專利名稱：用于酶聯(lián)免疫吸附測定的酶標板的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及生物技術領域，具體地說是一種酶標板。
背景技術：
酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法 是一種將抗原抗體反應的特異性和酶的高效催化作用相結合，由此建立的一 種免疫4企測技術，并在臨床及生物技術領域得到了廣泛應用。
ELISA的起始步驟是將抗體附著于微孔板的反應孔表面，稱為包被，包被 的效率即最終結合于微孔板表面的抗體密度及其穩(wěn)定性決定了隨后結合抗原 的數(shù)量，亦即決定了 ELISA的敏感性。傳統(tǒng)技術的酶標板其固相的抗體分子 因其呈團串狀，不均一分布和易解吸等不利因素使其應用受到限制，因此一
部分生產者利用了 1個鏈霉親和素分子可與4個生物素分子結合的原理，釆 用鏈霉親和素的預包被方法制備酶標板，即包被層為采用鏈霉親和素、生物 素化特異性抗體依次涂布在反應孔上形成的包被層，此種酶標板一方面可以 通過充分暴露抗體的可變區(qū)從而提高與待測抗原的親和性，另 一方面還可以 通過其放大原理降低特異性抗體的使用量，提高酶標板的靈敏度，但是現(xiàn)有 技術采用鏈霉親和素的預包被制備的酶標板成本高，因為鏈霉親和素同樣價 格昂貴。

實用新型內容
為解決現(xiàn)有技術存在的問題，本實用新型提供一種特異性、敏感性好， 且成本低的用于酶聯(lián)免疫吸附測定的酶標板。
本實用新型是這樣實現(xiàn)的一種用于酶聯(lián)免疫吸附測定的酶標板，包括固相載體和包被層，所述固 相載體為設置有若干個微孔的微孔板，所述固相載體的反應孔表面附著由抗鏈 霉親和素抗體、鏈霉親和素、生物素化特異性抗體依次涂布在反應孔上形成的 包被層。
作為本實用新型的一種優(yōu)選方案，所述包被層中抗鏈霉親和素抗體與鏈 霉親和素之間可以有一層封閉液，所述封閉液可為牛血清白蛋白。
作為本實用新型的進一步優(yōu)選方案，所述固相載體可為96孔聚苯乙烯微孔板。
作為本實用新型的再一種優(yōu)選方案，所述固相載體可為48孔聚苯乙烯微孔板。
本實用新型的制備過程是在固相載體的微孔上先預包被抗鏈霉親和素 抗體，在4。C條件下放置12 15小時，然后再加入^t連霉親和素溶液，以上兩個 步驟完成ELISA板的預包被過程，制成的半成品在4。C條件下保存，最后根 據(jù)待測抗原，選擇生物素化的特異性抗體進行包:^皮，此步驟大約30分鐘即可 完成，即制得ELISA酶標一反。
本實用新型包被層為采用成本低且制備簡單的抗鏈霉親和素抗體先于鏈 霉親和素預包被而形成的包被層，鏈霉親和素及其抗體均具有較好的熱穩(wěn)定 性和抗變性特性，所以容易保持其天然構象，將其預先包被至固相，則特異 性抗體(單克隆或多克隆)即可通過"抗鏈霉親和素抗體+4連霉親和素+生物素化 特異性抗體，，的結合模式而間接吸附于載體表面，這種方法不僅改善了固相 抗體分子的功能化保留程度，而且還能夠捕獲較多待測蛋白分子。此種包被 層最大方式的保留了特異性抗體的親和性，還保留了鏈霉親和素預包被方法 降低特異性抗體用量的優(yōu)勢，更有意義的還在于減少了鏈霉親和素的用量， 明顯降低了總生產成本。另一方面，本實用新型利用鏈霉親和素與生物素分 子的親和力遠大于一般抗原抗體親和力的特性(數(shù)百萬倍)，用此種預包被方 法法制備的半成品只再需30分鐘即可完成成品的包被，特別適用于大規(guī)模生產，且試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，經實驗證實，采用本實用新型酶標板進行檢測具有更高的靈敏度，其最低檢測限為lpg/ml，回收率為卯 ±13%,重復性亦佳。


此處所說明的附圖用來提供對本實用新型的進一步理解，構成本申請的 一部分，并不構成對本實用新型的不當限定，在附圖中圖1為本實用新型結構示意圖；圖2為本實用新型剖一見圖；圖3為本實用新型酶標板所測人IL-6標準曲線圖； 圖4為為現(xiàn)有技術酶標板所測人IL-6標準曲線圖。
具體實施方式
