專利名稱：防治牙周疾病的特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治牙周疾病的特異性抗體，尤其涉及一種通過免疫接種乳牛并從其分泌的牛奶中制備對抗牙周病致病菌的特異性抗體，以及用于防治牙周疾病的方法。
發(fā)明技術(shù)背景牙周疾病是常見的口腔疾病，它是發(fā)生在牙周組織包括牙齦、牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨的疾患，是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一，也是危害人類牙齒和全身健康的主要口腔疾病。其發(fā)病率有增高趨勢。
牙周疾病是由于致病菌聚集牙周而引起，正常人體牙周圍寄居的細(xì)菌是以格蘭氏陽性菌為主，一旦格蘭氏陰性桿菌集聚繁殖，就會(huì)發(fā)生牙周疾病，最常見的格蘭氏陰性桿菌是牙齦桿菌(Bacteroides Gingivalis)、核粒梭形桿菌(Fusobacterium nucleatum)、艾肯腐蝕桿菌(Eikenella corrodens)、放線共生桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)，患有嚴(yán)重牙周疾病的成年人牙周局部絕大多數(shù)可檢測出上述細(xì)菌，而分離率最高的細(xì)菌是牙齦桿菌，對上述病人的血清進(jìn)行抗體滴度檢查，通常牙齦桿菌抗體明顯升高。
有關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給動(dòng)物接種牙齦桿菌，會(huì)增加牙周感染的程度，加重牙周疾病的病情。證明牙齦桿菌是引發(fā)牙周疾病的重要因素，牙齦桿菌的菌毛和被膜容易粘附在牙齦表面，生長繁殖，引起牙齦局部的感染和炎癥。
通過有效抑制牙齦桿菌等致病菌在牙周組織生長繁殖，對牙周疾病的預(yù)防和治療會(huì)起到良好作用，目前治療牙齦疾病采用的廣譜抗菌素雖能起到殺滅細(xì)菌的作用，但其廣譜殺菌的同時(shí)會(huì)殺死口腔中其它的正常寄生菌，而引發(fā)菌群失調(diào)或繼發(fā)真菌感染，而且長期服用抗菌素也會(huì)影響腸道菌群平衡，引起很多付作用。
采用疫苗是個(gè)可行的好辦法，但是疫苗直接應(yīng)用于人體可能存在不安全因素，眾所周知通過免疫接種乳牛，在其分泌的牛奶中制備特異性抗體是個(gè)有效的方法。
從免疫接種的乳牛的牛奶中制備某些生物活性物質(zhì)已有很多報(bào)導(dǎo)，美國專利(4324784)報(bào)導(dǎo)了治療齲齒的方法，美國專利(4636384)報(bào)導(dǎo)了從高免疫敏感狀態(tài)乳牛牛奶中制備改善心血管和肺功能的生物活性物質(zhì)的方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，通過制備疫苗，免疫接種乳牛并從其分泌的牛奶中制備治療牙周疾病的特異性抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，制備多價(jià)抗原復(fù)合疫苗，免疫接種健康乳牛，通過血清測試特異性抗體滴度，確定已產(chǎn)生特異性抗體，從收集的免疫乳牛牛奶中制備特異性抗體，應(yīng)用于預(yù)防和治療牙周疾病。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，選擇制備疫苗的細(xì)菌是與牙周疾病發(fā)病相關(guān)的致病菌，這些致病菌包括但不限于牙齦桿菌、核粒梭形桿菌、艾肯腐蝕桿菌、共生放線桿菌等格蘭氏陰性細(xì)菌，其中牙齦桿菌是所制備疫苗中必需的主要成份，而牙齦桿菌的菌毛和被膜碎片也可以考慮作為抗原成份加入疫苗中，可以采用滅活的完整細(xì)菌作為抗原，也可以將滅活的細(xì)菌用超聲粉碎后制備細(xì)菌均漿作為抗原。