專利名稱：一種腫瘤治療劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤的基因治療。更具體而言，本發(fā)明涉及一種新的腫瘤治療劑和其用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是當(dāng)前危害人類健康最主要的疾病之一，發(fā)病率在不斷提高，目前已成為人類最主要的死因之一。據(jù)報(bào)道，1997年美國(guó)死于腫瘤的預(yù)期人數(shù)是56萬(wàn)人，新發(fā)病例為138萬(wàn)余人，在全死因中占第二位。1990-1992年全國(guó)27個(gè)省、市、自治區(qū)的抽樣調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)惡性腫瘤在死因順位中也是第二位，僅次于呼吸系統(tǒng)疾病，腫瘤粗死亡率為108.26/10萬(wàn)，占死因構(gòu)成的17.94％。最近，專家估計(jì)，腫瘤引起的死亡占我國(guó)每年死亡人數(shù)的20％，每年發(fā)病人數(shù)在160萬(wàn)人以上?？梢韵嘈烹S著我國(guó)工業(yè)化、城市化程度的提高和環(huán)境污染的不斷加劇，其對(duì)我國(guó)人民健康的危害將不斷加大。因此開(kāi)展惡性腫瘤的防治研究具有十分重要的意義。
雖然腫瘤臨床治療已取得了很大進(jìn)展，但迄今仍無(wú)特效的治療藥物。對(duì)于惡性腫瘤的治療，目前主要有手術(shù)、放療和化療及聯(lián)合方案。前兩者主要適用未轉(zhuǎn)移的腫瘤(手術(shù)治療僅適用于實(shí)體腫瘤)，不適用于轉(zhuǎn)移腫瘤?；瘜W(xué)治療實(shí)際上是應(yīng)用最廣泛的治療方法，目前已用到各種腫瘤的治療，對(duì)于少量腫瘤可達(dá)到根治或延長(zhǎng)病人生存時(shí)間的效果。化學(xué)藥物的抗癌原理是通過(guò)產(chǎn)生阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)、復(fù)制的不利環(huán)境而使細(xì)胞死亡，這些機(jī)制包括打亂細(xì)胞必需酶的合成、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成、阻止細(xì)胞有絲分裂等。為提高療效，這類藥物的使用劑量都非常高，因此也對(duì)正常分裂的機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生殺滅作用，其治療結(jié)果是使病人元?dú)獯髠袷惴俣唐诙靖弊饔冒摪l(fā)、發(fā)熱、頭疼、嘔吐等，長(zhǎng)期使用則對(duì)心、腎、肺和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損害和其它潛在危險(xiǎn)?；?、放療的另一個(gè)更大障礙是藥物治療一定時(shí)間后腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生耐藥性最終導(dǎo)致病人無(wú)藥可用、治療失敗。因此，研制高效、低毒、對(duì)于腫瘤具有高度特異性的藥物始終是抗腫瘤藥物發(fā)展一個(gè)方向。
基因治療是醫(yī)學(xué)上的第四次革命，為攻克腫瘤治療這一難題帶來(lái)了希望。其原理是將目的基因通過(guò)人工方式導(dǎo)入人體特定細(xì)胞內(nèi)，使其成為宿主細(xì)胞的一部分，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)疾病產(chǎn)生治療效果。在此過(guò)程中外源基因可整合入宿主基因組內(nèi)，也可以不發(fā)生整合。與重組蛋白藥物相比，基因治療具有成本低、容易生產(chǎn)和保存、產(chǎn)品穩(wěn)定性好、療效持久、副作用低、可控性好、可實(shí)現(xiàn)靶向給藥等優(yōu)點(diǎn)，并且從理論上講幾乎所有基因均可用于基因治療，因此可開(kāi)發(fā)的藥物種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)。正因?yàn)榛蛑委熡腥绱吮姸嗟膬?yōu)點(diǎn)，在短短10余年時(shí)間里得到飛速發(fā)展。至1998年，世界上共記錄有3000多例基因治療病例，美國(guó)1700例，針對(duì)腫瘤的基因治療成為研究重點(diǎn)，在現(xiàn)有基因治療方案中惡性腫瘤占68％。但是腫瘤基因治療目前存在的問(wèn)題是有效基因種類較少、特異性仍不理想，嚴(yán)重影響了治療效果，因此篩選、應(yīng)用更多、更新的治療基因并研究其特異性導(dǎo)入和治療技術(shù)一直是腫瘤基因治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。
腫瘤基因治療目前需要解決的問(wèn)題有以下幾方面一是有效的治療基因，要求能殺滅對(duì)現(xiàn)有化療、放療耐藥的腫瘤細(xì)胞；二是給藥要能實(shí)現(xiàn)特異性或靶向性，以提高效率并降低毒副作用；三是基因轉(zhuǎn)移載體要高效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特征是利用腫瘤特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制新型腫瘤殺傷劑HIV Vpr基因的表達(dá)作為基因治療藥物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的特異性殺滅作用。
人類免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體。Vpr基因是HIV-1的非結(jié)構(gòu)基因，編碼一15KD的病毒蛋白。Vpr基因的功能目前已經(jīng)成為HIV研究的熱點(diǎn)。Vpr在HIV病毒的生命周期中扮演著非常重要的角色，它可被組裝入病毒整合復(fù)合體，并將病毒整合復(fù)合體帶入宿主細(xì)胞核中，激發(fā)病毒復(fù)制。此外它還對(duì)宿主細(xì)胞的生活周期進(jìn)行一系列的調(diào)控，例如，多項(xiàng)研究表明，Vpr可干擾細(xì)胞周期循環(huán)，誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G2/M期而阻止細(xì)胞的增殖，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。(可參見(jiàn)Yao XJ，Subbramanian RA，Rougeau N，et al.Mutagenic analysis ofhuman immunodeficiency virus type 1 Vprrole of a predicted N-terminalalpha-helical structure in Vpr nuclear location and virion incorporation.J Virol，1995，697032-7044.Stewart SA，Poon B，Jowett JBM，et al.Lentiviraldelivery of HIV-1 Vpr protein induce apoptosis in transformed cell.Proc NatlAcad Sci USA，1999，9612039-12043.Chen MZ，Elder RT，Yu M，et al.Mutation analysis of Vpr-induced G2 arrest，nuclear location and cell death infission yeast.J Virol，1999，733236-3245.Zhao Y，Yu M，Chen MZ，et al.Pleiotropic effects of HIV-1 protein R(Vpr)on morphogenesis and cellsurvival in fission yeast and antagonism by pentoxifylline.Virology，1998，246266-276.)本研究選擇HIV Vpr作為治療基因，是因?yàn)镠IV Vpr基因用于腫瘤的治療具有更巨大的潛力。其原因在于(1)HIV Vpr基因可使細(xì)胞停留在G2/M期，而長(zhǎng)期的研究證明，處于G2/M期的細(xì)胞對(duì)放療和化療都很敏感，Vpr表達(dá)載體轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞可提高放療和化療的療效，尤其可有效殺滅對(duì)放化療耐受的腫瘤細(xì)胞；(2)Vpr引起細(xì)胞周期G2停滯的靶點(diǎn)是特異的(Cdc2)，而且對(duì)Cdc2的抑制是通過(guò)在抗癌治療中最多用的靶標(biāo)Cdc25和Wee1實(shí)現(xiàn)的；(3)Vpr通過(guò)引起細(xì)胞凋亡和壞死可快速殺滅腫瘤細(xì)胞。
Vpr基因最終能否成功用于腫瘤治療，其運(yùn)載形式或?qū)敕椒ㄊ顷P(guān)鍵。由于Vpr干擾細(xì)胞周期，目前在各種細(xì)胞內(nèi)都較難實(shí)現(xiàn)其高表達(dá)，故將其開(kāi)發(fā)成蛋白藥物在技術(shù)上有一定難度，在這種情況下進(jìn)行基因治療有其必然性。
由于Vpr對(duì)細(xì)胞的殺傷作用是普遍性的，缺乏細(xì)胞特異性，因此若將其直接插入持續(xù)表達(dá)型載體(如在CMV等啟動(dòng)子元件的控制下表達(dá)，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)特異性)進(jìn)行導(dǎo)入，則Vpr對(duì)正常細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生非特異性殺滅作用，從而造成毒副作用并影響療效。另外，若將Vpr直接插入持續(xù)表達(dá)型病毒載體(如在CMV等啟動(dòng)子元件控制下進(jìn)行表達(dá))，由于Vpr會(huì)殺死宿主細(xì)胞而影響病毒的生產(chǎn)。因此，由此推測(cè)用CMV等持續(xù)型表達(dá)啟動(dòng)子控制的Vpr表達(dá)在基因治療中會(huì)對(duì)正常細(xì)胞也發(fā)生殺滅作用，從而影響其安全性和治療效果。
