專利名稱：：基于多價(jià)免疫球蛋白的生物活性裝配體的制作方法基于多價(jià)免疫球蛋白的生物活性裝配體相關(guān)的申請(qǐng)本專利申請(qǐng)是下列申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)案2006年3月24日提交的PCT/US2006/010762;2006年3月29日提交的PCT/US2006/012084;2006年6月29日提交的PCT/US2006/025499;2006年3月24日提交的序號(hào)為11/389,358的美國專利申請(qǐng)；2006年3月28日提交的序號(hào)為11/391,584的美國專利申請(qǐng)和2006年6月29日提交的序號(hào)為11/478,021的美國專利申請(qǐng)；這些申請(qǐng)要求對(duì)下列臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)2006年3月14日提交的第60/782,332號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)；2005年10月19日提交的第60/728,292號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)；2005年12月16日提交的第60/751,196號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)。本申請(qǐng)按35U.S.C.§119(e)要求2005年12月16曰提交的第60/751,196號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)和2006年11月6日提交的第60/864,530號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的權(quán)益。上文引用的每篇申請(qǐng)的內(nèi)容均通過引用整體結(jié)合入本文。
背景技術(shù)：
：制備具有多種功能或結(jié)合特異性的基于抗體的試劑的現(xiàn)有技術(shù)存在很多限制。對(duì)于通過重組工程制備的試劑而言，此類限制可包括生產(chǎn)成本高、表達(dá)產(chǎn)率低、在血清中不穩(wěn)定、在溶液中不穩(wěn)定(導(dǎo)致形成聚集體或解離的亞基)、不確定的批組成(由于存在多種產(chǎn)物形式)、污染性副產(chǎn)物、功能活性或者結(jié)合親和性/親和力降低(由于空間因素或者構(gòu)象改變)等。對(duì)于通過各種化學(xué)交聯(lián)方法產(chǎn)生的試劑而言，高生產(chǎn)成本和純化產(chǎn)物的異質(zhì)性是兩大限制。近年來，對(duì)抗體或可與多于一個(gè)抗原決定簇(也稱為表位)結(jié)合的其他結(jié)合部分的關(guān)注日益增加。一般而言，天然存在的抗體和單克隆抗體具有兩個(gè)識(shí)別相同表位的抗原結(jié)合位點(diǎn)。相反，雙功能或者雙特異性抗體(下文將僅使用術(shù)語"雙特異性抗體")是經(jīng)合成或遺傳改造的可與兩個(gè)不同表位結(jié)合的結(jié)構(gòu)。因此，同一分子構(gòu)建體具有與兩個(gè)不同抗原決定簇結(jié)合的能力。雙特異性抗體可用于許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。例如，具有腫瘤細(xì)胞表面抗原和T細(xì)胞表面受體兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體可引導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)特定的腫瘤細(xì)胞的裂解。識(shí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤和T細(xì)胞上的CD3表位的雙特異性抗體已成功用于治療人類患者的腦肺瘤(Nitta等，Lancet.1990;355:368-371)。最近，已報(bào)道稱為"雙特異性T細(xì)胞嚙合體"(BiTE)的一類新的雙特異性抗體克服了參與效應(yīng)細(xì)胞募集以發(fā)揮生物活性的大多數(shù)腫瘤靶向雙特異性抗體的局限(Kufer等，TrendsinBiotechnol.2004;22:238-244)。BiTE是重組的雙特異性單鏈抗體，其由導(dǎo)向靶細(xì)胞表面抗原和T細(xì)胞上的CD3的兩個(gè)不同單鏈Fc片段(scFv)通過柔性多肽連接體串聯(lián)連接而成(Mack等，ProcNatlAcadSciU.S.A.1995;92:7021-7025)。BiTE產(chǎn)生于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且與其他CD3定向雙特異性抗體相反，其能夠有效地再引導(dǎo)人外周T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞，而無需效應(yīng)T細(xì)胞的預(yù)刺激或共刺激(Mack等，JImmonol.1997;158:3965-3970;Loffler等，Blood.2000;95:2098-2103)。已表明，低至10-100pg/mL(0.1-2pM)的BiTE濃度足以在體外實(shí)現(xiàn)最大耙細(xì)胞裂解的一半(Dreier等，IntJCancer.2002;100:690-697),而在小鼠;溪型中，亞微克量的BiTE可以阻止腫瘤生長(zhǎng)(Dreier等，JImmunol.2003;170:4397-4404;Schlereth等，CancerRes.2005;65:2882-2889)。已知有多種制備雙特異性抗體的方法。例如，2004年2月11日提交的第20050002945號(hào)美國專利申請(qǐng)公布(其完整內(nèi)容通過引用結(jié)合入本文)公開了雙特異性和多特異性抗體的構(gòu)建和使用的方法。雙特異性抗體可通過四源雜交瘤方法制備，該方法包括兩個(gè)不同雜交瘤的融合，每個(gè)雜交瘤產(chǎn)生識(shí)別不同抗原位點(diǎn)的單克隆抗體(Milstein和Cuello,Nature,1983;305:537-540)。融合的雜交瘤能夠合成兩種不同的重鏈和兩種不同的輕鏈，它們可以隨機(jī)締合產(chǎn)生IO種不同抗體結(jié)構(gòu)的異質(zhì)群體，其中只有一個(gè)(占總抗體分子的1/8)是雙特異性的，因此必須進(jìn)一步將其從其他形式中純化出來，但是即使這方法可行，其也不具備成本效益。此外，融合的雜交瘤經(jīng)常在細(xì)胞遺傳學(xué)上比親本雜交瘤更不穩(wěn)定，使制備細(xì)胞系的產(chǎn)生更加困難。另一種制備雙特異性抗體的方法使用異雙功能交聯(lián)劑來化學(xué)拴結(jié)兩個(gè)不同的單克隆抗體，以便所得的雜交軛合物將與兩個(gè)不同耙結(jié)合(Staerz等，Nature,1985;314:628-631;Perez等，Nature,1985;316:354-356)。通過此方法產(chǎn)生的雙特異性抗體基本上為兩個(gè)IgG分子組成的異軛合物，其緩慢擴(kuò)散入組織，并且很快被從循環(huán)中清除。雙特異性抗體還可通過下述方法制備將兩個(gè)親本單克隆抗體中的每一個(gè)均還原為相應(yīng)的半分子，然后將這些半分子進(jìn)行混合和再氧化以獲得雜交結(jié)構(gòu)(Staerz和Bevan，ProcNatlAcadSdUSA.1986;83:1453-1457)。替代的方法包括使用適當(dāng)?shù)倪B接體化學(xué)交聯(lián)兩個(gè)或三個(gè)單獨(dú)純化的Fab，片段。例如，歐洲專利申請(qǐng)0453082公開了將三馬來酰亞胺化合物用于制備雙特異性或三特異性抗體樣結(jié)構(gòu)。第6,511,663號(hào)美國專利提供了通過連接結(jié)構(gòu)將三個(gè)或四個(gè)Fab片段彼此共價(jià)連接，以制備三價(jià)和四價(jià)單特異性抗原結(jié)合蛋白的方法。所有這些化學(xué)方法均不適合商業(yè)化開發(fā)，原因是生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)過程費(fèi)力、純化步驟多、產(chǎn)量低(<20%)和產(chǎn)品不純。其他方法包括提高產(chǎn)生雜交瘤的效率，其通過逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的穿梭載體將不同的選擇標(biāo)志物基因轉(zhuǎn)入相應(yīng)的親本雜交瘤，然后對(duì)親本雜交瘤進(jìn)行融合(DeMonte等，ProcNatlAcadSciUSA.1990,87:2941-2945);或者，使用包含不同抗體的重鏈和輕鏈基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞系。這些方法也面臨上文討論的不可避免的純化問題。第5,582,996號(hào)美國專利公開了制備由來自相同或不同抗體的Fab片段組成的重組雙特異性抗體的方法，所述Fab片段通過插入抗體重鏈恒定區(qū)區(qū)域的互補(bǔ)相互作用結(jié)構(gòu)域締合在一起。所述互補(bǔ)相互作用結(jié)構(gòu)域選自互補(bǔ)的亮氨酸拉鏈或者一對(duì)肽段，一個(gè)肽段包含一系列帶正電的氨基酸殘基，而另一肽段則包含一系列帶負(fù)電的tt酸殘基。此方法的一個(gè)限制在于除非同時(shí)包括兩個(gè)Fab亞基，否則包含融合的互補(bǔ)相互作用結(jié)構(gòu)域的單個(gè)Fab亞基對(duì)其靶抗原的親和力大大下降。通過重組DNA技術(shù)制備的抗體離散型Vh和V^結(jié)構(gòu)域可以彼此配對(duì)形成具有結(jié)合能力的二聚體(重組Fv片段)(第4,642,334號(hào)美國專利)。穩(wěn)定性。同源Vh和VL結(jié)構(gòu)域可用具有適當(dāng)組成和長(zhǎng)度的肽連接體(通常由超過12個(gè)的氨基酸殘基組成)連接，以形成具有結(jié)合活性的單鏈Fv(scFv)。制備scFv的方法參見第4,946，778號(hào)美國專利和第5，132,405號(hào)美國專利。將所述肽連接體的長(zhǎng)度減至少于12個(gè)氨基酸殘基，可防止Vh和VL結(jié)構(gòu)域在同一鏈上配對(duì)，而迫4吏Vh和VL結(jié)構(gòu)域與其他鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成功能性多聚體。用具有3至12個(gè)氨基酸殘基的連接體連接的Vh和VrJ吉構(gòu)域多肽鏈主要形成二聚體(稱為二鏈抗體)。使用0至2個(gè)氨基酸殘基的連接體則有利于形成三聚體(稱為三鏈抗體)和四聚體(稱為四鏈抗體)，但是除了連接體長(zhǎng)度之外，低聚的精確模式還顯示依賴于V-結(jié)構(gòu)域的組成和方向(Vh-連接體-Vl或Vl-連接體-Vh)。已經(jīng)使用由5個(gè)或更少氨基酸殘基組成的肽連接體獲得了多價(jià)單特異性二鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體。雙特異性二鏈抗體也已制得，其是由兩個(gè)不同scFv組成的異源二聚體，每個(gè)scFv由通過短的肽連接體與另一抗體的VL結(jié)構(gòu)域連接的一個(gè)抗體的VH結(jié)構(gòu)域組成；其制備方法是使用雙順反子表達(dá)載體，該載體在一個(gè)順反子中包括具有Vm-連接體-Vu的重組基因構(gòu)建體，且在另一順反子中包括具有Vm-連接體-Vu的第二個(gè)重組基因構(gòu)建體(Holliger等，ProcNatlAcadSciUSA.1993;90:6444-6448;Atwell等，MolImmunol.19%;33:1301-1302;Holliger等，NatureBiotechnol.1997;15:632-631;Helfrich等，Int.JCancer.1998;76:232-239;Kipriyanov等，IntJCancer.1998;77:763-772;Holliger等，CancerRes.1999;59:2909-2916)。最近還報(bào)道了具有雙特異性的四價(jià)串聯(lián)二鏈抗體(稱為tandab)(Cochlovius等，CancerRes.2000;60:4336-4341)。該雙特異性tandab是兩個(gè)相同多肽的二聚體，每個(gè)多肽均包含兩個(gè)不同抗體的四個(gè)可變區(qū)(Vm、Vu、Vm、Vu),這些可變區(qū)的連"l姿方向有利于自締合后形成兩個(gè)各自具有兩個(gè)不同特異性的潛在的結(jié)合位點(diǎn)。到目前為止，構(gòu)建表達(dá)雙特異性或者三特異性的三鏈抗體的載體尚未成功。不過，已報(bào)道包含膠原凝素頸區(qū)的多肽可三聚化(Hoppe等，F(xiàn)EBSLetters.1994;344:191-195)。第6,190,886號(hào)美國專利公開了從包含膠原凝素頸區(qū)的融合蛋白制備同三聚體或異三聚體。第5,844,094號(hào)美國專利、第5,837,242號(hào)美國專利和WO98/44001公開了通過改變連接體長(zhǎng)度制備多價(jià)和多特異性的基于scFv的試劑的方法。第5,989,830號(hào)美國專利和第6,239,259號(hào)美國專利^Hf了通過構(gòu)建兩個(gè)多肽鏈(一個(gè)包含來自至少兩個(gè)抗體的Vh結(jié)構(gòu)域，且另一個(gè)包含相應(yīng)的Vi^結(jié)構(gòu)域)制備多價(jià)和多特異性的基于scFv的試劑的方法。與使用先前技術(shù)方法產(chǎn)生多價(jià)和多特異性的基于scFv的試劑時(shí)常相關(guān)的共同問題是表達(dá)水平低、產(chǎn)物形式不純、在溶液中不穩(wěn)定(導(dǎo)致聚集)、在血清中不穩(wěn)定和親和力降低。第6,809,185號(hào)美國專利公開了重組制備的雙特異性或三特異性抗體，其中CH1的C-末端和Fab的Ct均融合至來自相同或不同單克隆抗體的scFv。此"三鏈抗體(Tribody)"技術(shù)的主要缺陷包括附加的scFv的結(jié)合親和力降低、產(chǎn)物形式不純和在溶液中不穩(wěn)定(導(dǎo)致聚集)。因此，本領(lǐng)域仍需要制備具有單特異性或多特異性或功能性的多價(jià)結(jié)構(gòu)的方法，所述多價(jià)結(jié)構(gòu)具有確定的組成、同質(zhì)純度和不變的親和力，并可以高產(chǎn)率被制備而無需過多的純化步驟。此外，此類結(jié)構(gòu)還必須在血清中足夠穩(wěn)定以適于在體內(nèi)應(yīng)用。需要易于構(gòu)建和/或獲得相對(duì)純的形式、并具有單特異性或多特異性或功能性的穩(wěn)定的多價(jià)結(jié)構(gòu)。發(fā)明概述本發(fā)明公開了產(chǎn)生穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)(tetheredstructures)的平臺(tái)技術(shù)，所述結(jié)構(gòu)可以是單特異性和/或單功能性的，或者可以具有多種功能或結(jié)合特異性，并且適合在體外和體內(nèi)應(yīng)用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)被制備為兩種組分(本文稱為A和B)通過兩個(gè)不同狀序列(一個(gè)稱為二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域(dimerizationanddockingdomain,DDD)，另一個(gè)則稱為錨定結(jié)構(gòu)域(anchoringdomain,AD))之間特異的相互作用形成的復(fù)合體。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DDD序列(在圖1中表示為DDDl和DDD2)衍生自cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)的調(diào)節(jié)亞基(R)，且所述AD序列(在圖2中表示為AD1和AD2)衍生自在各種A激酶錨定蛋白(AKAP)中發(fā)現(xiàn)的、介導(dǎo)與PKA的R亞基締合的特定區(qū)域。但是，技術(shù)人員將了解其他二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域以及錨定結(jié)構(gòu)域是已知的，且任何此類已知結(jié)構(gòu)域都可在本發(fā)明要求保護(hù)的主題的范圍內(nèi)使用。本發(fā)明公開的方法和組合物實(shí)現(xiàn)了具有DDD/AD偶聯(lián)系統(tǒng)的任何兩個(gè)復(fù)合體的定點(diǎn)共價(jià)或非共價(jià)締合。發(fā)現(xiàn)作為DDD結(jié)構(gòu)特征的X-型四螺旋束二聚化模體(Newlon等，EMBOJ.2001;20:1651-1662;Newlon等，NatureStructBiol.1999;3:222-227)也存在于其他蛋白類別，如S100蛋白(例如，S100B和4丐周期蛋白)，和轉(zhuǎn)錄因子中的肝細(xì)胞核因子(HNF)家族(例如，HNF-la和HNF-1卩)。由于S100蛋白具有如肺瘤發(fā)生等生物活性，它們可能不太適用于此用途。參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)錄激活的300多種蛋白質(zhì)包含被稱為不育a模體(SAM)結(jié)構(gòu)域的65-70個(gè)氨基酸的模塊，該模塊具有存在于其二聚化界面的X-型四螺旋束的變異。對(duì)于S100B，此X-型四螺旋束使得每個(gè)二聚體能夠與衍生自c-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(殘基367-388)的兩個(gè)p53肽以微摩爾親和力結(jié)合(Rustandi等，Biochemistry,1998;37:1951-1960)。相似地，已表明HNF-la(HNF-pl)的N-末端二聚化結(jié)構(gòu)域通過HNF-pl的二聚體與DCoH(HNF-1的二聚化輔助因子)的二聚體締合(Rose等，NatureStructBiol.2000;7:744-748)。在替代實(shí)施方案中，這些天然存在的系統(tǒng)也可用于本發(fā)明要求保護(hù)的方法和組合物，以提供具有多種功能或結(jié)合特異性的穩(wěn)定的多聚結(jié)構(gòu)。其他結(jié)合事件(如酶與其底物/抑制劑之間的結(jié)合，例如角質(zhì)酶與褲酸酯(Hodneland等，ProcNatlAcdSciUSA.2002;99:5048-5052))，也可用于產(chǎn)生所述的兩個(gè)締合組分("停靠"步驟)，然后使這兩個(gè)組分共價(jià)穩(wěn)定("鎖定"步驟)。利申請(qǐng)，其完整內(nèi)容通過引用結(jié)合入本文。在示例性實(shí)施方案中，二元復(fù)合體的一個(gè)組分A是通過重組工程或者經(jīng)由間隔區(qū)基團(tuán)的化學(xué)軛合將DDD序列連接至A的前體(稱為yO而得到爿/DDD結(jié)構(gòu)(下文簡(jiǎn)稱a)來制備的。因?yàn)閍中的DDD序列影響二聚體的自發(fā)形成，所以A由a2組成。二元復(fù)合體的另一個(gè)組分B是通過重組工程或者經(jīng)由間隔區(qū)基團(tuán)的化學(xué)軛合將AD序列連接至B的前體(稱為而得到S/AD結(jié)構(gòu)(下文簡(jiǎn)稱b)來制備的。a2中包含的二聚化結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了用于結(jié)合b中包含的AD序列的停靠位點(diǎn)，該事實(shí)導(dǎo)致a2與b容易締合而形成組成為a2b的二元復(fù)合體。在不同的實(shí)施方案中，此結(jié)合事件通過隨后共價(jià)固定裝配體的兩個(gè)組分(例如通過二好u橋)的反應(yīng)而得到進(jìn)一步的穩(wěn)定，其高效率地發(fā)生，因?yàn)槌跏嫉慕Y(jié)合相互作用引導(dǎo)活性硫醇基團(tuán)位點(diǎn)特異性地連接。通過使半胱氨酸殘基置于DDD和AD兩個(gè)序列的關(guān)鍵位置(如DDD2和AD2中所示)，a2和b之間可通過二硫橋發(fā)生共價(jià)結(jié)合相互作用，進(jìn)而形成更有利于在體內(nèi)應(yīng)用的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)同時(shí)保留了兩個(gè)前體X和S的完整功能特性。本發(fā)明人不知道具有此獨(dú)特的特征組合的雙特異性組合物的任何先前技術(shù)。上文公開的設(shè)計(jì)性質(zhì)上是^t塊化的本質(zhì)，因?yàn)樗x的兩個(gè)前體中的每一個(gè)都可與DDD或AD連接，然后再進(jìn)行組合。所述兩個(gè)前體還可以相同04=3)或者不同04#3)。當(dāng)乂=^時(shí)，所得的a2b復(fù)合體由三個(gè)亞基的穩(wěn)定拴結(jié)裝配體(下文簡(jiǎn)稱a3)組成?？勺鳛榍绑w的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、多核苷酸、RNA/、寡糖、天然或合成的多聚物、納米粒子、量子點(diǎn)以及有機(jī)或無機(jī)化合物。其他具有潛在用途的前體的非限制性實(shí)例列于下面的表6-表10。除了使用二硫鍵連接防止組成性亞基解離外，也可使用增強(qiáng)穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的整體穩(wěn)定性的其他方法。例如，可選4奪可商業(yè)途徑獲得的或者研究中使用的各種交聯(lián)劑或方法用于此類目的?？赡苡杏玫脑噭┌ㄎ於?，它已廣泛用于通過交聯(lián)組成性亞基以形成穩(wěn)定的輒合物，進(jìn)而探測(cè)非共價(jià)締合的多聚蛋白的結(jié)構(gòu)(Silva等，F(xiàn)oodTechnolBiotechnol.2004;42:51-56)。同樣值得注意的還有兩種包括蛋白質(zhì)亞基的氧化交聯(lián)的化學(xué)方法。一種是使用六組氨酸標(biāo)記蛋白(Fancy等，ChemBiol.1996;3:551-559)或N-末端甘氨酸-甘氨酸-組氨酸標(biāo)記蛋白(Brown等，Biochemistry.1998;37:4397-4406)的近位標(biāo)記技術(shù)。這些標(biāo)記緊密結(jié)合Ni(II)，并且在用高酸氧化時(shí)生成能夠介導(dǎo)包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)在內(nèi)的多種氧化反應(yīng)的Ni(III)物類。另一種技術(shù)稱為PICUP(光誘導(dǎo)的非修飾蛋白交聯(lián))，該技術(shù)使用[Ru(n)(bipy)3]2+、過硫酸銨和可見光來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)(Fancy和Kodadek,ProcNatlAcadSdUSA.1999;96:6020-6024)。但是，如下文所述，許多用于化學(xué)交聯(lián)肽、多肽、蛋白質(zhì)或其他大分子物類的方法是本領(lǐng)域已知的，任何此類已知的方法均可用于共價(jià)穩(wěn)定所述二元a2b復(fù)合體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中(更詳細(xì)公開于下文實(shí)施例23-35),可以形成單特異性或雙特異性的六聚復(fù)合體。例如，如圖10、圖11和圖13所示，此類復(fù)合體可通過下列方法形成在IgG部分的每個(gè)C-或N-末端連接一個(gè)AD2,然后所述IgG部分可與DDD2軛合的Fab片段或其他DDD2軛合的抗體或抗體片段結(jié)合，以形成六聚復(fù)合體。如實(shí)施例23-35中所述，與親本抗體或片段相比，此類單特異性或雙特異性六聚復(fù)合體表現(xiàn)出更高的結(jié)合親和力和增強(qiáng)的效力。實(shí)施例23-35中公開了很多單特異性或雙特異性的六聚穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。但是，技術(shù)人員應(yīng)了解這些實(shí)例是非限制性的，所公開的六聚結(jié)構(gòu)中可包括多種抗原結(jié)合或者其他功能部分，表6-10對(duì)其中的一部分進(jìn)行了討論。技術(shù)人員應(yīng)了解上文所述的IgG或Fab片段可用其他類型的抗體、抗體片段或非抗體蛋白(在下文詳細(xì)討論)替代。所迷穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可包含抗原結(jié)合組分和/或效應(yīng)組分的不同組合。例如，與激活的血小板和組織來防止進(jìn)一步形成凝塊，其還可通過將內(nèi)源tPA募集到血小板表面來溶解已存在的凝塊(Neblock等，BioconjugateChem.1991,3:126-31)。與毒素(如核糖核酸酶)連接的、包含針對(duì)內(nèi)化腫瘤相關(guān)抗原(如CD74)的多價(jià)抗體結(jié)合組分的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，對(duì)于將選擇性遞送該毒素以破壞耙肺瘤細(xì)胞非常有用。包含IL-4R受體可溶組分(sIL-4R)和IL-13受體可溶組分(sIL-13R)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)是治療哮喘或變態(tài)反應(yīng)的潛在治療劑。在防止凝塊再形成方面，包含抗GPlIb/niaFab片段的六聚、單特異性穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)由于具有更高的結(jié)合親和力而比其單價(jià)(ReoPro，Centocor)或雙價(jià)類似物更加有效。