專利名稱：伴侶蛋白10的免疫抑制作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療移植物抗宿主疾病，和其他移植物相關(guān)的免疫學(xué)反應(yīng)和疾病的方法。更具體的是，本發(fā)明涉及使用伴侶蛋白10預(yù)防和治療移植物抗宿主疾病的方法。
背景技術(shù)：
移植物抗宿主疾病(GVHD)是當(dāng)免疫活性細(xì)胞(immunologically-competent cell)被導(dǎo)入個(gè)體體內(nèi)時(shí)，例如在骨髓或干細(xì)胞移植過(guò)程中，發(fā)生的一種疾病。GVHD是指一種免疫學(xué)過(guò)程，是通過(guò)新移植的細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)宿主組織的排斥反應(yīng)。GVHD可在移植或輸入骨髓組織、造血干細(xì)胞、未被照射的血液制品和含有淋巴組織的實(shí)體器官后發(fā)生。
有兩種類型的GVHD，即急性和慢性的GVHD。急性GVHD在移植后的頭三個(gè)月內(nèi)發(fā)生，臨床癥狀包括皮炎、腸炎和肝炎。慢性GVHD通常在移植三個(gè)月以后發(fā)生，是一種影響多器官和組織，如皮膚、胃腸道和肝臟的自體免疫綜合征。
供體T細(xì)胞可激發(fā)GVHD的發(fā)生。供體細(xì)胞識(shí)別宿主細(xì)胞抗原為外源物質(zhì)，并通過(guò)增殖和釋放細(xì)胞因子發(fā)生應(yīng)答，這些細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)活化自體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。
同種異體骨髓移植或造血細(xì)胞移植仍然是治療惡性血液疾病如，白血病、骨髓瘤、淋巴瘤和再生障礙性貧血的最有效方法。嚴(yán)重的急性GVHD是骨髓移植過(guò)程中引起死亡和疾病的主要原因。慢性GVHD也可引起死亡，其幸存者經(jīng)常是嚴(yán)重殘疾。
免疫抑制藥物在急性和慢性GVHD的預(yù)防、治療和處理中具有很重要的地位。該藥物可在移植之前和之后給予患者。目前用于治療GVHD的藥物包括環(huán)孢霉素、氨甲喋呤、他克莫司、西羅莫司(sacrolimus)、麥考酚酸嗎啉乙酯和類固醇。免疫抑制方案通常通過(guò)給予多種藥物的組合來(lái)取得最大作用。
伴侶蛋白10(cpn10)存在于多種生物體中，從細(xì)菌到人類，是熱休克蛋白家族(伴侶)的成員，是現(xiàn)有的進(jìn)化最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)之一。伴侶分子涉及翻譯后折疊、靶向和其他蛋白質(zhì)的組裝(Hartman等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，3394-8)，但它們本身不構(gòu)成最終組裝結(jié)構(gòu)的一部分(Ellis等人，1991，Annu.Rev.Biochem.60，321-47)。這些蛋白質(zhì)在正常細(xì)胞中起一些基本的作用，但在細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程(例如，代謝紊亂、感染、炎癥、轉(zhuǎn)化)中其產(chǎn)生被上調(diào)。
出乎意料地發(fā)現(xiàn)伴侶蛋白10與早孕因子(EPF)具有相同的氨基酸序列(Morton等人，國(guó)際專利公開WO 95/15338)。EPF是一種與妊娠相關(guān)的物質(zhì)，出現(xiàn)在受精后6-24小時(shí)內(nèi)的母體血清中(Morton等人，1974，Nature，249；459-460和Morton等人，1976，Proc.R.Soc.Lond.，193；413-9)。它至少存在于妊娠的前半期，對(duì)胚胎的持續(xù)生長(zhǎng)和存活是非常重要的(Morton等人，1987，Current Topics in Developmental Biology 23；73-92)。現(xiàn)在清楚的是EPF具有許多生理學(xué)功能，其產(chǎn)生并不限于妊娠。
已有報(bào)道EPF可作為一種來(lái)自淋巴細(xì)胞的免疫抑制劑，釋放抑制因子(Rolfe等人，1988，Clin.Exp.Immunol.73，219-225)，并增強(qiáng)免疫抑制性抗淋巴細(xì)胞血清的玫瑰花抑制特性(rosette-inhibiting property)(Morton等人，1974和1976，見前)。EPF可抑制小鼠對(duì)2，4，6-三硝基氯苯的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(Noonan等人，1979，Nature，278，649-51)，抑制有絲分裂原誘發(fā)的淋巴細(xì)胞增殖作用(Athanasas-Platsis，1993，PhDThesis，The University of Queensland)并抑制CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ。
但是，沒有直接的證據(jù)證實(shí)EPF或cpn10是否可能作為移植中的免疫抑制劑的能力，特別是在GVHD的預(yù)防中。伴侶蛋白60，是一種相關(guān)的熱休克蛋白，也可作為免疫抑制劑，還沒有顯示在GVHD中具有任何治療作用。實(shí)際上，以前的文獻(xiàn)教導(dǎo)熱休克蛋白對(duì)移植可產(chǎn)生副作用(Ogita等人，2000，Transplantation，69，2273-2277)。
發(fā)明目的本發(fā)明者已經(jīng)意識(shí)到現(xiàn)在用于治療和處理GVHD的免疫抑制劑具有下列明顯缺陷(i)它們可誘發(fā)嚴(yán)重的副作用，例如高血壓，其需要另外用藥控制；中毒性腎損害(腎中毒，nephrotoxicity)，可在高達(dá)40％的患者中發(fā)生，經(jīng)常迫使醫(yī)生使用藥物的亞最佳劑量來(lái)抑制這種毒性；CNS作用，如震顫、頭痛、抑郁、感覺異常、視力障礙和痙攣；細(xì)菌、真菌或病毒感染的機(jī)會(huì)增加，癌癥，特別是皮膚癌發(fā)生的機(jī)會(huì)增加，食欲減退，惡心和毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)度；(ii)在很大比例的患者中GVHD對(duì)藥物是有抗性的，需要組合藥物治療；(iii)這種藥物非常昂貴；(iv)已經(jīng)證明這些藥物與其他治療藥物、免疫作用和天然食物具有負(fù)性的相互作用，這種治療藥物如抗生素，NSAID，抗癲癇藥和抗真菌劑，這種免疫作用，如風(fēng)疹和脊髓灰質(zhì)炎，這種天然食物如葡萄柚(在環(huán)孢菌素的情況下)。
因此，開發(fā)與現(xiàn)在所使用的治療方法相比，具有更小的副作用，并對(duì)市場(chǎng)上現(xiàn)有藥物有抗性的患者更有效的新型藥物來(lái)治療和處理GVHD，在市場(chǎng)上具有巨大的需求。
本發(fā)明者出乎意料地發(fā)現(xiàn)cpn10可作為一種新的治療方法，在GVHD的治療和處理中具有巨大的臨床潛力。

發(fā)明內(nèi)容
在廣義上，本發(fā)明致力于在移植中應(yīng)用cpn10，特別是治療和/或預(yù)防移植物抗宿主疾病中應(yīng)用cpn10。
在廣義形式上，本發(fā)明提供了將cpn10給予供體和/或受體動(dòng)物或細(xì)胞、來(lái)自供體的組織或器官，盡管本發(fā)明特別有優(yōu)勢(shì)的方面是提供對(duì)供體和受體動(dòng)物的治療。
因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療性或預(yù)防性處理移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，包括以下步驟(i)給予供體動(dòng)物或細(xì)胞、來(lái)自該動(dòng)物的器官或組織藥學(xué)有效量的伴侶蛋白10(cpn10)或cpn10的衍生物；并(ii)給予受體動(dòng)物藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物，以延緩、減輕、抑制或進(jìn)一步減少移植一種或多種細(xì)胞、組織或器官給受體動(dòng)物后產(chǎn)生的一種或多種GVHD癥狀。