為了避免Vpr的毒副作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的特異性治療本發(fā)明使用了組織(腫瘤)特異性啟動(dòng)子或/和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列基因，它們?cè)诜遣±項(xiàng)l件下的人的組織細(xì)胞中很少顯示活性或者沒(méi)有活性，但是在某些類型腫瘤中開(kāi)放或者上調(diào)。利用這些腫瘤特異性異?？蛇M(jìn)行腫瘤的特異性基因治療。例如編碼癌胚抗原(CEA)的基因的啟動(dòng)子，其在不同類型的腺癌中可被再激活。另一個(gè)例子如編碼癌胚甲胎蛋白(AFP)基因的啟動(dòng)子，它在非病理?xiàng)l件下在胎肝中特異地有活性，在出生后非癌肝細(xì)胞內(nèi)，因無(wú)特定的轉(zhuǎn)錄激活因子(AFP)，基本無(wú)活性，而在大部分原發(fā)性肝癌內(nèi)AFP啟動(dòng)子則可被AFP反式激活。因此，不難理解，利用任何一種組織(腫瘤)特異性啟動(dòng)子都有望實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的相對(duì)特異性治療。類似的啟動(dòng)子已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多，如端粒酶啟動(dòng)子(多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào))、前列腺抗原啟動(dòng)子(PSA)、E2F-1啟動(dòng)子、Flk-1啟動(dòng)子、E-selectin啟動(dòng)子、HK-II啟動(dòng)子、c-ebrB2啟動(dòng)子、L-Plastin啟動(dòng)子、SLP-I啟動(dòng)子等。可以利用這些啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)對(duì)不同腫瘤的特異性抑制作用。
除了這些啟動(dòng)子，誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子也可以利用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因，在常規(guī)條件下不表達(dá)，但是當(dāng)受到外界條件誘導(dǎo)時(shí)則啟動(dòng)表達(dá)。例如，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有低氧反應(yīng)元件，只有在缺氧時(shí)才表達(dá)，已知腫瘤細(xì)胞由于增殖太快，其組織內(nèi)部是處于缺氧狀態(tài)的，因此可用于腫瘤的特異性治療。再如射線啟動(dòng)子Egr-1，即人早期生長(zhǎng)反應(yīng)-1基因(Early growth response 1，Egr-1)，位于第5號(hào)染色體長(zhǎng)臂，又稱為zif68，Tis-8，NFGI-A，Krox-24。Egr-1基因在真核細(xì)胞對(duì)外界刺激發(fā)生反應(yīng)、細(xì)胞的增殖、分化中發(fā)揮著重要功能。細(xì)胞在離子輻射后，Egr-1基因被特異性激活。將外源基因置于Egr-1啟動(dòng)子下游，腫瘤放療時(shí)射線照射后將激活其表達(dá)，因此也可用于腫瘤的特異性治療。類似的例子還有糖皮質(zhì)激素啟動(dòng)子(由糖皮質(zhì)激素激活)、金屬硫蛋白啟動(dòng)子(由鋅等金屬離子激活)、四環(huán)素啟動(dòng)子(由四環(huán)素激活)等。
為了增強(qiáng)表達(dá)效果，可將上述啟動(dòng)子拼接成雜合啟動(dòng)子。
基因治療另外要考慮的是導(dǎo)入載體，從理論上講腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)以及質(zhì)粒載體等均可作為表達(dá)載體。


圖1顯示腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)結(jié)構(gòu)。
圖2顯示rvAdHREAFPvpr的PCR鑒定結(jié)果。1Vpr引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；2AFP引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；3DL-2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp)。
圖3顯示重組腺病毒rvAdHREAFPVpr中整合的特異性AFP和Vpr基因片段Southern blot分析結(jié)果。AAFP啟動(dòng)子檢測(cè)1rvAdHREAFPVpr；2Ad5(對(duì)照)；BVpr基因檢測(cè)3Ad5(對(duì)照)；4rvAdHREAFPVpr。
圖4顯示Vpr在AFP(+)肝癌細(xì)胞中的特異性表達(dá)。
A～CSMMC-7721(AFP-)細(xì)胞中Vpr表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。ASMMC-7721正常細(xì)胞；BSMMC-7721+rvAd-null；CSMMC-7721+rvAdHREAFPvpr。
D～FBEL-7402(AFP+)細(xì)胞中Vpr表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。
DBEL-7402正常細(xì)胞；EBEL-7402+rvAd-null；FBEL-7402+rvAdHREAFPvpr。
圖5顯示rvAdHREAFPVpr導(dǎo)致的細(xì)胞周期G2停滯。
ASMMC-7721細(xì)胞；BBEL-7402細(xì)胞。
圖6顯示rvAdHREAFPVpr引起細(xì)胞線粒體膜電位的降低。
ASMMC-7721細(xì)胞；BBEL-7402細(xì)胞。
圖7顯示rvAdHREAFPvpr對(duì)BEL-7402細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響。
圖8顯示rvAdHREAFPVpr對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤增殖的抑制作用和化療增強(qiáng)作用。
圖9顯示裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡檢測(cè)(TUNEL法)結(jié)果。
A空白對(duì)照組；BAd-null組；CrvAdHREAFPVpr治療組；D環(huán)磷酰胺治療組；ErvAdHREAFPVpr+環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療組。
圖10顯示rvAdEgrVpr的放療增強(qiáng)作用。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明顯然并不局限于以下具體實(shí)施例。
實(shí)施例一本實(shí)施例的內(nèi)容是以腺病毒為載體，利用甲胎蛋白-低氧反應(yīng)元件啟動(dòng)子控制HIV Vpr基因的表達(dá)，在細(xì)胞和動(dòng)物水平上證明該制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性殺傷作用并可增強(qiáng)化療效果。具體步驟如下除非特別指出，下文所有分子克隆的操作均同J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)[M].北京科學(xué)出版社，2002。
1.腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttlHREAFPVpr的構(gòu)建(1)腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)的構(gòu)建含HIV vpr基因的質(zhì)粒BSVprThy(簡(jiǎn)稱pVPR)見(jiàn)Jowett JBM，PlanellesV，Poon B，Shan NP，Hen ML，Chen ISY.The Human Immunodeficiency Virus Type 1 vprGene Arrests Infected T Cells in the G2+M Phase of the Cell Cycle.J Virol，1995，696304-13)；pCI-neo質(zhì)粒購(gòu)于Promega、pCDNA II質(zhì)粒購(gòu)于Invitrogen公司，腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pShuttle、骨架載體質(zhì)粒pAdEasy-1和大腸桿菌BJ5183見(jiàn)He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplified system forgenerating recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，952509-14。
1)合成型射線反應(yīng)性啟動(dòng)子-多克隆位點(diǎn)-多聚腺苷酸尾[hcEgr-CMS-Poly(A)]片段的PCR擴(kuò)增引物由上海生工公司合成引物15’-CATAGATCTGCGTGGGGCGGCGTGGGGCGGCGTGGGGCGGCCCCGTTGACGCAAAT-3’(SEQ ID NO 1)引物25’-TATGATATCTACCACATTTGTAGAGGT-3’(SEQ ID NO 2)以pCI-neo質(zhì)粒(Promega公司)為模板，利用引物1、2 PCR擴(kuò)增合成型射線反應(yīng)性啟動(dòng)子-多克隆位點(diǎn)-多聚腺苷酸尾[hcEgr-CMS-Poly(A)]片段。方法在50ul反應(yīng)體系中pCI-neo質(zhì)粒lng(1ul)；dNTP(Takara公司，濃度2.5mmol/L)，4ul；10X Vent DNA合成酶緩沖液，5ul；Vent DNA合成酶(Biolabs)，1ul；ddH2O，37ul。PCR條件94℃預(yù)變性3min后開(kāi)始PCR循環(huán)，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為750bp。
