專利名稱：免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含保留免疫原性的滅活脊髓灰質炎病毒(IPV)的干燥固體或高粘性液體制劑的免疫原性組合物。本發(fā)明也包括包含IPV的干燥固體或高粘性液體制劑的疫苗。本發(fā)明的另一方面是保存滅活脊髓灰質炎病毒(IPV)為干燥固體或高粘性液體的方法。該方法包含通過在穩(wěn)定劑溶液中懸浮或溶解IPV和細菌多糖制備樣品，并使所述樣品經受導致溶劑從所述樣品喪失的溫度和壓力條件。維持或調節(jié)壓力和溫度條件以便除去溶劑并干燥所述樣品形成固體或高粘性液體。上述制劑在使用前可重配或直接使用。
眾所周知，IPV作為疫苗的一種成分，但是，其配制為液體，例如為Infanrix penta。業(yè)已證實IPV冷凍干燥處理與抗原性的損失有關，所以難以配制包含IPV干燥形式的有效疫苗。已知干燥的疫苗制劑，特別是在細菌多糖存在下。b型流感嗜血菌(Haemophilusinfluefzzae b)(Hib)的PRP多糖經常配制為干燥固體，例如為Infanrixhexa(WO99/48525)。
IPV干燥制劑的有利之處有幾方面原因。干燥制劑具有良好的貯藏特性，并能增加含有IPV的疫苗的保存期限。干燥的IPV也可能使IPV成為更具靈活性的疫苗成分，并使之配制為之前所不可能存在的新的聯(lián)合疫苗。某些含有液體和固體成分的疫苗，僅在給藥前混合(例如Infanrix hexa)。Infanrix Hexa含有干燥的Hib成分，僅在使用前與DTPa-HepB-IPV重配。IPV通過與Hib一起配制為干燥固體，就可能向疫苗的液體成分中添加更多成分，除非所述成分可能與IPV不相容。
本領域公知幾種用于干燥疫苗成分的技術。從傳統(tǒng)上來說，使用冷凍干燥方法業(yè)已達到該目的，在該方法中制備物質溶液并冷凍樣品。在初步干燥階段中，在減壓條件中通過冰升華除去大部分水分，形成了多孔的‘蛋糕’。通常跟隨著二次干燥階段，當壓力和溫度改變時，水分就從固體“蛋糕”中蒸發(fā)出來。與液體制劑比較，所產生的凍干樣品具有改良的穩(wěn)定性。但是，冷凍干燥過程冗長，會成為生產過程中的限速步驟。
當大量樣品在大的干燥器設備中分批凍干時，產物差異性也是一道難題。冷凍干燥器擱板上的條件在不同的位置是不同的，導致了樣品在不同條件下以不同的速率凍干。對于某些諸如活病毒的生物材料而言，在冷凍干燥過程中活性損失相當大(Pikal(1994)ACS Symposium567120-133)。許多凍干的物質在環(huán)境溫度下仍然不穩(wěn)定(Carpenter等(1994)ACS Symposium 567；134-147)。
通過使用諸如多羥基化合物的冷凍保護劑可在一定程度上防止冷凍過程所導致的損傷。在該過程中通過避免冷凍樣品以及通過沸騰除去水分，也已獲得對凍干方法的進一步改良(WO96/40077；US63063450)。該方法包括在合適的溶劑中制備玻璃基質成形材料與要保存樣品的混合物，從該混合物中蒸發(fā)大量溶劑以獲得漿狀物，將漿狀物暴露于足夠引起該漿狀物沸騰的壓力和溫度下，并除去殘留的溶劑。
類似方法描述于US 5,766,520中，其中所述方法包括部分除去水分以形成粘性液體，進一步對漿狀物抽真空以引起‘沸騰’，接著在基本上低于100℃的溫度下干燥。該方法仍然遇到某些傳統(tǒng)的凍干難題。當在大的冷凍干燥器中進行該方法時，取決于它們在擱板上的位置樣品會以不同的速率干燥，其導致了在干燥過程中，不同樣品損失不同數量的活性。其導致了在一批產物中一致性的缺乏。
迄今為止，沒有制備保持高水平抗原性和/或免疫原性的IPV干燥固體疫苗制劑的成功實例的報道。
因此，本發(fā)明公開了一種包含IPV和穩(wěn)定劑的免疫原性組合物，配制為干燥組合物或高粘性液體，在重配后能產生抗脊髓灰質炎病毒的免疫應答。穩(wěn)定劑的存在對于抗原的保存是至關緊要的，多羥基化合物被證明是有效的穩(wěn)定劑。在細菌多糖存在下IPV更適合干燥，可使原始抗原保留更高比例的抗原性和/或免疫原性。本發(fā)明包括保存包含IPV的組合物的方法，優(yōu)選存在多羥基化合物和細菌多糖，其中IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。與IPV單獨凍干相比，在多糖存在下，IPV的凍干導致改良的IPV抗原保持率。此外，通過與IPV一起配制為干燥固體或高粘性液體，Hib的免疫原性也得到增強。具體而言，當用DTP疫苗(如下所述)即時重配時，本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)Hib滴度沒有因DTP疫苗的氫氧化鋁成分所減少，與不存在IPV的情況一樣。
所使用的干燥方法也能影響IPV抗原性和/或免疫原性的保持率。對于干燥IPV而言，發(fā)泡干燥方法較常規(guī)的冷凍干燥技術在保留IPV的抗原性方面更有效。令人驚奇的是，在發(fā)泡干燥方法中包含冷凍步驟并不導致抗原性損失，反而更能促進快速和有效的保存方法的發(fā)展。本發(fā)明另一種優(yōu)選的方法保留了高水平的IPV抗原性和/或免疫原性，通過干燥含有IPV的樣品，無需冷凍或發(fā)泡，形成干燥制劑，優(yōu)選高粘性液體制劑。
本發(fā)明提供了一種IPV的干燥制劑，其具有貯藏穩(wěn)定性的優(yōu)點。所述干燥制劑可就在給藥前快速且容易地重配。在使用優(yōu)選的發(fā)泡干燥方法情況下，由于所述蛋糕的巨大表面積，發(fā)泡的蛋糕特別容易重配。
IPV和Hib干燥固體或高粘性液體制劑的額外好處包括Hib成分增強的免疫原性。眾所周知在多成分疫苗中，疫苗制劑的其它成分可引起對Hib免疫原性的干擾(WO96140242，WO97/00697)。在干燥制劑中包含IPV和Hib可減輕該問題，特別是在給藥前將干燥的IPV-Hib組合物與白喉、破傷風和百日咳成分混合。
雖然在細菌多糖存在下，有可能使用常規(guī)的冷凍干燥方法凍干IPV，但優(yōu)選使用發(fā)泡干燥技術或不包括冷凍或發(fā)泡的溫和的干燥方法。這些方法導致了在IPV中甚至更多的抗原性和/或免疫原性保持率，所形成的蛋糕也更容易且更快速地重配。較標準的冷凍干燥技術而言，所述方法也具有更快速和更高能效的優(yōu)點。因為在疫苗生產中凍干步驟通常是限速步驟，所以使用優(yōu)選的方法可產生更高量級的疫苗產物，而無需對設備進行額外投資。在優(yōu)選的發(fā)泡干燥方法中引入冷凍步驟也產生了改良的分批重復性。


圖1-含有在發(fā)泡干燥方法不同階段的保存樣品的管形瓶的照片。
A-顯示了以液體制劑進行冷凍干燥時保存樣品的外觀。
B-顯示了當壓力減小到1.5毫巴時保存樣品的外觀。基于每個管形瓶不同的條件，樣品開始以稍有差異的速率冷凍。
C-顯示了在0.1毫巴下保存樣品的外觀，其中所有樣品已經變?yōu)橥耆鋬觥?br> D-顯示了當壓力增加到0.8-3.5毫巴時保存樣品的外觀。當保存樣品發(fā)泡和溶劑蒸發(fā)時，形成了泡沫玻璃。
圖2-在倒置的管形瓶中高粘性液體的照片。
發(fā)明詳述本發(fā)明的免疫原性組合物本發(fā)明包括免疫原性組合物，配制為干燥固體或高粘性液體，包含IPV和穩(wěn)定劑，其中IPV的抗原性和/或免疫原性在重配后得到保留。IPV的干燥固體或高粘性液體制劑能產生免疫應答，優(yōu)選是保護性免疫應答，抗脊髓灰質炎病毒，優(yōu)選在重配和接種后。
IPV定義為滅活的脊髓灰質炎病毒(優(yōu)選包含在疫苗領域中認為是標準的1、2和3型，最優(yōu)選Salk脊髓灰質炎疫苗)。IPV的疫苗劑量包含20-80、優(yōu)選40或80D-抗原單位的1型(Mahoney)，4-16、優(yōu)選8或16D-抗原單位的2型(MEF-1)和20-64、優(yōu)選32或64D-抗原單位的3型(Saukett)。
當通過本發(fā)明的方法干燥時，優(yōu)選1、2或所有3種1、2和3型脊髓灰質炎病毒的抗原性得到保留；更優(yōu)選1型；2型；3型；1型和2型；1型和3型；2型和3型的抗原性得到保留；或1型、2型和3型保留至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的參比樣品的抗原性水平，所述參比樣品沒有接受干燥處理。在干燥固體或高粘性液體在水溶液中重配后，通過任何合適的方法包括通過ELISA，其使用了抗1、2和/或3型脊髓灰質炎病毒的多克隆和/或單克隆抗體，可測量抗原性。
當通過本發(fā)明的方法干燥時，優(yōu)選1、2或所有3種1、2和3型脊髓灰質炎病毒的免疫原性得到保留；更優(yōu)選1型；2型；3型；1型和2型；1型和3型；2型和3型的免疫原性得到保留；或1型、2型和3型保留至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的參比樣品的免疫原性水平，所述參比樣品沒有接受干燥處理。在干燥固體或高粘性液體在水溶液中重配后，通過任何合適的方法可測量抗原性。在一種優(yōu)選的方法中，所述干燥制劑在水溶液中得到重配，并給動物接種，優(yōu)選大鼠。在合適的一段時間后，從接種的動物中收集抗血清并測試血清轉化。優(yōu)選地，與未干燥的參比樣品比較，達到至少0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的相對功效。
干燥固體組合物是一種通過凍干、升華、蒸發(fā)或干燥除去溶劑的制劑，所述凍干、升華、蒸發(fā)或干燥使得溶劑殘留小于或等于15％、12％、10％、7％、5％、4％，優(yōu)選3％、2％或更優(yōu)選1％。術語“干燥固體”包含玻璃、橡膠或具有固體外觀的結晶固體。任一上述方法可用于制備所述干燥固體。通過升華、沸騰或蒸發(fā)，優(yōu)選通過蒸發(fā)除去溶劑。
高粘性液體定義為具有溶劑含量小于或等于15、12、10，優(yōu)選8、5、4、3、2或1％的物質。高粘性液體具有足夠低的溶劑含量，使得活性劑在4℃下以穩(wěn)定態(tài)保存至少3、6、9、12或24個月，在這段時間后，容許活性劑保留至少40、50、60，優(yōu)選70、80、90、95％的其抗原性和/或免疫原性。高粘性液體并不暴露于涉及泡沫形成的起泡形成物。優(yōu)選地，高粘性液體具有除了玻璃之外的固體外觀，在幾天后，優(yōu)選幾星期，更優(yōu)選幾個月后，能非常緩慢地流動。
本發(fā)明的免疫原性組合物配制為干燥固體或高粘性液體，包含IPV和穩(wěn)定劑以及優(yōu)選細菌多糖。所述穩(wěn)定劑是任一下述組合物。所述細菌多糖包含源自任何細菌的莢膜多糖，所述細菌優(yōu)選一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、b型流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae b)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