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，制備疫苗是采用下列方法，接種各種與牙周疾病相關(guān)的細(xì)菌在細(xì)菌培養(yǎng)基，在37℃溫度下培養(yǎng)48小時(shí)，加熱至60℃持續(xù)2小時(shí)，以殺滅致病菌，用緩沖液反復(fù)沖洗五次后離心分離收集細(xì)菌，冷凍干燥后制成干粉，等量稱取上述細(xì)菌干粉，用生理鹽水緩沖液調(diào)制成濃度為2.times.10.sup.8.cells/ml的多價(jià)抗原復(fù)合疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，免疫接種的乳牛必須經(jīng)過全面健康檢查，確定是沒有任何疾病的健康乳牛，每頭乳牛每次注射2.times.10.sup.8.cells/ml濃度的多價(jià)抗原疫苗5ml，采用肌肉注射方式在臀部注射，每兩周追加接種一次，追加注射部位和注射劑量與首次注射相同，在首次注射后第五天檢查接種乳牛血清中特異性抗體的滴度，只有出現(xiàn)高抗體滴度的接種乳牛的牛奶才能用作原料，以后每兩周檢查血清抗體滴度一次，如接種乳牛出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象，則停止使用這頭乳牛的牛奶作為原料。為加強(qiáng)免疫接種效果可以同時(shí)口服疫苗，采用上述四種細(xì)菌等量混合干粉，每次口服劑量為2g，于首次肌肉注射接種后后每三周追加口服一次，定期檢測其血清抗體滴度作為接種的依據(jù)和指標(biāo)。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，收集接種乳牛的牛奶中含有豐富的對抗牙周疾病致病菌的特異性抗體，可以直接讓牙周疾病的患者服用此牛奶，也可以采用多種方法分離提取純度較高的特異性抗體，這些特異性抗體是免疫球旦白，主要是免疫球旦白G(IgG)，也有IgA和IgM。通常采用的分離方法是，脫脂后凝固分離去除酪旦白，上清液直接噴霧干燥制備干粉，其中含有豐富的特異性抗體；為了制備更高純度的免疫球旦白，可以在脫脂、去除酪旦白后采用超微濾膜濾除殘余酪旦白或更小分子的物質(zhì)，采用分子量為100,000D的超微濾膜，進(jìn)行超濾，超濾濃縮物噴霧干燥或冷凍干燥制備干粉，其中含有較高純度的特異性免疫球旦白；也可以采用層析柱、分子篩等方法進(jìn)行分離以獲得更高純度的免疫球旦白；還可以采用硫酸銨飽和沉淀后，用離子交換或透析去除離子后獲得高純度的免疫球旦白。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明方法制備的抗牙周疾病致病菌的特異性抗體，既可以以牛奶方式或干粉形式直接應(yīng)用，也可以以較高純度的特異性抗體與其他輔料聯(lián)合制備固體或液體的制劑，用于預(yù)防和治療牙周疾病，包括但不限于下列形式，例如牙膏、牙粉、液體狀漱口劑、液體狀冷凍劑、口含片、口香糖、咀嚼片等，或者是冰琪淋、酸奶等功能性食品方式。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明方法制備的對抗牙周疾病致病菌的特異性抗體既可以單獨(dú)應(yīng)用于預(yù)防和治療牙周疾病，也可以與其他能夠抑制牙周疾病致病菌、改善牙周組織炎癥以及促進(jìn)牙周組織修復(fù)的任何制劑聯(lián)合使用，包括但不限于各類口服抗菌素、含殺菌消炎作用的漱口液、有防治牙周病作用的牙膏、牙粉、含酪旦白磷酸多肽的復(fù)合物、含氟化合物的制劑等。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明方法制備特異性抗體可以用于預(yù)防和治療牙齦炎、牙周炎、牙周膿腫、齒齦膿腫等牙周疾病，使用劑量為0.1～50g/天，較佳選擇為1～10g，最好為2～3g/天。