2)質(zhì)粒pCDNAII-hcEgr-CMS-Poly(A)的構(gòu)建i)用EcoR V(Takara)酶切pCDNAII(Invitrogen公司)制備平端連接載體片段。體系質(zhì)粒pCDNAII 5ul；緩沖液H 2ul；EcoR V 1ul；水12ul。
ii)合成型射線反應(yīng)性啟動(dòng)子-多克隆位點(diǎn)-多聚腺苷酸尾[hcEgr-CMS-Poly(A)]片段PCR產(chǎn)物用生工公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化目的片段。
iii)載體片段和目的片段的連接。方法在20ul體系(pCDNAII載體片段，2ul；目的片段，10ul；10X T4 DNA連接酶緩沖液，2ul；T4 DNA連接酶(Promega公司)，1ul；ddH2O，5ul)中于12～16℃進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取和酶切鑒定，得到陽(yáng)性質(zhì)粒pCDNAII-hcEgr-CMS-Poly(A)，以質(zhì)粒pCDNAII上T7啟動(dòng)子為引物進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的正確。
3)腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-heEgr-CMS-Poly(A)的構(gòu)建i)用Bgl II和EcoR V(Takara)雙酶切質(zhì)粒pShuttle，制備連接載體片段。
體系質(zhì)粒pShuttle 5ul；Bgl II和EcoR V各1ul；緩沖液H 2ul；水11ul。
ii)用Bgl II和EcoR V雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒pCDNAII-hcEgr-CMS-Poly(A)，回收小片段hcEgr-CMS-Poly(A)目的片段。
體系質(zhì)粒pCDNAII-hcEgr-CMS-Poly(A)5ul；Bgl II和EcoR V各1ul；緩沖液H 2ul；水11ul。
iii)載體片段和目的片段的連接在20ul體系(載體片段，2ul；目的片段，10ul；10X T4 DNA連接酶緩沖液，2ul；T4 DNA連接酶，1ul；ddH2O，5ul)中進(jìn)行連接反應(yīng)。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑取克隆，堿法提取質(zhì)粒，BglII-EcoRV雙酶切鑒定，得到陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)。
(2)腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)的構(gòu)建
1)質(zhì)粒pCDNAII-Vpr的構(gòu)建PCR引物由上海生工公司合成，其序列為引物35’-TATGCTAGCATGGAACAAGCCCCAGAA-3’(SEQ ID NO 3)引物45’-TATACGCGTCTAGGATCTACTGGCTCC-3’(SEQ ID NO 4)以pVPR質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增HIV Vpr基因片段。50ul反應(yīng)體系pVPR質(zhì)粒1ul(1ng)；引物3、4各1ul(50pmol)；dNTP(2.5mmol/L濃度)，4ul；10×Vent DNA合成酶緩沖液，5ul；Vent DNA合成酶，1ul(5U)(Biolabs公司)；ddH2O，37ul。條件94℃預(yù)變性3min后開(kāi)始PCR循環(huán)，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為300bp。按生工公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化HIV Vpr基因片段，插入pCDNAII(Invitrogen公司)EcoRV位點(diǎn)，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pCDNAII-Vpr，以質(zhì)粒pCDNAII上T7啟動(dòng)子為引物進(jìn)行測(cè)序，證明PCR產(chǎn)物的正確。
2)腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)的構(gòu)建i)Nhe I和Mlu I(Takara)雙酶切pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)制備粘端載體片段。第一步先用Nhe I酶切pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)，體系質(zhì)粒pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)20ul；緩沖液M 5ul；Nhe I 2ul；水23ul。酶切后，無(wú)水乙醇法沉淀回收基因片段。第二步再用Mlu I酶切線性化片段pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)。體系在回收片段pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)沉淀中加入水17ul；緩沖液H 2ul；Mlu I 1ul。
ii)同法用Nhe I和Mlu I雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒pCDNAII-Vpr，用生工公司DNA回收試劑盒回收小片段Vpr目的片段。
iii)載體片段和目的片段的連接反應(yīng)方法在20ul體系中(載體片段，2ul；目的片段，10ul；10X T4 DNA連接酶緩沖液，2ul；T4 DNA連接酶，1ul；ddH2O，5ul)進(jìn)行連接反應(yīng)。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑取克隆，堿法提取質(zhì)粒，NheI-Mlu I雙酶切鑒定，得到陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。
(3)腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttleHREAFPVpr的構(gòu)建
1)用Hind III酶切pLN[HRE]AFTK(見(jiàn)Ido A，Uto H，Moriuchi A，Nagata K，Onaga Y，Onaga M，Hori T，Hirono S，Hayashi K，Tamaoki T，Tsubouchi H.Gene TherapyTargeting for Hepatocellular CarcinomaSelective and Enhanced Suicide Gene ExpressionRegulated by a Hypoxia-inducible Enhancer Linked to a Human a-Fetoprotein Promoter.Cancer Res，2001，613016-21)，無(wú)水乙醇沉淀法回收片段后，建立補(bǔ)平反應(yīng)體系10X緩沖液，2ul；10X BSA，2ul；dNTP，2ul，；Klenow酶(Promega公司，下同)，1ul；ddH2O，13ul。
室溫反應(yīng)10分鐘，75℃終止反應(yīng)10分鐘。進(jìn)行無(wú)水乙醇沉淀法回收片段。
2)BamH I再酶切補(bǔ)平線性化pLN[HRE]AFTK，回收小片段HRE-AFP啟動(dòng)子。
3)Nhe I酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，Klenow酶補(bǔ)平，方法同上。
4)Bgl II再酶切補(bǔ)平線性化pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，切去hcEgr啟動(dòng)子，回收大片段載體。
5)小片段HRE-AFP啟動(dòng)子和大片段載體的連接利用BamH I和BglII同尾酶的特性，建立一端粘端、一端平端的連接反應(yīng)。這樣得到重組腺病毒的穿梭載體pShuttleHREAFPVpr，在該載體中Vpr的上游為HRE-AFP雜合啟動(dòng)子，下游為polyA，Vpr的轉(zhuǎn)錄被上游的雜合啟動(dòng)子控制。
2.重組腺病毒質(zhì)粒pAdHREAFPVpr的獲得用堿裂解法小量制備克隆有Vpr的重組穿梭質(zhì)粒pShuttleHREAFPVpr及腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，溶解于50μl ddH2O中備用。
(1)重組穿梭質(zhì)粒的線性化與回收取約500ng重組穿梭質(zhì)粒，分別用Pme I(Biolabs公司)單酶切以線性化，加水將體積補(bǔ)至200μl，加入20μl3mol/L乙酸鈉，再加入2～2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，-20℃沉淀過(guò)夜，次日15,000rpm離心10min，75％乙醇洗一次，晾干后溶解于6μl ddH2O中，備用。