優(yōu)選在步驟(ii)之前或之后均給予受體動(dòng)物藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物。
優(yōu)選給予動(dòng)物的藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10衍生物的范圍在0.1-100mg每千克/體重之間。更優(yōu)選，其范圍在0.1-10mg每千克/體重之間。
優(yōu)選，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
優(yōu)選哺乳動(dòng)物是人。
較合適的是，細(xì)胞、組織或器官是骨髓或來(lái)自骨髓。
較合適的是，治療或預(yù)防性治療GVHD的方法進(jìn)一步包括下列的步驟，即給予所述的供體動(dòng)物和/或所述的受體動(dòng)物至少另一種選自環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和氨甲喋呤的免疫抑制劑。
較合適的是，治療或預(yù)防性治療GVHD的方法進(jìn)一步包括給予所述供體動(dòng)物和/或所述受體動(dòng)物類固醇的步驟。
在第二個(gè)方面，提供了抑制、阻止或進(jìn)一步減少動(dòng)物產(chǎn)生TNFα的方法，包括給予所述動(dòng)物藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10衍生物的步驟，以抑制、阻止或進(jìn)一步減少所述動(dòng)物中TNFα的產(chǎn)生。
優(yōu)選動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
優(yōu)選動(dòng)物是人。
根據(jù)這個(gè)方面，本發(fā)明也提供了一種抑制、阻止或進(jìn)一步減少?gòu)膭?dòng)物獲得的一種或多種細(xì)胞、組織或器官產(chǎn)生的TNFα的方法，其包括以下步驟，即給予所述細(xì)胞、組織或器官藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10衍生物以抑制所述動(dòng)物產(chǎn)生TNFα。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)、擴(kuò)大或進(jìn)一步增加動(dòng)物IL-10產(chǎn)生的方法，包括以下的步驟，即給予所述動(dòng)物藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10衍生物，以誘導(dǎo)、擴(kuò)大或進(jìn)一步增加所述動(dòng)物中IL-10的產(chǎn)生。
優(yōu)選動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
優(yōu)選哺乳動(dòng)物是人。
根據(jù)這個(gè)方面，本發(fā)明也提供了誘導(dǎo)、擴(kuò)大或進(jìn)一步增加來(lái)自動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞、組織或器官產(chǎn)生TNFα的方法，其包括以下的步驟，即給予所述細(xì)胞、組織或器官藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10衍生物以誘導(dǎo)所述動(dòng)物產(chǎn)生IL-10。
在第四個(gè)方面，提供了一種藥學(xué)組合物，可根據(jù)任何前述的方面中的方法應(yīng)用，其含有藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10衍生物，以及一種藥學(xué)可接受的載體，賦形劑或稀釋液。
優(yōu)選另一種免疫抑制劑中至少一種是一種免疫抑制藥物，或針對(duì)B或T淋巴細(xì)胞或介導(dǎo)它們活化的表面受體的特異抗體。
優(yōu)選，該免疫抑制藥物是環(huán)孢霉素、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和氨甲喋呤中的任何一種。
在第五個(gè)方面，提供了含有類固醇的第四個(gè)方面的藥學(xué)組合物。
優(yōu)選，所述的cpn10蛋白具有

圖1(SEQ ID NO1)中所示的氨基酸序列。
在本說(shuō)明書中，″含有″被廣泛使用而不是專用，應(yīng)被理解為包含所述的整數(shù)或一組整數(shù)，但不排除任何其他的整數(shù)或整數(shù)組。
附表簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1cpn10蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2體內(nèi)cpn10治療對(duì)LPS和同種抗原誘導(dǎo)的小鼠腹膜巨噬細(xì)胞促炎應(yīng)答和T細(xì)胞分化的作用。
圖3骨髓移植的和移植后用cpn10治療的小鼠的存活。在移植后的時(shí)間(0天至21天)，動(dòng)物皮下注射載體(同系，n＝8，同種異體對(duì)照組，n＝10)或cpn10(10和100μg/動(dòng)物/天cpn10 10μg/天，同種異體，n＝10和cpn10 100μg/天，同種異體，n＝10)。B.小鼠GVHD臨床計(jì)分與時(shí)間的作圖(0-45天；**P＜0.01)。
圖4骨髓移植的和移植前用cpn10治療的小鼠的存活。受體和供體小鼠移植前皮下注射cpn10(100μg/天)或?qū)φ障♂屢?天。然后產(chǎn)生5組動(dòng)物第1組同系對(duì)照(n＝8)表示為B6D2F1，移植了同系的B6D2F1骨髓和T細(xì)胞；第2組由稀釋液預(yù)處理的B6D2F1受體組成的同種異體對(duì)照(n＝10)移植了稀釋液預(yù)處理的B6供體細(xì)胞；第3組預(yù)處理的同種異體受體(n＝10)，受體B6D2F1小鼠移植前用cpn10處理，移植B6供體細(xì)胞預(yù)處理的載體；第4組用稀釋液預(yù)處理的受體B6D2F1小鼠僅接受cpn10預(yù)處理的B6供體的移植物(同種異體預(yù)處理的供體，n＝10)；和第5組B6D2F1受體和B6供體小鼠在移植前均用cpn10預(yù)處理(同種異體預(yù)處理的受體和供體，n＝10)。(與同種異體對(duì)照相比*P＜0.01)。B.小鼠的GVHD臨床計(jì)分與時(shí)間的作圖(0-30天；***P＜0.001)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明者已經(jīng)證明了cpn10在小鼠體內(nèi)移植模型中具有顯著的免疫抑制活性，cpn10的處理可提高患有GVHD的小鼠的生存率。這是第一次證實(shí)了cpn10的有效的免疫抑制作用和在體內(nèi)GVHD模型中增加的生存率。
如果供體和受體動(dòng)物在移植手術(shù)之前都用cpn10處理，cpn10處理的效果是增加的。本發(fā)明也證實(shí)了cpn10可抑制脂多糖介導(dǎo)的TNFα分泌，并促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。IL-10是一種有效的免疫抑制性細(xì)胞因子，其對(duì)LPS發(fā)生獲得性和先天性免疫應(yīng)答的有效抑制劑。
同種異體骨髓移植(BMT)后的急性GVHD是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，其中供體T細(xì)胞可識(shí)別異種的宿主抗原，并以Th1顯性的方式分化。得到的T細(xì)胞來(lái)源的Th1細(xì)胞因子當(dāng)與脂多糖(LPS)接觸時(shí)，可激發(fā)供體的單核細(xì)胞釋放可引起細(xì)胞病變數(shù)量的炎性細(xì)胞因子(如，TNFα)。LPS可從GVHD和以前放射治療損壞的胃腸道粘膜中滲透出來(lái)。因此，TNFα以及產(chǎn)生的失調(diào)的細(xì)胞毒性細(xì)胞因子可一起誘導(dǎo)宿主組織發(fā)生凋亡。T細(xì)胞定向的免疫抑制作用，特別是可抑制IL-2產(chǎn)生的藥物可防止BMT模型中GVHD的死亡率。