優(yōu)選b型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae b)的PRP莢膜多糖存在于干燥固體或高粘性液體中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性組合物包含莢膜多糖的干燥固體或高粘性液體制劑，所述莢膜多糖源自一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的血清組A、C、W-135和Y(腦膜炎球菌多糖)。另一個優(yōu)選的實施方案包含源自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)莢膜多糖的干燥固體或高粘性液體制劑。所述肺炎球菌莢膜多糖抗原優(yōu)選選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最優(yōu)選自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一個優(yōu)選的實施方案包含金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的5型、8或336型莢膜多糖。另一個優(yōu)選的實施方案包含表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的I型、II型或III型莢膜多糖。另一個優(yōu)選的實施方案包含B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型或III型莢膜多糖。另一個優(yōu)選的實施方案包含A組鏈球菌的莢膜多糖，優(yōu)選進一步包含至少一種M蛋白和更優(yōu)選包含多種類型的M蛋白。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述細菌多糖是全長的，純化的天然多糖。在本發(fā)明的一個可選的實施方案中，所述多糖按大小排列在2-20倍之間，優(yōu)選2-5倍、5-10倍、10-15倍或15-20倍之間，所以多糖大小排列越小就越易于處理。在優(yōu)選的實施方案中使用了寡糖。寡糖通常具有2-20個重復單位。
本發(fā)明進一步包括作為干燥固體或高粘性液體的包含一種以上細菌多糖和IPV的免疫原性組合物。優(yōu)選地，IPV與一種或多種Hib(b型流感嗜血菌)PRP多糖和/或腦膜炎球菌A、C、W和/或Y多糖和/或肺炎球菌多糖組合。最優(yōu)選地，所述活性劑包含IPV和Hib；IPV和MenC；IPV和Hib及MenC；IPV和MenA及C；IPV和Hib及Men A和C；IPV和Hib及Men A和C和Y；或IPV和Hib及Men C和Y。
上述列舉的活性劑也包含一種或多種如下所述的肺炎球菌莢膜多糖。
在上述組合物中使用了多糖，也可以用寡糖(如上所定義)。
雖然這些組合物可以使用佐劑(如下所述)，但是它們優(yōu)選不使用佐劑或優(yōu)選不包含鋁鹽。
優(yōu)選地，所述多糖或寡糖結合于包含T-輔助表位的肽或載體蛋白(如下所述)。
存在于本發(fā)明免疫原性組合物中的莢膜多糖是未結合的或結合于諸如破傷風類毒素、破傷風類毒素片段C、白喉類毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)的載體蛋白。破傷風類毒素、白喉類毒素和肺炎球菌溶血素任一通過遺傳突變和/或優(yōu)選地通過化學處理解毒。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案含有結合于破傷風類毒素的Hib。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中存在一種以上結合的多糖，所述多糖結合于相同的載體蛋白或不同的載體蛋白。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案包含結合于載體蛋白的腦膜炎球菌多糖。在結合的Hib和腦膜炎多糖存在下，它們結合于相同的載體蛋白或不同的載體蛋白。
可通過任何公知的偶聯(lián)技術制備所述的多糖結合物。在一種優(yōu)選的偶聯(lián)技術中，所述多糖經硫醚鍵偶聯(lián)。該結合方法依賴于多糖與四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓(CDAP)的活化作用以形成氰酸酯。因此，活化的多糖可直接或通過間隔基與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)。優(yōu)選地，使用包括形成硫醚鍵的異種連接(heteroligation)化學反應，將氰酸酯與己二胺偶聯(lián)以及將氨基衍生的多糖結合于載體蛋白。上述結合物描述于Uniformed Services University的PCT公開申請WO93/15760中。
所述結合物也可通過直接還原性胺化方法制備，所述方法描述于US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。
另一種方法包括將己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖通過碳二亞胺縮合與蛋白載體偶聯(lián)(Chu C.等Infect.Immunity，1983245 256)。
摻入本發(fā)明免疫原性組合物中作為其一部分的多糖可不吸附在佐劑上或吸附在佐劑上，所述佐劑優(yōu)選鋁鹽(磷酸鋁或氫氧化鋁)，最優(yōu)選磷酸鋁。
本發(fā)明的免疫原性組合物包含了在干燥過程中能有助于防止損害的穩(wěn)定劑。任一穩(wěn)定劑描述如下，包括可摻入免疫原性組合物的玻璃形多羥基化合物，無論是使用本發(fā)明的方法所制備的干燥固體、發(fā)泡玻璃或是高粘性液體組合物。優(yōu)選的穩(wěn)定劑包括蔗糖、山梨糖醇、乳糖和海藻糖。
所述優(yōu)選的化合物，通過本發(fā)明的方法干燥，在聯(lián)合疫苗中可與其它抗原組合，所述疫苗是干燥的或用于重配干燥成分的液體制劑。
額外成分摻入了IPV和穩(wěn)定劑的本發(fā)明的干燥固體或高粘性液體制劑可另外與另一種疫苗成分配制。包含IPV干燥固體或高粘性液體制劑和細菌多糖的優(yōu)選的疫苗可與包含額外疫苗成分的液體制劑混合。在固體成分與液體成分重配后，完整的疫苗通過注射施用。
額外成分包括源自一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的莢膜多糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性組合物包含源自一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的血清組A、C、W-135和Y的莢膜多糖。另一個優(yōu)選的實施方案包含源自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)莢膜多糖。所述肺炎球菌莢膜多糖抗原優(yōu)選選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最優(yōu)選自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一個優(yōu)選的實施方案包含金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的5型、8或336型莢膜多糖。另一個優(yōu)選的實施方案包含表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的I型、II型或III型莢膜多糖。另一個優(yōu)選的實施方案包含B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型或III型莢膜多糖。另一個優(yōu)選的實施方案可包含A組鏈球菌的莢膜多糖，優(yōu)選進一步包含至少一種M蛋白和更優(yōu)選包含多種類型的M蛋白。
本發(fā)明的免疫原性組合物可與蛋白抗原配制。優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原是那些暴露于肺炎球菌外表面的肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌生活周期的至少一部分中能為宿主免疫系統(tǒng)所識別)，或是為肺炎球菌所分泌或釋放的蛋白。最優(yōu)選地，所述蛋白是毒素、粘附素、二元信號轉導蛋白或肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的脂蛋白，或它們的片段。具體優(yōu)選的蛋白包括但不限于肺炎球菌溶血素(優(yōu)選通過化學處理或突變解毒的)[Mitchell等.Nucleic Acids Res.1990 Jul11；18(13)4010“Comparison of pneumolysin genes and proteins fromStreptococcus pneumoniae types 1 and 2.”，Mitchell等.Biochim BiophysActa 1989 Jan 23；1007(1)67-72“Expression of the pneumolysin genein Escherichia colirapid purification and biological properties.”，WO96/05859(A.Cyanamid)，WO 90/06951(Paton等)，WO 99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失變體(US 5804193-Briles等.)；PspC及其跨膜缺失變體(WO 97/09994-Briles等)；PsaA及其跨膜缺失變體(Berry和Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)5255-62“Sequenceheterogeneity of PsaA，a 37-kilodalton putative adhesin essential forvirulence of Streptococcus pneumoniae”)；肺炎球菌膽堿結合蛋白及其跨膜缺失變體；CbpA及其跨膜缺失變體(WO 97/41151；WO99/51266)；甘油醛-3-磷酸酯-脫氫酶(Infect.Immun.1996 643544)；HSP70(WO 96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等.FEMS Microbiol Lett1998，164207-14)；M樣蛋白，(EP 0837130)和粘附素18627，(EP 0834568)。另一種優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原是公開于WO98/18931中的那些，特別是在WO 98/18930和PCT/US99/30390中所選擇的那些。