(2)用線性化的重組穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，分別取出約100ng pAdEasy-1、上述經(jīng)線性化處理過(guò)的重組穿梭質(zhì)粒pShuttleHREAFPVpr和-70℃保存?zhèn)溆玫腂J5183電轉(zhuǎn)化菌，按下述方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)化將BJ5183電轉(zhuǎn)化菌置于冰水浴中緩慢解凍，同時(shí)將預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)杯繼續(xù)置于冰水浴中，將pAdEasy-1、線性化的穿梭質(zhì)粒加入到含有BJ5183的Ep管中，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)化杯中，電穿孔的條件為2,500V、200Ohms和25mFD，電穿孔完成后，立即用1ml SOC培養(yǎng)液(配方見(jiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)[M].北京科學(xué)出版社，2002)懸浮電轉(zhuǎn)化混合物，37℃慢搖10min，取細(xì)菌懸液分別涂入卡那霉素(Kan)培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)16～20h，挑選10～20個(gè)較小的菌落，接種Kan的LB培養(yǎng)液中，置37℃搖床，培養(yǎng)10～15h，堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，用0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析，并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶圖譜分析。得到重組腺病毒質(zhì)粒pAdHREAFPVpr。將所得的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，在此宿主菌中可產(chǎn)生高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，挑取目的克隆，經(jīng)適當(dāng)?shù)拿盖需b定后，-70℃保存菌種備用。
3.重組腺病毒rvAdHREAFPVpr的獲得(1)用Pac I酶切重組的腺病毒質(zhì)粒，完全消化以去除ori和kan抗性基因等質(zhì)粒構(gòu)件，并暴露其倒置末端重復(fù)序列(ITR)。陽(yáng)性質(zhì)粒用氯化鈣法重新轉(zhuǎn)化宿主菌DH10B，挑取單克隆，接種至3ml含Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖8h，按照1/500的比例將培養(yǎng)菌接種至25ml含Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖12～16h。利用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司)提取質(zhì)粒，方法如下25ml菌液4℃ 6,000g離心15min收集細(xì)菌，用4ml含有RNase的溶液P1重懸細(xì)菌；加入4ml溶液P2，輕輕混合4～6次，室溫孵育5min；加入4ml預(yù)冷的溶液P3，混合4～6次，冰上孵育15min；4℃≥20,000g×離心30min，將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，繼續(xù)4℃≥20,000g×離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，以徹底除去沉淀；在將離心上清上QIAGEN-tip100柱子之前，先用4ml溶液QBT平衡柱子，平衡后，使離心上清通過(guò)重力作用通過(guò)柱子，用10ml溶液QC洗柱子兩次，加5ml溶液QF洗脫DNA，洗脫液接入一新的離心管中，加入3.5ml(0.7倍體積)異丙醇沉淀DNA，混勻后4℃ 15,000g離心30min，小心去掉上清，用2ml 70％乙醇洗DNA沉淀，4℃ 15,000g離心10min，仔細(xì)倒掉上清，室溫干燥沉淀5～10min，溶于100μl TE(PH8.0)中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的量約250ng/μl。
取20μl DNA Pac I(Biolabs公司)酶切，酶切后產(chǎn)物加入ddH2O將體積補(bǔ)足200μl，加入20μl 3mol/L乙酸鈉，再加入2～2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，-20℃沉淀過(guò)夜，次日15,000rpm離心10min，75％乙醇洗一次，晾干后溶解于20μl無(wú)菌的ddH2O中，備用。
(2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC)傳至12.5cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至50％～70％時(shí)即可轉(zhuǎn)染，將Pac I酶切線性化后的重組腺病毒DNA 20μl及6μl的Lipofectine 2000(Invitrogen公司)分別與100μl M溶液(M溶液為無(wú)血清、無(wú)抗生素的含有谷氨酰胺及碳酸氫鈉的DMEM培養(yǎng)液，Invitrogen公司)充分混勻，室溫下溫育15min，混合兩種懸液，室溫繼續(xù)作用30min。在上述等待的時(shí)間內(nèi)，移去293細(xì)胞的原培養(yǎng)液，用4ml M溶液小心洗細(xì)胞一次。補(bǔ)加800μl M溶液至Lipofectine-DNA的復(fù)合物中，充分混勻后，輕輕加入細(xì)胞瓶中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱，溫育3～5h。補(bǔ)加2ml含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過(guò)夜。次日，吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，補(bǔ)加2ml含2％小牛血清的MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞。7～14d左右，293細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變圓等細(xì)胞病變(CPE)，收集病變細(xì)胞連同上清凍存于-20℃。細(xì)胞反復(fù)凍融三次，使細(xì)胞完全破碎，凍融三次后離心，取上清接種一瓶293細(xì)胞，加入含2％小牛血清的DMEM維持液，逐日觀察，7d左右出現(xiàn)細(xì)胞病變。獲得的重組腺病毒命名為rvAdHREAFPVpr。
4.重組腺病毒的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定293細(xì)胞在接種腺病毒病變后，相對(duì)于正常細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)圓縮，聚集，且可見(jiàn)典型的“葡萄串”樣形態(tài)學(xué)特征。
(2)293細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍融后釋放出重組腺病毒rvAdHREAFPVpr，經(jīng)磷酸鎢負(fù)染，在透射電鏡下略呈典型二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約為70nm，具有典型的腺病毒形態(tài)，未見(jiàn)有其它病毒、支原體、細(xì)菌和真菌污染。
(3)外源啟動(dòng)子AFP和外源基因Vpr整合的PCR分析直接取反復(fù)凍融后的重組腺病毒懸液1ul，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。外源啟動(dòng)子AFP和外源基因Vpr PCR引物，均由上海生工生物工程公司合成，反應(yīng)體系為10×緩沖液5μl，2.5mmol/L dNTP(Takara公司)4μl，引物Beg和End(100ng/μl)各1μl，重組腺病毒懸液1μl，Taq DNA聚合酶(Takara公司)1μl，補(bǔ)水至總體積50μl，混勻后加入液體石蠟。94℃預(yù)變性3min后開(kāi)始PCR循環(huán)，條件為94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為500bp。
Vpr引物Beg5’-TATGCTAGC ATGGAACAAGCCCCAGAA-3’(SEQ ID NO5)End5’-TAT ACGCGT CTAGGATCTACTGGCTCC-3’(SEQ ID NO6)AFP引物Beg5’-GAGCTCTTACGCGTGCTA-3’(SEQ ID NO7)End5’-GCGATCCGGTGTTATT-3’(SEQ ID NO8)分別用AFP和Vpr引物對(duì)經(jīng)反復(fù)凍融后獲得的重組腺病毒模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以檢測(cè)到特異性擴(kuò)增條帶，在此位置野生型腺病毒Ad5為陰性，說(shuō)明兩個(gè)重組腺病毒基因組中都整合有AFP和Vpr基因。結(jié)果見(jiàn)圖2。
(4)外源基因整合的Southern Blot分析全部采用Roche公司探針標(biāo)記與雜交試劑盒，按說(shuō)明書操作。
①重組腺病毒基因組DNA的提取腺病毒DNA的提取按常規(guī)方法培養(yǎng)293細(xì)胞，取重組病毒rvAdHREAFPVpr以及野生型腺病毒Ad5以m.o.i＝5病毒量分別感染細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)80％時(shí)收獲。沉淀細(xì)胞加2ml TE(配方見(jiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)[M].北京科學(xué)出版社，2002)重懸，分裝四個(gè)1.5ml Ep管，每管加蛋白酶K(20μg/μl)7μl和10％ SDS 50μl，37℃孵育1h，再加5mol/L NaCl 150μl置于4℃作用2h，13,000rpm離心30min，轉(zhuǎn)移上清，用等體積酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次后，上清加入1/10體積3mol/L的乙酸鈉和2倍體積無(wú)水乙醇，置-20℃過(guò)夜。次日13,000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗兩次，室溫晾干后，每管加50μl TE和RNase 6μl溶解，BamH I酶切后用于Southern Blot分析。