本發(fā)明在骨髓移植方面進(jìn)行了舉例說(shuō)明。但要理解的是這種概念可應(yīng)用于其他細(xì)胞、組織和器官，其包括能夠啟動(dòng)宿主免疫應(yīng)答的免疫活性細(xì)胞。這些細(xì)胞、組織或器官的非限制性實(shí)例包括肝、肺、心、腎和干細(xì)胞和祖細(xì)胞。
在此描述的發(fā)明可廣泛用于任何動(dòng)物，但特別針對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。例如，本發(fā)明針對(duì)家畜、家養(yǎng)動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物和表演動(dòng)物(例如，賽馬和駱駝)的移植。
對(duì)于本發(fā)明而言，“分離的”的含義是指已經(jīng)從其天然狀態(tài)或經(jīng)過(guò)人為處理移出的物質(zhì)。分離的物質(zhì)實(shí)質(zhì)上或基本上去掉了在其天然狀態(tài)中與其正常相伴隨的成分，或被處理以與其天然狀態(tài)中正常伴隨的成分處于人造的狀態(tài)。分離的物質(zhì)可以是天然的、化學(xué)合成的或重組的形式。
“蛋白質(zhì)”是指氨基酸聚合物。如本領(lǐng)域中所熟知的那樣，氨基酸可以是D-和L-型的天然的或非天然的氨基酸。
“肽”是具有不超過(guò)50個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
“多肽”是具有超過(guò)50個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”是指單鏈或雙鏈mRNA，RNA，cRNA，RNAi和DNA，包括cDNA和基因組DNA。
“免疫抑制劑”是指可預(yù)防或治療性抑制自體免疫，或針對(duì)移植的同種異體或異種細(xì)胞、組織或器官的免疫應(yīng)答，或防止移植物抗宿主疾病。
優(yōu)選給予個(gè)體的藥學(xué)有效量的cpn10的范圍在0.1-100mg之間。
更優(yōu)選給予個(gè)體的藥學(xué)有效量的cpn10的范圍在0.1-10mg之間。
普通技術(shù)人員可以理解的是前述的藥學(xué)有效量是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的70kg人來(lái)計(jì)算的。因此，用藥量可根據(jù)個(gè)體的體重、年齡、性別、一般健康狀況和適應(yīng)情況，以及個(gè)體進(jìn)行的任何其他治療而變化。而且，給予的cpn10的量要同時(shí)考慮給藥頻次和給藥時(shí)間。
也可理解的是前述的藥物有效量的cpn10可給予動(dòng)物，例如家養(yǎng)動(dòng)物和家畜。對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言用藥量可根據(jù)動(dòng)物的體重和類型而改變是很淺顯的。
給予人或其他動(dòng)物的cpn10可以是任何形式的分離的cpn10，包括但不限于重組的cpn10(SEQ ID NO1)、天然cpn10、聚乙二醇化的cpn10、重組cpn10-GSM或cpn10的任何其他衍生蛋白質(zhì)。
合適的cpn10核苷酸和氨基酸序列在本領(lǐng)域中是為人所熟知的，但是為了方便普通技術(shù)人員引用下列哺乳動(dòng)物的cpn10序列(i)人cpn10(NCBI Entrez登記號(hào)No.U07550；Chen等人，1994，Biochim.Biophys.Acta，1219，189-190)(ii)鼠cpn10(NCBI Entrez登記號(hào)No.U09659；Dickson等人，1994，J.Biol.Chem.，269，26858-864)；和(iii)大鼠cpn10(NCBI Entrez登記號(hào)No.X71429；Ryan等人，1994，F(xiàn)EBS Lett.，337，152-156)。
在移植手術(shù)前，供體和受體均用cpn10治療。
優(yōu)選供體在移植手術(shù)之前不超過(guò)7天接受cpn10治療。更優(yōu)選供體在移植手術(shù)之前2至5天接受cpn10治療。
優(yōu)選受體在移植手術(shù)前不超過(guò)7天接受cpn10治療，在手術(shù)后不超過(guò)90天接受cpn10治療。更優(yōu)選的是，受體在移植手術(shù)前2至5天接受cpn10治療，手術(shù)后不超過(guò)60天接受cpn10治療。更為優(yōu)選的是，受體在移植手術(shù)前2至5天接受cpn10治療，在手術(shù)后10至30天接受cpn10治療。
本文所使用的，本發(fā)明的“衍生”蛋白質(zhì)是一些如cpn10蛋白的蛋白質(zhì)，它已經(jīng)通過(guò)例如與其他化學(xué)成分交聯(lián)或絡(luò)合，或通過(guò)如本領(lǐng)域所知的翻譯后修飾技術(shù)被改變，包括融合伴侶蛋白。
本發(fā)明考慮的其他衍生作用包括但不限于，在肽、多肽或蛋白合成過(guò)程中聚乙二醇化進(jìn)行側(cè)鏈的修飾，摻入非天然氨基酸和/或其衍生物，和使用交聯(lián)劑和可將構(gòu)象約束(conformaional constraint)施加于本發(fā)明的多肽、片段和變異體上的其他方法。本發(fā)明所考慮的側(cè)鏈修飾的實(shí)例包括氨基基團(tuán)的修飾，如醋酸酐的酰化；琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐對(duì)氨基基團(tuán)的?；患谆鶃啺敝鹨宜狨?methylacetimidate)的瞇基化；氰酸鹽對(duì)氨基基團(tuán)的氨基甲酰化；5-磷酸吡哆醛對(duì)賴氨酸的吡哆化，然后用NaBH4還原；與乙醛反應(yīng)進(jìn)行還原性烷基化反應(yīng)，然后用NaBH4還原；并用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)對(duì)氨基基團(tuán)進(jìn)行三硝基芐基化。
羧基通過(guò)形成O-acylisourea可被碳化二亞胺活化，隨后衍化為、例如相應(yīng)的酰胺。
精氨酸殘基的胍基可通過(guò)使用一些如2，3-丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛的試劑形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物而被修飾。
巰基可通過(guò)如下列的方法進(jìn)行修飾，如過(guò)甲酸氧化為半胱磺酸；使用4-氯汞基硫酸苯酯、4-氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚、苯基氯化汞和其他的汞劑形成汞衍生物；與其他的硫醇化合物形成混合二硫化物；與馬來(lái)酰亞胺、馬來(lái)酸酐或其他被取代的馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)；與碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化作用；和與氰酸鹽在堿性pH條件下的甲氨酰化作用。
色氨酸殘基可被修飾，例如2-羥基-5-硝基芐基溴化物或磺酰鹵對(duì)吲哚環(huán)的烷基化作用；或N-溴代丁二酰亞胺的氧化作用。
酪氨酸殘基可通過(guò)四硝基甲烷的硝化作用形成3-硝基酪氨酸衍生物而被修飾。
組氨酸殘基的咪唑環(huán)可通過(guò)焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化或通過(guò)碘乙酸衍生物的烷基化作用而被修飾。
在肽合成過(guò)程中摻入非天然氨基酸的實(shí)例包括但不限于，使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、t-丁基甘氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。