在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和某些其他自身免疫疾病(AID)時(shí)，包含多拷貝TNFa-R可溶組分的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)應(yīng)該比Enbrel(Amgen)更有效地抑制TNF。本發(fā)明要求保護(hù)的方法和組合物還包括由連接至穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)物或載體組成的輒合物。所述效應(yīng)物或載體可非共價(jià)或者共價(jià)連接至所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，例如通過化學(xué)交聯(lián)或者通過與雙特異性或者多特異性穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)結(jié)合，其中第一個(gè)特異性針對(duì)疾病相關(guān)靶，而第二個(gè)特異性針對(duì)效應(yīng)物和/或連接至所述效應(yīng)物的半抗原，詳見下文。根據(jù)預(yù)定用途，所述效應(yīng)物可選自診斷劑、治療劑、化療劑、放射性同位素、顯像劑、抗血管生成劑、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、藥物、前體藥物、酶、結(jié)合分子、細(xì)胞表面受體的配體、螯合劑、免疫調(diào)節(jié)劑、寡核苷酸、激素、可光檢測(cè)的標(biāo)記、染料、肽、毒素、造影劑、順磁標(biāo)記、超聲標(biāo)記、促凋亡劑、脂質(zhì)體、納米粒子或其組合。此外，軛合物還可包含多于一個(gè)的相同或不同的效應(yīng)物，或者多于一個(gè)的相同或者不同的載體。效應(yīng)物和載體也可出現(xiàn)在同一軛合物中。當(dāng)所迷效應(yīng)物為螯合劑時(shí)，所得的輒合物通常與放射性或非放射性的金屬進(jìn)行進(jìn)一步絡(luò)合。包含載體的軛合物還可進(jìn)一步包括具有適合預(yù)定用途的診斷或治療功能的試劑。在某些實(shí)施方案中，所述效應(yīng)物或栽體可在穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)之后被施用至受治療者，例如在下文討論的預(yù)靶向策略中。可首先將所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)施用至受治療者，以允許其在疾病組織(如腫瘤)中定位。然后加入所述效應(yīng)物或載體，以允許其與已定位的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)結(jié)合。當(dāng)所述效應(yīng)物或載體與毒性部分(如放射性核素)軛合時(shí)，此預(yù)靶向方法減少所迷受治療者與毒性的全身接觸，從而允許將毒性試劑成比例更多地遞送至耙組織。任選地，可在施用可靶向的構(gòu)建體之前施用清除劑，以從循環(huán)中清除未定位的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。這些方法在本領(lǐng)域是已知的，詳細(xì)描述參見第4,624,846號(hào)美國專利、WO92/19273和Sharkey等，Int.J.Cancer51:266(1992)?？砂邢虻臉?gòu)建體的示例可具有X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2的結(jié)構(gòu)，其中該化合物在X或Y處包括硬酸陽離子螯合劑、和在剩余的X或Y處包括軟酸陽離子螯合劑；其中該化合物進(jìn)一步包含至少一種診斷性或治療性陽離子，和/或一種或多種螯合的或者化學(xué)結(jié)合的治療劑、診斷劑或酶。例如，所迷診斷劑可以是Gd(in)、Eu(ni)、Dy(m)、Pr(III)、Pa(IV)、Mn(II)、Cr(III)、Co(III)、Fe(in)、Cu(II)、Ni(II)、Ti(m)、V(IV)離子或自由基。第二個(gè)構(gòu)建體示例可具有式X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2，其中該化合物在X或Y處包括硬酸陽離子螯合劑或軟酸螯合劑，且在剩余X或Y處不包含任何物質(zhì)；并且其中該化合物進(jìn)一步包含至少一種診斷性或治療性陽離子，和/或一種或多種螯合或者化學(xué)結(jié)合的治療劑、診斷劑或酶。在此類實(shí)施方案中，所述A亞基可例如包含腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合位點(diǎn)，而所述B亞基可包含效應(yīng)物或載體、或者輒合至效應(yīng)物或載體的半抗原的結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)(包括其軛合物)適合用于多種治療和診斷用途。例如，基于抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的六價(jià)構(gòu)建體可用于此類構(gòu)建體未與其他功能試劑軛合的治療場(chǎng)合，其方式與使用棵抗體的治療相同。替代地，可使用一種或多種功能試劑對(duì)這些穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生，以用于診斷或治療用途。所述其他試劑可使用常規(guī)軛合化學(xué)共價(jià)連接至所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的使用方法可包括檢測(cè)、診斷和/或治療疾病或其他醫(yī)療病癥。此類病癥可包括但不限于癌癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、神經(jīng)退行性疾病、阿爾茨海默病、代i射性疾病、增生癥(hyperplasia)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(retinopathy),黃斑變性、炎性腸病、克羅恩(Crohn)病、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病(sarcoidosis)、哮喘、水肺、肺高壓(pulmonaryhypertension),牛皮癬、角膜移植排斥反應(yīng)、新生血管性青光眼、Osier-Webber綜合征、心肌血管生成(myocardialangiogenesis)、斑塊新生血管(plaqueneovascularization)、再狹窄、血管損傷后新生內(nèi)膜形成(neointimaformation)、毛細(xì)血管擴(kuò)張、血友病關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、淀粉樣變性病、器官移植排斥反應(yīng)、深靜月永血栓形成或創(chuàng)面肉芽(woundgranulation)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的方法和組分可用于治療自身免疫疾病，如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、皮肌炎、西德納姆氏(Sydenham)舞蹈病、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘙、狼瘡性腎炎、風(fēng)濕熱、多腺體綜合征、大皰性類天皰瘡、青少年糖尿病、過敏性紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、鏈球菌感染后腎炎(post-streptococcalnephritis)、結(jié)節(jié)性紅斑、Takayasu氏動(dòng)脈炎、艾迪生氏病(Addison'sdisease),類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、強(qiáng)直性脊推炎、肺出血腎炎綜合征(Goodpasture'ssyndrome)、thromboangitisubiteran、Sjogren氏綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本曱狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis),甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動(dòng)性肝炎、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰瘡、韋格納氏(Wegener's)肉芽腫、膜性腎病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓癆(tabesdorsalis)、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球腎炎、牛皮癬或纖維性肺泡炎。不同的實(shí)施方案可包含治療炎性和免疫失調(diào)性疾病、感染性疾病、病理性血管生成或癌癥的方法。在本申請(qǐng)中，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)與選自由以下成員組成的組的兩個(gè)不同靶結(jié)合(A)先天性免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，(B)凝血因子，(C)補(bǔ)體因子和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，以及(D)與炎性或免疫失調(diào)性疾病，或者與病理性血管生成或癌癥特異性相關(guān)的靶，其中后者的靶不是(A)、(B)或(C)。所迷靶中至少有一個(gè)為(A)、(B)或(C)。靶的合適組合請(qǐng)參見2005年12月8日提交的題為"MethodsandCompositionsforImmunotherapyandDetectionofInflammatoryandImmune-DysregulatoryDisease,InfectiousDisease,PathologicAngiogenesisandCancer"(免疫治療和才企測(cè)炎十生禾口免疫失調(diào)性疾病、感染性疾病、病理性血管生成和癌癥的方法和組合物)的序號(hào)為11/296,432的美國專利申請(qǐng)，其內(nèi)容通過引用整體結(jié)合入本文。與所述結(jié)合分子結(jié)合的先天性免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物可以是促炎效應(yīng)細(xì)胞因子、促炎效應(yīng)趨化因子或促炎效應(yīng)受體。適合的促炎效應(yīng)細(xì)胞因子包括MIF、HMGB-1(高遷移率族盒蛋白1)、TNF-a、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15和IL-18。促炎效應(yīng)趨化因子的實(shí)例包括CCL19、CCL21、IL國8、MCP-1、RANTES、MIP誦1A、MIP-1B、ENA-78、MCP國1、TP-IO、GROB和嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)。促炎效應(yīng)受體包括IL-4R(白介素-4受體)、IL-6R(白介素-6受體)、IL-13R(白介素-13受體)、IL-15R(白介素-15受體)和IL-18R(白介素-18受體)。所述結(jié)合分子還可與至少一種凝血因子、特別是組織因子(TF)或凝血酶發(fā)生特異性反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子與至少一種補(bǔ)體因子或補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述補(bǔ)體因子選自由C3、C5、C3a、C3b和C5a組成的組。當(dāng)所述結(jié)合分子與補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)時(shí)，所述補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白優(yōu)選地選自由CD46、CD55、CD59和mCRP組成的組。在某些實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定^t全結(jié)結(jié)構(gòu)可用于治療癌癥。預(yù)期可以靶向4壬4可類型的肺瘤和4壬4可類型的腫瘤抗原。可以輩巴向的腫瘤的示例類型包括急性淋巴母細(xì)胞性白血病、急性脊髓白血病、膽管癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、霍奇金氏(Hodgkin，s)淋巴瘤、肺癌、甲狀腺髓樣癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌和尿膀胱癌?？梢园邢虻哪[瘤相關(guān)抗原包括但不限于碳酸酐酶IX、A3、A33抗體的特異性抗原、BrE3-抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亞基、CEA(CEACAM畫5)、CEACAM畫6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、KC4-抗原、KS-1抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4抗原、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL隱8、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肺瘤壞死抗原、VEGF、胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)、17-1A抗原、血管生成標(biāo)志物(如ED-B纖連蛋白)、致癌基因標(biāo)志物、致癌基因產(chǎn)物和其他腫瘤相關(guān)抗原。有關(guān)腫瘤相關(guān)抗原的近期報(bào)告包括Mizukami等(2005，Atowre^fed11:992-97);Hatfield等(2005，CwrC朋cerZ>wgrarge"5:229-48);Vallbohmer等(2005，JC/,".(9"co/.23:3536-44);和Ren等(2005，爿朋.242:55-63),其均通過引用結(jié)合入本文。特別優(yōu)選的實(shí)施方案可包括具有CD20或CD22結(jié)合位點(diǎn)的六價(jià)單特異性構(gòu)建體。其他優(yōu)選的實(shí)施方案可包括具有CD20和CD22兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的六價(jià)雙特異性構(gòu)建體。其他實(shí)施方案可包含通過向受治療者施用單個(gè)或多個(gè)劑量的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，來治療受治療者的淋巴瘤、白血病或自身免疫疾病的方法，其中第二個(gè)前體的結(jié)合位點(diǎn)與淋巴細(xì)胞抗原結(jié)合，且第一個(gè)前體的結(jié)合位點(diǎn)與相同或不同的淋巴細(xì)胞抗原結(jié)合。所述一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可結(jié)合不同的表位、或結(jié)合選自由以下組成的組的抗原的表位CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CD138、CD154、B7、MUC1、Ia、Ii、畫1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纖連蛋白、致癌基因、致癌基因產(chǎn)物、NCA66a-d、壞死抗原、IL-2、TlOl、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。例如，所述組分可按單位劑量20-1500毫克蛋白、單位劑量20-500毫克蛋白、單位劑量20-100毫克蛋白、或單位劑量20-1500毫克蛋白的劑量進(jìn)行腸胃外施用。在其他實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可用于治療病原生物(如細(xì)菌、病毒或真菌)感染。可治療的真菌示例包括小孢子菌屬(AZ/cra^on/w)、發(fā)癬菌屬(7>/c/70//^tow)、表皮癬菌屬(五;/(ierwop/y/to")、申克氏孢子絲菌(5^ora齡/義sc/ewcA:")、新型隱球菌(C，tococcMSwe咖r層朋)、粗球孢子菌(Cocc,'Wo/fifer)、莢膜組織胞漿菌(//,'Wo//ow7or<:a/^w/artw7)、皮炎芽生菌(說o^cw^ces)或白色念玉求菌(Cawd/(iaG/^om')。病毒示例包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、皰療病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙臺(tái)病毒(Sendaivims)、貓白血病病毒、。乎腸孑瓜病毒(Reovirus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人類血清細(xì)小(parvo-like)病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、登革病毒、風(fēng)疹病毒(rubellavirus)、麻滲病毒、！^病毒、人T細(xì)J包白血病病毒、Epstein隱Barr病毒、小鼠白血病病毒、^腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德畢斯(Sindbis)病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒或藍(lán)舌病毒。細(xì)菌示例包括炭疽桿菌(5fif"'〃wsaw^rac/s)、無專'L《連5求菌(5^e/tococci^agGf/ach"e)、嗜月市軍團(tuán)菌(丄eg/owe〃fl/we應(yīng)o/M/a)、化膿性鏈球菌(浙e盧cocow/"gewes)、大腸斗干菌(i^c/zen'c//aco/O、'淋3求奈瑟菌(7Vejr'^en'agowo/r/zoeae)、腦膜炎奈瑟、菌(JVebsenamem.wgWA's)、肺炎雙J求菌(尸wew附ococcws5/;.)、流感嗜血桿菌B(孝McnzaeB)、梅毒螺旋體(7>，"￡麵;a〃/(iw附)、萊姆病蟲累S走體cfoeases/7^oc/etex)、^同纟錄4叚單月包菌(i^ewcfo/wowo"en/g/Masvaf)、麻風(fēng)分一支4干菌(A^ycoZ"Cen'wm/ep/Y/e)、i充產(chǎn)布魯氏桿菌(5rwce〃tf"Z)om^)、結(jié)核分枝桿菌(Af少co6ac&nMW勵(lì)eraz/a^)或支原體(A^yco//a扁a)。雖然不是限制，但是在不同實(shí)施方案中，被加入所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的前體可包含一種或多種蛋白質(zhì)，如細(xì)菌毒素、植物毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素A、美洲商陸(pokeweed)抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素、綠膿桿菌內(nèi)毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、可溶性受體組分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF121、TPO、EPO(促紅細(xì)胞生成素)、凝塊溶解劑(clot-dissolvingagent)、酶、熒光蛋白、sTNFa-R、avimer、scFv、dsFv或納米纟元體。在其他實(shí)施方案中，抗血管生成劑可形成部分或全部前體，或者可連接至穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。使用的抗血管生成劑示例包括制管張素(angiostatin)、baculostatin、血管能抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體或肽、抗胎盤生長(zhǎng)因子抗體或肽、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、血纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-10、Gro-(3、血小板反應(yīng)素(thrombospondin)、2-曱氧雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、欺酰胺三峻(carboxiamidotriazole)、CM101、馬立馬司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸鹽、血管生成素2、干擾素a、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide(利諾胺)、沙利度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、TNP-470、內(nèi)皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管張素、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博萊霉素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。在其他實(shí)施方案中，一種或多種治療劑可以被輒合至或結(jié)合至穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，所述治療劑如aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮雜胞苷、博萊霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜樹堿、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、塞來昔布、苯丁酸氮芥、順鉑、伊立替康(CPT-ll)、SN-38、卡鉑、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪胺、多西紫杉醇、；改線菌素、柔紅霉素葡糖苷酸、柔紅霉素、地塞米松、二乙基己烯雌酚、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-D0X)、氰基嗎啉阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸鹽、氟脲嘧啶脫氧核苷(FUdR)、3',5'-0-二油?；?FudR(FUdR-dO)、氟達(dá)拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、乙酸曱羥孕酮(medroprogesteroneacetate)、乙酸曱地孕酮、美法侖、巰基噤呤、6-巰基噪呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、苯丁酸、潑尼松、曱基千肼、紫杉醇、噴司他丁、PSI-341、司莫司汀鏈脲佐菌素、他莫昔芬、紫杉烷類、紫杉酚、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、萬珂(velcade)、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹蛙酶(onconase)、rapLRl、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素、綠膿桿菌內(nèi)毒素、反義寡核普酸、干擾RNA或其組合。不同的實(shí)施方案可涉及穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)和使用其用于誘導(dǎo)病變細(xì)胞凋亡的方法。進(jìn)一步的詳情可參見第20050079184號(hào)美國專利申請(qǐng)公布，其完整內(nèi)容通過引用結(jié)合入本文。此類結(jié)構(gòu)可包含對(duì)選自由以下組成的組的抗原具有結(jié)合親和性的前體CD2、CD3、CD8、CD10、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA-DR、CEA、CSAp、CA誦125、TAG國72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、而C1、而C2、而C3、而C4、TNFR1、TNFR2、NGFR、Fas(CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纖連蛋白、生腱蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。在更加特定的實(shí)施方案中，用來誘導(dǎo)凋亡的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可包含單克隆抗體、Fab片段、嵌合抗體、人源化抗體或者人抗體或片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可包含下列組合抗CD74X抗CD20、抗CD74X抗CD22、抗CD22X抗CD20、抗CD20X抗HLA-DR、抗CD19X抗CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8X抗CD25、抗CD2X抗CD147、抗CEACAM5X抗CD3、抗CEACAM6X抗CD3、抗EGFRX抗CD3、抗HER2/neuX抗CD3、抗CD20X抗CD3、抗CD74X抗CD3和抗CCD22X抗CD3。