②探針的合成和標(biāo)記采用Roche公司地高辛探針標(biāo)記試劑盒。以重組質(zhì)粒pShuttleHREAFPVpr為模板，用特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物和反應(yīng)條件參見(jiàn)上文，PCR產(chǎn)物用無(wú)水乙醇沉淀回收目的基因片段，建立如下標(biāo)記反應(yīng)將回收的PCR基因片段溶于15μl水中，放入沸水浴中煮沸10min，然后立即放入冰浴中，防止已變性的兩條鏈重新退火成雙鏈，然后迅速加入dNTP(10×)2μl，六聚核苷酸混合物(10×)2μl，Klenow酶1μl。37℃反應(yīng)1h后，EDTA終止反應(yīng)，乙醇沉淀，溶于50μl TE中。以試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，檢測(cè)探針的含量。
③瓊脂糖凝膠電泳及Southern Blot配制試劑，均參照J(rèn).薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)[M].北京科學(xué)出版社，20020.2mol/L HCl500ml蒸餾水中加入36％的鹽酸11.8ml變性液0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl中和液1mol/L Tris.HCl(pH7.4)及1.5mol/L NaCl20×SSC 3mol/L NaCl，300mmol/L檸檬酸鈉，用2mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌6×SSC30ml 20×SSC加70ml蒸餾水預(yù)雜交液 5×SSC，0.1％十二烷酰肌氨酸鈉，0.02％SDS，1％封閉液雜交液在上述預(yù)雜交液中加入新變性的探針DNA(約10μl PCR探針/1ml雜交液)洗膜I液 2×SSC，0.1％SDS洗膜II液 0.1×SSC，0.1％SDS
緩沖液I0.1mol/L順丁烯二酸，0.15mol/L NaCl，以NaOH調(diào)pH至7.5，高壓滅菌10×封閉液 6克脫脂奶粉溶于50ml緩沖液I中，68℃水浴溶解，定容至60ml緩沖液II 以緩沖液I 10倍稀釋10×封閉液，即封閉液終濃度為1％緩沖液III 100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，調(diào)pH至9.5顯色液BCIP 50mg/ml，溶在100％的二甲基甲酰胺內(nèi)NBT75mg/ml，溶在70％的的二甲基甲酰胺內(nèi)凝膠電泳及轉(zhuǎn)印取重組腺病毒DNA，BamH I酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，切去凝膠的多余部分，將凝膠浸泡在0.2mol/L HCl中輕搖10min，進(jìn)行脫嘌呤，用蒸餾水漂洗兩次后放入變性液中，進(jìn)行堿變性，輕搖45min，用蒸餾水漂洗一次，中和液連續(xù)中和兩次，每次15min。將與凝膠同樣大小的尼龍膜(AmshamPharmacia)先用蒸餾水自上而下潤(rùn)濕，再置10×SSC中浸泡5min以上，電轉(zhuǎn)儀經(jīng)抽真空檢測(cè)后，在塑料紙上剪一個(gè)略小于凝膠的洞，洞的下方自下而上為三層經(jīng)10×SSC浸泡后的濾紙和尼龍膜，塑料紙的上方為凝膠，在膠上倒少量的10×SSC，打開(kāi)電源，使抽真空的壓力保持在5毫米汞柱，轉(zhuǎn)膜1.5h，其間在膠上補(bǔ)充幾次10×SSC，以保證轉(zhuǎn)膜效果。
預(yù)雜交和雜交轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，以6×SSC泡膜5min，去除瓊脂碎片，將膜置于濾紙上，室溫干燥30min以上，80℃烤膜1～2h。將膜裝入雜交袋中，68℃預(yù)雜交1h。將適量標(biāo)記探針用雜交液稀釋后，100℃ 10min完全變性，迅速置冰浴中。將變性探針加入預(yù)雜交液中，排除氣泡，封口。于68℃恒溫水浴中反應(yīng)過(guò)夜。
洗膜倒掉雜交液，室溫下，將膜泡入適量洗膜I液中洗兩次，每次5min。倒凈洗膜I液，68℃水浴中用洗膜II液洗兩次，每次15min。
顯色雜交膜在緩沖液I中洗5min，繼續(xù)用緩沖液II，洗60min，倒掉緩沖液II，加入適量的用緩沖液II配制的抗地高辛(DIG)抗體(Roche公司)，室溫孵育30min，倒掉抗體液，用緩沖液I洗膜兩次，每次15min，繼續(xù)用緩沖液III，浸膜2min，棄去液體，加入用緩沖液III配制的NBT/BCIP的底物工作液，室溫下避光顯色，至出現(xiàn)目的條帶，水沖洗終止反應(yīng)，干燥保存。
結(jié)果表明在重組腺病毒中確有特異性的基因穩(wěn)定整合。圖3為重組腺病毒的BamH I酶切產(chǎn)物分別與AFP和Vpr特異性探針雜交的結(jié)果。
5.腺病毒感染肝癌細(xì)胞效率的測(cè)定用表達(dá)β-半乳糖苷酶基因的重組腺病毒rvAd-LacZ(該病毒與本發(fā)明中制備的重組腺病毒骨架相同，均缺失了腺病毒的E1和E3區(qū)基因)為代表，按不同的感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)感染肝癌細(xì)胞BEL-7402、SMMC-7721(均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生化研究所細(xì)胞中心)48h后，棄去培養(yǎng)基，用10％福爾馬林固定10min后，加入X-gal染液[1mg/mL X-gal溶于0.1mol/L二甲基甲酰胺中，1.3mmol/L MgCl2，3mmol/LK3Fe(CN)6，3mmol/L K4Fe(CN)6)]放37℃溫箱作用2h至過(guò)夜。鏡下計(jì)數(shù)藍(lán)染細(xì)胞的百分率。用rvAd-LacZ按MOI為5，10，25，50，100，200的量分別感染SMMC-7721(AFP-)、BEL-7402(AFP+)細(xì)胞，培養(yǎng)48h后進(jìn)行X-gal染色，結(jié)果證實(shí)當(dāng)MOI大于50的感染強(qiáng)度時(shí)，重組體腺病毒即可實(shí)現(xiàn)對(duì)上述兩細(xì)胞接近100％的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
6.重組腺病毒中外源基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)以m.o.i＝50病毒量的rvAd-null(該病毒無(wú)外源基因和啟動(dòng)子插入，與本發(fā)明中制備的重組腺病毒骨架相同，均缺失了腺病毒的E1和E3區(qū)基因)、rvAdHREAFPVpr接種BEL-7402、SMMC-7721 96h后，收集細(xì)胞2×106個(gè)，用冷的PBS 2ml洗滌細(xì)胞一次，800rpm×5min離心。4％多聚甲醛2ml室溫固定細(xì)胞40分鐘，800rpm×5min離心。PBS 2ml重懸細(xì)胞，800rpm×5min離心，用含0.2％ Triton-X100和5％血清的PBS 1ml重懸細(xì)胞，冰上放置10分鐘，800rpm×5min離心。Vpr兔多克隆抗體(Santa Cruz公司)1∶50稀釋，飽和劑量加入，冰上放置40分鐘，800rpm×5min離心，洗去未結(jié)合的一抗，重復(fù)一次；加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(SantaCruz公司)，冰上避光放置40分鐘后，800rpm×5min離心，去上清，PBS洗滌兩次，加入1％多聚甲醛0.5ml重懸細(xì)胞，上Coulter EPICS XL型流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度數(shù)值，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理表明，在甲胎蛋白表達(dá)陰性的SMMC-7721中沒(méi)有表達(dá)，而Vpr基因在甲胎蛋白表達(dá)陽(yáng)性的BEL-7402細(xì)胞中特異性表達(dá)(圖4)，充分表明Vpr的表達(dá)具有細(xì)胞特異性，即只有在表達(dá)AFP的細(xì)胞中才表達(dá)。
7.rvAdHREAFPVpr對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響以m.o.i＝50病毒量的rvAd-null、rv AdHREAFPVpr接種BEL-7402、SMMC-7721中，分別在接毒后的24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，棄去營(yíng)養(yǎng)液，加入適量細(xì)胞消化液后棄去消化液，加入5ml PBS吹打細(xì)胞，800rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞，吸入1ml一次性注射器中，緩慢的將細(xì)胞懸液滴加入3ml 70％乙醇中，4℃固定。PBS洗2次，加入含RNase A(終濃度40ug/ml，Sigma公司)的PBS 200ul，37℃水浴45分鐘，800rpm×5min離心，加入4℃ PBS 400ul，加入碘化丙錠(PI，Sigma公司)至終濃度50ug/ml，4℃放置45分鐘，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，Coulter EPICS XL型流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布。rvAdHREAFPVpr接種SMMC-7721細(xì)胞后，在各個(gè)時(shí)間相對(duì)于陰性對(duì)照rvAd-Null而言，重組腺病毒rvAdHREAFPVpr接種于AFP(-)的SMMC-7721，沒(méi)有引起SMMC-7721細(xì)胞周期G2期的特異性阻滯，而在AFP(+)的BEL-7402細(xì)胞內(nèi)則引起典型的細(xì)胞周期停滯。圖5為SMMC-7721和BEL-7402各時(shí)間段內(nèi)各個(gè)細(xì)胞周期DNA含量的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果?？梢?jiàn)重組腺病毒rvAdHREAFPVpr感染BEL-7402細(xì)胞96小時(shí)后G2期細(xì)胞可達(dá)50％，而在AFP(-)的細(xì)胞中則只有25％，二者差異顯著(p＜0.05)，表明重組腺病毒只能引起AFP(+)細(xì)胞的G2期停滯，與預(yù)先設(shè)計(jì)相符。