衍生物也可包括融合伴侶(fusion partner)和抗原決定簇標(biāo)志。熟知的融合伴侶的實(shí)例包括但不限于，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，人IgG的Fc部分，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和六聚組氨酸(HIS6)，特別用于親和色譜分離融合蛋白。為了使用親和色譜進(jìn)行融合多肽純化，親和色譜的相應(yīng)基質(zhì)分別是谷胱甘肽-，直鏈淀粉-，和鎳-或鈷-交聯(lián)的樹脂。許多這樣的基質(zhì)可在“試劑盒”中獲得，如使用(HIS6)融合伴侶的QIAexpressTM系統(tǒng)(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統(tǒng)。
如Ryan等人(見前)所述，融合伴侶的一個(gè)特殊實(shí)例是GST。在一些情況下，融合伴侶也具有蛋白酶裂解位點(diǎn)，如因子Xa或凝血酶的位點(diǎn)，可使相關(guān)的蛋白酶部分地消化本發(fā)明的融合多肽，從而從中釋放本發(fā)明的重組多肽。然后，釋放的多肽通過(guò)隨后的色譜分離從融合伴侶中分離。例如在裂解GST-cpn10的過(guò)程中，產(chǎn)生了衍生的GSM-cpn10蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的融合伴侶也包括在“抗原決定簇標(biāo)志”的范圍內(nèi)，而抗原決定簇標(biāo)志通常是可獲得特異抗體的短肽序列。熟知的很容易獲得特異單克隆抗體的抗原決定簇標(biāo)志包括c-myc、血細(xì)胞凝集素和FLAG標(biāo)志。
本發(fā)明的cpn10蛋白(包括片段、變異體、衍生物和同系物)可通過(guò)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的任何合適的方法來(lái)制備，包括化學(xué)合成和重組表達(dá)。
優(yōu)選cpn10是重組cpn10。
例如，該重組cpn10蛋白可通過(guò)包括下列步驟的方法來(lái)制備(i)制備一種表達(dá)構(gòu)建物，含有編碼cpn10的分離核酸，在表達(dá)載體中與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控核苷酸序列可操作地相連接；(ii)用表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞；和(iii)在所述的宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白。
“表達(dá)載體”可以是可自我復(fù)制的染色體外載體，如質(zhì)粒，或可整合進(jìn)宿主基因組的載體。
“可操作連接”是指所述的調(diào)控核苷酸序列可相對(duì)于本發(fā)明的重組核酸被定位來(lái)啟動(dòng)、調(diào)節(jié)或控制轉(zhuǎn)錄。
調(diào)控核苷酸序列通常適合于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。對(duì)于各種宿主細(xì)胞，在本領(lǐng)域中已知有多種類型的合適的表達(dá)載體和合適的調(diào)控序列。
一般所述的一條或多條調(diào)控核苷酸序列包括但不限于，啟動(dòng)子序列、引導(dǎo)或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和終止序列、拼接供體/受體序列，和增強(qiáng)子或激活物序列。
本發(fā)明可考慮本領(lǐng)域中已知的結(jié)構(gòu)性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，包括例如，四環(huán)素阻遏性和金屬硫蛋白誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以是天然的啟動(dòng)子或組合了超過(guò)一個(gè)啟動(dòng)子的元件的雜合啟動(dòng)子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該表達(dá)載體含有一個(gè)可選擇的標(biāo)記基因，這樣可以選擇被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞?？蛇x擇的標(biāo)基基因在本領(lǐng)域中是為人所熟知的，可根據(jù)所使用的宿主而變化。
合適的表達(dá)宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，如大腸埃希氏桿菌(例如，DH5α)、酵母、使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的SF9細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS、CV-1和293細(xì)胞，此外沒有限制。
重組cpn10蛋白可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)的方法常規(guī)制備，例如Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Cold Spring Harbor Press，1989)所述，特別是第16和17節(jié)，其在此合并為參考文獻(xiàn)；Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)方法)。Ausubel等人主編(John Wiley & Sons，Inc.1995-1999)，特別是第10和16章，其在此合并為參考文獻(xiàn)；和Current Protocols inProtein Science(現(xiàn)代蛋白科學(xué)方法)，Coligan等人(John Wiley & Sons，Inc.1995-1999)，特別是第1，5和6章，其在此合并為參考文獻(xiàn)。
使用pGEX系統(tǒng)產(chǎn)生和純化重組合成的cpn10的實(shí)例在WO95/15338中提供。使用已知可產(chǎn)生活性cpn10的高產(chǎn)量細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)(Ryan等人，見前)來(lái)產(chǎn)生用于本文所述的試驗(yàn)中的cpn10(SEQ ID NO1)。
藥學(xué)組合物本發(fā)明提供了cpn10治療細(xì)胞、組織或器官移植引起的疾病或醫(yī)學(xué)病征，特別是GVHD的用途。
本發(fā)明也提供了含有cpn10或cpn10衍生物的藥學(xué)組合物。
很合適的是，藥學(xué)組合物含有一種合適的藥學(xué)可接受的載體、稀釋液或賦形劑。
很合適的是，藥學(xué)組合物含有cpn10或cpn10的衍生物、藥學(xué)可接受的載體、稀釋液或賦形劑和至少一種其他的免疫抑制劑。優(yōu)選，其他的免疫抑制劑是免疫抑制藥物或針對(duì)B或T淋巴細(xì)胞或介導(dǎo)它們活化的表面受體的特異抗體。更優(yōu)選的是，該免疫抑制劑是環(huán)孢霉素、氨甲喋呤、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和類固醇。該藥學(xué)組合物也可含有類固醇。
“藥學(xué)可接受的載體、稀釋液或賦形劑”的含義是固體或液體填充劑，稀釋液或可安全用于全身給藥的包封物質(zhì)。根據(jù)給藥的具體途徑，可使用本領(lǐng)域熟知的多種載體。這些載體可選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸鹽緩沖液、乳化劑、等滲鹽水和如包括鹽酸鹽、溴化物和硫酸鹽的無(wú)機(jī)酸鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽的有機(jī)酸的鹽類和無(wú)熱原水。