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可以是單特異性或多特異性抗CD20、抗CD22、抗HLA-DR和/或抗CD74。技術(shù)人員應(yīng)了解多價(jià)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可包含多個(gè)抗原結(jié)合部分，例如，所述抗原結(jié)合部分與CD20或CD22抗原的不同表位結(jié)合；或者任選地可包含均結(jié)合相同的表位的單個(gè)抗原結(jié)合部分的多個(gè)拷貝。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嵌合抗體、人源化抗體或人抗體或者抗體片段可衍生自LL2(抗CD22)、LL1(抗CD74)、L243(抗HLA-DR)和A20(抗CD20)的可變區(qū)。圖1顯示兩個(gè)DDD示例性序列。DDD1(SEQIDN0:1)中標(biāo)有下劃線的序列對(duì)應(yīng)于人PKA的RIIa中發(fā)現(xiàn)的前44個(gè)氨基末端殘基。DDD2(SEQIDN0:2)的兩個(gè)N-末端氨基酸殘基與DDD1的不同。圖2顯示兩個(gè)AD示例性序列。AD1(SEQIDNO:3)標(biāo)有下劃線的序列對(duì)應(yīng)于優(yōu)化的RII選擇肽其fd報(bào)道為0.4nM。同時(shí)還顯示了AD2(SEQIDNO:4)。圖3顯示N-DDD2-Fab-hMN-14的示意圖(A),以及通過DDD2介導(dǎo)的二聚化作用形成的假定的a2結(jié)構(gòu)(B)。圖4顯示N-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2質(zhì)粒表達(dá)載體的設(shè)計(jì)。圖5顯示C-DDD2-Fab-hMN-14的示意圖(A)，以及通過DDD2介導(dǎo)的二聚化作用形成的假定的a2結(jié)構(gòu)(B)。圖6顯示C-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2質(zhì)粒表達(dá)載體的i殳計(jì)。圖7顯示下列結(jié)構(gòu)的圖式表征(A)在還原條件下混合N-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2而形成的非共價(jià)a2b復(fù)合體；(B)通過二硫橋形成的共價(jià)TF1結(jié)構(gòu)。圖8顯示TF2的示意圖。圖9為C-H-AD2-IgG的簡(jiǎn)圖。(A)重鏈-AD2和輕鏈的cDNA/多肽序列排列。(B)C-H-AD2-IgG的圖式表征。圖10為C-H-AD2-IgG和Fab-DDD2沖莫塊結(jié)合得到的單特異性HIDS(基于IgG的六價(jià)DNL結(jié)構(gòu))的圖式表征。圖11為C-H-AD2-IgG和Fab-DDD2模塊結(jié)合得到的雙特異性HIDS的圖式表征。圖12為N-K-AD2-IgG的簡(jiǎn)圖。(A)重鏈和AD2-輕鏈的cDNA/多肽序列排列。(B)N-K-AD2-IgG的圖式表征。圖13為N-K-AD2-IgG和Fab-DDD2才莫塊結(jié)合得到的雙特異性HIDS的圖式表征。圖14顯示下列載體的簡(jiǎn)圖(A)Fc-AD2-pdHL2穿梭載體，(B)IgG-pdHL2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體和(C)C-H-AD2-IgG-pdHL2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。圖15顯示經(jīng)蛋白A純化的C-H-AD2-hLL2-IgG的SE-HPLC分析。指出了代表單體和二聚體形式的峰。圖16顯示經(jīng)蛋白A純化的C-H-AD2-hLL2-IgG在還原和非還原條件下的SDS-PAGE分析。指出了還原泳道中代表重鏈-AD2、重鏈和k輕鏈的條帶。指出了非還原泳道中代表C-H-AD2-hLL2-IgG和所述共價(jià)二聚體的條帶。指出了分子量標(biāo)志物的位置。圖17顯示經(jīng)蛋白A純化的N-K-AD2-hLL2-IgG的SE-HPLC分析。(A)箭頭指出了代表單體、二聚體和三聚體形式的峰。(B)谷胱甘肽還原之后的分析顯示二聚體和三聚體形式轉(zhuǎn)化為單體形式。圖18顯示N-K-AD2-hLL2-IgG的二聚體(A)和三聚體(B)形式的假定結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)圖，它們通過溫和還原轉(zhuǎn)化為單體形式(C)。圖19顯示經(jīng)蛋白A純化的Hex-hA20的SE-HPLC分析。圖20顯示六種基于C-H-AD2-hLL2-IgG的HIDS的SDS-PAGE分析。(A)非還原條件下的SDS-PAGE。(B)還原條件下的SDS-PAGE。箭頭指出了代表重鏈-AD2、Fd-DDD2和k輕鏈的條帶。指出了分子量標(biāo)志物的位置。圖21顯示經(jīng)蛋白A純化的Hex-hLL2的SE-HPLC分析。圖22顯示(A)DNL1和(B)DNL1C的SE-HPLC分析。圖23顯示DNL2的SE-HPLC分析。圖24顯示DNL3和K-Hex-hA20在還原和非還原條件下的SDS-PAGE分析。代表重鏈、AD2-k鏈、Fd-DDD2和k輕鏈的條帶顯示在還原泳道中。代表DNL3和K-Hex-hA20的條帶顯示在非還原泳道中。指出了分子量才示志物的^f立置。圖25顯示DNL3的SE-HPLC分析。圖26顯示兩個(gè)竟?fàn)嶦LISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，比較了DNL1、DNL2Hex-hA20和Hex-hLL2與親本IgG對(duì)hA20/hLL2的相對(duì)結(jié)合親和力。用5嗎/ml的hA20或h!X2IgG涂布微滴定板。HIDS的稀釋系列與特異性針對(duì)hA20或hLL2IgG的抗Id(保持2nM的恒定濃度)混合。使用過氧化物酶軛合的山羊抗鼠IgG和OPD底物溶液4全測(cè)抗Id與涂布孔之間的結(jié)合水平。結(jié)果用％抑制(與涂布孔結(jié)合的抗Id)和HIDS濃度圖表示。使用Prism軟件獲得EC5Q(造成50%抑制的有效濃度)值。HIDS用于竟?fàn)幗Y(jié)合(A)hA20涂布孔中的WI2(hA20鼠抗Id)或(B)hLL2涂布孔中的WN(hLL2鼠抗Id)。圖27顯示兩個(gè)竟?fàn)嶦LISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，比較了DNL2和DNL3對(duì)hA20/hLL2的相對(duì)結(jié)合親和力。實(shí)驗(yàn)如圖26所描迷的進(jìn)行。使用DNL2、DNL3和親本IgG竟?fàn)幗Y(jié)合(A)hA20涂布孔中的WI2(hA20鼠抗Id)或(B)hLL2涂布孔中的WN(hLL2鼠抗Id)。圖28顯示用DNL1、DNL2、Hex-hA20或利妥昔單抗(rituximab)處理Daudi淋巴瘤細(xì)胞后的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果。向組織培養(yǎng)^f瓦中接種1x105個(gè)Daudi細(xì)胞/ml,于補(bǔ)充了不同濃度HIDS或利妥昔單抗中的一種的RPMI1640培養(yǎng)基中。每天使用GuavaPCA對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。(A)10nM濃度處理后的生長(zhǎng)曲線比較。(B)選定濃度下的生長(zhǎng)曲線比較。圖29顯示用不同HIDS處理Daudi細(xì)胞的劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用細(xì)胞涂布96孔板(5,000個(gè)細(xì)胞/孔，于RPMI1640培養(yǎng)基中)。采用五倍系列稀釋，將濃度從2xlO-s降到6.4xlO"M，三個(gè)重復(fù)。將平板孵育四天后，向其中加入MTS試劑，然后繼續(xù)孵育另外四小時(shí)，然后在490nm下對(duì)平板進(jìn)行讀數(shù)。結(jié)果表示為未處理孔OD柳的百分比與HIDS摩爾濃度的log值。測(cè)量每個(gè)劑量響應(yīng)曲線的EC4()(造成40%生長(zhǎng)抑制的有效濃度)值。圖30顯示使用DNL2或Hex-hA20處理帶有人伯基特淋巴瘤(Daudi)小鼠的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。小鼠(4只/組)靜脈內(nèi)(i.v.)接種1.5x107個(gè)Daudi細(xì)胞(第0天)。在第1、4和7天，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)施用4昭或20ng的DNL2或Hex-hA20。如果小鼠出現(xiàn)后肢癱瘓或者體重下降〉20%即予以處死。結(jié)果用％存活和時(shí)間(天)圖表示。顯示了中位存活期和長(zhǎng)期存活者。圖31顯示用雙特異性HID(拴結(jié)至hA20IgG的DNL2-四個(gè)hLL2Fab片段)和單特異性HID(Hex-hA20)處理Daudi細(xì)胞、Raji細(xì)胞和Ramos細(xì)胞，通過MTS細(xì)胞增殖分析得到的相對(duì)劑量響應(yīng)曲線(與hA20IgG對(duì)照進(jìn)行比較)。在Daudi細(xì)胞(上圖)中，與hA20IgG相比，DNL2顯示出>100倍，Hex-hA20顯示出>10,000倍的有效抗細(xì)胞增殖活性。在Raji細(xì)胞(中圖)中，與hA20IgG相比，Hex-hA20顯示出有效的抗細(xì)胞增殖活性，而DNL2僅顯示最小活性。在Ramos細(xì)胞(底圖)中，與hA20IgG相比，DNLs和Hex-hA20均顯示出有效的抗細(xì)胞增殖活性。圖32顯示交聯(lián)對(duì)hA20IgG、DNL2和Hex-hA20抗細(xì)胞增殖活性的影響。如圖中所示，交聯(lián)加強(qiáng)了hA20IgG的抗細(xì)胞增殖活性，但對(duì)DNL2或Hex-hA20的活性則無增強(qiáng)作用。圖33顯示DNL1和DNL2在人血清中的穩(wěn)定性，采用雙特異性ELISA分析確定。10嗎/ml的所述蛋白結(jié)構(gòu)與新鮮釆集的人血清在37。C和5%C02條件下孵育五天。對(duì)于第0天的樣品，等分試樣在用血清稀釋后立即用液氮冷凍。用hA20IgG的抗Id涂布ELISA平板，然后用hLL2IgG的抗Id檢測(cè)雙特異性結(jié)合。DNL1和DNL2均顯示了高度的血清穩(wěn)定性，并保持了完全的雙特異結(jié)合活性。圖34顯示DNLl、DNL2、Hex-hA20、hLL2、hA20-IgG和hA20-IgG-AD2的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)或其缺失。令人驚奇的是，雖然hA20IgG和hA20-IgG-AD2在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)Daudi細(xì)胞的有效CDC活性，但是所有六價(jià)DNL結(jié)構(gòu)均未在此分析中表現(xiàn)出CDC活性。DNL2和Hex-ha20均包含hA20-IgG-AD2，它們顯示出與hA20IgG相似的CDC活性。圖35比較了DNL1、hA20IgG、利妥昔單抗和hLL2IgG的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)，分析采用新鮮分離的外周血單核細(xì)胞。利妥昔單抗和hA20IgG均表現(xiàn)出有效的ADCC活性，而DNL1則未表現(xiàn)出任何可檢測(cè)的ADCC。具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)引用的所有文檔，或者其部分內(nèi)容，包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、論文、專著和論著，均明確地通過引用整體結(jié)合入本文。在某些實(shí)施方案中，提供了a2b形式的新的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)以及制備這些復(fù)合體的方法。一般而言，該二元復(fù)合體由非共價(jià)連接的同型二聚體結(jié)構(gòu)(稱為A或a2)組成，該同型二聚體結(jié)構(gòu)與另一結(jié)構(gòu)(稱為B或b)進(jìn)行位點(diǎn)特異性締合。得到的a2b結(jié)構(gòu)可通過A和B之間的非共價(jià)或者優(yōu)選地共價(jià)(例如，二石危鍵)相互作用進(jìn)行穩(wěn)定。A由兩個(gè)相同的亞基形成，其中每個(gè)亞基由連接至肽序列(稱為二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域，DDD)的前體組成；在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽序列衍生自cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)。所述亞基中包含的DDD結(jié)構(gòu)域自發(fā)締合形成穩(wěn)定的同型二聚體，而此締合又進(jìn)一步生成另一肽序列(稱為錨定結(jié)構(gòu)域，AD)的高親和結(jié)合位點(diǎn)，AD發(fā)現(xiàn)于例如各種A-激酶錨定蛋白(AKAP)，并包含在B中。因此，B由連接至AD的前體組成。所述二元復(fù)合體的組裝通過AD肽與(DDD)2結(jié)合位點(diǎn)的相互作用很容易發(fā)生。DDD肽可插入基本上任何多肽序列或拴結(jié)至任何前體，條件是這種衍生不干擾其二聚化和與AD肽結(jié)合的能力。相似地，AD肽可插入基本上任何多肽序列或拴結(jié)至任何前體，條件是這種衍生不干擾其與同型二聚體DDD結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。這種^^莫塊化方法具有高度的通用性，可用于組合基本上任何A和任何B,以形成包含衍生自A的前體的兩個(gè)亞基(a》和彩于生自B的前體的一個(gè)亞基(b)的二元裝配體。其中A和B的前體均包含能夠與另一抗體結(jié)構(gòu)域締合而產(chǎn)生抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體結(jié)構(gòu)域(例如，F(xiàn)ab或scFv),得到的a2b復(fù)合體是雙特異性且三^介的。例如，在一些實(shí)施方案中，所述二元復(fù)合體可通過化學(xué)輒合連4矣至效應(yīng)物(如配體或藥物)，連接至載體(如葡聚糖或納米粒子)，或同時(shí)連接至效應(yīng)物和載體，以實(shí)現(xiàn)此類修飾允許的其他應(yīng)用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此主題的變化可用于制備為同型六聚體或異型六聚體的六聚復(fù)合體。由于二元復(fù)合體的穩(wěn)定性主要依賴于A中包含的DDD對(duì)B中包含的AD的結(jié)合親和力，且使用平衡尺寸排阻HPLC分析估測(cè)由C末端融合AD1的構(gòu)建體(h679-Fab-ADl，參見實(shí)施例3)與C-或N-末端融合DDD1的構(gòu)建體(C-DDDl-Fab-hMN-14或N-DDDl-Fab-hMN-14，均請(qǐng)參見實(shí)施例4)形成的兩種原型a2b結(jié)構(gòu)(參見實(shí)施例5)的此親和力不大于8nM,因此共價(jià)連接a2b復(fù)合體中包含的A和B將會(huì)防止各亞基間出現(xiàn)不希望的解離，進(jìn)而有助于在體內(nèi)應(yīng)用。為了穩(wěn)定該二元復(fù)合體，可在DDD和AD序列的關(guān)鍵位置同時(shí)引入半胱氨酸殘基，以使DDD和AD之間形成二硫鍵連接。還可應(yīng)用其他方法或策略來實(shí)現(xiàn)經(jīng)由32和b交聯(lián)形成穩(wěn)定的復(fù)合體。例如，使用戊二醛或PICUP方法，組成亞基彼此之間可以較低效率的低特異性方式共價(jià)連接。也可使用其他已知的共價(jià)交聯(lián)方法。定義本文使用的"一個(gè)"或"一種"可指一個(gè)(種)或多于一個(gè)(種)的項(xiàng)目。如此處所用，術(shù)語"和"和"或，，可用于表示合取或析取。即，除非另外指明，二者均應(yīng)理解為等同于"和/或"。"二聚化和停靠結(jié)構(gòu)域(DDD)"指允許包含DDD序列的兩個(gè)同型單體自發(fā)形成二聚體的狀序列。所得同型二聚體在DDD序列內(nèi)包含錨定結(jié)構(gòu)域的?？课稽c(diǎn)。雖然示例性DDD序列可從cAMP依賴性蛋白激酶獲得，但是也可使用其他已知的DDD序列。"錨定結(jié)構(gòu)域(AD)"是對(duì)二聚化DDD序列具有結(jié)合親和力的肽序列。雖然示例性AD序列可衍生自任何A-激酶錨定蛋白(AKAP),但是也可使用其他已知的AD序列。術(shù)語"前體，，使用其普通含義，即可從其形成更加穩(wěn)定、確定或終產(chǎn)物的物質(zhì)。如此處所用，"結(jié)合分子"、"結(jié)合部分"或"靶向分子"是任何可以特異結(jié)合靶分子、細(xì)胞、復(fù)合體和/或組織的分子。結(jié)合分子可包括但不限于抗體或片段、其類似物或才莫擬物、avimer、適體或靶向肽。如此處所述，"抗體"指全長(zhǎng)(即天然存在的或者通過正常的免疫球蛋白基因片段重組技術(shù)形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗體)，或者具有免疫活性(即特異性結(jié)合)的免疫球蛋白分子的部分或類似物，像抗體片段。"抗體片段"是抗體的一部分，如F(ab)2、F(ab')2、Fab、Fv、sFv等。無論結(jié)構(gòu)如何，抗體片段與完整抗體識(shí)別的相同抗原結(jié)合。術(shù)語"抗體片段"還包括通過結(jié)合特異抗原以形成復(fù)合體來發(fā)揮抗體類似作用的任何合成或基因工程蛋白。例如，抗體片段包括由可變區(qū)組成的分離片段，如由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成的"Fv"片段，輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽連接體連接形成的重組單鏈多肽分子("scFv蛋白")和由氨基酸殘基組成的模仿高變區(qū)的最小識(shí)別單位(CDR)。"效應(yīng)物"是產(chǎn)生選定結(jié)果的原子、分子或化合物。效應(yīng)物可包括治療劑和/或it斷劑。"治療劑"是可用于治療疾病的原子、分子或化合物。治療劑的實(shí)例包括抗體、抗體片段、藥物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、小千擾RNA(siRNA)、螯合劑、硼化合物、光敏劑、染料和放射性同位素。其他示例性的治療劑和使用方法參見第20050002945、20040018557、20030148409和20050014207號(hào)美國專利7>布，其均通過引用結(jié)合入本文。"診斷劑"是可用于診斷疾病的原子、分子或化合物。有用的診斷劑包括但不限于放射性同位素、染料(如生物素-鏈霉親和素復(fù)合體)、造影劑、熒光化合物或分子和磁共振成像(MRI)的增強(qiáng)劑(如順磁離子)。"免疫軛合物"是結(jié)合分子(如抗體組分)與原子、分子或更高級(jí)結(jié)構(gòu)(如載體、治療劑或診斷劑)的軛合物。"棵抗體"是未與任何其他試劑軛合的抗體。原子、分子或更高級(jí)結(jié)構(gòu)。載體可包括脂質(zhì)(如能夠形成更高級(jí)結(jié)構(gòu)的兩親性脂質(zhì))、多糖(如葡聚糖)或其他更高級(jí)結(jié)構(gòu)(如膠束、脂質(zhì)體或納米粒子)。如此處所用，術(shù)語"抗體融合蛋白"是重組制備的抗原結(jié)合分子，其中連接了具有相同或不同特異性的兩個(gè)或多個(gè)相同或不同的scFv或抗體片段。該融合蛋白的價(jià)位指示其對(duì)單個(gè)抗原或表位具有多少結(jié)合臂或位點(diǎn)；即單價(jià)、雙價(jià)、三價(jià)或多價(jià)?？贵w融合蛋白的多價(jià)位意味著它在與抗原結(jié)合時(shí)可以利用多個(gè)相互作用，因而增強(qiáng)與抗原結(jié)合的親和力。特異性表示抗體融合蛋白能與多少種抗原或表位結(jié)合；即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。根據(jù)這些定義，天然抗體如IgG為雙價(jià)的，因?yàn)樗袃蓚€(gè)結(jié)合臂，但是它是單特異性的，因?yàn)樗Y(jié)合一個(gè)表位。單特異性、多價(jià)融合蛋白具有多于一個(gè)的表位結(jié)合位點(diǎn)，但是只與一個(gè)此類表位結(jié)合，例如具有與同一抗原反應(yīng)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈抗體。該融合蛋白可包含單個(gè)抗體組分、不同抗體組分的多價(jià)或多特異性組合，或者同一抗體組分的多個(gè)拷貝。該融合蛋白還可含抗體或抗體片段和治療劑。適合用于此類融合蛋白的治療劑實(shí)例包括免疫調(diào)節(jié)劑("抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白")和毒素("抗體-毒素融合蛋白，，)。一個(gè)優(yōu)選的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，優(yōu)選為重組RNA酶。如果抗體或者免疫軛合物制品，或者本文所述的組合物的施用量是生理學(xué)上顯著的，即被稱為施以"治療有效量"。如果試劑的存在引起受體哺乳動(dòng)物生理發(fā)生可檢測(cè)的變化，即被視為生理學(xué)上顯著的。在特定實(shí)施方案中，如果抗體制品的存在引起了抗腫瘤反應(yīng)或者減輕了自身免疫疾病狀態(tài)的征兆或者癥狀，即被視為生理學(xué)上顯著的。生理學(xué)上顯著的效應(yīng)還可以是引發(fā)了受體哺乳動(dòng)物的體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致靶細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制或者死亡。"治療有效量"并不限于對(duì)受治療者產(chǎn)生最優(yōu)選效應(yīng)的試劑量，而可以指對(duì)受治療者、細(xì)胞、組織或器官產(chǎn)生任何可能已知的效應(yīng)的量。制備模塊化亞基的穩(wěn)定拴結(jié)裝配體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開的方法和組分提供了制備由模塊化亞基組成的穩(wěn)定拴結(jié)裝配體的平臺(tái)技術(shù)。一個(gè)實(shí)施方案涉及由優(yōu)選分別制備的兩種確定組分A和B形成的穩(wěn)定拴結(jié)的二元復(fù)合體。但是，在替代實(shí)施方案中，A和B可以一起制備，例如，通過使用既編碼A又編碼B的栽體，或者使用分別編碼A和B的兩個(gè)不同載體轉(zhuǎn)染單個(gè)細(xì)胞系。當(dāng)A和B二者均為Fab片段時(shí)，優(yōu)選為分別制備，否則共同制備時(shí)會(huì)因輕鏈亂序而導(dǎo)致異質(zhì)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，由兩個(gè)相同亞基(a2)組成的A與由一個(gè)亞基(b)組成的B結(jié)合，形成a2b結(jié)構(gòu)的裝配體。A和B的締合是位點(diǎn)特異并且自發(fā)的締合，原因在于分別構(gòu)建入A和B的DDD和AD序列之間強(qiáng)烈的結(jié)合作用。A和B均可以為任何實(shí)體，且DDD連接的A的前體可以與AD連接的B的前體不同或者相同。在后一種情況下，所得a2b復(fù)合體(稱為a3)由三個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基均包含相同的前體但是均同時(shí)連接至DDD和AD。本申請(qǐng)要求保護(hù)的方法和組合物的才莫塊化本質(zhì)允許任何A和任何B的組合。只要不干擾DDD的二聚化或者DDD與AD的結(jié)合，A和B所連接或包含的前體類型基本上沒有限制。當(dāng)通過基因工程方法構(gòu)建時(shí)，A和B可以獨(dú)立在不同的宿主細(xì)胞中生成、被純化和存儲(chǔ)(或者替代地，按上述方法在相同宿主細(xì)胞中生成)。但是，在組裝之前對(duì)A和B進(jìn)行純化并不是完全必需的。含有A和B的細(xì)胞提取物或培養(yǎng)物可以在適當(dāng)條件下直接進(jìn)行混合，以實(shí)現(xiàn)二元復(fù)合體的形成，然后通過氧化后的二^5危鍵來穩(wěn)定該復(fù)合體，之后再對(duì)該復(fù)合體進(jìn)行純化。在某些應(yīng)用中，在純化之后且在與A結(jié)合之前，B可能需要與效應(yīng)物或載體軛合?；蛘?，在純化之后且在與B結(jié)合之前，A可能需要與效應(yīng)物或載體軛合。還有可能是在結(jié)合之前，A和B均需要用效應(yīng)物或載體進(jìn)行修飾。此外，在某些應(yīng)用中，a2b復(fù)合體可能需要軛合效應(yīng)物或載體。當(dāng)A和B在同一宿主細(xì)胞中制備時(shí)，它們可自發(fā)組裝為a2b復(fù)合體。優(yōu)選的實(shí)施方案利用cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)調(diào)節(jié)亞基和A-激酶錨定蛋白(AKAP)錨定結(jié)構(gòu)域之間自然發(fā)生的特異性蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用。PKA首次報(bào)道于1968年(請(qǐng)參見Walsh等，J.5w/.C/2e附.243:3763-65(1968))。