與本發(fā)明免疫原性組合物配制的優(yōu)選的奈瑟氏球菌屬蛋白包括TbpA(WO93/06861；EP586266；WO92/03467；US5912336)、TbpB(WO93/06861；EP586266)、Hsf(WO99/31132)、NspA(WO96/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(也已知為D15)(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PIdA(PCT/EP99/06718)、FrpB(WO96/31618參見SEQ ID NO38)、FrpA或FrpC或與兩者共有至少30、50、100、500、750個氨基酸的保守部分(WO92/01460)、LbpA和/或LbpB(PCT/EP98/05117；Schryvers等Med.Microbiol.1999321117)、FhaB(WO98/02547)、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、MItA(WO99/57280)和ctrA(PCT/EP00/00135)。奈瑟氏球菌屬蛋白可以作為純化的蛋白或部分外膜泡囊制備物添加。
免疫原性組合物優(yōu)選與提供抗一種或多種白喉、破傷風和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)感染保護的抗原配制。所述百日咳成分可滅活，是全細胞百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(Pw)或優(yōu)選是非細胞百日咳(Pa)，所述非細胞百日咳含有來自PT、FHA和69kDa百日咳博德特氏菌粘附素的至少一種抗原(優(yōu)選兩種或所有三種)，某些其它非細胞疫苗也包含凝集原，例如Fim2和Fim3，在本發(fā)明中也考慮使用這些疫苗。一般來說，提供了抗白喉和破傷風保護的抗原是白喉毒素和破傷風毒素。所述毒素是化學滅活的毒素，例如隨后用甲醛處理的，或通過導入一種或多種點突變滅活的毒素。
可選地，本發(fā)明的免疫原性組合物可以藥盒提供，在一種容器中含有所述干燥固體、發(fā)泡玻璃或高粘性液體以及在另一種容器中含有液體DTPa或DTPw。上述藥盒可例如，包含雙室注射器，在上述注射器的不同室中含有所述干燥固體和液體成分。然后，在注射前立即用液體疫苗重配所述干燥成分，作為單一疫苗。因此例如，用液體DTPa或DTPw疫苗重配本發(fā)明的干燥固體、發(fā)泡玻璃或高粘性液體(優(yōu)選即時地)并以單一疫苗施用。所述DTPa或DTPw疫苗通常至少部分地用鋁鹽作為佐劑，如磷酸鋁和/或氫氧化鋁(例如GlaxoSmithKlineBiologicals s.a.的Infanrix和Tritanrix疫苗)。
所述免疫原性組合物任選地與能保護宿主抗無法測定類型(non-typeable)德流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、RSV的一種或多種抗原，和/或能保護宿主抗流感病毒的一種或多種抗原配制。優(yōu)選的無法測定類型德流感嗜血菌(H.influenzae)蛋白抗原包括Fimbrin蛋白(US 5766608)和包含來自OMP26、P6、蛋白D、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、Hap和D15中的肽的融合蛋白(如LB1融合蛋白)(US 5843464-Ohio State Research Foundation)。
優(yōu)選的流感病毒抗原包括全、活或滅活病毒，分裂流感病毒、在雞蛋或MDCK細胞中生長的，或非洲綠猴腎異倍體細胞(Vero cells)或全流感病毒小體(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所描述)或它們純化的或重組的蛋白，例如HA、NP、NA或M蛋白，或它們的組合。
優(yōu)選的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。
包含DTP-Hib的聯(lián)合疫苗為本領域公知。但是存在著與某些制劑相關的難題，所述制劑涉及Hib與其它抗原的簡單混合。除非謹慎地配制，否則由于疫苗其它成分的干擾，增加的抗Hib成分的抗體滴度可能低于通過單獨接種相同劑量Hib所引起的那些。即使該難題為本領域眾所周知，且業(yè)已通過各種方法來解決，對于該難題，其中Hib和IPV一起配制為干燥固體或高粘性液體的本發(fā)明的免疫原性組合物提供了一種可選的解決方案。
本發(fā)明的免疫原性組合物可組成為疫苗藥盒的一部分，其中IPV和Hib以藥盒的一種成分形式存在，另一種成分，如上所述，以第二成分形式存在，舉例來說，如本文中所描述的雙室注射器。僅在施用所述疫苗前將兩種成分一起混合。在上述制劑中，包含IPV和Hib的成分優(yōu)選干燥固體、發(fā)泡玻璃或高粘性液體，即使其被任選地配制為液體。該制劑引起的抗Hib成分的抗體滴度是臨床上可接受的，以提供抗b型流感嗜血菌病原體的保護。一般來說，聯(lián)合疫苗中的抗體滴度是單價Hib疫苗中相同劑量Hib所引起的滴度的至少85％、90％，優(yōu)選約100％或更多。
本發(fā)明的疫苗上述本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選配制為疫苗。優(yōu)選地，所述疫苗包含足夠增強對免疫原的免疫應答的適量佐劑。合適的佐劑包括但不限于，諸如氫氧化鋁和磷酸鋁的鋁鹽、角鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝桿菌細胞壁制備物、單磷酰脂質A、分枝菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂毒素B亞基、polphosphazene及衍生物、和免疫刺激復合物(ISCOMs)，如那些為Takahashi等.(1990)Nature 344873-875所描述的。對于獸醫(yī)使用或用于在動物中產生抗體而言，可使用弗氏佐劑的促有絲分裂成分。
本發(fā)明的疫苗制劑優(yōu)選在使用前重配。重配涉及將疫苗的液體成分與本發(fā)明的干燥固體、發(fā)泡玻璃或高粘性液體制劑混合。本發(fā)明也涉及一種具有防水內表面的容器，所述容器含有本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗。使用該容器是有利的，因為其使得干燥組合物置于試管底部，以更易于重配的形式存在。
在保存樣品中摻入有色染料的有利之處在于以便容許本發(fā)明的干燥組合物更易顯現(xiàn)。在重配過程中其是特別重要的，可確保在使用前干燥固體或高粘性液體充分重配。優(yōu)選地，所述有色染料在中性pH下保持其顏色，且與注入患者的注射劑相容。最優(yōu)選的有色染料是酚紅。
當使用所有的免疫原性組合物或疫苗時，免疫原的免疫有效量應通過經驗確定。應當考慮的因素包括免疫原性，無論免疫原與佐劑或載體蛋白或其它載體是復合的或是共價連接的，給藥途徑和所要施用的免疫劑的用量。上述因素為疫苗領域所公知，且進行該決定完全為免疫學家之技能而無需過度實驗。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中物質可以不同濃度存在。一般而言，物質的最小濃度是必需達到其預期用途的數量，而最大濃度是可保留在溶液中或均勻懸浮在最初混合物中的最大數量。例如，治療劑的最小數量優(yōu)選可提供單一治療有效劑量的數量。如果在結晶前形成發(fā)泡玻璃，也可使用過飽和溶液。對于生物活性物質而言，最小濃度是重配時對于生物活性所必需的數量，最大濃度是均勻懸浮無法保持時所處的濃度。在單劑量單位情況下，所述數量是單一治療應用的數量。通常來說，預計每一劑量可包含1-100ug的蛋白抗原，優(yōu)選5-50ug以及更優(yōu)選5-25ug。優(yōu)選的細菌多糖劑量是10-20ug、10-5ug、5-2.5ug或2.5-lug。但是，各種物質之間不同物質的優(yōu)選數量是很容易為本領域技術人員所確定。
本發(fā)明的方法本發(fā)明的方法是用于保存包含IPV和穩(wěn)定劑組合物，產生了其中IPV的抗原性得到保留的組合物。優(yōu)選地，在所述樣品中摻入的細菌多糖應當是干燥的。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及干燥IPV并包含步驟·通過在穩(wěn)定劑溶液中懸浮或溶解IPV制備保存樣品；優(yōu)選地所述保存樣品中存在細菌多糖和/或玻璃形多羥基化合物；·使所述保存樣品經受下述的溫度和壓力條件，即溶劑從保存樣品中喪失的條件；和·除去溶劑直至所述保存樣品干燥形成固體或高粘性液體，其中IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述保存樣品裝入至具有防水內表面的容器中進行干燥。
本發(fā)明的另一種方法涉及發(fā)泡干燥，包含步驟·通過在穩(wěn)定劑溶液中懸浮或溶解IPV制備保存樣品；優(yōu)選地所述保存樣品中存在細菌多糖和/或玻璃形多羥基化合物；·使所述保存樣品經受下述的溫度和壓力條件，即所述保存樣品形成泡沫的條件；和·除去溶劑直至所述泡沫干燥形成固體，其中IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。
本發(fā)明的一種優(yōu)選的發(fā)泡干燥方法使用了具有防水內表面的容器，包含步驟·通過在穩(wěn)定劑溶液中懸浮或溶解IPV和優(yōu)選地細菌多糖制備保存樣品；·將所述保存樣品裝入具有防水內表面的容器中；·使所述含有保存樣品的容器經受下述的溫度和壓力條件，由所述溫度和壓力條件使所述保存樣品形成泡沫；·除去溶劑直至所述泡沫干燥形成固體，其中IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。