下面將結合附圖以及具體實施例來詳細說明本實用新型，在此本實用新 型的示意性實施例以及說明用來解釋本實用新型，但并不作為對本實用新型 的限定。如圖1、 2所示，本實施例提供的用于檢測人白介素6 (IL-6)的ELISA 的酶標板,包括固相載體1和包被層3,固相載體1為96孔聚苯乙烯微孔板， 96孔聚苯乙烯微孔板的反應孔2表面附著由抗鏈霉親和素抗體、鏈霉親和素、 生物素化特異性抗體依次涂布在反應孔上形成的包被層3,包被層3中抗鏈霉 親和素抗體與鏈霉親和素之間有一層牛血清白蛋白封閉液。本實用新型酶標板的制備過程是.(1)將96孔聚苯乙烯微孔板1 ( PS )置于紫外光下幅照2小時，使PS 板活化；(2 )預包被采用PH=7.8的Tris鹽緩沖液(TBS )配置濃度為0.2 ug/ml的抗鏈霉親和素抗體工作液，將抗鏈霉親和素抗體工作液力。入PS板酶標孔中，每個孔中加入100ul，在fC條件下放置12~15小時；(3 )洗板以PH=7.4 TBS洗滌步驟(2 )制得的包被板3次；(4) 封閉以2Q/。BSA (牛血清白蛋白)溶液作為封閉液，加入PS板酶 標孔內，每孔200u舊SA溶液，室溫力丈置2小時；(5) 洗板同步驟(3),拍干；(6 )將工作濃度為0.4 ug/ml的鏈霉親和素溶液加入到步驟(5 )得到的 包被板微孔中，100ul/孔，在37。C下放置2小時，半成品完成，在4。C條件下 保存?zhèn)溆茫?7) 洗板同步驟(3)，拍干；(8) 加入工作濃度為0.1 ug/ml的生物素化人IL-6單克隆抗體，100u1/ 孔，室溫放置30分鐘，完成整個酶標板包被過程；(9) 包裝。分別釆用現(xiàn)有技術的ELISA酶標^l和本實用新型酶標+反定量4全測已知濃 度(134 pg/ml) IL-6標本，其中現(xiàn)有技術的ELISA酶標板其包被層為鏈霉親 和素、生物素化特異性抗體依次涂布在反應孔上形成的包^C層，測量步驟如 下(1) 加樣分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，空白孔加樣品稀釋液 lOOul,標準孔和待測樣品孔分別加標準品(IL-6)和定值樣品lOOul,覆膜， 37。C放置120分鐘，標準品濃度分別為500 pg/ml， 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5pg/ml， 31.2 pg/ml, 15.6 pg/ml, 7.8 pg/ml;(2) 棄去液體，甩干，每孔加檢測抗體A工作液lOOul,覆膜，37。C放 置60分鐘；(3) 棄去孔內液體，洗板3次，甩干，溫育60分鐘；(4 )每孔加檢測抗體B工作液lOOul,覆膜，37。C放置60分鐘；(5)棄去孔內液體，洗板5次，甩干；(6 )每孔加TMB底物溶液90ul， 37。C避光顯色30分鐘；(7 )依序每孔加終止溶液50ul，用酶聯(lián)儀在450nm波長測量各孔的光密 度(OD值)。測量結果如圖3、 4所示，對檢測結果進行比較(如表l)，其中，批內精 密度定值標本在同一酶標板上重復檢測20次；批間精密度同一定值標本 分20次進4力險測。表1.不同EL ISA酶標板檢測結果比較酶標板類艱定值樣品 別'J定值(mean)標準差(SD)變異系數(shù)(cv %)批內批間批內批間本實用新，.141. 58. 39. 15. 86. 4現(xiàn)有技術 ELISA酶標板142. 310. 611. 67.48.2注現(xiàn)有技術ELISA酶標板采用鏈霉親和素預包被制得的酶標板從表1數(shù)據(jù)可以看出應用本實用新型酶標板檢測IL-6標本，其準確性在 94-106%,準確性良好，且精確度也優(yōu)于現(xiàn)有技術的ELISA酶標》反。與現(xiàn)有技術的采用鏈霉親和素預包被制得的酶標板相比，現(xiàn)有技術酶標 板所需特異性抗體與鏈霉親和素的量分別為2ug/ml和10 ug/ml,而本實用新 型所需特異性抗體與鏈霉親和素的量分別為0.1 ug/ml與0.4 ug/ml,所用特異 性抗體量僅為現(xiàn)有技術ELISA酶標板的1/10 1/20，因此可節(jié)約成本大約10-20倍。
權利要求1、一種用于酶聯(lián)免疫吸附測定的酶標板，包括固相載體和包被層，所述固相載體為設置有若干個微孔的微孔板，其特征在于所述固相載體的反應孔表面附著由抗鏈霉親和素抗體、鏈霉親和素、生物素化特異性抗體依次涂布在反應孔上形成的包被層。
2、 如權利要求1所述的用于酶聯(lián)免疫吸附測定的酶標板，其特征在于 所述包被層中抗鏈霉親和素抗體與鏈霉親和素之間有一層封閉液，所述封閉液 為牛血清白蛋白。
3、 如權利要求1或2所述的用于酶聯(lián)免疫吸附測定的酶標板，其特征在 于所述固相載體為96孔聚苯乙烯微孔板。
4、 如權利要求1或2所述的用于酶聯(lián)免疫吸附測定的酶標才反，其特征在 于所述固相載體為48孔聚苯乙烯微孔板。
專利摘要本實用新型公開了一種用于酶聯(lián)免疫吸附測定的酶標板，包括固相載體和包被層，所述固相載體為設置有若干個微孔的微孔板，所述固相載體的反應孔表面附著由抗鏈霉親和素抗體、鏈霉親和素、生物素化特異性抗體依次涂布在反應孔上形成的包被層。本實用新型具有的有益效果是快速，特異性、敏感性好，且成本低。
文檔編號G01N33/544GK201289484SQ200820202969
公開日2009年8月12日 申請日期2008年11月6日 優(yōu)先權日2008年11月6日
發(fā)明者何峰容 申請人:武漢中美科技有限公司