全酶結(jié)構(gòu)在20世紀(jì)70年代中期得到闡明，其由兩個(gè)催化亞基組成，催化亞基被調(diào)節(jié)(R)亞基二聚體置于失活狀態(tài)(請(qǐng)參見Corbin等，J.說o/.C/ze肌248:1813-21(1973))。發(fā)現(xiàn)R亞基有兩種類型(RI和RII),每種類型均有a和(3亞型。R亞基只能通過分離得到穩(wěn)定的二聚體，且表明二聚化結(jié)構(gòu)域由前44個(gè)氨基末端殘基組成(請(qǐng)參見Hausken等，J.歷o/.CZem.271:29016-22(1996))。PKA是廣鐠絲氨酸/蘇氨酸激酶，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性是通過全酶的區(qū)隔化實(shí)現(xiàn)的，而全酶的區(qū)隔化則是借助于稱為A-激酶錨定蛋白(AKAP)的停靠蛋白(Scott等，</.說o/.C/2em.265:21561-66(1990》。第一個(gè)AKAP，即微管相關(guān)蛋白-2，是在1984年鑒定的(Lohmann等，Prac.M/".爿c^/.Sdt/&4.81:6723-27(1984))。截至目前為止，已在從酵母到人類等諸多物種中鑒定了50多種結(jié)構(gòu)各異的AKAP(請(qǐng)參見Wong等，iVWifevA/o/Ce〃說W.12:959-70(2004))。AKAP的PKA錨定結(jié)構(gòu)域?yàn)?4-18個(gè)殘基的兩親螺旋(請(qǐng)參見Carr等，丄5,》/.C/2e附.266:14188-92(1991))。AKAP的PKA錨定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相當(dāng)多樣化，并且其對(duì)RII二聚體的結(jié)合親和力為2-90nM,而對(duì)RI二聚體的結(jié)合親和力約小100倍(請(qǐng)參見Alto等，Ato/.y4a^.100:4445-50(2003))。該錨定結(jié)構(gòu)域與RII二聚體上由RII氨基末端的前23個(gè)殘基形成的疏水表面結(jié)合(Colledge等，J>e"ACW/說o/.6:216-21(1999))。因此，RII二聚化結(jié)構(gòu)域和AKAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域均位于相同的44氨基酸序列內(nèi)。此外，AKAP僅與RII二聚體而非單體結(jié)合。圖7顯示了此相互作用的結(jié)構(gòu)模型。DDD和AD序列之間通過相互作用形成的非共價(jià)復(fù)合體可被共價(jià)穩(wěn)定以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)應(yīng)用。這可通過在DDD和AD兩個(gè)序列的關(guān)鍵位置(如DDD2和AD2中所示)引入半胱氨酸殘基，以利于形成二硫鍵來實(shí)現(xiàn)。替代地，可使用其他已知類型的共價(jià)交聯(lián)方法。當(dāng)采用重組工程方法制備時(shí)，二元復(fù)合體的兩個(gè)組分(A和B)可在同一宿主細(xì)胞中合成，或者更優(yōu)選地，在兩個(gè)單獨(dú)的宿主細(xì)胞系中合成。引導(dǎo)A的合成的表達(dá)載體將包含目標(biāo)多肽(/0的DNA序列，該序列與編碼PKAR-亞基的DDD(如DDD1或DDD2)的序列融合，DDD可由RIa、RIP、RIIa、RII(3或者任何天然或者合成的功能類似物的前30個(gè)或更多氨基酸組成。DDD可偶聯(lián)至4的氨基末端或羧基末端，直接軛合或者優(yōu)選使用包含適當(dāng)長(zhǎng)度和組成的氨基酸殘基的間隔區(qū)。替代地，DDD可位于融合蛋白的內(nèi)部，條件是DDD的結(jié)合活性和該多肽融合配偶體所需的活性不受影響。一旦合成以后，A/DDD融合蛋白將與DDD1全部形成穩(wěn)定的同型二聚體，或者與DDD2大部分形成穩(wěn)定的同型四聚體。形成穩(wěn)定同型六聚體或異型六聚體的方法請(qǐng)參見下文的實(shí)施例。引導(dǎo)B合成的另一表達(dá)盒可位于引導(dǎo)A合成的同一載體中或者優(yōu)選地位于獨(dú)立載體中，該表達(dá)盒將包含與編碼錨定結(jié)構(gòu)域(AD)(如AD1或AD2)的序列融合的目標(biāo)多肽(S)的DNA序列，所述錨定結(jié)構(gòu)域可衍生自US2003/0232420A1(其通過引用結(jié)合入本文)公開的任何AKAP蛋白或者其天然或合成類似物。AD可偶聯(lián)至萬的氨基末端或羧基末端，直接偶聯(lián)或者優(yōu)選使用包含適當(dāng)長(zhǎng)度或組成的氨基酸殘基的間隔區(qū)。在二硫化物還原劑存在下將S/AD2融合蛋白(b)和爿/DDD2融合蛋白(主要是&)混合，形成由a2b組成的二元復(fù)合體，然后可通過加入合適的氧化劑(如二甲基亞砜，DMSO)，以利于形成二硫鍵，進(jìn)而對(duì)該復(fù)合體進(jìn)行穩(wěn)定。這些亞基的^t塊化本質(zhì)允許任何DDD2-多肽二聚體和任何AD2-多肽的組合。多種;f莫塊化亞基的貯存物可以作為純化產(chǎn)物或未純化的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液?jiǎn)为?dú)保存，然后在需要時(shí)合并以得到各種a2b結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，A或B在純化后可利用適當(dāng)?shù)能椇匣瘜W(xué)而偶聯(lián)效應(yīng)物(如藥物或螯合劑)或者載體(如葡聚糖或納米粒子)。替代地，此類々務(wù)飾也可在該結(jié)構(gòu)形成并純化以后進(jìn)行，或者在混合之前對(duì)A和B進(jìn)行。衍生自重組抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的模塊化亞基的穩(wěn)定拴結(jié)裝配體本發(fā)明公開的方法和組合物可用于提供基于重組抗體的、可以為單特異性或雙特異性的多價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)。例如，DDD2序列可與單鏈Fv融合以獲得單特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)。更為普遍的，DDD序列可與抗體可變區(qū)融合，該可變區(qū)可與互補(bǔ)抗體可變區(qū)締合以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如，DDD1或DDD2序列可融合至包含VH結(jié)構(gòu)域和CH1結(jié)構(gòu)域(Fd/DDD)的抗體序列，或者替代地，融合至VL結(jié)構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域(L/DDD)。然后，F(xiàn)d/DDD或L/DDD可分別與互補(bǔ)的L或Fd締合以形成Fab/DDD，以及進(jìn)一步形成Fab/DDD1二聚體或Fab/DDD2四聚體/二聚體。相似地，AD序列(如AD2)可融合至單鏈Fv，或者更為普遍地，融合至包含VH結(jié)構(gòu)域和CH1結(jié)構(gòu)域的抗體序列(Fd/AD2)，該抗體序列與同源L鏈配對(duì)時(shí)形成Fab/AD2。替代地，AD序列(如AD2)可融合至包含VrJ吉構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域的抗體序列，該抗體序列與同源Fd鏈配對(duì)時(shí)形成Fab/AD2。將Fab/DDD2的四聚體/二聚體與Fab/AD2混合，然后進(jìn)行還原和氧化，即得到可以是單特異性或雙特異性的三價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定拴結(jié)裝配體。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)的Vh和Vl區(qū)可衍生自"人源化"單克隆抗體或人抗體。替代地，Vh和/或Vl區(qū)可包含衍生自從重組免疫球蛋白文庫分離的人抗體片段的序列。例如，請(qǐng)參見Barbas等，METHODS:AcompaniontoMethodsinEnzymology(方法酶學(xué)方法指南)2:119(1991)和Winter等，Ann.Rev.Immunol.12:433(1994)。例如，可從STRATAGENECloningSystems(LaJolla,Calif.)獲得用于制備人免疫球蛋白噬菌體文庫的克隆和表達(dá)載體。人抗體Vh或Vl序列可衍生自從小鼠中制備的人單克隆抗體。此類抗體獲自經(jīng)過"改造"以在響應(yīng)抗原刺激時(shí)產(chǎn)生特異人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在此技術(shù)中，人重鏈和輕鏈基因座元件被引入含有被單巴向破壞的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的胚胎干細(xì)胞系衍生而來的小鼠種系。這種轉(zhuǎn)基因小鼠可合成對(duì)人抗原特異的人抗體，并且所述小鼠可用于制備分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法請(qǐng)參見Green等，NatureGenet.7:13(1994)，Lonberg等，Nature368:856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)。制備包含抗體片段的重組融合蛋白的一般方法編碼識(shí)別特定表位的抗體片段的核酸序列可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)獲得。例如，分泌具有所需特異性的抗體的雜交瘤可用于獲得編碼抗體的DNA，所述DNA使用已知技術(shù)制備，例如通過PCR或者傳統(tǒng)的cDNA克隆技術(shù)。替代地，可構(gòu)建Fab'表達(dá)文庫或抗體噬菌體展示文庫以篩選具有所需特異性的抗體片段。然后可以直接或者通過編碼肽間隔區(qū)的序列，將編碼所述抗體片段的核酸連接至編碼DDD或AD的核酸。制備編碼這些類型的融合蛋白的核酸序列的方法在本領(lǐng)域?yàn)楣?，并將在?shí)施例中進(jìn)一步提供。在另一實(shí)施方案中，主要由爿/DDD或S/AD組成的模塊化亞基的N-或C-末端可連接額外的氨基酸殘基，其中準(zhǔn)確的融合位點(diǎn)可能取決于DDD或AD是連接至N-末端還是C-末端(或者在內(nèi)部位置)。所述額外的氨基酸殘基可包含肽標(biāo)簽、信號(hào)肽、細(xì)胞因子、酶(例如前體藥物激活酶)、激素、毒素、肽藥物、膜相互作用肽或其他功能蛋白質(zhì)。在希望的宿主細(xì)胞中制備重組蛋白的方法在本領(lǐng)域?yàn)楣榱吮阌诩兓?，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可包含合適的肽標(biāo)簽，如FLAG序列或多聚-HIS序列，以利于使用相應(yīng)的親和柱對(duì)它們進(jìn)行純化。適合表達(dá)所迷穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的組成亞基的示例性表達(dá)系統(tǒng)為pdHL2載體，該載體具有可擴(kuò)增的鼠dhfr基因，允許通過曱氨蝶呤處理進(jìn)行選擇和擴(kuò)增。請(qǐng)參見Gillies等，J.Immunol.Methods125:191(1989)。pdHL2載體提供由兩個(gè)金屬硫蛋白啟動(dòng)子和IgH增強(qiáng)子單獨(dú)控制的兩個(gè)基因的獨(dú)立表達(dá)。適合表達(dá)所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的組成亞基的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員為已知。使用人宿主細(xì)胞會(huì)使任何表達(dá)的分子能夠用人糖基化模式進(jìn)行修飾。但是，并沒有跡象暗示本發(fā)明公開的方法必須或者優(yōu)選使用人宿主細(xì)胞。作為示例，可通過電穿孔方法用編碼所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的組成亞基的線性化pdHL2載體轉(zhuǎn)染鼠骨髓瘤細(xì)胞系(如Sp2/0)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，可通過將細(xì)胞與含有0.05-0.1nM甲氨蝶呤的培養(yǎng)基孵育而開始選擇。然后可通過將甲氨蝶呤濃度遞增至5岸來擴(kuò)增所選克隆。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的扼合物上述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)還可軛合其他部分。例如，藥物、毒素、放射性化合物、酶、激素、細(xì)胞毒性蛋白、螯合劑、細(xì)胞因子和其他功能試劑可軛合至所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)亞基。例如，可通過共價(jià)連接軛合至側(cè)鏈含有胺、羧基、巰基或羥基基團(tuán)的氨基酸殘基。有各種常規(guī)連接體可用于此用途，例如，二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、二(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳二亞胺、馬來酰亞胺-羥基琥珀酰亞胺酯、戊二醛及類似物。試劑與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的軛合優(yōu)選不顯著影響未修飾結(jié)構(gòu)中包含的各個(gè)亞基的活性。可以分開對(duì)模塊化亞基進(jìn)行軛合，然后將亞基組裝為穩(wěn)定拴結(jié)構(gòu)建體，或者替代地，也可使用完全形成的穩(wěn)定拴結(jié)構(gòu)建體或者該穩(wěn)定拴結(jié)構(gòu)建體形成過程中的任何中間體進(jìn)行軛合。此外，可先將細(xì)胞毒性試劑或其他試劑偶聯(lián)至多聚物載體，然后將該載體軛合至穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。有關(guān)此方法的詳情，請(qǐng)參見Ryser等，Ato/.Jcai/.WX4，75:3867-3870，1978;U.S.4,699,784和U.S.4,046,722，其通過引用結(jié)合入本文。此處所述軛合物可通過本領(lǐng)域已知的各種方法制備。例如，穩(wěn)定^t全結(jié)結(jié)構(gòu)可用1311進(jìn)行^:射性標(biāo)記，然后與脂質(zhì)軛合，以便所得軛合物可以形成脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體可結(jié)合一個(gè)或多個(gè)治療劑(如FUdR-dO等藥物)或診斷劑。替代地，除了所述載體之外，穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可以軛合1311(如在酪氨酸殘基處)和藥物(如在賴氨酸的s氨基)，并且該載體可結(jié)合其他治療劑或診斷劑。治療劑和診斷劑可與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多于一個(gè)的亞基共價(jià)締合。脂質(zhì)體和膠束的形成在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?。例如，?qǐng)參見Wrobel和Collins，BiochimicaetBiophysicaActa(1995),1235:296-304;Lundberg等，J.Pharm.Pharmacol.(1999),51:1099-1105;Lundberg等，Int.J.Pharm.(2000)，205:101-108;Lundberg,J.Pharm.Sci.(1994)，83:72-75;Xu等，Molec.CancerTher.(2002),1:337-346;Torchilin等，Proc.Nat'l.Acad.Sci.,U.S.A.(2003),100:6039-6044;U.S.5,565,215;U.S.6,379,698和U.S.2003/0082154。由聚合物、二氧化硅或金屬形成的可用于藥物遞送或成像的納米粒子或納米膠嚢也已有才艮道。例如，請(qǐng)參見West等，ApplicationsofNanotechnologytoBiotechnology(2000)，11:215-217;U.S.5,620，708;U.S.5,702,727和U.S.6,530,944?？贵w或結(jié)合分子與脂質(zhì)體軛合形成治療劑或診斷劑的輩巴向載體已有才艮道。例如，請(qǐng)參見Bendas，Biodrugs(2001),15:215-224;Xu等，Mol.CancerTher(2002)，1:337-346;Torchilin等,Proc.Nat'lAcad.Sci.U.S.A(2003)，100:6039-6044;Bally等，J.LiposomeRes.(1998)，8:299-335;Lundberg，Int.J.Pharm.(1994)，109:73-81;Lundberg,J.Pharm.Pharmacol.(1997),49:16-21;Lundberg，Anti-cancerDrugDesign(1998)，13:453-461。另請(qǐng)參見U.S.6,306,393;序號(hào)為10/350,096的美國專利申請(qǐng)；序號(hào)為09/590,284的美國專利申請(qǐng)和1999年6月9日提交的序號(hào)為60/138,284的美國專利申請(qǐng)。所有這些參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合入本文。多種診斷劑和治療劑可有利地用于形成所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的軛合物，或者可連接至與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)上的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合的半抗原。診斷劑可包括放射性同位素、用于MRI的增強(qiáng)劑或用于超聲成像的造影劑和熒光化合物。許多合適的顯像劑，以及它們與蛋白質(zhì)或肽的連接方法在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?例如，請(qǐng)參見美國專利5,021,236和4,472,509,其均通過引用結(jié)合入本文)。某些連接方法包括金屬螯合絡(luò)合物的使用，例如，使用有機(jī)螯合劑(如連接至蛋白質(zhì)或肽的DTPA)的復(fù)合體(美國專利4,472，509)。為了向穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)加載放射性金屬離子或順磁離子，可能需要先讓該結(jié)構(gòu)與連接了多個(gè)拷貝的用于結(jié)合放射性金屬離子或順磁離子的螯合基團(tuán)的載體反應(yīng)。此載體可為多聚賴氨酸、多糖或者具有側(cè)基的衍生多聚物或可衍生多聚物，所述側(cè)基可結(jié)合已知可用于此用途的螯合基團(tuán)，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、口卜啉、多胺、冠醚、雙-縮氨基硫脲、聚將(polyoximes)等。包含螯合劑的載體可通過使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法來以最小化聚集和免疫活性損失的方式偶聯(lián)至所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)?？捎糜谥苽浯祟愜椇衔锏钠渌^為不常見的方法和試劑公開于U.S.4,824,659,其通過引用整體結(jié)合入本文。特別有用的金屬-螯合劑組合包括2-苯甲基-DTPA及其單甲基類似物和環(huán)己基類似物，它們可與60-4,000keV的總能量范圍內(nèi)的診斷性同位素配合使用。一些有用的診斷性核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111111。當(dāng)與本發(fā)明公開的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)和載體一起使用時(shí)，與非放射性金屬(如錳、鐵和釓)絡(luò)合的相同螯合劑可用于MRI。大環(huán)螯合劑，如NOTA、DOTA和TETA，可用于多種金屬和射電金屬，特別是分別用于鎵、釔和銅放射性核素。通過根據(jù)目標(biāo)金屬調(diào)節(jié)環(huán)的大小，可使此類金屬-螯合劑絡(luò)合物非常穩(wěn)定?？墒褂闷渌h(huán)類型的螯合劑，如用于絡(luò)合223Ra的大環(huán)聚酯。例如，治療劑包括化療藥物，如長(zhǎng)春堿類、蒽環(huán)類、表葉毒素(epidophyllotoxin)、紫杉烷類、抗代謝物、烷化劑、抗生素、Cox-2抑制劑、抗有絲分裂劑、抗血管生成劑和促凋亡劑，特別是來自這些和其他抗癌劑類別的阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-ll、喜樹堿和其他物質(zhì)及類似物。其他癌癥化療藥物包括氮芥類、烷基磺酸鹽、亞硝基脲類、三氮烯類、葉酸類似物、嘧，定類似物、噤呤類似物、鉑配合物、激素及類似物。合適的化療劑請(qǐng)參見REMINGTON'SPHARMACEUTICALSC正NCES(雷明頓氏藥物科學(xué))，第19版(MackPublishingCo.1995)以及GOODMANANDGILMAN，STHEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS(GOODMAN和GILMAN的治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ))，第7版(MacMillanPublishingCo.1985),以及這些出版物的修訂版。其他合適的化療劑(如實(shí)驗(yàn)藥)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知，并可用本領(lǐng)域所知的方法軛合至本文所迷的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。另一類治療劑由發(fā)射a-粒子(如212Pb、mBi、213Bi、211At、223Ra、225Ac)、J3-粒子(如32p、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90Y、mAg、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、188Re、189Re)或俄歇電子(如mIn、125I、67Ga、191Os、193mPt、195mPt、195mHg)的放射性核素組成。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可使用上述一個(gè)或多個(gè)放射性核素進(jìn)行標(biāo)記，方法同診斷劑所用方法。包含可檢測(cè)標(biāo)記(如萸光分子)或細(xì)胞毒劑(如放射性碘)的合適的肽可以共價(jià)、非共價(jià)或其他方式與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)締合。例如，可通過將光敏劑或染料結(jié)合在穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)上以獲得可用于治療的軛合物。熒光組合物(如焚光染料)和其他對(duì)可見光敏感的顯色劑或染料(如卟啉)已經(jīng)用于檢測(cè)和治療病變，方法是用合適的光照射病變部位。在治療中，這被稱為光輻射、光療法或光動(dòng)力療法。請(qǐng)參見Jori等編，PHOTODYNAMICTHERAPYOFTUMORSANDOTHERDISEASES(肺瘤和其他疾病的光動(dòng)力療法)(LibreriaProgetto1985);vandenBergh，Chem.Britain(1986)，22:430。此外，還將單克隆抗體與光活化染料偶聯(lián)以實(shí)現(xiàn)光療法。請(qǐng)參見Mew等，J.Immunol.(1983),130:1473;idem.,CancerRes.(1985)，45:4380;Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744;idem.，Photochem.Photobiol.(1987)，46:83;Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288:471;Tatsuta等，LasersSurg.Med.(1989),9:422;Pelegrin等，Cancer(1991),67:2529。還包括內(nèi)窺鏡或腹腔鏡應(yīng)用。內(nèi)窺鏡檢測(cè)和治療方法請(qǐng)參見U.S.4,932，412;U.S.5,525,338;U.S.5,716,595;U.S.5,736,119;U.S.5，922,302;U.S.6,096,289;和U.S.6,387,350，其均通過引用整體結(jié)合入本文。在某些實(shí)施方案中，本文公開的新構(gòu)建體和方法可用于靶向遞送RNAi進(jìn)行治療性干預(yù)。遞送載體可以是以融合至人精蛋白(~50個(gè)氨基酸殘基的肽)的內(nèi)化抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為前體的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。使用的a2構(gòu)建體的實(shí)例為VH-CHl-hPl-DDDl〃VL-CL或VH-CHl-hP2-DDDl〃VL-CL，其中hPl和hP2分別為人精蛋白1和人精蛋白2;二者均可在體內(nèi)應(yīng)用中形成穩(wěn)定的DNA復(fù)合體(NatBiotechnol.23:709-717,2005;GeneTherapy.13:194-195，2006)。