上述本發(fā)明的發(fā)泡干燥方法任選地包含冷凍步驟。所述保存樣品可以全部或部分冷凍。因此本發(fā)明的某些方法包含步驟·通過在穩(wěn)定劑溶液中懸浮或溶解IPV和優(yōu)選地細菌多糖制備至少部分冷凍的保存樣品，以及冷凍所述混合物；·使所述至少部分冷凍的保存樣品經受下述的溫度和壓力條件，即所述保存樣品形成泡沫的條件；和·除去溶劑直至所述泡沫干燥形成固體，其中IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。
上述方法的冷凍步驟優(yōu)選使用急冷冷凍的處理，其中通過蒸發(fā)減壓是導致冷凍的原因。其導致樣品快速冷凍，使得抗原損失較少。因此本發(fā)明的一種方法包括步驟·通過在穩(wěn)定劑溶液中懸浮或溶解IPV和優(yōu)選地細菌多糖制備保存樣品；·使所述保存樣品經受減壓，使得所述保存樣品成為至少部分冷凍的；·使所述至少部分冷凍的保存樣品經受下述的溫度和壓力條件，即所述保存樣品形成泡沫的條件；和·除去溶劑直至所述泡沫干燥形成固體，其中IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。
本發(fā)明另一種優(yōu)選的方法是用于保存IPV，包含步驟·通過在穩(wěn)定劑溶液中懸浮或溶解IPV制備保存樣品·使所述保存樣品經受下述的溫度和壓力條件，即所述保存樣品通過蒸發(fā)作用釋放溶劑，并不起泡形成泡沫和優(yōu)選地無需冷凍；·除去溶劑直至所述樣品干燥形成高粘性液體，其中IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。
本發(fā)明的方法生產的IPV制劑能經受長期貯藏，在貯藏過程中IPV的抗原性和/或免疫原性得到保留。優(yōu)選地，在4℃下貯藏至少3、6、9、12、24個月后，IPV保留了至少40、50、60、70，優(yōu)選地80、90、95％的其最初抗原性和/或免疫原性。在IPV重配后，在合適的水溶液中并使用合適的方法，例如那些上述的方法來測定抗原性和免疫原性。
無需冷凍或發(fā)泡的干燥方法特別適用于要被干燥的活性劑，其中所述活性劑在干燥過程中，由于暴露于冷凍或泡沫形成相關的起泡中而易于損失活性和/或抗原性。其也特別適用于其中較低濃度的玻璃形多羥基化合物是有利的和/或其中優(yōu)選較短干燥過程的。
穩(wěn)定劑用于本發(fā)明方法中的穩(wěn)定劑可優(yōu)選包含玻璃形多羥基化合物。合適的物質包括但不限于，所有的多羥基化合物，包括糖類和非糖類多羥基化合物。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑能使活性劑得到貯藏，通過變性、聚集或其它方法基本上不損失活性。特別合適的原料包括糖類、糖醇類和糖類衍生物。優(yōu)選地，所述玻璃形多羥基化合物是糖類或其衍生物，包括葡萄糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖、乳果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、異麥芽糖、麥芽糖醇、乳糖醇、益壽糖(palatinit)、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖或葡聚糖，最優(yōu)選海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、棉子糖、甘露醇、乳糖、乳糖醇或益壽糖。
細菌多糖作為穩(wěn)定劑，以及本發(fā)明優(yōu)選的實施方案摻入細菌多糖作為所述穩(wěn)定劑的成分。在該實施方案中所述細菌多糖扮演著穩(wěn)定劑和免疫原的雙重角色。
糖類包括但不限于，單糖、二糖、三糖、寡糖和它們相應的糖醇類、諸如糖類衍生物和化學修飾的糖類的多羥基化合物、羥乙基淀粉和糖類共聚物。天然和合成的糖類皆適合于使用。合成的糖類包括但不限于，具有為硫醇或碳鍵所取代的糖苷鍵的那些。D和L型糖類皆可使用。所述糖類可以是非還原的或還原的。其中使用還原糖類時，優(yōu)選添加麥拉德反應(Mailard reaction)的抑制劑。
適合于本發(fā)明使用的還原糖類是本領域公知的那些，包括但不限于，葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麥芽酮糖和乳果糖。非還原糖類包括但不限于，選自糖醇類和其它直鏈多羥基化合物的多羥基化合物的非還原苷類。其它有用的糖類包括棉子糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖蔗糖、纖維二糖、甘露二糖和糖醇類。所述糖醇苷類優(yōu)選單糖苷類(monoglycosides)，具體而言是通過還原諸如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖的二糖類而獲得的化合物。
特別優(yōu)選的糖類是海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、益壽糖和吡喃葡萄糖基-1→6-甘露醇。
氨基酸可作為穩(wěn)定劑并可單獨使用和優(yōu)選地與多羥基化合物聯(lián)合使用。雖然所有的氨基酸、或氨基酸的組合、肽、水解蛋白或諸如血清白蛋白的蛋白可作為穩(wěn)定劑，優(yōu)選的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺。
優(yōu)選地，所述保存樣品可含有能抑制本發(fā)明干燥固體或高粘性液體中結晶形成的成分。鹽類和包括氨基酸和酚紅的其它分子抑制結晶形成。
在本發(fā)明方法中使用的穩(wěn)定劑的濃度可在1％-50％w/v，優(yōu)選在1-5％、5-10％、5-10％、15-20％、20-25％或25-50％，最優(yōu)選小于25％(w/v)。所需的穩(wěn)定劑的數量與存在的鹽類的數量成比例。因此，盡管3％-10％的穩(wěn)定劑水平是優(yōu)選的，但是具有高鹽含量的干燥樣品可能需要10％-25％(w/v)較高濃度的穩(wěn)定劑水平。
容器不同和混合物和各種容器外形及尺寸可同時進行加工。理想地，所使用的容器尺寸是足夠用于容納最初混合物且能向其形成的干燥制劑提供容量。一般來說，其由玻璃形材料的質量、所述容器的表面積和決定了是否發(fā)生發(fā)泡的溫度及壓力條件所確定。玻璃形成材料的質量應足以形成粘性漿狀物，任選地發(fā)泡，事實上轉變?yōu)槊咳萜鞅砻婷繂挝幻娣e的最小質量。該比率隨混合物和所使用的容器的不同而改變，但其易于為本領域技術人員通過如下本文中所列出的方法可憑經驗確定。任何上述可使用的容器包括Wheaton結晶器和管截短的管形瓶。
本發(fā)明的方法優(yōu)選使用具有防水內表面的容器。通過在內表面上被覆疏水組合物可達到該目的，例如通過硅化作用?？赏ㄟ^本領域技術人員眾所周知的方法完成硅化作用。在一種方法中，所述容器通過用硅樹脂乳液充滿(rising)容器內部而得到硅化處理，接著通過烘箱高溫處理，通常在350℃?？蛇x地，所述防水內表面可通過由防水組合物制備的容器而實現(xiàn)。
所述容器的防水內表面可更適于發(fā)生發(fā)泡并具更多重現(xiàn)性。其容許在保存樣品中使用較低濃度的多羥基化合物，能依次減少干燥樣品所需的時間長度、減少麥拉德反應(Mailard rections)的影響或與損害活性劑的多羥基化合物的其它相互作用。如果保存樣品包含疫苗，由于較低數量的多羥基化合物存在，所產生的發(fā)泡玻璃可快速及容易地重配，以及所產生的疫苗溶液具較低的粘性，更便于施用。所述防水內表面容許更容易地重配干燥固體或高粘性液體，因為其促使樣品保持在容器底部使得其更易于有效重配。
盡管單一類型可用于本文中，但是可以存在一種以上的穩(wěn)定劑，一種以上的添加劑和一種以上的物質。這些成分的有效量容易為本領域技術人員所確定。
溶劑通過在水中溶解/懸浮IPV和穩(wěn)定劑以制備水溶液而獲得所述保存樣品。優(yōu)選地，水以5-98％體積水平存在于保存樣品中，更優(yōu)選80-98％體積，最優(yōu)選85-98％體積。
溶劑的體積可改變，并取決于穩(wěn)定劑和所要摻入的物質以及所有的添加劑。所需的最小體積是必需用于溶解各種成分的數量。但是，也可使用所述物質均勻分散的懸浮液。在特定實施方案中成分的合適數量容易為本領域技術人員按照本文所提供的實施例所確定。
各種添加劑可放入所述保存樣品中。一般來說，添加劑增強發(fā)泡和/或干燥處理和/或有助于物質的溶解?？蛇x地，添加劑有助于在固體中摻入的物質的穩(wěn)定性?？纱嬖谝环N或多種添加劑。
作為一個例子，在泡沫玻璃中添加揮發(fā)性/發(fā)泡鹽類容許更大初始體積并產生更高的表面積，因此能達到較好的起泡和更快速地干燥。在本文中使用的揮發(fā)性鹽類是在用于產生泡沫玻璃的條件下?lián)]發(fā)的鹽類。合適的揮發(fā)性鹽類的例子包括但不限于，醋酸銨、碳酸氫銨和碳酸銨。分解產生氣體產物的鹽類也能達到增強發(fā)泡和更快速干燥的目的。上述鹽類的例子是碳酸氫鈉和偏亞硫酸氫鈉。優(yōu)選地，所述揮發(fā)性鹽類以約0.01-5M的數量存在。高達5M的濃度適合在本文中使用。所產生的泡沫玻璃具有相同的泡沫構象，且與其中未使用揮發(fā)性/發(fā)泡鹽類的泡沫玻璃比較明顯更干燥。
另一種合適的添加劑是泡沫穩(wěn)定劑，其可與揮發(fā)性鹽或分解鹽結合使用。其可以是諸如兩親性分子(即，例如磷脂和表面活性劑)的表面活性成分或可增加發(fā)泡漿狀物的粘性的試劑，例如諸如瓜爾膠的及其衍生物增稠劑。
另外的添加物是麥拉德反應(Maillard reaction)的抑制劑。優(yōu)選地，如果所述物質和/或玻璃基質成形材料包含羰基和氨基、亞氨基或胍基，所述組合物進一步包含至少一種生理學上可接受的麥拉德反應(Maillard reaction)的抑制劑，以有效基本阻止在所述組合物中氨基和活性羰基縮合的數量存在。所述的麥拉德反應(Maillard reaction)的抑制劑可以是本領域任何公知的抑制劑。所述抑制劑以足夠阻止或基本上阻止氨基和活性羰基縮合的數量存在。一般來說，所述物質提供了氨基以及玻璃基質成形材料提供了羰基，或相反。然而，在所述物質或糖類中氨基和羰基可存在于所述物質和碳水化合物分子內。
已知多種類型的化合物顯示對麥拉德反應(Maillard reaction)起抑制作用，因此可用于本文所述的組合物中。這些化合物通常是麥拉德反應(Maillard reaction)的競爭性或非競爭性抑制劑。競爭性抑制劑包括但不限于，氨基酸殘基(D和L)、氨基酸殘基和肽的組合。特別優(yōu)選的是賴氨酸、精氨酸、組氨酸和色氨酸。賴氨酸和精氨酸是最有效的。存在著許多已知的非競爭性抑制劑。這些包括但不限于，氨基胍及其衍生物及兩性霉素B。EP-A-0 433 679也描述了合適的麥拉德(Maillard)抑制劑，其包括4-羥基-5，8-二氧喹啉衍生物。