描述藥學(xué)可接受載體、稀釋液和賦形劑的有用的參考文獻(xiàn)是Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，在此合并為參考文獻(xiàn)。
可使用任何安全的給藥途徑，為患者提供本發(fā)明的組合物。例如，可使用口服、直腸、胃腸外、舌下、含服、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)、透皮等途徑。例如，肌肉內(nèi)和皮下注射適合給予免疫原組合物，疫苗和DNA疫苗。
劑型包括片劑、分散劑、懸浮劑、注射劑、溶液劑、糖漿劑、錠劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、透皮貼片劑等。這些劑型也包括注射或植入特別為此目的設(shè)計(jì)的可控釋放裝置，或被修飾以此方式作用的其他形式的植入體。例如，包括丙烯酸樹脂、蠟、高級(jí)脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸的疏水聚合物，和如羥基丙甲基纖維素的某些纖維素衍生物包被可影響治療制劑的可控釋放。另外，使用其他的聚合物基質(zhì)(matrice)，脂質(zhì)體和/微球體可影響可控釋放。
上述的組合物可用劑型相容的方式給藥，其量是藥學(xué)上有效的。給予患者的劑量，就本發(fā)明而言，應(yīng)該足以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間周期內(nèi)在患者身上產(chǎn)生有益的反應(yīng)。給藥的制劑量可根據(jù)要治療的受試者的情況而定，包括年齡、性別、體重和一般健康狀況，以及根據(jù)醫(yī)生判斷的一些因素。
因此本發(fā)明很容易被理解，并付諸于實(shí)際應(yīng)用，普通技術(shù)人員可參照下列非限制性的實(shí)例。
實(shí)施例方法移植根據(jù)Hill等人，1997，Blood，90，3204-3213，和Hill等人，1999，J.Clin.Invest，104，459-467所述的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)小鼠進(jìn)行移植。在第0天，B6D2F1小鼠接受1400cGy總量的全身照射(TBI，137Cs源)，這種照射間隔3小時(shí)分成兩次，以盡量減小胃腸道毒性。5×106骨髓細(xì)胞和2×106尼龍纖維純化的來(lái)自B6小鼠(同種異體)或B6D2F1小鼠(同系)脾供體的T細(xì)胞重新懸浮在0.25ml Leibovitz L-15培養(yǎng)基中，并靜脈注射進(jìn)被照射的受體中。
重組cpn10的制備
XL 1-Blue大腸桿菌細(xì)胞使用表達(dá)載體pPL550轉(zhuǎn)化cpn10，并在37℃生長(zhǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞通過(guò)將溫度增加至42℃，4小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)。細(xì)胞離心沉淀，重新懸浮在30ml 0.025M pH8.0的TrisHCl中，并在-30℃儲(chǔ)存。
復(fù)溫來(lái)自1L培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀，用溶菌酶(100μg/ml；37℃15分鐘)溶解細(xì)胞，然后，超聲處理(5×10秒，4℃)，通過(guò)離心(30分鐘，4℃，48 384×g)去掉細(xì)胞碎片。
通過(guò)離子交換和疏水相互作用層析從已凈化的溶解物中純化Cpn10。使用10-20％Tris-Tricine的SDS-PAGE凝膠(100×100×1mm；Novex)，在柱餾分中該蛋白質(zhì)被鑒定為大約10kDa的區(qū)帶。
將溶解物加于200ml Macroprep HighQ(BIO-RAD)的柱上，使用0.025M pH8.0的TrisHCl作為工作緩沖液，流速為8ml/min。保留未結(jié)合的餾分，調(diào)整pH為6.8。樣品加于5ml EconoPac S cartridge(BIO-RAD)上，使用0.025M磷酸鈉pH6.8緩沖液作為工作緩沖液，流速為2ml/min。用0→1M NaCl梯度的0.025M磷酸鈉緩沖液pH6.8的洗脫該柱，以2ml/min工作超過(guò)30分鐘。
含有cpn10的餾分被集中起來(lái)，加入等體積pH6.8的3M(NH4)2SO4的0.05M磷酸鈉緩沖液。樣品加于5ml Econo-pac Methyl HIC cartridge上，使用pH6.8的1.5M(NH4)2SO4的0.05M磷酸鈉緩沖液作為工作緩沖液，流速為2ml/min。用1.5→0M(NH4)2SO4梯度的0.05M磷酸鈉緩沖液pH6.8的洗脫該柱，以2ml/min工作超過(guò)15分鐘。
含有cpn10的餾分被集中起來(lái)，鹽水透析過(guò)夜，分成適當(dāng)?shù)捏w積，在-30℃下儲(chǔ)存。
Cpn10的治療在注射前重組人cpn10在PBS中進(jìn)行稀釋。如所述，在BMT之前或之后對(duì)小鼠每天皮下注射cpn10(10μg/次，或100μg/次)。對(duì)照組的小鼠僅注射稀釋液。
評(píng)價(jià)GVHD全身GVHD程度的評(píng)價(jià)可通過(guò)存活率和評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，該系統(tǒng)以5個(gè)臨床參數(shù)的改變進(jìn)行綜合體重下降、體態(tài)(隆起)、活力、皮毛質(zhì)地和皮膚完整性(最大指數(shù)＝10)(Cooke等人，1996，Blood，88，3230-3239；Hill等人，1999，J.Clin.Invest，104，459-467)。每個(gè)小鼠進(jìn)行耳標(biāo)記，每周按照每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)從0-2進(jìn)行分級(jí)。具有嚴(yán)重臨床GVHD的動(dòng)物(評(píng)分＞6)根據(jù)倫理學(xué)指導(dǎo)原則被處死，死亡日被認(rèn)為是第二天。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Kaplan-Meier估計(jì)值制作生存曲線，通過(guò)log-rank analysis進(jìn)行比較。The Mann Whitney-U檢驗(yàn)用來(lái)進(jìn)行臨床計(jì)分的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。
實(shí)施例1-體外小鼠巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)以確定cpn10在生理細(xì)胞群體中的作用。
小鼠從澳大利亞研究中心(Perth，Western Australia，Australia)購(gòu)買雌性C57BL/6(B6，H-2b，Ly-5.2+)，B6PtprcaLy-5a(H-2b，Ly-5.1+)和B6D2F1(H-2b/d，Ly-5.2+)小鼠。由澳大利亞國(guó)立大學(xué)(Canberra，Australia)提供C57BL/6IL-10-/-小鼠(B6，H-2b，Ly-5.2+)。用作移植受體的小鼠年齡在8至14周齡之間。移植后前2周，小鼠圈養(yǎng)在無(wú)菌微型隔離籠中，攝入酸性熱處理水(pH2.5)，正常飲食。
骨髓移植根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Hill等人，1997，見前)對(duì)小鼠進(jìn)行移植。簡(jiǎn)言之，在第一天，B6D2F1小鼠全身接受1300cGy的總照射劑量(137Cs源，108cGy/min)，這種照射間隔3小時(shí)分成兩次，以盡量減小胃腸道毒性。供體骨髓(每個(gè)動(dòng)物5×106)和脾T細(xì)胞(每個(gè)動(dòng)物3×106)重新懸浮在0.25ml Leibovitz L-15培養(yǎng)基(Gibco BRL，Gaithersburg MD)中，靜脈注射給受體。每天監(jiān)測(cè)生存情況，每周進(jìn)行GVHD臨床評(píng)分。Cpn10或?qū)φ障♂屢阂悦恐粍?dòng)物100μg的劑量皮下注射。如上所述評(píng)價(jià)全身GVHD的程度。