8.rvAdAFP-Vpr對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡作用(1)形態(tài)學(xué)觀察以完全RPMIl640培養(yǎng)液培養(yǎng)BEL-7402細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生化研究所細(xì)胞中心)，設(shè)立空白對(duì)照組、rvAd-null、rvAdHREAFPVpr組。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)24h，棄去rvAd-null、rvAdHREAFPVpr組培養(yǎng)中上清液，加入m.o.i＝50病毒液，吸附1h，棄病毒液，加入5ml正常細(xì)胞培養(yǎng)液?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞也同時(shí)換5ml正常培養(yǎng)液。分別在48h、72h、96h后，用胰酶消化法，制成細(xì)胞懸液，濃度1×107/ml。取95ul細(xì)胞懸液，加入5ul吖啶橙貯存液混勻，置室溫5～10min。吸一滴混合液點(diǎn)在潔凈玻片上，直接用蓋玻片封片。在激光共聚焦掃描電子顯微鏡(Leica公司)下觀察，正常細(xì)胞為圓形或橢圓形，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核為均勻綠色熒光。凋亡細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)周邊化，在核膜內(nèi)側(cè)形成新月體，或核碎裂成片段，分布在核膜周邊。還可見(jiàn)到出芽形成的凋亡小體。重組腺病毒rvAdHREAFPVpr感染BEL-7402(AFP+)細(xì)胞可以看到很多細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)變化，而rvAd-null則不明顯。
(2)細(xì)胞膜電位檢測(cè)以m.o.i＝50病毒量的rvAd-null、rvAdHREAFPVpr接種BEL-7402、SMMC-7721中，分別在接毒后的24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，棄去營(yíng)養(yǎng)液，加入適量細(xì)胞消化液后棄去消化液，PBS洗一次，800rpm離心5分鐘收集細(xì)胞。重懸細(xì)胞于無(wú)血清RPMIl640培養(yǎng)液中，加入Rhodamine 123使終濃度為0.5umol/L，37℃水浴20分鐘。用Coulter EPICSXL型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位，結(jié)果表明rvAd-null和rvAdHREAFPVpr接種SMMC-7721(AFP-)后，在觀察的三個(gè)時(shí)間段內(nèi)，雖然隨著時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)線粒體膜電位的下降，但rvAdHREAFPVpr和rvAd-Null兩組間無(wú)差異(P＞0.05)。rvAdHREAFPvpr接種BEL-7402細(xì)胞(AFP+)后，在各個(gè)時(shí)間相對(duì)于rvAd-Null，引起了明顯的BEL-7402線粒體膜電位下降(P＜0.05)，呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性，但在96h線粒體膜電位又有輕度上升(圖6)。
(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BEL-7402中與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以m.o.i＝50病毒量的rvAd-null、rvAdHREAFPVpr接種BEL-7402 96h后，收集細(xì)胞2×106個(gè)，用冷的PBS 2ml洗滌細(xì)胞一次，800rpm×5min離心。4％多聚甲醛2ml室溫固定細(xì)胞40分鐘，800rpm×5min離心。PBS 2ml重懸細(xì)胞，800rpm×5min離心，用含0.2％Triton-X100和5％血清的PBS1ml重懸細(xì)胞，冰上放置10分鐘，800rpm×5min離心。Bax、Caspase 9、Caspase8、Capase 3、細(xì)胞色素C多克隆抗體(均購(gòu)自SantaCruz公司)1∶50稀釋，飽和劑量加入，冰上放置40分鐘，800rpm×5min離心，洗去未結(jié)合的一抗，重復(fù)一次；加入FITC標(biāo)記的二抗，冰上避光放置40分鐘后，800rpm×5min離心，去上清，PBS洗滌兩次，加入1％多聚甲醛0.5ml重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Bax、Caspase 9、Caspase 8、Capase 3、細(xì)胞色素C等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，相對(duì)于以相同滴度rvAd-Null接種BEL-7402對(duì)照而言，Caspase 3、Caspase 9、細(xì)胞色素C表達(dá)都有所升高，而B(niǎo)ax蛋白有明顯升高，提示細(xì)胞凋亡過(guò)程被激活。圖7所示為各蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞儀結(jié)果。
9.rvAdHREAFPVpr在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BEL-7402細(xì)胞，經(jīng)0.25％胰蛋酶消化，離心去上清后用PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5×109/ml。用6號(hào)針頭的注射器吸取200ul細(xì)胞懸液，接種于裸鼠的前肢右腋下。選擇腫瘤生長(zhǎng)旺盛且無(wú)破潰，健康情況良好的荷瘤動(dòng)物，脫臼處死，固定于手術(shù)板上，用碘伏消毒動(dòng)物皮膚，無(wú)菌條件下在超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌剪刀剝離腫瘤，將瘤塊切成直徑為2mm左右的小塊，塞入套管針內(nèi)。在裸鼠前肢右腋旁邊用眼科剪刀剪一1cm左右豁口，套管針經(jīng)豁口進(jìn)入裸鼠前肢右腋皮下，將腫瘤組織小塊接種于此。共接種35只裸鼠，分5組第一組，空白對(duì)照組；第二組，rvAd-null治療組；第三組，rvAdHREAFPVpr治療組；第四組，環(huán)磷酰胺治療組；第五組，聯(lián)合用藥治療組(rvAdHREAFPVpr聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療組)。皮下接種瘤塊后的第三天開(kāi)始治療，瘤體內(nèi)多點(diǎn)直接注射rvAd-null、rvAdHREAFPVpr100ul。每周給藥兩次，共一個(gè)月。環(huán)磷酰胺組于第3天、第15天腹腔內(nèi)按100mg/kg注射兩次環(huán)磷酰胺。
裸鼠接種后，置入恒溫(25±2℃)、恒濕(45％-50％)無(wú)菌凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。定期觀察裸鼠精神、飲食和排便。用游標(biāo)卡尺每隔5天測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的長(zhǎng)徑a和短徑b，根據(jù)公式V＝1/2ab2計(jì)算腫瘤體積大小繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠剝離瘤塊，稱取每組瘤塊總重計(jì)算平均瘤重，按抑瘤率(％)＝(對(duì)照組瘤重-治療組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100％公式計(jì)算抑瘤率。
結(jié)果表明(圖8和表1)，空白對(duì)照組與rvAd-null相比，其腫瘤抑制能力沒(méi)有差別，說(shuō)明腺病毒載體本身對(duì)腫瘤無(wú)特異性抑瘤作用。與空白對(duì)照組和rvAd-null組相比，rvAdHREAFPVpr治療組能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)(P＜0.05)，其抑瘤率明顯高于rvAd-null，也高于環(huán)磷酰胺治療組，說(shuō)明由HRE-AFP啟動(dòng)子控制的Vpr在動(dòng)物體內(nèi)可特異性抑制肝癌細(xì)胞的增殖。