活性劑本發(fā)明的方法被用于保存滅活脊髓灰質炎病毒(IPV-優(yōu)選地包含在疫苗領域中作為標準的1、2和3型，更優(yōu)選Salk脊髓灰質炎疫苗)。IPV包含1型的20-80、優(yōu)選40或8D-抗原單位(Mahoney)，2型的4-20、優(yōu)選8或16D-抗原單位(MEF-1)和3型的20-64、優(yōu)選32或64D-抗原單位(Saukett)。所述IPV疫苗制劑在水溶液中重配后適于注射，其優(yōu)選含有額外的疫苗成分。
摻入本發(fā)明方法中的細菌多糖是例如源自一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、b型流感嗜血菌(Haemophilusirafluenzae b)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的莢膜多糖，優(yōu)選流感嗜血菌(Haemophilus irafluenzae)的PRP莢膜多糖。優(yōu)選的莢膜多糖也包括源自一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的血清組A、C、W-135和Y的那些。另一種優(yōu)選的莢膜多糖源自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。所述肺炎球菌莢膜多糖抗原優(yōu)選選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最優(yōu)選自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一個優(yōu)選的實施方案包含金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的5型、8或336型莢膜多糖。另一種優(yōu)選的多糖包括表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的I型、II型或III型莢膜多糖，B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型或III型莢膜多糖。另一種優(yōu)選的多糖包括A組鏈球菌的莢膜多糖，優(yōu)選進一步包含至少一種M蛋白和更優(yōu)選包含多種類型的M蛋白。
使用本發(fā)明方法可保存的優(yōu)選的活性劑組合包含IPV。優(yōu)選地，IPV與細菌多糖結合，所述細菌多糖包含一種或多種Hib PRP多糖和/或腦膜炎球菌A、C、W和/或Y多糖和/或肺炎鏈球菌多糖。優(yōu)選的組合包括IPV和Hib；IPV和MenC；IPV和MenA及C；IPV和Hib及MenC或IPV、Hib、MenA和C。每種細菌多糖可以1-5μg、5-10μg、10-20μg或20-40μg的劑量存在。
細菌多糖是未結合的或結合于諸如破傷風類毒素、破傷風類毒素片段C、白喉毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素或蛋白(US6342224的載體蛋白。
所述多糖結合物可通過本領域任何公知的偶聯(lián)技術制備。優(yōu)選的結合方法依賴于多糖與四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)的活化作用以形成氰酸酯?；罨亩嗵强芍苯踊蛲ㄟ^間隔基與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)。優(yōu)選地，使用涉及形成硫醚鍵的異種連接化學反應，將氰酸酯與己二胺偶聯(lián)以及將氨基衍生的多糖與載體蛋白結合。上述結合物描述于Uniformed Services University的PCT公開申請WO93/15760中。
所述結合物可任選地通過直接還原性胺化方法制備，所述方法描述于US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。
另一種方法涉及將己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖通過碳二亞胺縮合與蛋白載體偶聯(lián)(Chu C.等Infect.Immunity，1983245 256)。
干燥處理在一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及在穩(wěn)定劑存在下干燥IPV，優(yōu)選在細菌多糖存在下。在該方法中，保存樣品經受降低的溫度和壓力條件。所述溫度降低至小于20℃或0℃，優(yōu)選小于-10℃或-20℃，更優(yōu)選-40℃或-60℃。所述壓力降低至小于1毫巴，或優(yōu)選地小于0.5、0.1毫巴的壓力為，更優(yōu)選0.05或0.01毫巴。所述降低的溫度和壓力條件維持至少10、12、16、20小時，優(yōu)選24、36小時，更優(yōu)選48或72小時。除去溶劑直至所述保存樣品干燥形成固體。
在本申請全文中，固體包括形成為干燥樣品的玻璃、橡膠和晶體。上述固體優(yōu)選保留10-20％或5-10％的水含量，優(yōu)選5-6％、4-5％或3-4％或2-3％的水含量，更優(yōu)選1-2％或0-1％(w/w)的水含量。
發(fā)泡干燥本發(fā)明一種優(yōu)選的方法涉及使保存樣品經受這樣的壓力和溫度條件，以便所述樣品開始起泡，形成泡沫。
由于蒸發(fā)過程的吸熱性，所述保存樣品內部的溫度可不同于該樣品外部的溫度。參比溫度是保存樣品外部環(huán)境的溫度，例如，在使用大的工業(yè)冷凍干燥器的地方，為擱板的溫度。其通常相應于冷凍干燥器溫度設定值。
本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案通過降低壓力同時維持溫度條件以獲得起泡。所述壓力調節(jié)為或低于8、7、6，預選5、4、3，更優(yōu)選2、1.5、1，最優(yōu)選0.8或0.5毫巴，同時維持溫度設定值于高于0℃的溫度，優(yōu)選在10℃-15℃；15℃-20℃；20℃-25℃；25℃-30℃或30℃-37℃。維持這些條件至少1、2、3、4、5、8、10、12、16或24小時。
本發(fā)明的另一個實施方案通過改變溫度同時維持壓力條件以獲得起泡。所述溫度設定值增加到20℃以上，優(yōu)選在20℃-30℃；30℃-40℃；40℃-50℃或50℃-70℃；或所述溫度設定值在10-50℃范圍內，優(yōu)選在20-40℃，更優(yōu)選在25-35℃。壓力條件維持在減壓水平或低于8、7、6，優(yōu)選5、4、3，更優(yōu)選2、1.5、1，最優(yōu)選0.8或0.5毫巴。維持這些條件至少1、2、3、4、5、8、10、12、16或24小時。
除去溶劑形成泡沫玻璃本發(fā)明隨后階段的發(fā)泡干燥方法涉及除去溶劑直至所述泡沫干燥形成固體。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過維持壓力和溫度條件于為了獲得發(fā)泡所應用的那些條件以達到該目的。例如，所述壓力維持于或低于8、7、6，優(yōu)選5、4、3，更優(yōu)選2、1.5、1，最優(yōu)選0.8或0.5毫巴，同時維持溫度設定值高于0℃，優(yōu)選在2℃-10℃，10℃-20℃；20℃-30℃；30℃-35℃，35℃-40℃，最優(yōu)選在5℃-25℃。維持這些溫度和壓力條件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小時或更多，以便獲得具有溶劑含量小于或等于10、8、5、4，優(yōu)選3、2或最優(yōu)選1％(w/w)的固體。
本發(fā)明另一個實施方案在溶劑除去過程中將溫度設定值增加到較在該方法中較早所維持的溫度值更高的溫度設定值。其有利之處在于容許溶劑以較快速率離開樣品，以便本發(fā)明的方法可在較短時間內完成。舉例來說，所述溫度設定值增加到0℃以上，優(yōu)選在2℃-10℃；10℃-20℃；20℃-30℃；30℃-40℃；40℃-50℃；50℃-60℃，同時維持壓力于或低于8、7、6，優(yōu)選5、4、3，更優(yōu)選2、1.5、1，最優(yōu)選0.8或0.5毫巴。維持這些溫度和壓力條件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小時或更久，以便獲得具有小于10、8、5、4，優(yōu)選3、2或最優(yōu)選1％(w/w)水含量的固體。
本發(fā)明的另一個實施方案在溶劑除去過程中將壓力設定值降低到較在發(fā)泡過程中所使用的壓力設定值更低的壓力設定值。其有利之處在于容許溶劑以較快速率離開樣品，以便本發(fā)明的方法可在較短時間內完成。舉例來說，所述壓力設定值減少到或低于5、4、3，優(yōu)選2、1、0.8，更優(yōu)選0.5、0.1，最優(yōu)選0.05或0.01毫巴，同時維持溫度于或高于0℃，優(yōu)選在10℃-20℃；20℃-30℃；30℃-35℃或高于40℃。維持這些溫度和壓力條件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小時或更久，以便獲得具有溶劑含量小于或等于5、4，優(yōu)選3或2或更優(yōu)選1％(w/w)的固體。
包括冷凍步驟的發(fā)泡干燥本發(fā)明的方法任選地包括冷凍所述樣品。在發(fā)泡干燥前冷凍樣品有利于增加同一批次樣品之間的重復性。這是由于所有樣品從相同的冷凍物理狀態(tài)開始所述處理。保存樣品可以全部或部分冷凍。
冷凍任選在通過將所述保存樣品于低于0℃溫度，放置以容許所述樣品冷凍的合適的一段時間，使所述樣品減壓前進行。優(yōu)選所使用的溫度為或低于-10℃、-15℃、-20℃、-30℃、-40℃、-70℃或-140℃。樣品可在低于0℃溫度持續(xù)1、2、3、4、5、8、16或更多小時以容許冷凍發(fā)生的條件下取出。
對于某些樣品而言，具體而言，樣品是易于為溶劑結晶所損害的，例如細胞制備物或其它生物學系統(tǒng)，優(yōu)選以小于或等于0.1、0.5、1、2、3、4、5℃每小時的速率緩慢地冷凍所述樣品。其它組合物通過瞬時冷凍可更有效地保存，例如通過在液氮中快速冷凍。該方法特別有益于蛋白質或病毒顆粒。通過蒸發(fā)作用冷凍也導致樣品的快速冷凍。