使用的a4構(gòu)建體的實(shí)例為VH-CHl-hPl-DDD2〃VL-CL或VH-CHl-hP2-DDD2〃VL-CL，其可提供四個(gè)活性Fab片段，每個(gè)片段均攜帶人精蛋白以與RNAi結(jié)合。該多價(jià)復(fù)合體將有利于與靶細(xì)胞的結(jié)合以及受體介導(dǎo)的內(nèi)化進(jìn)入靶細(xì)胞的作用，其中非共價(jià)結(jié)合的RNAi在內(nèi)體中解離并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。因?yàn)椴簧婕把趸€原化學(xué)，所以hPl或hP2中存在的3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵并不會(huì)產(chǎn)生問題。除了遞送RNAi之外，這些構(gòu)建體還可用于靶向遞送治療基因或DNA疫苗。此技術(shù)的另一應(yīng)用領(lǐng)域是制備胞內(nèi)抗體，胞內(nèi)抗體是RNAi在功能方面的蛋白質(zhì)類似物。治療劑秀務(wù)效合務(wù)在某些實(shí)施方案中，可向受治療者(如有癌癥的受治療者)施用穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)和/或一個(gè)或多個(gè)其他治療劑。此類試劑可以藥物組合物的形式施用。一般而言，這必須制備成基本不含對(duì)人或動(dòng)物有害的雜質(zhì)的組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，藥物組合物可通過各種途徑施用至受治療者，例如，所述途徑包括口服或腸胃外(如靜脈內(nèi))。在某些實(shí)施方案中，必須向受治療者施用有效量的治療劑。"有效量"是產(chǎn)生所需效應(yīng)的試劑量。有效量將取決于，例如，該試劑的效力和預(yù)期的效果。例如，與癌癥治療中要減小或消滅實(shí)體腫瘤、或者阻止或減少其轉(zhuǎn)移所需的量相比，治療增生狀況(如黃斑變性或子宮內(nèi)膜異位癥)可能需要較少量的抗血管生成劑。具體用途中特定試劑的有效量可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來確定。在某些實(shí)施方案中，可施用化療劑。有用的抗癌化療劑包括但不限于5-氟尿嘧啶、博萊霉素、白消安、喜樹堿、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑(CDDP)、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、雌激素受體結(jié)合劑、足葉乙甙(VP16)、法尼西基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、甲氨蝶呤、絲裂霉素、諾維本、亞硝基脲、plicomycin、甲基節(jié)肼、雷洛昔芬、三苯氧胺、紫杉醇、替莫唑胺(temazolomide)(DTIC的水化形式)、反鉑(transplatinum)、長(zhǎng)春堿和甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿或前述化合物的任何類似物或衍生物。有用的抗傳染性生物體的化療劑包括但不限于，阿昔洛韋、阿苯達(dá)唑、金剛烷胺、阿米卡星、阿莫西林、兩性霉素B、氨芐西林、氨曲南、阿奇霉素、桿菌肽、復(fù)方新諾明(bactrim)、Batrafen(巴特芬)、聯(lián)苯千唑、羧千青霉素、卡泊芬凈、頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢菌素、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟、氯霉素、西多福韋、Cipro(環(huán)丙沙星)、克拉霉素、克拉維酸、克霉唑、氯唑西林、強(qiáng)力霉素、益康唑、紅環(huán)化素(erythrocycline)、紅霉素、滅滴靈、氟康唑、氟胞嘧咬、膦甲酸、呋喃唑酮、更昔洛韋、慶大霉素、亞胺培南、異煙肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑酮、美羅培南、咪康唑、米諾環(huán)素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奧司他韋、苯唑西林、巴龍霉素、青霉素、戊烷脒、哌4立西林-他唑巴坦、利福布汀、利福平、金剛乙胺、鏈霉素、磺胺甲噁唑、柳氮磺胺吡啶、四環(huán)素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、甲氧千咬磺胺曱噁唑、萬乃洛韋、萬古霉素、扎那米韋(zanamir)和阿奇霉素?；焺┖褪┯梅椒?、劑量等對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知(例如，請(qǐng)參見"PhysiciansDeskReference"(醫(yī)師用藥參考)、古德曼和吉爾曼的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"(治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ))和"Remington'sPharmaceuticalSciences"(雷明頓氏藥物科學(xué))，其相應(yīng)部分通過引用結(jié)合入本文)。必須根據(jù)治療的受治療者的狀況對(duì)劑量進(jìn)行一些調(diào)整。在任何情況下，負(fù)責(zé)給藥的人員都必須根據(jù)具體受治療者確定合適的劑量。糖皮質(zhì)激素可增加其他化療劑的效力，因此它們經(jīng)常用于聯(lián)合治療。糖皮質(zhì)激素的實(shí)例如潑尼松和地塞米松。孕激素，如己酸羥孕酮、乙酸曱羥孕酮和乙酸甲地孕酮，已用于治療子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌。雌激素，如二乙基己烯雌酚和炔雌醇，已用于治療前列腺癌等癌癥?？勾萍に兀缛窖醢?，已用于治療乳腺癌等癌癥。雄激素，如丙酸睪酮和氟羥甲睪酮也已用于治療乳腺癌。業(yè)#4彭尸辦在某些實(shí)施方案中，可使用抗血管生成劑，如制管張素、baculostatin、血管能抑素、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體、抗PIGF肽和抗體、抗血管生長(zhǎng)因子抗體、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體和肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、血纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、千擾素、白介素-12、IP-IO、Gro-P、血小板反應(yīng)素、2-曱氧雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、羧酰胺三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、Marimastat(馬立馬司他)、戊聚糖多^^酸鹽、血管形成素-2、干擾素a、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide(利諾胺)、沙利度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、TNP-470、內(nèi)皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管張素、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博萊霉素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。如此處所用，術(shù)語"免疫調(diào)節(jié)劑"包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素和造血因子，如白介素、集落刺激因子、干擾素(例如，干擾素-a、-P和-y)和命名為"S1因子"的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。合適的免疫調(diào)節(jié)劑部分的實(shí)例包括IL-2、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素y、TNF-a及類似物。術(shù)語"細(xì)胞因子"是由一個(gè)細(xì)胞群體釋放的、作為細(xì)胞間介導(dǎo)物而作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)或肽的總稱。如此處廣泛所用，細(xì)胞因子的實(shí)例包括淋巴因子、單核因子、生長(zhǎng)因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素，如人生長(zhǎng)激素、N-曱硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；曱狀旁腺激素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如卵泡刺激素(FSH)、甲狀腺刺激素(TSH)和黃體生成素(LH);肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；前列腺素、成纖維生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤催乳素、OB蛋白；腫瘤壞死因子-a和-卩；苗勒抑制物質(zhì)(mullerianinhibitingsubstance);鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整合素；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子，如NGF-P;血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，如TGF-a和TGF-P;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；干擾素，如干擾素-a、-P和^;集落刺激因子(CSF)，如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)，如IL國1、IL-la、IL-2、IL-3、IL誦4、IL隱5、IL誦6、IL國7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12;IL-13、IL國14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、G-CSF、GM誦CSF、M-CSF、EPO、kit配體或FLT-3、制管張素、血小板反應(yīng)素、內(nèi)皮抑制素、腫瘤壞死因子和LT。如此處所用，術(shù)語細(xì)胞因子包括自然來源或者重組細(xì)胞培養(yǎng)物來源的蛋白質(zhì)和天然序列細(xì)胞因子的生物活性等同物。趨化因子一般充當(dāng)化學(xué)引誘物，以將免疫效應(yīng)細(xì)胞募集到趨化因子表達(dá)位點(diǎn)。趨化因子包括但不限于，RANTES、MCAF、MIPl-a、MIPl-卩和IP-IO。熟練的技術(shù)人員了解，某些細(xì)胞因子已知同樣具有化學(xué)引誘效應(yīng)，并可歸于術(shù)語趨化因子下。相似地，術(shù)語免疫調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞因子各自的成員也有重疊。^##^在#浴《弄放#龍瘦浴#在某些實(shí)施方案中，所述肽和/或蛋白質(zhì)可用于;^射性核素治療或;^文射免疫治療方法(例如，請(qǐng)參見Govindan等，2005，7fec/mo/ogyz力C朋ceri^ea/r/2&rrea加e加，4:375-91;Sharkey和Goldenberg,2005，J.M/d.她t/.46:115S-127S;Goldenberg等(JClinOncol2006;24:823-834)，"AntibodyPre-targetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy"(抗體預(yù)輩巴向改善了癌癥的》文射免疫4企測(cè)和i文射免疫治療)，其均通過引用結(jié)合入本文)。在特定實(shí)施方案中，穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可直接用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記并施用至受治療者。在替代實(shí)施方案中，一種或多種放射性同位素可用上述預(yù)靶向方法施用，使用了在施用定位于病組織中表達(dá)升高的部位的雙特異性穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)之后放射性標(biāo)記并注射的半抗原肽或配體?？捎糜谥委煵〗M織的放射性同位素包括但不限于mIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、mAg、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、，Au和川Pb。治療性放射性核素的衰變能優(yōu)選在20-6,000keV范圍內(nèi)，俄歇輻射源的衰變能優(yōu)選為60-200keV范圍內(nèi)，p輻射源的衰變能優(yōu)選為100-2,500keV,a輻射源的衰變能優(yōu)選為4,000-6,000keV。有用的P粒子輻射核素的最大衰變能優(yōu)選為20-5,000keV，更優(yōu)選地為100-4,000keV,最優(yōu)選地為500-2,500keV?；旧贤ㄟ^輻射俄歇粒子進(jìn)行衰變的放射性核素也是優(yōu)選的。例如，Co國58、Ga國67、Br-80m、Tc-99m、Rh畫103m、Pt國109、In-lll、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的P粒子輻射核素的衰變能優(yōu)選為<1,000keV，更優(yōu)選地為<100keV,最優(yōu)選地為<70keV?；旧贤ㄟ^產(chǎn)生a-粒子進(jìn)行衰變的放射性核素也是優(yōu)選的。此類放射性核素包括葉旦不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn誦219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的a-粒子輻射的》文射性核素的衰變能優(yōu)選為2,000-10,000keV，更優(yōu)選地為3,000-8,000keV，最優(yōu)選地為4,000-7,000keV。例如，由于具有61.5小時(shí)的半衰期并供應(yīng)大量(3粒子和Y射線，67Cu被視為放射免疫治療的一種更有前景的放射性同位素，其可通過使用螯合劑p-溴乙酰^^-卡基-四乙胺四乙酸(TETA)軛合至蛋白質(zhì)或肽。替代地，放射含能P粒子的9GY，可通過使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)偶聯(lián)至肽、抗體、融合蛋白或其片段。其他可用的放射性同位素包括"C、13N、150、75Br、198Au、224Ac、1261、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51G、59Fe、75Se、201T1、225Ac、76Br、169Yb及類似同位素。在另一實(shí)施方案中，可使用放射增敏劑。添加放射增敏劑可導(dǎo)致效力增強(qiáng)。放射增敏劑描述于D.M.Goldenberg編，CANCERTHERAPYWITH(1995),其通過引用整體結(jié)合入本文。具有用于熱中子活化治療的硼附加物(boronaddend)負(fù)載載體的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)通常有幾種起效方式。但是，在執(zhí)行中子輻照之前，最好等待非定位免疫軛合物清除完畢?？墒褂门c所述配體結(jié)合的抗體來加速清除。有關(guān)此基本原理的描述，請(qǐng)參見第4,624,846號(hào)美國專利。例如，可在抗體上連接硼附加物(如碳硼烷)。如本領(lǐng)域公知的，可以制備在側(cè)鏈具有羧基官能的碳硼烷。碳硼烷與載體(如氨基葡聚糖)的連接可通過激活碳硼烷的羧基并與載體上的胺縮合來實(shí)現(xiàn)。然后將此中間輒合物軛合至所述抗體。施用所述軛合物之后，硼附加物被熱中子輻照激活并轉(zhuǎn)化為放射性原子，后者通過(X輻射進(jìn)行衰變，產(chǎn)生高毒性的短程作用。試劑盒不同實(shí)施方案可包括含有適合用于治療或診斷受治療者病組織的組分的試劑盒。示例性試劑盒可包含至少一種穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。如果包含施用成分的組合物未制成通過消化道(如通過口服)遞送，則試劑盒還可包括能夠通過其他途徑遞送試劑盒組分的設(shè)備。一種用于腸胃外遞送等的設(shè)備類型為注射器，其用于將所述組合物注射到受治療者體內(nèi)。也可使用吸入設(shè)備。所述試劑盒組分可包裝在一起或者分開包裝在兩個(gè)或更多獨(dú)立的容器中。在某些實(shí)施方案中，所述容器可以是包含適合重建(reconstitution)的組合物的無菌、凍干制劑的管形瓶。試劑盒還可包含適用于重建和/或稀釋其他試劑的一種或多種緩沖液。其他可使用的容器包括但不限于袋、盤、盒、管或類似容器。試劑盒組分可無菌包裝并保存在所述容器中。可包括的另一組成部分為給使用試劑盒的人員的使用說明。配制和施用所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)(包括其軛合物)可進(jìn)一步進(jìn)行配制以獲得組合物，該組合物包含一種或多種藥學(xué)適宜賦形劑、一種或多種其他成分、或者這些賦形劑和成分的某些組合。這些可通過制備藥學(xué)有用劑型的已知方法實(shí)現(xiàn)，其中有效成分(即所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)或軛合物)與一種或多種藥學(xué)適宜賦形劑組合成混合物。無菌的磷酸鹽緩沖液即為藥學(xué)適宜賦形劑的一個(gè)實(shí)例。其他合適的賦形劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知。例如，請(qǐng)參見Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS(藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng))，第5版(Lea&Febiger1990),和Gennaro編，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(雷明頓氏藥物科學(xué))，第18版(MackPublishingCompany1990)，及其4務(wù)訂版本。本文所迷組合物的優(yōu)選施用途徑為腸胃外注射。在腸胃外注射中，所述組合物將與藥學(xué)可接受賦形劑一起制成單位劑量可注射形式，如溶液、懸浮液或乳劑。此類賦形劑本身無毒，并且無治療作用。此類賦形劑的實(shí)例有生理鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。也可使用非水相賦形劑，如脂肪油和油酸乙酯。優(yōu)選的賦形劑為5%葡萄糖生理鹽水溶液。賦形劑可包含少量添加劑，如增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，包括緩沖液和防腐劑。還考慮其他給藥方法，包括口服給藥。包含穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的配制組合物可用于靜脈內(nèi)施用，例如通過推注或連續(xù)輸注。用于注射的組合物可與添加的防腐劑以單位劑量形式提供在例如安瓿或多劑量容器中。組合物還可采取諸如油相或水相介質(zhì)的懸浮液、溶液或乳劑的形式，并可包含制劑用劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。替代地，所述組合物可以是粉末形式，以便在使用前用合適介質(zhì)(例如，無菌無熱原水)構(gòu)成制劑。所述組合物可以溶液形式施用。該溶液的pH應(yīng)在pH5-9.5范圍內(nèi)，優(yōu)選為pH6.5-7.5。其制劑應(yīng)為具有合適的藥學(xué)可接受緩沖液的溶液，所述藥學(xué)可接受緩沖液如磷酸、三鞋曱基氨基甲烷-鹽酸或檸檬酸鹽等。緩沖液濃度應(yīng)在1-100mM范圍內(nèi)。配制的溶液還可包含鹽類，如濃度為50-150mM的氯化鈉或氯化鉀。還可包括有效量的穩(wěn)定劑，如甘油、白蛋白、球蛋白、去污劑、明膠、精蛋白或精蛋白鹽。如果所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)使用抗體的人源化形式作為模板，則配制的組合物的全身用藥通常為每?jī)商旎蛉爝M(jìn)行或者一周一次。替代地，可以每天施用。通常的施用方式為肌肉注射或血管內(nèi)輸注。所述組合物可通過皮下或其他腸胃外途徑施用至哺乳動(dòng)物。此外，可通過連續(xù)輸注或者單次或多次推注施用。對(duì)抗體或免疫軛合物有用的方法可用于本文所述組合物。一般而言，人的免疫輒合物、融合蛋白或^果抗體施用劑量取決于諸如受治療者年齡、體重、身高、性別、總體健康狀況和先前的治療歷史等因素。通常情況下，需要向受體提供約1mg/kg至20mg/kg范圍內(nèi)的有效成分劑量作為單次靜脈內(nèi)輸注，但是也可根據(jù)情況需要施用更低或更高的劑量。可按需要重復(fù)此劑量，例如，每周一次，持續(xù)4-10周；優(yōu)選為每周一次，持續(xù)8周；更優(yōu)選地，每周一次，持續(xù)4周。給藥頻率也可降低，如每?jī)芍芤淮?，持續(xù)若干個(gè)月?？赏ㄟ^不同的腸胃外途徑給藥，并相應(yīng)調(diào)整劑量和用藥時(shí)間。在不同示例性實(shí)施方案中，對(duì)于抗體、抗體片段或融合蛋白施用，可用的劑量范圍為100-500mg，200-1000mg,500-2000mg，100-250mg，250-500mg,500-1000mg,或已知的其他范圍?？蓪?duì)本文所述的配制組合物應(yīng)用用于控制免疫軛合物或抗體作用持續(xù)時(shí)間的藥學(xué)方法。控釋制劑可通過使用生物相容性聚合物絡(luò)合或者吸附所述免疫軛合物或棵抗體來實(shí)現(xiàn)，例如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基質(zhì)和硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酸酐共聚物基質(zhì)。請(qǐng)參見Sherwood等，Bio/Technology(1992)，10:1446。免疫軛合物或抗體從此基質(zhì)上釋放的速率取決于該免疫軛合物或抗體的分子量、基質(zhì)內(nèi)的免疫軛合物或抗體量和分散粒子的大小。請(qǐng)參見Saltzman等，Biophys.J(1989)，55:163;Sherwood等，同上。其他固體劑型描述于Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS(藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng))，第5版(Lea&Febiger1990)，和Ge皿aro編，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(雷明頓氏藥物科學(xué))，第18版(MackPublishingCompany1990)，及其修訂版本。用于治療目的時(shí)，所述組合物以治療有效量施用至哺乳動(dòng)物。本文公開的治療和診斷方法的合適受治療者通常為人，但也包括非人動(dòng)物受治療者，如哺乳動(dòng)物、貓、狗、馬、豬、山羊、牛、羊駝、-膝駝或綿羊。本文公開的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)在序號(hào)為09/590,284的美國專利申請(qǐng)(待通過)公開的治療自身免疫疾病方法中特別有用，該專利申請(qǐng)于2000年6月9日提交，題為"ImmunotherapyofAutoimmuneDisordersusingAntibodiesthatTargetB-Cells"(使用靶向B細(xì)胞的抗體治療自身免疫疾病的免疫療法)，其通過引用整體結(jié)合入本文。包含此類結(jié)合結(jié)構(gòu)的組合物優(yōu)選采用靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施用方式，劑量為20-5000mg。還可使用鼻內(nèi)或其他非腸胃外施用途徑。組合物還可通過微球、脂質(zhì)體或置于某些組織(包括血液)內(nèi)的其他樣t?；f送系統(tǒng)施用。所述組合物可通過氣溶膠施用，以實(shí)現(xiàn)定位遞送到肺部?？墒褂盟鄽馊苣z或非水相(如氟碳推進(jìn)劑)懸浮液。制備氣溶膠時(shí)優(yōu)選使用聲波噴霧器，以最大限度減少組合物中的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)暴露于剪切力，那樣會(huì)導(dǎo)致其降解和活性的損失。一般而言，施用劑量取決于諸如受治療者年齡、體重、身高、性別、總體健康狀況和先前的治療歷史等因素。優(yōu)選向患者施用飽和劑量的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。通常情況下，需要向受體提供劑量約50-500毫克范圍內(nèi)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，但是也可根據(jù)情況需要而施用更低或更高的劑量。