從表1還可以看出，rvAdHREAFPVpr不僅自身具有腫瘤的抑制作用，而且還與環(huán)磷酰胺等化療藥物具有協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤抑制作用，其腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用和抑瘤率均明顯高于單獨(dú)的rvAdHREAFPVpr和環(huán)磷酰胺治療組，提示該重組病毒對(duì)化療具有增強(qiáng)作用。
按上文方法，將各組動(dòng)物處死后，立即取腫瘤組織進(jìn)行病理切片，采用TdT介導(dǎo)的脫氧核苷酸原位末端標(biāo)記法(TUNEL法，試劑盒購(gòu)自Promega公司)染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞，以細(xì)胞核呈棕黃色染色者為凋亡細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)均按試劑盒說(shuō)明書操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第一組的腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞很罕見(jiàn)，而在第三、四、五組細(xì)胞中均見(jiàn)到很多凋亡細(xì)胞(圖9)，說(shuō)明重組腺病毒rvAdHREVpr在動(dòng)物體內(nèi)可以誘導(dǎo)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡，與預(yù)期結(jié)果相符。
從表1可以看出，單純腺病毒治療組的終末平均體重要高于環(huán)磷酰胺和腺病毒+環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療組，說(shuō)明腺病毒的毒副作用(對(duì)裸鼠生長(zhǎng)的抑制作用)要低于環(huán)磷酰胺等化療藥物，但是其抑瘤作用要強(qiáng)于環(huán)磷酰胺，顯示基因治療的優(yōu)勢(shì)。
上述結(jié)果表明，HRE-AFP啟動(dòng)子控制Vpr表達(dá)的重組腺病毒可特異性誘導(dǎo)AFP(+)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期G2期停滯、細(xì)胞凋亡，對(duì)小鼠體內(nèi)的腫瘤具有明顯的抑制作用并與化學(xué)治療有協(xié)同作用。由是推之，本發(fā)明的思路也適用于其他組織(腫瘤)特異性啟動(dòng)子。
表1重組腺病毒rvAdHREAFPVpr的抑瘤作用

實(shí)施例二除非另外指出，本實(shí)施例中具體實(shí)驗(yàn)操作均同實(shí)施例一。
研究表明，放射治療可使腫瘤細(xì)胞處于G2期停滯，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)施例的內(nèi)容是在腺病毒載體中用射線啟動(dòng)子(Egr-1)控制HIV Vpr基因的表達(dá)，證明該制劑在射線誘導(dǎo)后對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性增強(qiáng)細(xì)胞周期G2停滯的作用，從而可以增強(qiáng)腫瘤放射治療的效果。具體步驟如下1.重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttleEgrVpr的構(gòu)建(1)用Sal I(5’端)和BamH I(3’端)雙酶切含有射線反應(yīng)性啟動(dòng)子(Egr-1)的pE425，(見(jiàn)Seung LP，Mauceri HJ，Beckett MA，Hallahan DE，HellmanS，Weichselbaum RR.Genetic radiotherapy overcomes tumor resistance to cytotoxic agents.Cancer Res，1995，555561-5.)，獲得一450bp大小的Egr啟動(dòng)子片段。體系緩沖液T2ul；BamH I 1ul；Sal I 1ul；pE425 10ul；水6ul(以上酶及緩沖液購(gòu)于Takara公司)。
(2)Xho I和BamH I雙酶切pCDNAII(Invitrogen公司)制備粘端連接載體片段。體系緩沖液K2ul；BamH I 1ul；Xho I 1ul；pCDNAII 10ul；水6ul(以上酶及緩沖液購(gòu)于Takara公司)。
(3)利用Sal I和Xho I酶是同尾酶的特性，片段和載體可在同一體系建立連接反應(yīng)，連接后此酶切位點(diǎn)消失。體系連接緩沖液2ul；載體片段pCDNAII 1ul；目的片段Egr啟動(dòng)子片段5ul；連接酶1ul；水11ul。(以上酶及緩沖液購(gòu)于Takara公司)，得到重組質(zhì)粒pCDNAII-Egr。
(4)Xba I和Hind III雙酶切pCDNAII-Egr，回收小片段Egr啟動(dòng)子目的片段，將其插入腺病毒穿梭載體pShuttle相應(yīng)位點(diǎn)。體系Xba I 1ul；HindIII 1ul；緩沖液M 2ul；pCDNAII-Egr或pShuttle 5ul；水11ul。(以上酶及緩沖液購(gòu)于Takara公司)。然后將Egr啟動(dòng)子插入pShuttle載體。連接反應(yīng)體系連接緩沖液2ul；載體片段pShuttle 1ul；目的片段Egr啟動(dòng)子片段5ul；連接酶1ul；水11ul。(以上酶及緩沖液購(gòu)于Takara公司)，得到重組質(zhì)粒pShuttleEgr。
(5)Xba I酶切pShuttle-Egr，無(wú)水乙醇沉淀法回收片段后，建立補(bǔ)平反應(yīng)體系10X緩沖液，2ul；10X BSA，2ul；dNTP，2ul；Klenow酶，1ul；ddH2O，13ul。室溫反應(yīng)10分鐘，75℃終止反應(yīng)10分鐘。進(jìn)行無(wú)水乙醇沉淀法回收片段。
(6)Bgl II再酶切已補(bǔ)平的線性化pShuttle-Egr，回收小片段Egr啟動(dòng)子。
(7)Nhe I酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，Klenow酶補(bǔ)平，方法同上。
(8)Bgl II再酶切已補(bǔ)平的線性化pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，切去hcEgr啟動(dòng)子，回收大片段載體。
(9)小片段Egr啟動(dòng)子和大片段載體的連接建立一端粘端、一端平端的連接反應(yīng)。獲得重組腺病毒穿梭載體pShuttleEgrVpr。
2.重組腺病毒質(zhì)粒pAdEgrVpr的獲得用堿裂解法小量制備克隆有Vpr的重組穿梭質(zhì)粒pShuttleEgrVpr及腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，溶解于50μl ddH2O中備用。
(1)重組穿梭質(zhì)粒的線性化與回收取約500ng重組穿梭質(zhì)粒，分別用Pme I(Biolabs公司)單酶切以線性化，加水將體積補(bǔ)至200μl，加入20μl 3mol/L乙酸鈉，再加入2～2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，-20℃沉淀過(guò)夜，次日15,000rpm離心10min，75％乙醇洗一次，晾干后溶解于6μl ddH2O中，備用。
(2)用線性化的重組穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183分別取出約100ng pAdEasy-1、上述經(jīng)線性化處理過(guò)的重組穿梭質(zhì)粒和-70℃保存?zhèn)溆玫腂J5183電轉(zhuǎn)化菌，按下述方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)化將BJ5183電轉(zhuǎn)化菌置于冰水浴中緩慢解凍，同時(shí)將預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)杯繼續(xù)置于冰水浴中，將pAdEasy-1、線性化的穿梭質(zhì)粒加入到含有BJ5183的Ep管中，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)化杯中，電穿孔的條件為2,500V、200Ohms和25mFD，電穿孔完成后，立即用1ml SOC培養(yǎng)液(配方見(jiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)[M].北京科學(xué)出版社，2002)懸浮電轉(zhuǎn)化混合物，37℃慢搖10min，取細(xì)菌懸液分別涂入卡那霉素(Kan)培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)16～20h，挑選10～20個(gè)較小的菌落，接種Kan的LB培養(yǎng)液中，置37℃搖床，培養(yǎng)10～15h，堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，用0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析，并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶圖譜分析。得到重組腺病毒質(zhì)粒pAdEgrVpr。
3.重組腺病毒rvAdEgrVpr的獲得(1)用Pac I酶切重組的腺病毒質(zhì)粒pAdEgrVpr，完全消化以去除ori和kan抗性基因等質(zhì)粒構(gòu)件，并暴露其倒置末端重復(fù)序列(ITR)。將pAdEgrVpr質(zhì)粒用氯化鈣法重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(Invitrogen公司)，挑取單克隆，接種至3ml含Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖8h，按照1/500的比例將培養(yǎng)菌接種至25ml含Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖12～16h。利用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司)提取質(zhì)粒，將所得質(zhì)粒溶于100μl TE(PH8.0)中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的量約250ng/μl。