可選地，所述保存樣品通過將樣品減壓使得所述樣品發(fā)生全部或部分冷凍而被冷凍。在大容量冷凍干燥器設備中，在擱板溫度為或高于0℃、10℃、15℃、20℃、30℃、37℃下進行上述驟冷凍。優(yōu)選地，所述擱板溫度在5-35℃，更優(yōu)選在10-20℃，最優(yōu)選在15℃。所述壓力任選地從最初減少到200毫巴，持續(xù)5、10、20、30、60分鐘或更久，可容許抽氣。為了冷凍樣品，所述壓力進一步減少到等于或低于2、1、0.5、0.2、0.1毫巴的壓力。維持該壓力至少5、10、20或30分鐘直至樣品全部或部分冷凍。
隨后發(fā)泡和除去溶劑形成固體的步驟描述如上。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，在干燥器中樣品冷凍以及起泡的步驟在恒溫下進行，優(yōu)選改變壓力條件。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，在干燥器中樣品冷凍、發(fā)泡和除去溶劑形成固體的步驟在恒溫下進行，優(yōu)選改變壓力條件。
在本發(fā)明另一個實施方案中，在冷凍樣品、發(fā)泡和除去溶劑形成固體的過程中，壓力和溫度條件都不相同。
本發(fā)明的方法優(yōu)選使用具有防水內表面的容器。通過在內表面上被覆疏水組合物可達到該目的，例如通過硅化作用。可通過本領域技術人員眾所周知的方法完成硅化作用。可選地，所述防水內表面可通過由防水組合物制備的容器而實現(xiàn)。
存在容器的防水內表面可更適于發(fā)生發(fā)泡并具更多重現(xiàn)性。其容許在保存樣品中使用較低濃度的多羥基化合物，能依次減少干燥樣品所需的時間長度、減少麥拉德反應(Mailard rections)的影響或與損害活性劑的多羥基化合物的其它相互作用。如果保存樣品包含疫苗，由于較低數量的多羥基化合物存在，所產生的發(fā)泡玻璃可快速及容易地重配，以及所產生的疫苗溶液具較低的粘性，更便于施用。
無需冷凍或發(fā)泡的干燥本發(fā)明一種特別優(yōu)選的方法包括在穩(wěn)定劑，和優(yōu)選細菌多糖存在下干燥IPV，其使用了溫和的方法以避免IPV暴露于冷凍或發(fā)泡過程中，使得IPV在干燥過程中經受更低的壓力且保留高水平的抗原性。
該方法特別適用于在較低濃度玻璃形多羥基化合物條件下，例如在低于10％(w/v)的濃度條件，更優(yōu)選低于5％(w/v)，其是有利的且優(yōu)選更短的干燥時間。
通過蒸發(fā)作用喪失溶劑(蒸發(fā)干燥-步驟b)無需冷凍或發(fā)泡的干燥方法包括將樣品經受這樣的壓力和溫度條件，以便所述保存樣品通過蒸發(fā)作用喪失溶劑，無需樣品冷凍或起泡形成泡沫。
由于蒸發(fā)過程的吸熱性，所述保存樣品內部的溫度有時可以不同于樣品外部的溫度。所提及的溫度是保存樣品外部環(huán)境的溫度，例如，在使用大的工業(yè)冷凍干燥器情況下，為擱板的溫度。其通常相應于冷凍干燥器溫度設定值。
任選地，所述保存樣品抽氣的預備步驟存在于本發(fā)明的方法中。所述壓力減少到或低于200毫巴，優(yōu)選在200-35毫巴，在進一步減壓前持續(xù)至少5分鐘。
本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案通過減壓同時控制溫度條件實現(xiàn)蒸發(fā)干燥。所述壓力調節(jié)為或低于30、25、20，優(yōu)選15、12，最優(yōu)選10、8、7、6、5、4、3、2或1毫巴，同時維持溫度設定值在高于0℃的溫度，優(yōu)選在4℃-37℃、4℃-10℃、10℃-15℃；15℃-20℃；20℃-25℃；25℃-30℃；或30℃-37℃；或37℃-45℃。維持這些條件至少1、2、3、4、5、8、10、12、16或24小時，優(yōu)選持續(xù)2-4小時、4-6小時、6-8小時、8-12小時或12-18小時。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述壓力維持高于2毫巴，于此溫度設定值為15℃以防止樣品的冷凍。在一個優(yōu)選的實施方案中，溫度維持于15℃，以及壓力設定在5-10毫巴，更優(yōu)選6-9毫巴，最優(yōu)選約8毫巴。在使用更高溫度設定值情況下，可能較低的壓力可避免樣品冷凍，在使用較低溫度設定值情況下，壓力應維持在更高水平以避免冷凍。優(yōu)選地，維持所述條件足夠時間以便蒸發(fā)速率能減慢，使得樣品的溫度與樣品外部的溫度近似相同。
優(yōu)選地，保存樣品不應冷凍或沸騰形成泡沫，可喪失溶劑形成粘性液體或高粘性液體。
除去溶劑形成高粘性液體本發(fā)明下一階段方法包括除去溶劑直至所述保存樣品干燥形成高粘性液體，無需發(fā)泡和優(yōu)選地無需冷凍。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過維持壓力和溫度條件于應用于最初蒸發(fā)干燥階段的那些條件以達到目的。舉例來說，壓力維持于或低于30、25、20，優(yōu)選15、12，更優(yōu)選10、8、7、6、5、4、3、2或1毫巴，同時維持溫度設定值高于0℃，優(yōu)選在5℃-37℃、5℃-10℃、10℃-15℃；15℃-20℃；20℃-25℃；25℃-30℃；或30℃-37℃。對于15℃的溫度設定值而言，壓力為5-10毫巴，優(yōu)選6-9毫巴，最優(yōu)選約8毫巴，維持4-24小時，優(yōu)選1-4、4-8、8-12或12-16小時。維持這些溫度和壓力條件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小時或更久以便獲得具有小于或等于15、12，優(yōu)選10、8、5、4、3、2或1％(w/w)溶劑含量的高粘性液體。
本發(fā)明的另一個實施方案在溶劑除去過程中，較在該方法初期所維持的溫度，將溫度設定值增加到更高的溫度設定值。其容許溶劑離開以較快速率離開樣品，使得本發(fā)明的方法可在更短時間內完成。例如，將溫度設定值增加到高于0℃，更優(yōu)選高于20℃，優(yōu)選在5℃-37℃、5℃-10℃、10℃-20℃；20℃-30℃；更優(yōu)選在30℃-40℃；更優(yōu)選在40℃-50℃；最優(yōu)選在50℃-60℃，同時維持壓力于或低于30、25、20，優(yōu)選15、12，最優(yōu)選10、8、7、6、5、4、3、2或1毫巴。維持這些溫度和壓力條件1、2、3、4、5、6、8、10、12、18小時或更久，以便獲得具有小于或等于15、12，優(yōu)選10、8、5、4、3、2或1％的固體。為了方法成功完成，該實施方案需要使用在所述溫度下熱穩(wěn)定的活性劑。
本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案在溶劑除去(步驟c)過程中，較在該方法(步驟b)初期所使用的壓力，將壓力設定值減少到較低的壓力設定值。其容許溶劑以較快速率離開樣品，使得本發(fā)明的方法可在更短時間內完成。也能使更高比例的溶劑喪失。舉例來說，將壓力設定值設定在或低于7、6，優(yōu)選5、4、3，更優(yōu)選2、1.5、1，最優(yōu)選0.8、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01或0.005毫巴，同時維持溫度于或高于0℃，優(yōu)選在10℃-20℃；20℃-30℃；30℃-35℃或高于40℃。維持這些溫度和壓力條件1、2、3、4、5、6、8、10、12或18小時或更久，以便獲得具有小于或等于15、12，優(yōu)選10、8、5、4、3、2或1％(w/w)溶劑含量的固體，優(yōu)選通過Karl Fischer電量濕度分析儀測定(Eur.J.Pharm.Biopharm.(2000)50；277-284)。
優(yōu)選地，步驟b)和c)應當在等于或小于18小時，更優(yōu)選16、14、12，最優(yōu)選10、8、6或4小時的時間內完成。
干燥組合物是來自溶劑業(yè)已通過蒸發(fā)、沸騰或升華除去的組合物，留下的溶劑含量小于或等于15、12、10，更優(yōu)選8、5、4、3、2或1％(w/w)，優(yōu)選通過Karl Fischer方法測定。溶劑含量的優(yōu)選范圍是1-3％、3-5％、5-10％或10-15％(w/w)。所述術語包括高粘性液體及干燥的泡沫玻璃和冷凍干燥的固體。
高粘性液體定義為來自溶劑業(yè)已通過蒸發(fā)除去而無需沸騰的物質，所留下的溶劑含量小于或等于15、12、10，優(yōu)選8、5、4、3、2或1％(w/w)，優(yōu)選通過Karl Fischer方法測定。溶劑含量的優(yōu)選范圍是1-3％、3-5％、5-10％或10-15％(w/w)。所述高粘性液體具有足夠低的溶劑含量，使得活性劑在4℃下以穩(wěn)定態(tài)保存至少3、6、9、12或24個月，在這段時間后，容許活性劑保留至少40、50、60，優(yōu)選70、80、90、95％的其抗原性和/或免疫原性。優(yōu)選地，所述高粘性液體具有除了玻璃之外的固體外觀，在2、4或6天后，更優(yōu)選在1、2、3、4、6、7、10或12個月后，能非常緩慢地流動。所述非常緩慢地流動可通過倒置含有該高粘性液體的容器并置于室溫下直至觀察到高粘性液體流動而得到測定。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述高粘性液體在2、4或6天后，優(yōu)選在2、3或4星期后，更優(yōu)選在2、4、6、8、10或12個月后在倒置位置似乎并不流動。
粘性液體定義為溶劑除去的初始相產物，在該初始相末端大多數溶劑業(yè)已從樣品中喪失?？勺R別該點，因為當體積蒸發(fā)的吸熱影響失去時，蒸發(fā)速率降低使得樣品溫度回到環(huán)境溫度。
泡沫玻璃是含有玻璃成形多羥基化合物的干燥組合物，其通過其中將保存樣品經受下述的溫度和壓力條件的方法而形成，所述條件即樣品劇烈地起泡或沸騰使得當樣品干燥時形成泡沫。
在本專利說明書中引用的所有參考文獻或專利申請在本文中并入作為參考文獻。
實施例如下我們所采納的實施例使用了標準的技術，除非另有詳細描述，為本領域技術人員眾所周知且為常規(guī)技術。實施例是例證性的，但并不限制本發(fā)明。
實施例1.蒸發(fā)冷凍處理所進行的處理使用了Heto Drywinner 8-85冷凍干燥器，其中擱板溫度可在1℃范圍內調節(jié)，冷凝器的終點溫度是-85℃，壓力用放氣閥調節(jié)，6個熱電偶可用于測量產物溫度。
通過向水溶液中添加穩(wěn)定劑(10％海藻糖或3.5％蔗糖)和活性劑制備保存樣品。將樣品置于冷凍干燥器中，擱板溫度在全過程中維持在15℃的固定溫度設定值。壓力最初減少到200毫巴，并在進一步減壓前在該水平上維持10分鐘。在1.5毫巴處，由于蒸發(fā)冷卻溶液開始冷凍，如圖1所示。壓力進一步減少到0.1毫巴以容許樣品變成完全冷凍。接著將壓力增加到0.8毫巴-3.5毫巴，在該處泡沫形成，水分從樣品中喪失。在該實驗條件下，在僅含有水的參比樣品中沒有看到沸騰。樣品可通過蒸發(fā)喪失水分而不通過沸騰。在這些條件下18小時后，樣品被干燥且發(fā)泡溶液變成泡沫玻璃。