劑量實(shí)例包括單位劑量20-1500毫克蛋白、單位劑量20-500毫克蛋白、單位劑量20-100毫克蛋白、單位劑量20-1000毫克蛋白、單位劑量100-1500毫克蛋白。在所述組合物包含放射性核素的實(shí)施方案中，劑量可以毫居里測(cè)量。對(duì)于^Y，劑量可為15-40mCi、10-30mCi、20-30mCi或10-20mCi。連接放射性核素的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)對(duì)于治療微生物引起的疾病特別有效。確定所述穩(wěn)定"f全結(jié)結(jié)構(gòu)定位于受治療者體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)感染部位之后，注射較高劑量的所迷標(biāo)記組合物，一般為單位劑量20mCi至150mCi(1311)，單位劑量5mCi至30mCi(90Y),或者單位劑量5mCi至20mCi(186Re)，均基于患者體重為70kg。可采取靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、淋巴管內(nèi)、鞘內(nèi)、或腔內(nèi)(即腸胃外)注射，并可重復(fù)注射。對(duì)于某些治療，可有利地采取多次、分劑量的施用方式，以提供較高的微生物毒性劑量，而不會(huì)引起通常情況下發(fā)生的正常組織的輻射相應(yīng)增加的情況。未化學(xué)連接至所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的化療劑、抗菌劑、細(xì)胞因子、粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素及類似物，可在所述組合物之前、之后或者與所迷組合物同時(shí)施用。替代地，此類試劑可連接至所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。a2b形式的穩(wěn)定^t全結(jié)結(jié)構(gòu)特別適合用作預(yù)靶向劑。示例性結(jié)構(gòu)將由兩個(gè)scFv或Fab亞基組成，其作為與把組織或細(xì)胞雙價(jià)結(jié)合的a2，以及一個(gè)scFv或Fab亞基作為與半抗原結(jié)合的b。可先將此雙特異性三價(jià)結(jié)構(gòu)施用至受治療者，任選地可接著施用清除劑，然后施用連接了功能劑的半抗原，所述功能劑如診斷用的可檢測(cè)標(biāo)記，或治療方法所用的治療劑。熟練的技術(shù)人員了解，已知的使用雙特異性抗體的其他方法也可使用所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)來實(shí)施。這些診斷和治療方法基本上可用于其中已使用基于抗體的試劑進(jìn)行診斷或治療的任何場(chǎng)合。如下文所述，雙特異性六價(jià)穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)也可用于和雙特異性三價(jià)結(jié)構(gòu)相同的目的。治療和診斷用途不涉及預(yù)靶向的應(yīng)用所述穩(wěn)定^t全結(jié)結(jié)構(gòu)(包括其軛合物)適合用于多種使用抗體或免疫軛合物并且不需要預(yù)靶向的治療和診斷應(yīng)用。例如，所述三價(jià)結(jié)構(gòu)可作為"棵"構(gòu)建體、以與棵抗體的治療相同的方式用于治療，即此結(jié)構(gòu)未扼合其他功能試劑的實(shí)施方案。替代地，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)被一種或多種功能劑衍生化，以實(shí)現(xiàn)診斷或治療應(yīng)用。如上所迷，其他試劑可共價(jià)連接至穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。還包括連接至所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的放射性和非放射性診斷劑的用途。合適的非放射性診斷劑是那些用于磁共振成像(MRI)、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)或超聲的診斷劑。例如，MRI劑包括與合適的螯合劑(如2-千基-DTPA及其單甲基類似物和環(huán)己基類似物)絡(luò)合的非放射性金屬，如錳、鐵和釓。請(qǐng)參見2001年10月10日提交的序號(hào)為09/921,290的美國專利申請(qǐng)，其通過引用整體結(jié)合入本文?？墒褂糜兄谶M(jìn)行診斷成像的放射性同位素標(biāo)記所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。合適的放射性同位素可包括處于60-4,000KeV能量范圍內(nèi)的同位素，或者更具體地，18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、45Ti、mIn、123I、124I、125I、mI、154.158Gd、177Lu、32P、188Re及類似的同位素或其組合。例如，請(qǐng)參見題為"LabelingTargetingAgentswithGallium-68"(使用鎵-68標(biāo)記定位劑)的美國專利申請(qǐng)(發(fā)明人G.L.Griffkhs和W.J.McBride),和第60/342,104號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)，其公開了用于成像的正電子輻射源，如18F、68Ga、94mTc及類似物；二者均通過引用整體結(jié)合入本文。例如，可通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(SPECT)或正電子發(fā)射斷層顯像(PET)進(jìn)行檢測(cè)。也可應(yīng)用于外科手術(shù)期間的診斷，以鑒定隱蔽的新生腫瘤。在另一實(shí)施方案中，可使用一種或多種有效殺傷贅生性或其他快速分裂細(xì)胞的》丈射性同位素標(biāo)記所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，所述放射性同位素包括|3-輻射源(如32p、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90Y、mAg、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、188Re、189Re),俄歇電子輻射源(如111111、125I、67Ga、1910s、193mPt、195mPt、195mHg),a-輻射源(如"2pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac),或其組合。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可通過連接一種或多種成像增強(qiáng)劑而用于MRI,所述成像增強(qiáng)劑可包括選自由鉻(ni)、錳(n)、鐵(ni)、鐵(n)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、銣(m)、釤(ni)、鐿(m)、釓(in)、釩(n)、鋱(m)、鏑(in)、鈥(in)和鉺(m)組成的組的金屬的絡(luò)合物。相似地，所述穩(wěn)定4全結(jié)結(jié)構(gòu)可通過連接一種或多種市售的成像增強(qiáng)劑而用于超聲成像。第6,331,175號(hào)美國專利介紹了MRI技術(shù)和輒合MRI增強(qiáng)劑的抗體的制備，其通過引用整體結(jié)合入本文。功能蛋白(如毒素)可以多種方式存在于所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)中。例如，通過與DDD2或AD2融合，功能蛋白可充當(dāng)所迷二元復(fù)合體的任一組分的前體，然后DDD2或AD2與靶向?qū)嶓w復(fù)合，分別構(gòu)成例如Fab/AD2或Fab/DDD2。替代地，功能蛋白可融合至靶向結(jié)構(gòu)以充當(dāng)A的前體，所得A可任選地與合適的B配對(duì)?？捎糜诖擞猛镜亩舅匕ū吐槎舅亍⑾嗨级苟舅?、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、金葡菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素和綠膿桿菌內(nèi)毒素。例如，請(qǐng)參見Pastan.等，Cell(1986)，47:641和Goldenberg,CA隱ACancerJournalforClinicians(1994)，44:43。適合用于本發(fā)明的其他毒素對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知并描述于U.S.6,077,499，其通過引用整體結(jié)合入本文。其他值得關(guān)注的功能蛋白包括各種細(xì)胞因子、溶栓劑(clot-dissolvingagent)、酶和焚光蛋白。本發(fā)明還提供了通過按上文所述方法向受治療者施用"棵"穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)，以治療該受治療者的腫瘤性疾病的方法，所述穩(wěn)定纟全結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)中至少有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)與選自由以下組成的組的抗原結(jié)合碳酸酐酶IX、曱胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba733、BrE3抗原、CA125、癌胚抗原(CEACAM5)、CEACAM6、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原p(CSAp)、EGFR、EGP-1、EGP-2、Flt-l、Flt-3、葉酸受體、HER2/neu、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素、Ia、IL-2、IL國6、IL-8、胰島素樣生長(zhǎng)因子、KC4抗原、KS-1、KSl-4、Le(y)、巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、壞死抗原、p53結(jié)合抗原、PAM-4抗體、胎盤生長(zhǎng)因子、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TlOl、TAC、TAG-72、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肺瘤壞死抗原、生腱蛋白、TRAIL受體、ED-B纖連蛋白、VEGF、17-lA抗原、血管生成標(biāo)志物、致癌基因標(biāo)志物或致癌基因產(chǎn)物?？筎RAIL受體(如TRAIL-R1和TRAIL-R2)的抗體在本領(lǐng)域?yàn)楣?例如，請(qǐng)參見Georgakis等，Br.J.Haematol.2005,130:501-510;Mori等，F(xiàn)EBSLett.2005,579:5379-84)。所述腫瘤性疾病可選自由癌組織、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病和黑色素瘤組成的組?？砂邢虻哪[瘤的示例類型包括急性成淋巴細(xì)胞白血病、急性脊髓白血病、膽管癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性脊髓白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲狀腺髓樣癌、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌和尿膀胱癌。還提供了通過向受治療者施用一個(gè)或多個(gè)劑量的治療性組合物來治療受治療者的B細(xì)胞惡性腫瘤、或B細(xì)胞免疫或自身免疫疾病的方法，所述組合物包含上文所述的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)和藥學(xué)可接受載體，其中每個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位。所述治療組合物可按單位劑量20-1500毫克蛋白、或單位劑量20-500毫克蛋白、或單位劑量20-100毫克蛋白的劑量進(jìn)行腸胃外施用。受治療者可接受單位劑量20-100毫克蛋白的重復(fù)腸胃外用藥，或者單位劑量20-1500毫克蛋白的重復(fù)腸胃外用藥。在這些方法中，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)的亞組分可用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，如32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、90Y、mAg、mIn、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac，或其組合。還提供了通過為受治療者施用診斷性組合物來檢測(cè)或診斷受治療者的B細(xì)胞惡性腫瘤、或B細(xì)胞免疫或自身免疫疾病的方法，所述診斷性組合物包含穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)(其中每個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位)，藥學(xué)可接受載體，和選自由"F、52Fe、62Cu、64Qi、67Qi、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、mIn、123I、124I、125I、131I、154—158Gd、177Lu、32P、45TH。188Re,或其組合組成的組的放射性核素。可按上文所述通過SPECT或PET進(jìn)行檢測(cè)。還可應(yīng)用于外科手術(shù)期間的診斷，以鑒定隱蔽的新生肺瘤。本發(fā)明還提供了通過向受治療者施用診斷性組合物來檢測(cè)或診斷受治療者的B細(xì)胞惡性肺瘤、或B細(xì)胞免疫或自身免疫疾病的方法，所述診斷性組合物包含穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)(其中每個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位)，藥學(xué)可接受載體和用于磁共振成像(MRI)的一種或多種成^f象增強(qiáng)劑。所述成^3曾強(qiáng)劑可選自上文所述增強(qiáng)劑。本發(fā)明還提供了通過向受治療者施用穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)來診斷和/或治療非腫瘤性疾病的方法，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)上連接了可檢測(cè)標(biāo)記或治療劑，并且有特定于該疾病標(biāo)志物的一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。所述疾病或病癥可由真菌或病毒引起，所述真菌如小孢子菌屬、發(fā)癬菌屬、表皮癬菌屬、申克氏孢子絲菌、新型隱球菌、粗球孢子菌、莢膜組織胞漿菌、皮炎芽生菌和白色念球菌；所述病毒如人類免疫缺陷病毒(HIV)、皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙臺(tái)病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人類血清細(xì)小病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺紳瘤病毒、水痘-帶狀皰滲病毒、登革病毒、風(fēng)滲病毒、麻滲病毒、腺病毒、人T細(xì)胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、小鼠白血病病毒、腮4泉炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德畢斯病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒和藍(lán)舌病毒。所述疾病或病癥可由細(xì)菌引起，如炭疽桿菌、無乳鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、化膿性鏈球菌、大腸桿菌、淋球奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌B、梅毒螺旋體、萊姆病螺旋體、銅綠假單胞菌、麻風(fēng)分枝桿菌、流產(chǎn)布魯氏菌和結(jié)核分枝桿菌，或支原體。所述疾病或病癥可由寄生蟲引起，如疾疾。所述疾病或病癥可為自身免疫疾病，如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜皮肌炎、西德納姆氏舞蹈病、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風(fēng)濕熱、多腺體綜合征、大皰性類天皰瘡、糖尿病、過敏性紫癜、鏈球菌感染后腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、Takayasu's動(dòng)脈炎、艾迪生氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、強(qiáng)直性脊推炎、肺出血腎炎綜合征、thromboangitisubiterans、Sjogren氏綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本曱狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、曱狀腺功能亢進(jìn)、硬皮病、慢性活動(dòng)性肝炎、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰瘡、韋格納肉芽腫、膜性腎病、肌萎縮側(cè)索硬化、脊髓癆、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球腎炎、牛皮癬和纖維性肺泡炎。所述疾病或病癥可為心力幾梗死、缺血性心臟病、或動(dòng)"永粥樣;更化斑塊、或移植排斥反應(yīng)、或阿爾茨海默氏病、或由特應(yīng)性組織引起的疾病。所述疾病或病癥可為活化的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞或巨噬細(xì)胞在炎癥部位合生而引起的炎癥，并且該炎癥由傳染劑引起。此外，也可使用穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)靶向表達(dá)特定受體或者過表達(dá)受體的細(xì)胞，其中A或B組分包含該受體的配體，此配體可指導(dǎo)所述結(jié)構(gòu)與攜帶所述受體的細(xì)胞結(jié)合。所述結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)亞基可融合或者輒合至治療劑或診斷劑，以允許診斷和治療方法。治療和診斷用途涉及預(yù)靶向的應(yīng)用預(yù)靶向是最初為了解決直接靶向抗體血液清除慢而開發(fā)的多步驟過程，直接靶向抗體對(duì)正常組織(特別是骨髓)有不良毒性。在預(yù)耙向中，放射性核素或其他治療劑連接至可在幾分鐘內(nèi)從血液中清除的小化合物。先施用能夠識(shí)別放射標(biāo)記的小化合物和耙抗原的預(yù)耙向劑；當(dāng)所述預(yù)耙向劑稍后從血液中充分清除時(shí)再施用所述放射標(biāo)記化合物。預(yù)靶向方法的開發(fā)目的是增加檢測(cè)或治療劑的靶:本底比率。預(yù)靶向和生物素/親和素方法的實(shí)例請(qǐng)參見，例如，Goodwin等，第4,863,713號(hào)美國專利；Goodwin等，J.Nucl.Med.29:226，1988;Hnatowich等，J.Nucl.Med.28:1294，1987;Oehr等，J.Nucl.Med.29:728，1988;Klibanov等，J.Nucl.Med.29:1951,1988;Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30:66，1989;Kalofonos等，J.Nucl.Med.31:1791,1990;Schechter等,Int.J.Cancer48:]67，1991;Paganelli等，CancerRes.51:5960,1991;Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12:211,1991;第5,256,395號(hào)美國專利；Stickney等，CancerRes.51:6650,1991;Yuan等，CancerRes.51:3119,1991;第6,077,499號(hào)美國專利；美國序號(hào)09/597,580;美國序號(hào)10/361,026;美國序號(hào)09/337,756;美國序號(hào)09/823,746;美國序號(hào)10/116,116;美國序號(hào)09/382,186;美國序號(hào)10/150,654;第6,090,381號(hào)美國專利；第6，472,511號(hào)美國專利；美國序號(hào)10/114,315;第60/386,411號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)；第60/345,641號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)；第60/3328,835號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)；第60/426,379號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)；美國序號(hào)09/823,746;美國序號(hào)09/337,756;笫60/342,103號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng);和第6,962,702號(hào)美國專利，其均通過引用結(jié)合入本文。在特定的、非限制性實(shí)例中，基于所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的預(yù)靶向劑包含特定于CEA的兩個(gè)相同的腫瘤抗原結(jié)合位點(diǎn)和特定于組胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)半抗原的第三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在替代實(shí)施方案中，可使用相同或不同的半抗原靶向不同的腫瘤相關(guān)抗原。在預(yù)靶向應(yīng)用中，所述可乾向劑可為脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體脂膜的外表面共價(jià)連接了雙價(jià)HSG-肽。所述脂質(zhì)體可充氣作為對(duì)照，或者可填充治療劑或it斷劑。治療或診斷受治療者的疾病或病癥的預(yù)靶向方法提供如下Cl)向該受治療者施用上述雙特異性三價(jià)或六價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中第一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)針對(duì)特定于所述病癥的一種或多種標(biāo)志物，且第二個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)針對(duì)包含雙價(jià)半抗原的可靶向構(gòu)建體；(2)任選地向該受治療者施用清除組合物，并允許該組合物將所述結(jié)合結(jié)構(gòu)從循環(huán)中清除；和(3)向該受治療者施用所述包含雙價(jià)半抗原的可靶向構(gòu)建體，其中所述可耙向構(gòu)建體進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)螯合或者化學(xué)結(jié)合的治療劑或診斷劑。所述疾病或病癥可為上文所述疾病或病癥。本發(fā)明還提供了抗體依賴性酶前體藥物療法(ADEPT),具體為(l)按上文所述方法向患有腫瘤性疾病的患者施用結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中該結(jié)構(gòu)包含共價(jià)連接的、能夠激活前體藥物的酶，(2)任選地向該受治療者施用清除組合物，并允許該組合物將所述結(jié)合結(jié)構(gòu)從循環(huán)中清除，和(3)向該患者施用所述前體藥物。其他用途一般而言，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可替換為表現(xiàn)出治療癌癥或非癌疾病效力的基于抗體的試劑。眾所周知，放射性同位素、藥物和毒素可軛合至特異性結(jié)合癌癥細(xì)胞產(chǎn)生的或與癌癥細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物的抗體或抗體片段，并且此類抗體軛合物可用于將放射性同位素、藥物或毒素靶向至腫瘤部位，以增強(qiáng)其治療效力并最大限度減少副作用。Wawrzynczak和Thorpe(IntroductiontotheCellularandMolecularBiologyofCancer(癌癥6勺纟田月包和分子生物學(xué)介紹)，L.M.Franks和N.M.Teich編，第18章，第378-410頁,OxfordUniversityPress.Oxford,1986),Immunoconjugates(免疫輒合物)(選自"AntibodyConjugatesinRadioimagingandTherapyofCancer"(癌癥》丈射顯^象和治療中的抗體扼合物)，C.W.Vogel編，3-300,OxfordUniversityPress,N.Y.,1987)，和Dillman，R.O.