細(xì)胞培養(yǎng)全過(guò)程使用的培養(yǎng)基為10％FCS/IMDM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，添加了50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、2mM L-谷胺酰胺、1mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、0.02mM β-巰基乙醇和10mM HEPES。在pH7.75和37℃下，在5％CO2濕潤(rùn)孵箱中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
對(duì)于體外LPS刺激實(shí)驗(yàn)，使用梯度濃度的LPS、TNFα和IL-10對(duì)腹膜巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞進(jìn)行刺激，分別在5小時(shí)和48小時(shí)的培養(yǎng)上清液中進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于體外同種異體抗原實(shí)驗(yàn)，在含有105被照射(2000cGy)的B6D2F1腹膜巨噬細(xì)胞(原代MLC)和72小時(shí)收獲的上清液的96孔板(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中培養(yǎng)純化的C57BL/6T細(xì)胞。然后用脈沖向培養(yǎng)物中添加3H-胸腺嘧啶核苷(每孔1μCi)，16小時(shí)后在1205Betaplate讀數(shù)儀(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上測(cè)定增殖情況。對(duì)于體外有絲分裂原的刺激，在平底96孔板中培養(yǎng)純化的C57BL/6T細(xì)胞，96孔板中預(yù)鋪單克隆CD3和CD28，終濃度為10μg/ml。48小時(shí)時(shí)收獲上清液，用脈沖向培養(yǎng)物中添加3H-胸腺嘧啶核苷(每孔1μCi)。16小時(shí)后測(cè)定增殖。
細(xì)胞因子ELISAS用于IFNγ、IL-10、IL-4和TNFα測(cè)定的抗體從PharMingen(SanDiego，CA)購(gòu)買，根據(jù)生產(chǎn)廠商的方法進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)言之，樣品稀釋為1∶3至1∶24，用特異單克隆一抗(mAb)俘獲細(xì)胞因子，用生物素化標(biāo)記的二抗mAb檢測(cè)。用鏈霉和素(strepavidin)和底物(Kirkegaard and Perrylaboratories，Gaithersburg，MD)對(duì)生物素標(biāo)記的測(cè)定進(jìn)行顯影。使用Spectraflour Plus微量滴定板讀數(shù)儀(Tecan，Durham，NC)在450nm對(duì)平板進(jìn)行讀數(shù)。使用重組細(xì)胞因子(PharMingen)作為ELISA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)兩次，IFNγ的測(cè)定精度為0.063U/ml，IL-10，IL-4和TNFα為15pg/ml。
結(jié)果體內(nèi)給予cpn10可降低腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNFα的能力(圖2A)。B6小鼠(n＝3)用cpn10(100μg，每天一次)(cpn10+)或?qū)φ障♂屢?cpn10-)治療5天。在第6天通過(guò)腹腔灌洗收獲腹膜巨噬細(xì)胞，在治療組內(nèi)將每只動(dòng)物的細(xì)胞集中在一起。沒有(未顯示)或存在LPS(1μg/ml)下，細(xì)胞以2×105/孔接種。5小時(shí)時(shí)收集培養(yǎng)上清液，通過(guò)ELISA測(cè)定TNFα(pg/ml)水平。根據(jù)CD11b的染色將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為每105巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生量。圖2A顯示兩次相同試驗(yàn)的結(jié)果。這些細(xì)胞中LPS-誘導(dǎo)的TNFα分泌減少了40％。
體內(nèi)用cpn10治療可增加脾細(xì)胞IL-10的產(chǎn)生(圖2B)。如上所述B6小鼠用cpn10或?qū)φ障♂屢禾幚?。?天收獲脾細(xì)胞，在治療組中將來(lái)自每個(gè)動(dòng)物的細(xì)胞集中在一起，然后沒有(未顯示)或存在LPS(10μg/ml)下，以5×105/孔進(jìn)行培養(yǎng)。48小時(shí)時(shí)收集培養(yǎng)上清液，ELISA測(cè)定IL-10(pg/ml)的水平。兩次相同試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示在圖2B中。與對(duì)照動(dòng)物相比，可觀察到顯著增加的IL-10產(chǎn)生。
體內(nèi)用cpn10處理可減少IL10-/-腹膜巨噬細(xì)胞的TNFα產(chǎn)生(圖2C)。IL10-/-B6小鼠用cpn10或?qū)φ障♂屢褐委?，?天通過(guò)腹腔灌洗收獲腹膜巨噬細(xì)胞，將治療組內(nèi)每只動(dòng)物的細(xì)胞集中在一起。培養(yǎng)5小時(shí)后，在沒有(LPS 0)或存在LPS(0.1、1和10μg/ml)的情況下，在培養(yǎng)上清液中測(cè)定TNFα的量。Cpn10-介導(dǎo)的減少LPS誘導(dǎo)的TNFα的產(chǎn)生(圖2A)不需要IL-10，因?yàn)楫?dāng)來(lái)自cpn10處理的IL-10-/-小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞用LPS體外刺激時(shí)，可觀察到類似的TNFα分泌減少。因此，減少的TNFα分泌和增加的IL-10產(chǎn)生似乎與cpn10處理的結(jié)果無(wú)關(guān)。
Cpn10處理似乎不影響T細(xì)胞IFNγ或IL-4的分泌。以前的報(bào)道表明cpn10可抑制T細(xì)胞對(duì)有絲分裂原應(yīng)答的增殖作用(Morton H.1998Immunol.Cell Biol，76，483-496)。Th1免疫反應(yīng)的特征通常是如TNFα和IFNγ的促炎細(xì)胞因子。Th2反應(yīng)涉及IL-4和IL-10的分泌，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)反應(yīng)的特征是IL-10和TGFβ的產(chǎn)生。由于Th2和Treg反應(yīng)可抑制增殖，Th1反應(yīng)可抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此研究cpn10影響T細(xì)胞分化的能力。
體內(nèi)給予cpn10不影響T淋巴細(xì)胞對(duì)同種異體抗原的增殖性反應(yīng)(圖2D)。B6小鼠(n＝3)每天注射cpn10或?qū)φ障♂屢哼M(jìn)行處理。脾細(xì)胞來(lái)源的T細(xì)胞群體在體外用同種異體脾細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)中刺激7天。純化的T細(xì)胞(0.5×105，1×105和2×105/孔)用被照射的同種異體B6D2F1腹膜巨噬細(xì)胞(0.5×105/孔)刺激，72小時(shí)時(shí)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的3[H]胸腺嘧啶核苷摻入試驗(yàn)測(cè)定增殖。圖2D中標(biāo)注的數(shù)值代表3個(gè)孔的均數(shù)±SE。MLC中T細(xì)胞的增殖在cpn10治療和對(duì)照動(dòng)物之間的變化不明顯，表明cpn10不是T細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物。