將擱板溫度保持在高達37℃的其它溫度設定值，成功進行了類似的處理。
實施例2.冷凍條件的確定通過在水中溶解蔗糖給出1％、5％、10％和20％溶液來制備樣品。將樣品置于冷凍干燥器中，擱板溫度在全過程中維持在15℃。壓力最初減少到200毫巴，并在進一步減壓至50毫巴、5毫巴、2.5毫巴、0.75毫巴、0.4毫巴和0.2毫巴之前在該水平上維持10分鐘。在每個壓力水平上維持20分鐘以容許溫度達到平衡，使用熱電偶讀出樣品的溫度。熱電偶附著在具有不同蔗糖濃度的樣品上，記錄于表1中的溫度是溫度的平均值。
結果所有樣品在1.66-1.1毫巴之間冷凍，與存在的蔗糖濃度無關。在不同壓力下測量的溫度十分接近從三相點曲線所預測的那些。因此對于不同壓力下的樣品溫度，蔗糖的存在似乎并不具有大的影響。
在本發(fā)明一種優(yōu)選方法中，必需要避免樣品的冷凍?？赏ㄟ^維持壓力高于2毫巴，使用15℃的擱板溫度來實現(xiàn)。在較低溫度下，壓力應當維持在更高水平，反之使用更高溫度時，應容許壓力進一步減少，避免樣品冷凍。
表1

實施例3.具有不同糖濃度的樣品的發(fā)泡條件制備含有0％、5％、10％、15％、20％、25％和50％蔗糖的保存樣品。將樣品置于冷凍干燥器中，擱板溫度在全過程中維持在15℃。壓力最初減少到200毫巴，并在進一步減壓前在該水平上維持10分鐘。將壓力進一步減少到0.1毫巴以容許樣品變成完全冷凍。接著在隨后的實驗中將壓力增加到0.788毫巴、0.812毫巴或3.5毫巴。維持這些條件，對于3.5毫巴和0.812毫巴的實驗維持3小時，對于0.788毫巴的實驗維持6小時。評估每種樣品的物理特性。
結果如表2所示，在3.5毫巴壓力下，對于可靠的發(fā)泡而言，需要50％的高蔗糖濃度。與之相反，在10-25％的較低蔗糖濃度下，0.8毫巴的較低壓力容許可靠的發(fā)泡。使用較低蔗糖濃度可利于例如要用于疫苗的保存的樣品。因此使用0.8毫巴和10-25％蔗糖含量的方法是優(yōu)選的。
表2

實施例4.使用硅化容器的影響制備含有5％、10％、15％和25％蔗糖的保存樣品，并裝入管形瓶中，某些管形瓶被硅化。在一次實驗中，將樣品置于冷凍干燥器中，擱板溫度在全過程中維持在15℃。壓力最初減少到200毫巴，并在進一步減壓前在該水平上維持10分鐘。將壓力進一步減少到2.8毫巴，持續(xù)3小時。在這段時間內，當所存在的水蒸氣減少時，壓力減少到2.00毫巴。評估每種樣品的物理特性。
在第二次實驗中，將樣品置于冷凍干燥器中，擱板溫度在全過程中維持在37℃。壓力最初減少到200毫巴，并在進一步減壓前在該水平上維持10分鐘。將壓力進一步減少到2.4毫巴，持續(xù)3小時。在這段時間內，當所存在的水蒸氣減少時，壓力減少到1.06毫巴。評估每種樣品的物理特性。
結果硅化對樣品的抽氣有影響。在硅化的管形瓶中對樣品抽氣導致壓力減少到200毫巴，而在未硅化的管形瓶中則無該結果。通過樣品的起泡觀察到抽氣。
管形瓶的硅化也使發(fā)泡更可能產生，并具更多的重現(xiàn)性(表3)。管形瓶的硅化容許在較低的多羥基化合物濃度下發(fā)泡重復出現(xiàn)。較低的多羥基化合物濃度減少了干燥樣品所需時間的長度，并減少了麥拉德反應(Mailard rections)的影響或與損害活性劑的多羥基化合物的其它相互作用。在所涉及的樣品是疫苗情況下，其減少了樣品的粘性并更便于施用。
表3

實施例5.通過常規(guī)冷凍干燥或通過發(fā)泡干燥比較Hib-IPV的保存要被保存的活性劑是b型流感嗜血菌(Hib)的PRP多糖和滅活的脊髓灰質炎病毒(IPV)的三種毒株的混合物。通過將Hib-IPV在3.15％蔗糖溶液或10％海藻糖溶液中溶解制備保存樣品。
通過使用常規(guī)的冷凍干燥方法，樣品需要在大的冷凍干燥器中凍干3天，或通過使用實施例1所描述的發(fā)泡干燥方法來凍干樣品。
樣品在水中重配，使用ELISA來評估三種脊髓灰質炎病毒株抗原性的保持率。三種多克隆抗體和三種單克隆抗體，每種抗一種毒株，用于不同的ELISAs中。結果以未經受冷凍干燥或發(fā)泡干燥程序的樣品給定讀數的百分數來表示。
通過用重配的IPV-Hib對10只一組的小鼠接種，從小鼠中抽血并監(jiān)測抗IPV和Hib多糖的抗體水平，例如通過ELISA或蛋白質印跡的方法，來評估保存樣品在體內的它們的免疫原性。在激發(fā)免疫反應的小鼠模型中評估保護的程度。
結果使用蔗糖或海藻糖作為多羥基化合物，與使用常規(guī)冷凍干燥比較，使用發(fā)泡干燥技術IPV的抗原性維持得更好。
表4

*在3.15％蔗糖存在下重復5次冷凍干燥實驗，顯示的結果來自一次具有代表性的實驗。
實施例6.在存在Hib多糖下冷凍干燥IPV的保護效果制備含有3.15％蔗糖和IPV或IPV和Hib多糖混合物的保存樣品。將樣品置于Heto Drywinner 8-85冷凍干燥器中，在-32℃溫度設定值下冷凍干燥40小時，接著在4℃下持續(xù)干燥16小時。
樣品在水中重配，使用ELISA來評估三種脊髓灰質炎病毒株抗原性的保持率。三種單克隆抗體，每種抗一種毒株，用于不同的ELISAs中，與未被冷凍的參比樣品比較以評估在重配、冷凍干燥樣品中抗原保持率水平。結果以未經受冷凍干燥或發(fā)泡干燥程序的樣品給定讀數的百分數來表示。
結果如表5所示，在冷凍干燥后，較當IPV單獨冷凍干燥時所達到的效果而言，含有IPV的保存樣品中Hib的存在可導致IPV抗原的更高保持率。除了具有作為穩(wěn)定劑存在的蔗糖所達到的效果外，Hib多糖對IPV抗原性的保留起作用。
表5

實施例7.不同穩(wěn)定劑對IPV-Hib冷凍干燥的影響制備含有IPV-Hib的保存樣品，并使用3.15％蔗糖；2.5％山梨糖醇、0.8％谷氨酰胺和0.01％HSA；MMR穩(wěn)定劑和乳糖；3％甘氨酸、2％精氨酸和4％蔗糖；或4％蔗糖和2％甘氨酸作為穩(wěn)定劑。包括具有3.15％蔗糖作為穩(wěn)定劑的樣品的實驗使用兩倍濃度的IPV-Hib。在分批冷凍干燥器中使用常規(guī)的3天冷凍干燥周期對樣品進行冷凍干燥。
將樣品在水中重配，使用ELISA來評估三種脊髓灰質炎病毒株抗原性的保持率。三種多克隆抗體和三種單克隆抗體，每種抗各自毒株，用于不同的ELISAs中。結果以未經受冷凍干燥或發(fā)泡干燥程序的樣品給定讀數的百分數來表示。
通過用重配的IPV-Hib對10只一組的小鼠接種，從小鼠中抽血并監(jiān)測抗IPV和Hib多糖的抗體水平，例如通過ELISA或蛋白質印跡的方法，來評估保存樣品在體內的免疫原性。在激發(fā)免疫反應的小鼠模型中評估保護的程度。
結果IPV劑量從40/8/32DU/劑增加到80/16/64DU/劑導致IPV抗原性保持率的增加，如表6所示。穩(wěn)定劑的變化也影響抗原的保持率，4％蔗糖/2％甘氨酸和2.5％山梨糖醇/0.8％谷氨酰胺/0.01％HAS產生了更高的抗原保持率，如ELISA數據所示。
表6

實施例8.在冷凍干燥、發(fā)泡干燥或含冷凍步驟的發(fā)泡干燥后樣品特性的重復性。
配制保存樣品，其包含IPV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、CMV、肝炎病毒、HSV1、HSV2、呼吸道合胞病毒、登革熱病毒、諸如副流感病毒、披膜病毒和流感病毒的副粘病毒，和/或Hib作為活性劑。將活性劑在含有多羥基化合物的水溶液中溶解。通過冷凍干燥、遵循描述于實施例1的規(guī)程使用冷凍步驟的發(fā)泡干燥、或使用描述于實施例4的規(guī)程的沒有冷凍步驟的發(fā)泡干燥保存多種樣品。樣品在水溶液種重配并評估其活性。使用如實施例5所描述的ELISA測定法完成活性評估，該測定法使用特異于天然抗原的抗體。就活病毒而言，每種樣品的滴度通過使用病毒來感染合適的宿主細胞并通過空斑形成或通過免疫細胞化學來評估感染性而得到確定。在免疫原性組合物或疫苗發(fā)泡干燥情況下，在動物模型中通過用發(fā)泡干燥或冷凍干燥的疫苗免疫幾組動物，并在第一次免疫后例如在第14天和28天增強免疫應答，可測試免疫原性的保持率。在免疫接種程序表結尾時從動物中分離血清，并使用標準測定法測試其抗疫苗的滴度，例如通過ELISA、免疫細胞化學、蛋白質印跡、免疫沉淀反應、血清殺菌測定或凝集反應測定。結果遵照如下首先通過在冷凍干燥、使用冷凍步驟的發(fā)泡干燥或不用冷凍步驟的發(fā)泡干燥之后比較活性劑活性。其次，通過比較樣品在經受三種保存方法的每一種之后的活性范圍來評估保存技術的重復性程度。
實施例9.通過冷凍干燥和發(fā)泡干燥保存的活性劑的長期貯藏配制保存樣品，其包含IPV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、CMV、肝炎病毒、HSV1、HSV2、呼吸道合胞病毒、登革熱病毒、諸如副流感病毒、披膜病毒和流感病毒的副粘病毒，和/或Hib作為活性劑。將活性劑在含有多羥基化合物的水溶液中溶解。通過冷凍干燥、遵循描述于實施例1的規(guī)程使用冷凍步驟的發(fā)泡干燥、或使用描述于實施例4的規(guī)程的沒有冷凍步驟的發(fā)泡干燥保存多種樣品。樣品在37℃或23℃下貯藏7天得到老化，并與業(yè)已保持在4℃下的樣品比較活性。在水溶液中重配樣品并評估其活性。使用如實施例5所描述的ELISA測定法完成活性評估，該測定法使用特異于天然抗原的抗體。就活病毒而言，每種樣品的滴度通過使用病毒來感染合適的宿主細胞并通過空斑形成或通過免疫細胞化學來評估感染性而得到確定。結果遵照如下首先通過在貯藏于提高的溫度及貯藏于4℃之后比較活性劑活性。其次，通過比較樣品在經受每組條件之后的活性范圍來評估保存技術的重復性程度。
實施例10.無需冷凍或發(fā)泡的干燥方法制備含有5％、10％、15％和25％蔗糖的保存樣品，并裝入管形瓶中。將樣品置于冷凍干燥器中，在全過程中溫度設定于15℃。壓力最初減少到200毫巴，并在該水平上維持10分鐘以容許在進一步減壓前抽氣。壓力進一步減少到8毫巴，持續(xù)2-3小時，在該時間段內由于蒸發(fā)冷卻，插入樣品的熱電偶顯示樣品溫度降低到4℃。在2-3小時后，樣品溫度回到15℃，表明在這些溫度和壓力條件下蒸發(fā)接近完成。在該工序階段，樣品并不沸騰形成泡沫或冷凍，使得樣品內的活性劑暴露于盡可能小的壓力中。樣品具有固體外觀，類似于終產物。
通過進一步減少壓力到0.1毫巴，同時保持擱板溫度設定值于15℃以實現(xiàn)對樣品的進一步干燥。維持這些條件長達10-16小時。在該階段中，樣品溫度保持于15℃，因為蒸發(fā)速率減慢了。進行進一步干燥，所生成的樣品具有固體外觀。如果將樣品置于擱板邊上，樣品含量降低十分緩慢，在幾天或幾個月后才顯示該樣品是高粘性的液體玻璃。圖2顯示了容有高粘性液體的容器可被倒置而并不引起高粘性液體的立即流動。