取20μl pAdEgrVpr DNA用Pac I酶切，酶切后產(chǎn)物加入ddH2O將體積補(bǔ)足200μl，加入20μl 3mol/L乙酸鈉，再加入2～2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，-20℃沉淀過(guò)夜，次日15,000rpm離心10min，75％乙醇洗一次，晾干后溶解于20μl無(wú)菌的ddH2O中，備用。
(2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293細(xì)胞傳至12.5cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至50％～70％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將Pac I酶切線性化后的重組腺病毒DNA 20μl及6μl的Lipofectine 2000(Invitrogen公司)分別與100μl M溶液(M溶液為無(wú)血清、無(wú)抗生素的含有谷氨酰胺及碳酸氫鈉的DMEM培養(yǎng)液，Invitrogen公司)充分混勻，室溫下溫育15min，混合兩種懸液，室溫繼續(xù)作用30min。在上述等待的時(shí)間內(nèi)，移去293細(xì)胞的原培養(yǎng)液，用4ml M溶液小心洗細(xì)胞一次。補(bǔ)加800μl M溶液至Lipofectine-DNA的復(fù)合物中，充分混勻后，輕輕加入細(xì)胞瓶中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱，溫育3～5h。補(bǔ)加2ml含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過(guò)夜。次日，吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，補(bǔ)加2ml含2％小牛血清的MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞。7～14d左右，293細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變圓等細(xì)胞病變(CPE)，收集病變細(xì)胞連同上清凍存于-20℃。重懸細(xì)胞反復(fù)凍融三次，使細(xì)胞完全破碎，凍融三次后離心，取上清接種一瓶293細(xì)胞，加入含2％小牛血清的DMEM維持液，逐日觀察，7d左右出現(xiàn)細(xì)胞病變。將獲得的重組腺病毒命名為rvAdEgrVpr。重組腺病毒的PCR與Southern blot檢測(cè)與實(shí)施例1相同。
4.rvAdEgrVpr的放療增強(qiáng)作用以m.o.i＝50病毒量的rvAdEgrVpr感染U251細(xì)胞(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞與生物化學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù))中，在感染后的48小時(shí)，分別用5Gy、10Gy劑量照射細(xì)胞。棄去營(yíng)養(yǎng)液，加入適量細(xì)胞消化液后棄去消化液，加入5ml PBS吹打細(xì)胞，800rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞，吸入1ml一次性注射器中，緩慢的將細(xì)胞懸液滴加入3ml 70％乙醇中，4℃固定。PBS洗2次，加入含RNase A(終濃度40ug/ml，Sigma公司)的PBS 200ul，37℃水浴45分鐘，800rpm×5min離心，加入4℃PBS 400ul，加入碘化丙錠(PI，Sigma公司)至終濃度50ug/ml，4℃放置45分鐘，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，Coulter EPICS XL型流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布。發(fā)現(xiàn)未經(jīng)任何處理的細(xì)胞G2期細(xì)胞所占比例很低，只有3％。用5Gy劑量照射細(xì)胞后，接種重組腺病毒組G2期細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于只用射線劑量組(p＜0.05)，并且G2期細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到了只用射線照射組10Gy照射時(shí)的水平，說(shuō)明Vpr有增強(qiáng)放射治療的效果(圖10)。
序列表<110>王健偉 魏強(qiáng) 洪濤<120>一種腫瘤治療劑及其用途<130>1040002<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>56<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1catagatctg cgtggggcgg cgtggggcgg cgtggggcgg ccccgttgac gcaaat 56<210>2<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2tatgatatct accacatttg tagaggt 27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
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<400>4tatacgcgtc taggatctac tggctcc 27<210>5<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5tatgctagca tggaacaagc cccagaa 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6tatacgcgtc taggatctac tggctcc 27<210>7<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7gagctcttac gcgtgcta18<210>8<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>8gcgatccggt gttatt 1權(quán)利要求
1.一種腫瘤治療劑，其中含有人類免疫缺陷病毒Vpr基因，該基因處于一種啟動(dòng)子的控制之下，可以在腫瘤組織中特異性表達(dá)。
2.按照權(quán)利要求1的治療劑，其中所述Vpr基因位于選自以下的任意載體上腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、腺病毒相關(guān)病毒以及質(zhì)粒載體。
3.權(quán)利要求2的治療劑，其中所述載體是腺病毒載體。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的治療劑，其中所述啟動(dòng)子選自腫瘤組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和它們的雜合啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求4的治療劑，其中所述腫瘤組織特異性啟動(dòng)子選自甲胎蛋白啟動(dòng)子、癌胚抗原啟動(dòng)子、前列腺抗原啟動(dòng)子、端粒酶啟動(dòng)子、E2F-1啟動(dòng)子、Flk-1啟動(dòng)子、E-selectin啟動(dòng)子、HK-II啟動(dòng)子、c-ebrB2啟動(dòng)子、L-Plastin啟動(dòng)子和SLP-I啟動(dòng)子，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自低氧反應(yīng)元件啟動(dòng)子、射線誘導(dǎo)啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子、金屬誘導(dǎo)啟動(dòng)子和四環(huán)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求4的治療劑，其中所述雜合啟動(dòng)子是甲胎蛋白—低氧反應(yīng)元件啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求1的治療劑，其為重組腺病毒rvAdHREAFPVpr。
8.權(quán)利要求1的治療劑，其為重組腺病毒rvAdEgrVpr。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的治療劑在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的治療劑在制備腫瘤化學(xué)治療和放射治療的增強(qiáng)劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤的基因治療。更具體而言，本發(fā)明涉及一種新的腫瘤治療劑和其用途。本發(fā)明的腫瘤治療劑含有人類免疫缺陷病毒Vpr基因，該基因處于一種啟動(dòng)子的控制之下，在腫瘤組織中特異性表達(dá)。該腫瘤治療劑可用于腫瘤的治療，也可以作為腫瘤化學(xué)治療或者放射治療的增強(qiáng)劑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1669585SQ20041000878
公開(kāi)日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者王健偉, 魏強(qiáng), 洪濤 申請(qǐng)人:王健偉, 魏強(qiáng), 洪濤