圖2E-G顯示體內(nèi)給予cpn10對(duì)T細(xì)胞分化的作用。如上所述用cpn10體內(nèi)處理B6動(dòng)物。來(lái)自cpn10處理和載體處理動(dòng)物的T細(xì)胞(2×106/孔)用被照射的同種異體B6D2F1脾細(xì)胞(3×106/孔)(原代混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng))在培養(yǎng)中刺激7天。在第7天，收集T細(xì)胞，用結(jié)合在平板上的可刺激T細(xì)胞的CD3和CD28抗體重新刺激。24小時(shí)時(shí)收獲培養(yǎng)上清液，通過(guò)ELISA測(cè)定IFNγ、IL4和IL-10的濃度。圖4E-G中的濃度數(shù)值代表三個(gè)孔的均數(shù)±SE。
在cpn10處理和對(duì)照動(dòng)物之間T細(xì)胞的IL-4分泌(圖2E)和IFNγ分泌(圖2F)變化不明顯，表明cpn10不影響Th1/Th2的平衡。
相反，T細(xì)胞IL-10的分泌明顯升高(圖2G)。當(dāng)在體外而不是體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)過(guò)程中進(jìn)行cpn10處理時(shí)，也觀察到類似的IL-10分泌增加和增殖，IFNγ和IL-4未受影響(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明cpn10可增強(qiáng)對(duì)LPS和同種異體抗原刺激反應(yīng)引起的IL-10產(chǎn)生，表明cpn10增強(qiáng)的IL-10產(chǎn)生部分來(lái)自T細(xì)胞來(lái)源的IL-10。
實(shí)例2-在體內(nèi)GVDH模型中移植前和移植后cpn10治療的作用進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以便研究是否在移植期前給予cpn10可預(yù)防GVHD。
處理后給予cpn10來(lái)自供體B6小鼠的骨髓細(xì)胞(5×106/動(dòng)物)和純化的T細(xì)胞(上述)移植進(jìn)致死量照射(1100cGy)的B6D2F1受體小鼠(同種異體組)內(nèi)。同系對(duì)照組的B6D2F1受體接受相同劑量的B6D2F1骨髓和T細(xì)胞。在移植后的時(shí)間(0至21天)動(dòng)物皮下注射載體(同系，n＝8和同種異體對(duì)照組，n＝10)或cpn10(10和100μg/動(dòng)物/天cpn10 10μg/天同種異體組，n＝10和cpn10 100μg/天，同種異體組，n＝10)。GVHD臨床計(jì)分(如上所述)被確定為生存動(dòng)物GVHD嚴(yán)重性的指標(biāo)。與用載體處理的同種異體對(duì)照相比，在用100μg/天cpn10注射的同種異體動(dòng)物中在第14和21天觀察的臨床GVHD更輕微(**P＜0.01)。在載體注射和cpn10注射的同種異體組之間生存百分比沒有顯著差異。圖3顯示了小鼠生存曲線的Kaplan-Meier分析。
骨髓移植(BMT)后給予cpn10不能預(yù)防GVHD的死亡，通過(guò)GVHD臨床計(jì)分測(cè)定死亡率僅暫時(shí)降低(圖3B)。與用載體治療的同種異體對(duì)照相比，在用100μg/天cpn10注射的同種異體動(dòng)物中在第14和21天觀察到的GVHD臨床更輕微(**P＜0.01)。
處理前給予cpn10受體B6D2F1和供體B6小鼠移植前用cpn10(100μg/天/皮下)或?qū)φ障♂屢褐委?天。第6天從B6供體小鼠收獲的骨髓(5×106/動(dòng)物)和T細(xì)胞(3×106/動(dòng)物)被移植進(jìn)致死量照射的B6D2F1受體中。5組受體分組如下第1組同系對(duì)照(n＝8)代表用同系B6D2F1骨髓和T細(xì)胞移植的B6D2F1。
第2組由稀釋液預(yù)處理的B6D2F1受體組成的同種異體對(duì)照(n＝10)，移植用稀釋液預(yù)處理的B6供體細(xì)胞。
第3組同種異體受體預(yù)處理(n＝10)，受體B6D2F1小鼠移植前用cpn10處理，并移植載體預(yù)處理的B6供體小鼠細(xì)胞。
第4組僅用稀釋液預(yù)處理的受體B6D2F1小鼠接受cpn10預(yù)處理的B6供體的移植物(同種異體供體預(yù)處理，n＝10)。
第5組在移植前，B6D2F1受體和B6供體小鼠用cpn10預(yù)處理(預(yù)處理的同種異體受體和供體，n＝10)。
如上所述GVHD臨床計(jì)分被認(rèn)為是衡量存活動(dòng)物GVHD嚴(yán)重性的指標(biāo)。
與同種異體對(duì)照組相比，第5組中第7天觀察到的臨床計(jì)分顯著較低(在移植前用cpn10預(yù)處理的受體和供體)(圖4B；***P＜0.001)。圖4顯示了小鼠生存曲線的Kaplan-Meier分析。
在移植前給予移植供體和受體cpn10五天可顯著降低GVHD的死亡率(與同種異體對(duì)照相比*P＜0.01)。另外，以臨床計(jì)分作為指標(biāo)，GVHD嚴(yán)重程度也在BMT后早期被降低。當(dāng)在BMT前給藥時(shí)，cpn10減少GVHD死亡率的能力與在此所述的抗炎作用是密切相關(guān)的，即限制TNFα的產(chǎn)生(Hill等人，1998 J.Clin.Invest.，102，115-123；Hill等人，1997，見前)。在BMT后給予cpn10不能阻止GVHD的發(fā)生，與此相一致的是在本實(shí)施例中所使用的劑量和用藥方案下對(duì)T細(xì)胞的活化和分化沒有作用，表示在圖3中。
在這些模型中，移植物的預(yù)處理(致死性照射)產(chǎn)生了一種過(guò)程，進(jìn)行性的胃腸道損傷、LPS泄漏和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生反過(guò)來(lái)可誘導(dǎo)進(jìn)一步的胃腸道損傷，這樣該過(guò)程形成了一種正反饋環(huán)路。該過(guò)程可被一些保護(hù)腸道放射損傷的藥物制劑(如IL-11和角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子；Krijanovski等人，1999，Blood，94，825-831)、直接的LPS拮抗劑(Cooke等人，2001，J.Clin.Invest.，107，1581-1589)或TNFα本身的抑制劑(Hill等人，1997見前)所中斷。但是，除非TNFα被完全中和，或?qū)細(xì)胞活化和分化有其他的作用，這些制劑傾向于延緩而不是防止GVHD，。因此通過(guò)給予cpn10降低GVHD死亡率與在BMT后早期限制LPS的信號(hào)傳導(dǎo)和隨后TNFα的產(chǎn)生是密切相關(guān)的，但對(duì)隨后同種異體反應(yīng)性的T細(xì)胞功能沒有影響。
因此，在GVHD的治療中cpn10有潛力成為一種重要的治療性藥物。當(dāng)在移植操作前同時(shí)給予供體和受體cpn10時(shí)，觀察到GVHD的治療有效性增加，與其密切相關(guān)的事實(shí)是在移植期后TNFα從組織或器官中均可產(chǎn)生(Cooke等人，2000，J.Immunol.，165，6612-6619；Speiser等人，1997，J.Immunol.，158，5185-5190)。
而且，cpn10可與限制再次獲得性免疫反應(yīng)的傳統(tǒng)免疫抑制劑聯(lián)合用于治療GVHD。
在整篇說(shuō)明書中，其目的是要描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不將本發(fā)明限制于任何一個(gè)實(shí)施方案或一些具體的特征。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員要理解的是，就本說(shuō)明書而言，對(duì)于作為例證的特殊實(shí)施方案可進(jìn)行各種各樣的改進(jìn)和變換，并不背離本發(fā)明的精神。