本發(fā)明的有益效果是，采用純天然的免疫球旦白治療牙周疾病，不會(huì)破壞口腔菌群的平衡，特異性抑制牙周疾病致病菌的生長繁殖，長期使用無任何毒付作用，產(chǎn)品原料來源豐富，價(jià)格低廉，容易推廣。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1制備多價(jià)抗原疫苗分別接種牙齦桿菌、核粒梭形桿菌、艾肯腐蝕桿菌、共生放線桿菌等菌種在細(xì)菌肉湯培養(yǎng)基，牙齦桿菌應(yīng)接種在特殊肉湯培養(yǎng)基(Todd-Hewitt broth)，并且在培養(yǎng)基內(nèi)加入適量血紅素和人工維生素K3，在37℃溫度下培養(yǎng)48小時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長良好，加溫至60℃持續(xù)2小時(shí)滅活細(xì)菌，用緩沖液反復(fù)沖洗，并用離心機(jī)分離細(xì)菌，用冷凍干燥裝置冷凍干燥成細(xì)菌干粉，上述四種細(xì)菌干粉等量混合加生理鹽水反復(fù)稀釋至濃度為2.times.10.sup.8.cells/ml，冷藏備用。
實(shí)施例2免疫接種健康乳牛并檢測抗體滴度選擇健康乳牛，采用實(shí)施例1制備的多價(jià)抗原疫苗，在乳牛臀部肌肉注射5ml，每兩周重復(fù)一次，共重復(fù)四次，注射劑量和部位相同，在首次注射后第五天抽取血清，用抗體凝集反應(yīng)來測試血清中抗體滴度，抗體滴度在3200，證實(shí)在乳牛體內(nèi)產(chǎn)生了特異性抗體。
實(shí)施例3從免疫接種乳牛的牛奶中制備特異性抗體乳牛接種10天后，收集該接種乳牛的牛奶12升，用脫脂機(jī)去除牛奶中脂肪，用1N HCL調(diào)節(jié)牛奶PH至4.7，加熱40℃維持30分鐘，離心方式沉淀酪旦白，去除凝集的酪旦白，收集上清液，直接用噴霧干燥法制備免疫球旦白，噴霧干燥時(shí)溫度維持在140°F以下，制備的干粉中含8％的免疫球旦白。
實(shí)施例4臨床驗(yàn)證治療牙周疾病效果隨機(jī)選取牙齦炎和牙周病患者12人，口服實(shí)驗(yàn)例3制備的特異性免疫球旦白制劑，每天用5g干粉用水稀釋后漱口，早晚各漱口一次，每次漱口維持一分鐘，持續(xù)兩個(gè)月，兩個(gè)月后檢查，其中8名患者(67％)牙齦炎或牙周病癥狀明顯減輕，其中4名患者(33％)牙齦炎和牙周病癥狀部分改善，無任何付作用發(fā)生。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種防治牙周疾病的特異性抗體，尤其涉及一種通過免疫接種乳牛并從其分泌的牛奶中制備對抗牙周病致病菌的特異性抗體，以及用于防治牙周疾病的方法，其特征是，制備多價(jià)抗原復(fù)合疫苗，免疫接種健康乳牛，通過血清測試特異性抗體滴度，確定已產(chǎn)生特異性抗體，從收集的免疫乳牛牛奶中制備特異性抗體，應(yīng)用于預(yù)防和治療牙周疾病。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，選擇制備疫苗的細(xì)菌是與牙周疾病發(fā)病相關(guān)的致病菌，這些致病菌包括但不限于牙齦桿菌、核粒梭形桿菌、艾肯腐蝕桿菌、共生放線桿菌等格蘭氏陰性細(xì)菌，其中牙齦桿菌是所制備疫苗中必需的主要成份，而牙齦桿菌的菌毛和被膜碎片也可以考慮作為抗原成份加入疫苗中，可以采用滅活的完整細(xì)菌作為抗原，也可以將滅活的細(xì)菌用超聲粉碎后制備細(xì)菌均漿作為抗原。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，制備疫苗是采用下列方法，接種各種與牙周疾病相關(guān)的細(xì)菌在細(xì)菌培養(yǎng)基，在37℃溫度下培養(yǎng)48小時(shí)，加熱至60℃持續(xù)2小時(shí)，以殺滅致病菌，用緩沖液反復(fù)沖洗五次后離心分離收集細(xì)菌，冷凍干燥后制成干粉，等量稱取上述細(xì)菌干粉，用生理鹽水緩沖液調(diào)制成濃度為2.times.10.sup.8.cells/ml的多價(jià)抗原復(fù)合疫苗。