(CRCCriticalReviewsinOncology/Hematology1:357,CRCPress,Inc.,1984)對(duì)這些試劑和方法進(jìn)行了綜述。另請(qǐng)參見Pastan等，Cell(1986),47:641;Vitetta等，Science(1987)，238:1098-1104;和Brady等，Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.(1987),13:1535-1544。在某些實(shí)施方案中，可使用多價(jià)穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)對(duì)正?；蚣膊〗M織和器官進(jìn)行治療和/或成像，例如，使用下列專利中介紹的方法第6,126,916;6,077,499;6,010,680;5,776,095;5,776,094;5,776,093;5,772,981;5,753,206;5,746,996;5,697,902;5,328,679;5,128,119;5,101,827;和4,735,210號(hào)美國專利，其均通過引用結(jié)合入本文。其他方法請(qǐng)參見1999年6月22日提交的序號(hào)為09/337,756的美國專利申請(qǐng)和2001年4月3日^t是交的序號(hào)為09/823,746的美國專利申請(qǐng)。此成像可通過直接標(biāo)記所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)或者通過預(yù)耙向成像方法執(zhí)行，請(qǐng)參見Goldenberg等，"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadiotherapy"(抗體予貞革巴向？文善了癌癥的放射免疫檢測(cè)和放射治療)，(發(fā)行中，J.Clin.Oncol.)，另請(qǐng)參見第20050002945，20040018557，20030148409和20050014207號(hào)美國專利公布，其均通過引用結(jié)合入本文。已公開了使用免疫軛合物治療癌癥的其他實(shí)例和其他治療形式，尤其是在下列美國專利中4,331,647、4,348,376、4,361,544、4,468,457、4,444,744、4,460,459、4,460,5614,624,846、4,818,709、4,046,722、4,671,958、4,046,784、5,332,567、5,443,953、5,541,297、5,601,825、5,635,603、5,637,288、5,677,427、5，686,578、5,698，178、5，789，554、5，922,302、6,187,287和6,319,500。這些方法還可通過用本發(fā)明的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)代替工程抗體和前述方法的抗體，而用于本文所7>開的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開和要求保護(hù)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可用于放射性核素治療或》t射免疫治療方法(例如，請(qǐng)參見Govindan等，2005，TechnologyinCancerResearch&Treatment,4:375-91;Sharkey和Goldenberg,2005,J.Nucl.Med.46:115S-127S;Goldenberg等(發(fā)行中，J.Clin.Oncol.)，"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy"(抗體預(yù)乾向改善了癌癥的》丈射免疫才全測(cè)和;^射免疫治療)，其均通過引用結(jié)合入本文)。在另一實(shí)施方案中，放射增敏劑可與棵露或輒合的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)、抗體或抗體片段組合使用。例如，所述放射增敏劑可與放射標(biāo)記的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)組合使用。與單獨(dú)使用放射標(biāo)記的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)進(jìn)行治療相比，加入放射增敏劑可增強(qiáng)效力。放射增敏劑請(qǐng)參見D.M.Goldenberg編，CANCERTHERAPYWITHRADIOLABELEDANTIBOD正S(使用放射標(biāo)記抗體治療癌癥)，CRCPress(1995),其通過引用整體結(jié)合入本文。用于要求保護(hù)的任何方法的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)均可連接抗菌劑或者與其一起施用。用于要求保護(hù)的任何方法的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)均可締合細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑或者與其一起施用。這些細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑至少包括a、P和y干擾素以及集落刺激因子。本發(fā)明公開的方法還可使用穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)以刺激患者的免疫反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定^f全結(jié)結(jié)構(gòu)可保護(hù)抗獨(dú)特型抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(ABS)。此類穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可模擬腫瘤相關(guān)抗原的表位，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可用于許多目前使用抗體的免疫程序。這些程序包括使用抗獨(dú)特型抗體和表位軛合抗體，以激發(fā)免疫系統(tǒng)。請(qǐng)參見第5,798,100;6,090,381和6,132,718號(hào)美國專利。抗獨(dú)特型抗體還用作抗癌癥和傳染性疾病的疫苗。請(qǐng)參見第6,440,416和6,472,511號(hào)美國專利。此外，多特異性三聚或六聚結(jié)合結(jié)構(gòu)可結(jié)合多藥運(yùn)輸?shù)鞍撞⒖朔?xì)胞和病原體的多藥抗性表型。這些方法中的抗體可替換為本發(fā)明公開的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。不同的實(shí)施方案涉及治療自身免疫疾病癥狀的方法。在所述方法中，穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)施用至患有自身免疫疾病的患者，其在施用前可與藥學(xué)可接受載體混合。此方法中的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)應(yīng)包含至少一個(gè)能特異性結(jié)合B細(xì)胞或T細(xì)胞抗原表位的ABS。所述B細(xì)胞抗原可為CD22,且所迷表位可為CD22和其他抗原的A表位、B表位、C表位、D表位和E表位。所述B細(xì)胞相關(guān)抗原也可是另一細(xì)胞抗原，如CD19、CD20、HLA-DR和CD74。所述T細(xì)胞抗原可包括CD25。在某些實(shí)施方案中，可選擇用于治療自身免疫疾病的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)與IL-17結(jié)合。所述ABS可包含類人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、鼠單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人來源的序列。例如，所迷ABS可來源于人源化LL2(抗CD22)、人源化LL1(抗CD74)或人源化A20(抗CD20)單克隆抗體。所述施用方式可為腸胃外，劑量為單位劑量20-2000mg?？芍貜?fù)施用，直至癥狀得到一定程度的減輕。所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，如人類、靈長(zhǎng)類、馬科、犬科和貓科。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可用于治療抵抗或耐受全身化療的疾病。這些疾病包括各種病毒、真菌、細(xì)菌和原生動(dòng)物感染，以及特定的寄生蟲感染。病毒感染包括由流感病毒、皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒和巨細(xì)胞病毒、狂犬病毒(Rhabdoviridae)、乳頭瘤病毒和乳多空病毒引起的感染，這些感染均難以通過全身施用抗生素/細(xì)胞毒劑進(jìn)行治療。使用多價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)可提供更高的靶病毒親和力，進(jìn)而顯著提高治療指數(shù)。使用放射性同位素(并包括可用熱中子激活的硼附加物)標(biāo)記的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的軛合物進(jìn)行靶向放射免疫治療，提供了抗病毒治療的新方法?？捎帽景l(fā)明所述方法進(jìn)行治療的原生動(dòng)物包括，例如癥原蟲(特別是瘧疾寄生物惡性瘧原蟲)、剛地弓形蟲(弓形體病的傳染劑)、利什曼原蟲(利什曼病的傳染劑)和溶組織內(nèi)大腸桿菌(Escherichiahistolytica)。使用所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可顯著增強(qiáng)對(duì)各個(gè)階段的癡疾的檢測(cè)和治療。與子孢子抗原結(jié)合的單克隆抗體(mAb)為已知。但是，由于血液期的寄生蟲不具有子孢子抗原，因此使用此類針對(duì)子孢子抗原的mAb進(jìn)行定位只能局限于剛剛注射完畢并且在宿主肝細(xì)胞中發(fā)展之前，所述子孢子自由存在于循環(huán)中的相對(duì)較短的時(shí)間。因此，優(yōu)選使用可以靶向原生動(dòng)物C如P.falciparum)多于一個(gè)的寄生時(shí)期的mAb，這可通過使用具有多特異性的一個(gè)或多于一個(gè)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)。使用軛合物可提供進(jìn)一步的好處，如使用99mTc進(jìn)行成像，或者如使用^At或抗瘧藥(如乙胺嘧啶)進(jìn)行治療。弓形體病也不能使用全身化療。尚不清楚特異性結(jié)合T.gondii的mAb或天然的宿主抗體能否在對(duì)弓形體病的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，但是對(duì)于癥原蟲而言，合適定位的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可成為遞送治療劑的有效載體。廣泛流行的寄生蟲感染病血吸蟲病是由一些淡水螺類攜帶的自由游動(dòng)的尾蚴(cercariae)引起的。對(duì)于癥疾而言，其傳染過程涉及不同階段的尾蚴。能結(jié)合多個(gè)階段的尾蚴、任選地結(jié)合一個(gè)或多個(gè)階段的尾蚴上的多個(gè)表位、并且優(yōu)選為多特異性組合物形式的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，可軛合至顯像劑或治療劑，以進(jìn)行有效的定位和增強(qiáng)治療效力?？芍苽浣Y(jié)合克氏錐蟲(即查格斯病的病原體)的一個(gè)或多個(gè)形式的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，并將其用于此微生物傳染病的檢測(cè)和治療。與此錐體蟲不同分化階段的細(xì)胞表面糖蛋白或其他表面抗原反應(yīng)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)適合用于將顯像劑和治療劑定位至機(jī)體內(nèi)的寄生滲透部位?，F(xiàn)有藥物難以治療的另一傳染性生物體為麻風(fēng)桿菌(Mycobacteriuml印rae)?？芍苽涮禺愋越Y(jié)合M.leprae表面的多個(gè)表位的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，并且其可單獨(dú)或組合用于將顯像劑和/或抗生素/細(xì)胞毒劑靶向至該細(xì)菌。蠕蟲寄生傳染病(如類圓線蟲病(Strongyloidosis)和旋毛蟲病(Trichinosis))本身難以用化療劑控制，是穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的合適靶標(biāo)?？墒褂锰禺愋越Y(jié)合所述寄生蟲的多個(gè)表位的合適的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)或軛合物對(duì)其進(jìn)行診斷和治療。特異性結(jié)合引起人類大多數(shù)傳染病的大多數(shù)微生物和寄生蟲的抗體已有市售，或可容易地制得。其中有許多抗體之前已用于體外診斷，并可作為抗體軛合物的組分包含在穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)內(nèi)，以將診斷劑和治療劑靶向至傳染部位。人和哺乳動(dòng)物的微生物病原體和無脊推寄生蟲是具有復(fù)雜生命周期的生物，其在不同階段表達(dá)多種抗原。因此，當(dāng)制備識(shí)別不同形式生物體的抗原決定簇的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)并將其作為混合物或多特異性軛合物(與合適的治療劑連接)組合使用時(shí)，靶向治療可能最為有效。同樣的原理也適用于通過連接顯像劑(例如放射性核素和/或MRI增強(qiáng)劑)，使用包含穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的試劑檢測(cè)感染部位的情況。其他實(shí)施方案涉及通過施用有效量的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)和可靶向構(gòu)建體來手術(shù)定位病組織的方法，其中所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)特異性結(jié)合靶組織的抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且另外至少有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合所述可靶向構(gòu)建體；并且，其中所述至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠與耙細(xì)胞、組織或病原體上的互補(bǔ)結(jié)合部分，或者其產(chǎn)生或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分特異性結(jié)合。另一實(shí)施方案涉及通過施用有效量的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)和施用可靶向構(gòu)建體，來使用內(nèi)窺鏡確定受治療者的病組織的方法。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)特異性結(jié)合靶組織的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)特異性結(jié)合所述可靶向構(gòu)建體的抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且所述至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠與靶細(xì)胞、組織或病原體上的互補(bǔ)結(jié)合部分，或者其產(chǎn)生或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分特異性結(jié)合?？捎玫奶娲鷻z測(cè)方法為無線膠嚢內(nèi)鏡，該方法使用食入性膠嚢攝像機(jī)/檢測(cè)器類型，例如可購自GivenImaging(NorcrossGA)。某些實(shí)施方案包括通過施用有效量的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)和施用可靶向構(gòu)建體，來使用內(nèi)窺鏡確定受治療者的病組織的方法。在此實(shí)施方案中，包含至少一個(gè)特異性結(jié)合耙組織的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)特異性結(jié)合所述可把向構(gòu)建體的抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且所述至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠與耙細(xì)胞、組織或病原體上的互補(bǔ)結(jié)合部分，或者其產(chǎn)生或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分特異性結(jié)合。替代實(shí)施方案涉及通過施用有效量的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)和可耙向構(gòu)建體，來確定受治療者血管內(nèi)的病組織的方法。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)特異性結(jié)合靶細(xì)胞、組織或病原體上的互補(bǔ)結(jié)合部分，或者其產(chǎn)生或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分的抗原結(jié)合位點(diǎn)(ABS)，和至少一個(gè)特異性結(jié)合所述可輩巴向構(gòu)建體的ABS。所述耙組織可為正常組織，如曱狀腺、肝臟、心臟、卵巢、胸腺、甲狀旁腺、子宮內(nèi)膜、骨髓、淋巴結(jié)或脾。一些實(shí)施方案涉及可實(shí)施本發(fā)明要求保護(hù)的方法的試劑盒。該試劑盒可包括可靶向構(gòu)建體。所述可靶向構(gòu)建體可使用試劑標(biāo)記，所述試劑可為適合于上文所述可靶向構(gòu)建體的任何試劑。此外，所述可乾向構(gòu)建體可不進(jìn)行標(biāo)記，〗旦是所述試劑盒可包含標(biāo)記該可靶向構(gòu)建體的標(biāo)記試劑。所述標(biāo)記試劑(如果包括)可包含該標(biāo)記和交聯(lián)劑。所述試劑盒還可包含穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，該穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)特異性結(jié)合所述可耙向構(gòu)建體的ABS和至少一個(gè)特異性結(jié)合靶組織的ABS。所述試劑盒可任選包舍清除組合物，以從循環(huán)中清除穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。應(yīng)定趁錯(cuò)潛溝的乾標(biāo)有關(guān)穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)靶標(biāo)的其他公開內(nèi)容，請(qǐng)參見2004年12月9曰提交的序號(hào)為60/634,076的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)，"MethodsandCompositionsDisease,InfectiousDisease,PathologicAngiogenesisandCancer"(用于對(duì)炎癥和免疫失調(diào)疾病、傳染性疾病、病理性血管生成和癌癥進(jìn)4于免疫治療和檢測(cè)的方法和組分)(Goldenberg等)，其完整內(nèi)容通過引用結(jié)合入本文。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明要求保護(hù)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)與兩個(gè)不同耙標(biāo)發(fā)生特異性反應(yīng)。所述不同靶標(biāo)可包括但不限于，先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，凝血因子，補(bǔ)體因子和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，與炎癥和免疫失調(diào)疾病、與傳染原、或與病理性血管生成和癌癥特異性相關(guān)的靶標(biāo)；其中此后一類輩巴標(biāo)不是免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物或凝血因子。因此，在某些實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)包含至少一種與疾病細(xì)胞、病理性血管生成或癌癥，或者傳染性疾病相關(guān)的結(jié)合特異性，和至少一種對(duì)免疫系統(tǒng)組分的特異性，所述免疫系統(tǒng)組分如B細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的受體或抗原，凝血調(diào)節(jié)劑(如凝血酶或組織因子)，或者促炎細(xì)月包因子(如IL-1、IL-6、IL-IO、HMGB-1和MIF)。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可為棵的，但也可軛合至診斷顯像劑(例如，同位素、放射造影劑)或軛合至治療劑，所述治療劑包括放射性核素、硼化合物、免疫調(diào)節(jié)劑、肽、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、酶抑制劑、光敏治療劑、細(xì)胞毒劑、血管生成抑制劑和其組合。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)與輩巴標(biāo)的結(jié)合可下調(diào)或以其他方式影響免疫細(xì)胞的功能，但是所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)也可與不直接影響免疫細(xì)胞功能的其他乾標(biāo)結(jié)合。例如，抗粒細(xì)胞(如抗CD66或CEACAM6)抗體(例如NCA90或NCA95)不但可用于乾向感染組織中的粒細(xì)胞，而且還可用于耙向表達(dá)CEACAM6的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑為寡核苷酸。例如，所述寡核香酸可為反義寡核苷酸或雙鏈干擾RNA(RNAi)分子。所述寡核苷酸可針對(duì)致癌基因，如bcl國2或p53。第5,734,033號(hào)美國專利中描述了抑制bcl-2表達(dá)的反義分子。它可軛合至穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的治療劑部分，或形成該治療劑部分。替代地，所述寡核苷酸可與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)同時(shí)或在其后施用。在另一實(shí)施方案中，所述治療劑為硼附加物，并且在定位所述治療劑之后，必須通過熱或超熱中子照射進(jìn)行治療。所述治療劑還可為光敏治療劑，尤其是顯色劑或染料。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療劑為細(xì)胞毒劑，如藥物或毒素。還優(yōu)選的是，所述藥物選自由以下組成的組氮芥類、乙撐亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲類、吉西他濱、三氮烯類、葉酸類似物、蒽環(huán)類、紫杉烷類、COX-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶、酶抑制劑、表鬼臼毒素、鉑配合物、長(zhǎng)春堿類、取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺抑制劑、激素拮抗劑、內(nèi)皮抑制素、紫杉醇、SN38、喜樹堿、阿霉素及其類似物、抗代謝物、烷化劑、抗有絲分裂劑、抗血管生成劑、凋亡劑、甲氨蝶呤、CPT-ll及其組合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療劑為選自包含動(dòng)物、植物和微生物的組的來源的毒素。優(yōu)選毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、a毒素、肥皂草蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、金葡菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素和綠膿桿菌內(nèi)毒素。所述治療劑可為免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子、千細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、千擾素(IFN)、千細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素和其組合，所述淋巴毒素為腫瘤壞死因子(TNF)。