在此所引用的所有計(jì)算機(jī)程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)在此作為參考文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種治療性或預(yù)防性治療移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，其特征在于包括以下步驟(i)將藥學(xué)有效量的伴侶蛋白10(cpn10)或cpn10的衍生物給予供體動(dòng)物或從其獲得的細(xì)胞、器官或組織；和(ii)給予受體動(dòng)物藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物，以延緩、減輕、抑制或進(jìn)一步減少移植一種或多種細(xì)胞、組織或器官給受體動(dòng)物后產(chǎn)生的一種或多種GVHD癥狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述藥學(xué)有效量的伴侶蛋白10或cpn10的衍生物在步驟(ii)之前和之后均給予受體動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)前不超過(guò)7天給予供體和受體動(dòng)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)前2至5天給予供體和受體動(dòng)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)后不超過(guò)90天給予受體動(dòng)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)后不超過(guò)60天給予受體動(dòng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)后10至30天給予受體動(dòng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述cpn10蛋白具有圖1(SEQ ID NO1)中所示的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述給予動(dòng)物的藥學(xué)有效量cpn10或cpn10的衍生物在0.1-100mg每千克/體重范圍內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述給予動(dòng)物的藥學(xué)有效量cpn10或cpn10的衍生物在0.1-10mg每千克/體重范圍內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞、組織或器官是骨髓，或來(lái)自骨髓。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物是人。
14.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其特征在于進(jìn)一步包括給予所述供體動(dòng)物和/或所述的受體動(dòng)物至少一種其他的選自環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和氨甲喋呤的免疫抑制劑的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其特征在于進(jìn)一步包括給予所述的供體動(dòng)物和/或受體動(dòng)物類固醇的步驟。
16.一種抑制、阻止或進(jìn)一步減少動(dòng)物產(chǎn)生TNFα的方法，其特征在于包括給予所述動(dòng)物藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物以抑制、阻止或進(jìn)一步減少所述動(dòng)物產(chǎn)生TNFα的的步驟。
17.一種抑制、阻止或進(jìn)一步減少來(lái)自動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞、組織或器官產(chǎn)生TNFα的方法，其特征在于包括給予所述細(xì)胞、組織或器官藥學(xué)有效量的cpn0或cpn10的衍生物以抑制所述動(dòng)物產(chǎn)生TNFα的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物是人。
20.一種誘導(dǎo)、擴(kuò)大或進(jìn)一步增加動(dòng)物IL-10產(chǎn)生的方法，其特征在于包括給予所述動(dòng)物藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物以誘導(dǎo)、擴(kuò)大或進(jìn)一步增加所述動(dòng)物產(chǎn)生IL-10的步驟。
21.一種誘導(dǎo)、擴(kuò)大或進(jìn)一步增加來(lái)自動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞、組織或器官產(chǎn)生TNFα的方法，其特征在于包括給予所述細(xì)胞、組織或器官藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物以誘導(dǎo)所述動(dòng)物產(chǎn)生IL-10的步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物是人。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求1、16或17使用的藥學(xué)組合物，其特征在于含有藥學(xué)有效量的cpn10或cpn10的衍生物，和藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或稀釋液。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的藥學(xué)組合物，其特征在于進(jìn)一步含有至少一種其他的免疫抑制劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥學(xué)組合物，其特征在于所述的其他免疫抑制劑是免疫抑制藥物，或針對(duì)B或T淋巴細(xì)胞或介導(dǎo)它們活化的表面受體的特異抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求25中的藥學(xué)組合物，其特征在于所述的其他免疫抑制劑是環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和氨甲喋呤中的任何一種。
28.根據(jù)權(quán)利要求24至27中任何一項(xiàng)所述的藥學(xué)組合物，其特征在于進(jìn)一步含有類固醇。
29.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的藥學(xué)組合物，其特征在于所述的cpn10具有圖1(SEQ ID NO1)中所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明是針對(duì)cpn10在移植中的應(yīng)用，特別是針對(duì)在治療和/防止移植物抗宿主疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了將cpn10給予供體和/或受體動(dòng)物或細(xì)胞、來(lái)自供體的組織或器官的方法，盡管本發(fā)明特別優(yōu)選用于治療供體和受體動(dòng)物。該方法進(jìn)一步包括給予供體和/或受體動(dòng)物至少一種其他的免疫抑制劑以防止或緩解移植物抗宿主疾病。
文檔編號(hào)A61P37/06GK1735428SQ200380108296
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2003年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月6日
發(fā)明者G·R·希爾, T·巴諾維奇 申請(qǐng)人:悉生物有限公司