實施例11.在無需冷凍或發(fā)泡的干燥后IPV免疫原性的保持率根據實施例10的方法干燥樣品，其業(yè)已無需經受與發(fā)泡或冷凍所伴隨的起泡相關的壓力。當用于干燥IPV時，進行實驗以確定是否該方法產生高水平的抗原保持率。
進行三次獨立的實驗，其中IPV重懸浮在含有10％蔗糖或10％海藻糖作為穩(wěn)定劑的水溶液中。將樣品置于硅化的管形瓶中，將管形瓶放置于Heto Drywinner 8-85冷凍干燥器中，將溫度設定于15℃。壓力最初減少到35毫巴以對樣品脫氣。在10分鐘后，壓力進一步減少到8毫巴，并在該水平上保持2小時。在這段時間中，溫度設定值保持在15℃，并檢測樣品內的溫度。當水分從樣品中蒸發(fā)時，除了最后兩小時外溫度降到4℃，當蒸發(fā)速率減慢時溫度回到15℃。在這些條件下沒有出現(xiàn)起泡或發(fā)泡。接著將壓力進一步減少到0.1毫巴，在頭兩次實驗中維持這些條件超過16小時，在第三次實驗中超過10小時。
樣品在水中重配，使用ELISA來評估三種脊髓灰質炎病毒株抗原性的保持率。在ELISA中使用抗3型IPV的單克隆抗體，與未被冷凍的參比樣品比較，以評估重配的、冷凍干燥的樣品中抗原保持率水平。結果以未經受冷凍干燥或發(fā)泡干燥程序的樣品給定讀數的百分數來表示。
結果干燥樣品具有固體外觀，但是它們似乎以高粘性液體/玻璃的形式存在，因為在幾天后，如果于室溫倒置容器，則干燥固體能流動。
表7通過使用單克隆抗體的ELISA測定的3型IPV抗原保持率(無需發(fā)泡或冷凍的干燥)

這些水平的3型IPV抗原保持率與如下顯示的十分低的數值的冷凍干燥結果相比是十分有利的，當使用抗3型的單克隆抗體時，所述十分低的數值通常得自相同的ELISA實驗。
表8通過使用單克隆和多克隆抗體的ELISA測定1、2和3型IPV抗原的保持率(冷凍干燥)

*在3.15％蔗糖存在下重復5次冷凍干燥實驗，顯示的結果來自一次具有代表性的實驗。
實施例12.以高粘性液體/玻璃貯藏的干燥的IPV的長期貯藏穩(wěn)定性使用實施例11中描述的方法干燥的IPV于4℃貯藏9個月。在水中用150mM NaCl重配樣品，用ELISA來評估三種脊髓灰質炎病毒株抗原性的保持率。三種單克隆抗體，每種抗各自的毒株，用于不同的ELISAs中來評估重配的貯藏樣品中抗原保持率水平。對來自貯藏前相同批次的重配樣品業(yè)已進行類似的ELISA。所有結果與沒被干燥的參比樣品比較。結果以未經受干燥程序的樣品給定讀數的百分數來表示。
結果表9.在以高粘性液體貯藏9個月后IPV抗原的保持率

因此通過描述于實施例11的方法業(yè)已干燥的IPV可于4℃貯藏至少9個月，而不損失抗原性。
實施例13.相比于未干燥的IPV，在干燥形成高粘性液體和重配后的IPV體內免疫原性的比較用不同稀釋度的IPV接種10只一組的Wistar大鼠，使用了實施例10公開的方法，所述IPV在10％蔗糖存在下業(yè)已干燥形成高粘性液體，并得到重配。另外的10只一組的Wistar大鼠用IPV參比樣品接種，所述參比樣品以相同方法制備，但沒有被干燥。
21天后，從所有的大鼠中收集血清，在使用1型、2型和3型脊髓灰質炎病毒的不同的免疫沉淀測定中測試上述血清。
結果示于表10中，包含-a)對于每種IPV稀釋度應答大鼠的數量，b)ED50，其是確保50％的大鼠血清轉化所必需的劑量，通過免疫沉淀測定法評估和c)與未干燥的參比IPV相比，干燥的和重配的IPV的相對功效。
表10.與未干燥的參比IPV(JLE097)相比，在干燥形成高粘性液體(JLE017/05)和重配后IPV的免疫原性

JLEO17/05是干燥形成高粘性液體并隨后重配的IPV批次。JLE097是未干燥的參比樣品。
表10顯示了在干燥和重配的IPV兩批樣品和未干燥的參比樣品之間，用每種稀釋度的IPV接種的應答數量是相似的。一般來說，1型IPV引發(fā)最好的免疫應答，2型在稍少的大鼠中引發(fā)免疫應答。3型引發(fā)最弱的免疫應答。
干燥形成高粘性液體的過程并不損害IPV引起體內抗體的免疫沉淀反應的能力。相對功效(RP)讀數1.0表示樣品與參比樣品引發(fā)相等的應答。對于所有三種脊髓灰質炎病毒而言，兩種干燥樣品所產生的接近1.0的RP讀數表明干燥過程并不影響樣品引發(fā)免疫應答的能力。
實施例14.使用蔗糖或海藻糖作為穩(wěn)定劑干燥形成高粘性液體對IPV引發(fā)體內免疫沉淀的免疫應答的影響用IPV接種10只一組的Wistar大鼠，所述IPV在10％蔗糖或10％海藻糖存在下業(yè)已干燥，如實施例2所述，然后重配。使用相等數量的未被干燥的，作為參比樣品的IPV接種另外10只一組的Wistar大鼠。
21天后，收集所有大鼠的血清，如實施例5所述進行免疫中和測定用于評估抗每種1型、2型和3型脊髓灰質炎病毒的免疫中和抗體的數量，所述免疫中和抗體的數量業(yè)已提高。
通過與未干燥參比樣品所引發(fā)的免疫應答相比，對每種樣品計算相對功效。
結果示于表11中。
表11.在蔗糖和海藻糖中干燥的比較

當使用蔗糖作為穩(wěn)定劑時，樣品中殘留的水分數量是較低的，大約保留了5％濕度，相比而言，當海藻糖作為穩(wěn)定劑時，通過KarlFischer方法所測定的濕度大約為10％。
在干燥過程中，蔗糖和海藻糖都能有效地穩(wěn)定IPV，使得重配的IPV對于大多數不同類型的脊髓灰質炎病毒給出了接近1.0的相對功效讀數。對于3型脊髓灰質炎病毒而言，相對功效特別好，可相對容易地釋放其免疫原性。
實施例15用Karl Fischer測定濕度在Karl Fischer電量濕度分析儀(Aqua 30.00-ElektrochemieHalle)中進行分析。對樣品稱重并置于設定于80℃的烘箱中。用氮氣沖洗樣品，接著添加hydranal試劑(Riedel de Hahn)以便通過電量分析進行分析。
權利要求
1.一種包含配制為干燥組合物的IPV和穩(wěn)定劑的免疫原性組合物，在重配后，能產生抗脊髓灰質炎病毒的免疫應答。
2.權利要求1所述的免疫原性組合物，包含IPV和細菌多糖，都配制為干燥組合物，在重配后能產生抗脊髓灰質炎病毒的免疫應答。
3.權利要求1或2所述的免疫原性組合物，包含源自b型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae b)(Hib)的莢膜多糖或寡糖抗原。
4.權利要求2或3所述的免疫原性組合物，其中所述多糖或寡糖結合于載體蛋白。
5.權利要求4所述的免疫原性組合物，其中所述多糖或寡糖結合于破傷風類毒素。
6.權利要求3-5所述的免疫原性組合物，其中所述多糖或寡糖吸附在磷酸鋁上。
7.權利要求1-6所述的免疫原性組合物，包含源自C型腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的莢膜多糖或寡糖。
8.權利要求1-7所述的免疫原性組合物，額外包含源自任一A、C、Y或W型腦膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitidis)或其組合的莢膜多糖或寡糖。
9.權利要求7-8所述的免疫原性組合物，其中所述腦膜炎球菌多糖或寡糖結合于載體蛋白。
10.權利要求9所述的免疫原性組合物，包含Hib多糖或寡糖以及至少一種結合于相同類型載體蛋白的腦膜炎球菌多糖或寡糖。
11.權利要求9所述的免疫原性組合物，包含Hib多糖或寡糖以及至少一種結合于不同載體蛋白的腦膜炎球菌多糖或寡糖。
12.權利要求1-11所述的免疫原性組合物，進一步包含酚紅。
13.權利要求1-12所述的免疫原性組合物，其中所述干燥組合物是冷凍干燥的。
14.權利要求1-13所述的免疫原性組合物，其中所述干燥組合物是泡沫玻璃。
15.權利要求1-12所述的免疫原性組合物，其中所述干燥組合物是高粘性液體。
16.權利要求15所述的免疫原性組合物，其中所述高粘性液體沒有被冷凍。
17.一種制備疫苗的方法，包含在水溶液中重配權利要求1-16所述的免疫原性組合物的步驟。
18.權利要求17所述的方法，其中所述水溶液包含白喉毒素、破傷風類毒素和百日咳抗原(非細胞或全細胞)。
19.權利要求18所述的方法，其中DTP疫苗至少部分使用氫氧化鋁佐劑。
20.權利要求18或19所述的方法，其中所述水溶液包含乙型肝炎表面抗原。
21.一種藥盒，包含在一種容器中的權利要求1-16所述的免疫原性組合物和在第二種容器中的液體DTP(非細胞或全細胞)疫苗。
22.權利要求21所述的藥盒，進一步包含在第二個容器中的乙型肝炎病毒表面抗原。
23.一種疫苗，包含權利要求1-16所述的免疫原性組合物。
24.權利要求23所述的疫苗，其在使用前重配成水溶液。
25.一種具有防水內表面的容器，包含權利要求23-24所述的疫苗。
26.一種保存包含IPV和穩(wěn)定劑的組合物的方法，包含步驟a)通過在穩(wěn)定劑溶液中懸浮或溶解IPV制備保存樣品；b)將所述保存樣品經受下述的溫度和壓力條件，即溶劑從所述保存樣品中喪失；和c)除去溶劑直至所述保存樣品干燥形成固體或高粘性液體，其中IPV的抗原性得到保留。
27.權利要求26所述的方法，其中所述保存樣品是干燥的，位于具有防水內表面的容器內。
28.權利要求26或27所述的方法，其中所述保存樣品在步驟b)中起泡形成泡沫。
29.權利要求28所述的方法，其中所述樣品在開始干燥處理前至少部分冷凍。
30.權利要求28所述的方法，其中所述保存樣品在步驟b)中發(fā)生至少部分冷凍。
31.權利要求26所述的方法，其中在步驟b)中將所述保存樣品經受下述的溫度和壓力條件，即在所述條件下所述保存樣品通過蒸發(fā)釋放溶劑，無需冷凍或涉及泡沫形成的起泡，以形成粘性液體，以及在步驟c)中除去溶劑直至所述保存樣品干燥形成高粘性液體。
32.權利要求26-31所述的方法，其中所述保存樣品包含細菌多糖。
33.權利要求32所述的方法，其中所述保存樣品包含Hib多糖或寡糖。
34.權利要求32或33所述的方法，其中所述保存樣品包含源自任一A、C、Y或W型腦膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitidis)或其組合的多糖或寡糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含滅活的脊髓灰質炎病毒(IPV)干燥固體或高粘性液體制劑和穩(wěn)定劑的免疫原性組合物，其中所述IPV保留其抗原性和/或免疫原性。描述了產生保留其抗原性/免疫原性的IPV的干燥制劑的方法。
文檔編號A61P31/12GK1735430SQ200380108184
公開日2006年2月15日 申請日期2003年10月30日 優(yōu)先權日2002年11月1日
發(fā)明者Y·馬耶爾斯, J·斯蒂芬尼 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司