì)胞有一定誘導(dǎo)其凋亡的活性，對于PC1－CS模型小鼠脾細(xì)胞分泌NO也有顯著的抑制作用。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的黃烷酮類糖苷化合物可以用于制備免疫抑制劑或治療各種免疫性疾病的藥物。本發(fā)明公開了其制法。
文檔編號A61K31/7048GK1594346SQ20041004106
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月23日
發(fā)明者郭子建, 楊曉亮, 徐強, 孫洋, 張子超 申請人:南京大學(xué)