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，免疫接種的乳牛必須經(jīng)過全面健康檢查，確定是沒有任何疾病的健康乳牛，每頭乳牛每次注射2.times.10.sup.8.cells/ml濃度的多價(jià)抗原疫苗5ml，采用肌肉注射方式在臀部注射，每兩周追加接種一次，追加注射部位和注射劑量與首次注射相同，在首次注射后第五天檢查接種乳牛血清中特異性抗體的滴度，只有出現(xiàn)高抗體滴度的接種乳牛的牛奶才能用作原料，以后每兩周檢查血清抗體滴度一次，如接種乳牛出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象，則停止使用這頭乳牛的牛奶作為原料。為加強(qiáng)免疫接種效果可以同時(shí)口服疫苗，采用上述四種細(xì)菌等量混合干粉，每次口服劑量為2g，于首次肌肉注射接種后后每三周追加口服一次，定期檢測其血清抗體滴度作為接種的依據(jù)和指標(biāo)。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，收集接種乳牛的牛奶中含有豐富的對抗牙周疾病致病菌的特異性抗體，可以直接讓牙周疾病的患者服用此牛奶，也可以采用多種方法分離提取純度較高的特異性抗體，這些特異性抗體是免疫球旦白，主要是免疫球旦白G(IgG)，也有IgA和IgM。通常采用的分離方法是，脫脂后凝固分離去除酪旦白，上清液直接噴霧干燥制備干粉，其中含有豐富的特異性抗體；為了制備更高純度的免疫球旦白，可以在脫脂、去除酪旦白后采用超微濾膜濾除殘余酪旦白或更小分子的物質(zhì)，采用分子量為100,000D的超微濾膜，進(jìn)行超濾，超濾濃縮物噴霧干燥或冷凍干燥制備干粉，其中含有較高純度的特異性免疫球旦白；也可以采用層析柱、分子篩等方法進(jìn)行分離以獲得更高純度的免疫球旦白；還可以采用硫酸銨飽和沉淀后，用離子交換或透析去除離子后獲得高純度的免疫球旦白。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明方法制備的抗牙周疾病致病菌的特異性抗體，既可以以牛奶方式或干粉形式直接應(yīng)用，也可以以較高純度的特異性抗體與其他輔料聯(lián)合制備固體或液體的制劑，用于預(yù)防和治療牙周疾病，包括但不限于下列形式，例如牙膏、牙粉、液體狀漱口劑、液體狀冷凍劑、口含片、口香糖、咀嚼片等，或者是冰琪淋、酸奶等功能性食品方式。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明方法制備的對抗牙周疾病致病菌的特異性抗體既可以單獨(dú)應(yīng)用于預(yù)防和治療牙周疾病，也可以與其他能夠抑制牙周疾病致病菌、改善牙周組織炎癥以及促進(jìn)牙周組織修復(fù)的任何制劑聯(lián)合使用，包括但不限于各類口服抗菌素、含殺菌消炎作用的漱口液、有防治牙周病作用的牙膏、牙粉、含酪旦白磷酸多肽的復(fù)合物、含氟化合物的制劑等。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明方法制備特異性抗體可以用于預(yù)防和治療牙齦炎、牙周炎、牙周膿腫、齒齦膿腫等牙周疾病，使用劑量為0.1～50g/天，較佳選擇為1～10g，最好為2～3g/天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治牙周疾病的特異性抗體，尤其涉及一種通過免疫接種乳牛并從其分泌的牛奶中制備對抗牙周病致病菌的特異性抗體，以及用于防治牙周疾病的方法，其特征是，制備多價(jià)抗原復(fù)合疫苗，免疫接種健康乳牛，通過血清測試特異性抗體滴度，確定已產(chǎn)生特異性抗體，從收集的免疫乳牛牛奶中制備特異性抗體，應(yīng)用于預(yù)防和治療牙周疾病。
文檔編號A61K39/395GK1557493SQ20041001610
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月4日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平