所述造血因子可為白介素(IL)，所述集落刺激因子可為粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)，所述干擾素可為干擾素-a、P或y，所述干細(xì)胞生長(zhǎng)因子可為Sl因子。替代地，所述免疫調(diào)節(jié)劑可包含IL-1、IL-2、IL-3、IL國6、IL-IO、IL國12、IL-17、IL國18、IL-21、干擾素-y、TNF-a,或其組合。優(yōu)選的治療放射性核素包括keV范圍為80-500keV的P、a和俄歇輻射源。治療放射性同位素的示例包括3￥、33P、47Sc、125I、131I、86Y、90Y、186Re、188Re、189Re、64Cu、67Cu、67Ga、mIn、mAg、、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、198Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra和225Ac和其組合。光敏治療劑示例選自包含顯色劑和染料的組。還優(yōu)選地，所述治療劑為選自包含蘋果酸脫氳酶、金黃色葡萄球菌核酸酶、S-V-甾體異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、a-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、p-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氳酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、糖化酶和乙酰膽堿酯酶的組的酶。治療劑肽的各種實(shí)例在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?，并且任何此類已知試劑均可使用。示例性治療肽包括但不限于，激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子、結(jié)合肽、封閉肽、毒素、血管生成因子、抗血管生成因子、抗生素、抗癌肽、抗病毒肽、藥物肽、酶、激動(dòng)劑、拮抗劑、造血?jiǎng)?如促紅細(xì)胞生成素)和許多其他臨床有用化合物。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可與至少一個(gè)促炎效應(yīng)細(xì)胞因子、促炎效應(yīng)趨化因子或促炎效應(yīng)受體特異性結(jié)合?？膳c所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)結(jié)合的促炎效應(yīng)細(xì)胞因子包括但不限于，MIF、HMGB-1、TNF-a(肺瘤壞死因子a)、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL國12、IL-15、IL-17和IL畫18。促炎效應(yīng)趨化因子包括但不限于，CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1(單核細(xì)胞趨化蛋白1)、RANTES、MIP-1A(巨噬細(xì)胞炎性蛋白1A)、MIP-1B(巨噬細(xì)胞炎性蛋白1B)、ENA-78(上皮中性粒細(xì)胞激活肽78)、IP-10、GROB(GRO卩)和Eotaxin(嗜酸粒細(xì)胞趨化因子)。促炎效應(yīng)受體包括但不限于，IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R和IL-18R。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)還可與至少一個(gè)凝血因子(如組織因子或凝血酶)特異反應(yīng)。所述淋巴因子/細(xì)胞因子與其在免疫細(xì)胞上的受體反應(yīng)，以影響激活，而抗體可通過中和該淋巴因子/細(xì)胞因子來阻止激活。替代地，抗體可與所述淋巴因子/細(xì)胞因子受體反應(yīng)以阻止激活。的效應(yīng)物和凝血因子。例如，與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)不同靶標(biāo)可選自相同類別的效應(yīng)物或凝血因子，如兩個(gè)或多個(gè)不同的促炎效應(yīng)細(xì)胞因子、兩個(gè)或多個(gè)不同的促炎效應(yīng)趨化因子、兩個(gè)或多個(gè)不同的促炎效應(yīng)受體或者兩個(gè)或多個(gè)不同的凝血因子。替代地，所述兩個(gè)或多個(gè)不同靶標(biāo)可選自不同類別的效應(yīng)物和凝血因子。例如，一個(gè)把標(biāo)可為先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，而另一個(gè)靶標(biāo)可為凝血因子?；蛘咚龇€(wěn)定4全結(jié)結(jié)構(gòu)可與兩個(gè)不同類別的促炎效應(yīng)物特異反應(yīng)，如至少一個(gè)促炎效應(yīng)細(xì)胞因子和至少一個(gè)促炎效應(yīng)趨化因子，至少一個(gè)促炎效應(yīng)細(xì)胞因子和至少一個(gè)促炎效應(yīng)受體或者至少一個(gè)促炎效應(yīng)趨化因子和至少一個(gè)促炎效應(yīng)受體。還可以是如下情況與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)特異反應(yīng)的兩個(gè)不同靶標(biāo)為先天免疫系統(tǒng)中同一促炎效應(yīng)物的多于一個(gè)的表位，或者同一凝血因子的多于一個(gè)的表位。因此，"兩個(gè)不同靶標(biāo)"可指兩個(gè)不同的抗原或同一抗原的兩個(gè)不同表位?？蓪?duì)同一抗原使用多個(gè)抗體，進(jìn)而增加價(jià)位。例如，當(dāng)靶向MIF或HMGB-1，尤其是用于治療膿毒癥、某些癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊時(shí)，穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可包含兩個(gè)結(jié)合靶標(biāo)上兩個(gè)相同表位的抗體和具有一個(gè)或多個(gè)對(duì)不同抗原的結(jié)合臂的另一抗體，所述不同抗原如II類HLA恒定鏈抗原，如CD74。所述抗體可選擇為與兩個(gè)不同抗原結(jié)合，如MIF和CD74的抗體；HMGB-1和CD74的抗體。當(dāng)靶向促炎效應(yīng)受體時(shí)，在優(yōu)選實(shí)施方案中，實(shí)際的靶標(biāo)可為該促炎效應(yīng)受體的胞外結(jié)構(gòu)域。在替代實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可包含至少一個(gè)可與促炎效應(yīng)受體反應(yīng)性的分子。該分子可為所述促炎效應(yīng)受體的天然拮抗劑，或者與所述受體特異性相互作用的此拮抗劑的片段或突變體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述天然拮抗劑為天然的IL-1受體拮抗劑，或者此拮抗劑的片段或突變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)可為獲得性免疫系統(tǒng)的抗原或受體。在其他實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)可位于先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞。其他靶標(biāo)包括血小板和內(nèi)皮細(xì)胞。另一組靶標(biāo)為由C5a、LPS、IFNy和B7組成的組。另一組合適靶標(biāo)包括CD2、CD3、CD4、CD14、CD18、CDlla、CD20、CD22、CD23、CD25、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147和CD154。這些CD是免疫細(xì)胞上的革巴標(biāo)，可封閉它們以阻止免疫細(xì)胞反應(yīng)。CD83作為活化樹突狀細(xì)胞的標(biāo)記特別有效(Cao等，5/oc/ie附J.，2004年8月23日(印刷前的電子出版物)；Zinser等，J.五;c;Md200(3):345-51(2004》。某些靶標(biāo)非常值得關(guān)注，如MIF、HMGB-1、TNF-a、補(bǔ)體因子和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白以及凝血因子。MIF是先天性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，并且在控制炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)蛋白最初4皮描述為抑制巨噬細(xì)胞隨機(jī)遷移的、由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的因子，其在近30年的時(shí)間內(nèi)^皮視為神秘的細(xì)胞因子。近年來，MIF為垂體前葉產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)以及生物活性重組MIF蛋白的克隆和表達(dá)使人們清楚了其在體內(nèi)的重要生物作用。MIF具有從糖皮質(zhì)激素刺激的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞釋放的獨(dú)特特性。釋放之后，MIF在體外抵消糖皮質(zhì)激素對(duì)TNF-a、IL-1卩、IL-6和IL-8(由LPS刺激的單核細(xì)胞產(chǎn)生)的抑制作用，并且在體內(nèi)抑制甾體對(duì)內(nèi)毒素血癥的保護(hù)作用。通過恢復(fù)IL-2和IFN-y的產(chǎn)生，MIF還在體外拮抗糖皮質(zhì)激素對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用。MIF是確定可反向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的抑制作用的第一個(gè)調(diào)節(jié)體，因而在炎癥和免疫的宿主控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MIF在治療癌癥、病理性血管生成和膿毒癥或感染性休克方面特別有效。HMGB-1(DNA結(jié)合的核和胞質(zhì)蛋白)是由IL-lp、TNF或LPS激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子。其通過其B盒結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)DC的表型突變。它還造成促炎細(xì)胞因子IL-la、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-a和RANTES分泌增加。壞死細(xì)胞釋放的HMGB-1可能是組織或細(xì)胞受損的信號(hào)，當(dāng)此信號(hào)被DC感知時(shí)，其誘發(fā)和/或增強(qiáng)免疫反應(yīng)。Palumbo等報(bào)道了HMBG1誘導(dǎo)中間成血管細(xì)胞(Mesoangioblast)遷移和增殖C/Ce〃編，64:44卜449(2004))。HMGB-1是內(nèi)毒素致死的晚期調(diào)節(jié)體，與TNF和IL-1卩相比，其表現(xiàn)出顯著延遲的動(dòng)力學(xué)。靶向特異性早期炎癥調(diào)節(jié)體(如TNF和IL-ip)的治療劑單獨(dú)未能證明臨床有效性，但是同時(shí)靶向早期和晚期炎癥調(diào)節(jié)體的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可改善響應(yīng)。靶向HMBG-1的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)在治療關(guān)節(jié)炎，尤其是膠原性關(guān)節(jié)炎方面特別有效。包含HMBG-1的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)還可用于治療膿毒癥和/或感染性休克。Yang等，V&4101:296-301(2004);Kokkola等，/4rt/ntoi/2eM附，48:2052-8(2003);Czura等，J/w/erfZXs，187Suppl2:S391隱6(2003);Treutiger等，J/w^wMed,254:375-85(2003)。TNF-a是參與全身炎癥反應(yīng)和急性期反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。TNF-a由受激的單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放。巨喧細(xì)胞、T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肥大細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞也可在受激后產(chǎn)生TNF-a。其釋放是由幾種其他調(diào)節(jié)體(如白介素-l和細(xì)菌內(nèi)毒素)在損傷過程(如感染造成的損傷)中刺激的。其對(duì)各種器官系統(tǒng)具有多種作用，通常為與白介素-l和-6—起。TNF-a的一個(gè)作用是抑制食欲；因此，治療惡病質(zhì)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)優(yōu)選靶向TNF-a。TNF-a還刺激肝臟的急性期反應(yīng)，導(dǎo)致C反應(yīng)蛋白和多種其他調(diào)節(jié)體的增加。它還是治療膿毒癥或感染性休克的有效靶標(biāo)。補(bǔ)體系統(tǒng)是包括血漿糖蛋白的蛋白酶切(通常由細(xì)胞受體激活)的復(fù)雜級(jí)聯(lián)。"補(bǔ)體級(jí)聯(lián)"是組成型且非特異性的，但是它必須按順序激活才能發(fā)揮功能。補(bǔ)體激活造成單向序列的酶和生物化學(xué)反應(yīng)。在此級(jí)聯(lián)中，特異的補(bǔ)體蛋白C5形成兩個(gè)具有高度活性的炎性副產(chǎn)物C5a和C5b，C5a和C5b可聯(lián)合激活白細(xì)胞。這進(jìn)而激發(fā)許多其他炎性副產(chǎn)物，包括有害細(xì)胞因子、炎性酶和細(xì)胞粘附分子。這些副產(chǎn)物一起可導(dǎo)致許多炎性疾病中見到的組織的破壞。此級(jí)聯(lián)最終導(dǎo)致誘發(fā)炎癥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞趨化作用和調(diào)理作用，以及細(xì)胞裂解。補(bǔ)體系統(tǒng)可通過兩個(gè)不同途徑激活，即經(jīng)典途徑和替代途徑。大多數(shù)補(bǔ)體組分都進(jìn)行了編號(hào)(例如，Cl、C2、C3等)，但是一些則稱為"因子"。一些組分必須經(jīng)過酶切才能激活它們的功能；其他組分則只需形成活性復(fù)合體。經(jīng)典途徑的活性組分包括Clq、Clr、Cls、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a和C4b。替代途徑的活性組分包括C3a、C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D和Properdin(備解素)。每條途徑的最后一步是相同的，并包括組分組裝為膜攻擊復(fù)合體。所述膜攻擊復(fù)合體的活性組分包括C5a、C5b、C6、C7、C8和C9n。雖然穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可耙向補(bǔ)體系統(tǒng)的任何組分，但是其中某些補(bǔ)體組分為優(yōu)選。C3a、C4a和C5a導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放吸引巨噬細(xì)胞、抗體和補(bǔ)體等的趨化因子(如組胺和5-羥色胺)。這些補(bǔ)體組分構(gòu)成一組優(yōu)選靶標(biāo)。另一組優(yōu)選靶標(biāo)包括C3b、C4b和C5b,它們?cè)鰪?qiáng)外源細(xì)胞的吞噬作用。另一組優(yōu)選靶標(biāo)為前兩組的前驅(qū)物組分，即C3、C4和C5。C5b、C6、C7、C8和C9誘導(dǎo)外源細(xì)胞的裂解(膜攻擊復(fù)合體)，并構(gòu)成另一組優(yōu)選靶標(biāo)。像C3a—樣，補(bǔ)體C5a為過敏毒素。它介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并且是誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞釋放抗菌蛋白酶和氧自由基的趨化引誘劑。因此，C5a和其前驅(qū)物C5是特別優(yōu)選的靶標(biāo)。耙向C5不僅影響C5a，還影響啟動(dòng)膜攻擊復(fù)合體組裝的C5b。因此，C5是另一優(yōu)選靶標(biāo)。C3b及其前驅(qū)物C3也是優(yōu)選靶標(biāo)，原因在于經(jīng)典和替代補(bǔ)體途徑均依賴于C3b。三個(gè)蛋白(Cl抑制劑、蛋白h和因子i)影響此因子的水平，因此它們也是本發(fā)明的優(yōu)選靶標(biāo)。補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(如CD46、CD55和CD59)可為所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的結(jié)合靶標(biāo)。凝血因子，特別是組織因子(TF)和凝血酶，也是優(yōu)選靶標(biāo)。TF還稱作組織凝血活酶、cdi42、凝血因子in或因子ni。TF是膜內(nèi)在受體糖蛋白和細(xì)胞因子受體超家族的成員。TF的配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)結(jié)構(gòu)化模塊組成，依據(jù)這些模塊的特征，TF歸為2型細(xì)胞因子受體成員。TF參與凝血蛋白酶級(jí)聯(lián)，并通過在TF的胞外結(jié)構(gòu)域和循環(huán)血凝血因子、絲氨酸蛋白酶因子VII或因子VIIa之間形成高親和力復(fù)合體，啟動(dòng)外部和內(nèi)部凝血級(jí)聯(lián)。然后這些具有酶活性的復(fù)合體激活因子ix和因子x，導(dǎo)致產(chǎn)生凝血酶，并進(jìn)而形成凝血。TF表達(dá)于各種細(xì)胞類型，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，并受1L-1、TNF-a或細(xì)菌脂多糖的誘導(dǎo)。蛋白激酶C參與內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)的細(xì)胞因子激活過程。內(nèi)毒素和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的TF表達(dá)是革蘭氏陰性膿毒癥患者中引發(fā)播散性血管內(nèi)凝血的重要機(jī)制。TF還參與多種非止血功能，包括炎癥、癌癥、腦功能、免疫反應(yīng)和腫瘤相關(guān)性血管生成。因此，依據(jù)本發(fā)明，靶向TF的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)不僅可有效治療凝血病，而且可有效治療膿毒癥、癌癥、病理性血管生成，以及其他免疫和炎性失調(diào)疾病。多種細(xì)胞因子影響TF在多種細(xì)胞中的表達(dá)的能力，以及配體與所述受體結(jié)合的作用表明，凝血途徑和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)之間存在復(fù)雜的相互作用。已報(bào)道配體結(jié)合(因子Vila)產(chǎn)生胞內(nèi)4丐信號(hào)，進(jìn)而表明TF是真正的受體。凝血酶是凝血因子II(凝血酶原)的活性形式；它將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。凝血酶是巨噬細(xì)胞的有效趨化物，并可改變其細(xì)胞因子和花生四烯酸代謝物的產(chǎn)生。它在膿毒癥伴生的凝血病中具有重要作用。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，膿毒癥患者體內(nèi)或施用LPS的動(dòng)物模型內(nèi)激活了凝血系統(tǒng)。雖然已研究了30多年，但是人們對(duì)LPS誘導(dǎo)肝臟毒性的機(jī)制仍知之甚少。現(xiàn)在人們清楚它們包括細(xì)胞和體液調(diào)節(jié)體之間一系列復(fù)雜的順序性相互作用。在同一時(shí)段內(nèi)，革蘭氏陰性全身性膿毒癥和其后遺癥(sequallae)成為主要的健康問題，使用針對(duì)LPS或各種炎癥調(diào)節(jié)體的單克隆抗體的嘗試治療未能成功。同時(shí)耙向凝血酶和至少一個(gè)其他耙標(biāo)的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)解決了膿毒癥臨床治療失敗的問題。在其他實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)與I類MHC、II類MHC或輔助分子(如CD40、CD54、CD80或CD86)結(jié)合。所述穩(wěn)定4全結(jié)結(jié)構(gòu)還可與T細(xì)胞激活細(xì)胞因子或細(xì)胞因子調(diào)節(jié)體(如NF-kB)結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，所述兩個(gè)不同靶標(biāo)之一可為癌癥細(xì)胞受體或癌癥相關(guān)抗原，尤其是選自由以下組成的組的抗原B細(xì)胞系抗原(CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等)、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)、生腱蛋白、HER-2/"ew、EGP-1、EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、NCA66、CEACAM6(癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞粘附分子6)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、甲胎蛋白(AFP)、A3、CA125、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、葉酸受體、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、Ia、EL-2、胰島素樣生長(zhǎng)因子(ILGF)和ILGF受體、KS-1、Le(y)、MAGE、壞死抗原、PAM-4、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、Prl、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、SIOO、TlOl、TAC、TAG72、TRAIL受體和碳酸酐酶IX。與膿毒癥和免疫失調(diào)以及其他免疫疾病相關(guān)的把標(biāo)包括MIF、IL-1、IL-6、IL-8、CD74、CD83和C5aR。已發(fā)現(xiàn)針對(duì)C5aR的抗體和抑制劑改善了患膿毒癥的嚙齒動(dòng)物(Huber-Lang等，E4S五SJ2002;16:1567-1574;Riedemann等，JC7/"/wve^2002;110:101-108)以及患感染性休克和成人呼吸窘迫綜合征的猴(Hangen等，J^rg尺es1989;46:195-199;Stevens等，JC""/m^n986;77:1812-1816)的存活率。因此，對(duì)于膿毒癥而言，所述兩個(gè)不同靶標(biāo)之一優(yōu)選為感染相關(guān)靶標(biāo)，如LPS/C5a。其他優(yōu)選耙標(biāo)包括HMGB-1、TF、CD14、VEGF和IL-6，其均與敗血病或感染性休克相關(guān)。優(yōu)選的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)靶向HMGB-1、TF和MIF中的兩個(gè)或多個(gè)乾標(biāo)，如MIF/TF和麗GB-1/TF。在其他實(shí)施方案中，所述兩個(gè)不同靶標(biāo)之一可為與移植物抗宿主病或移才直排斥反應(yīng)相關(guān)的乾標(biāo)，如MIF(Lo等，S朋eMamwrraM,sp/a""30(6):375-80(2002))。所述兩個(gè)不同靶標(biāo)之一還可為與急性呼吸窘迫綜合征相關(guān)的抗原，如IL-8(Bouros等，PAfCPm/wMeo、4(1):6(2004),與動(dòng)脈粥樣硬化或再狹窄相關(guān)的抗原，如MIF(Chen等，v4rtenac/erJ7zra/wZ)J^wc編，24(4):709-14(2004);與哮喘相關(guān)的抗原，如IL-18(Hata等，M/w/m/朋/，2004年10月11日，出版前的電子出版物)；與肉芽肺病相關(guān)的抗原，如TNF-a(Ulbricht等，^t/^fei^ew附，50(8):2717-8(2004);與神經(jīng)病變相關(guān)的抗原，如氨甲酰EPO(促紅細(xì)胞生成素)(Leist等，SO"ce305(5681):164-5(2004);或與惡病質(zhì)相關(guān)的抗原，如IL-6和TNF-a。其他l巴標(biāo)包括C5a、LPS、IFN-y、B7;CD2、CD4、CD14、CD18、CDlla、CDllb、CDllc、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147、CD154。CD18、CDllb或CDllc的抗體可在一定程度上抑制某些微生物抗原(包括LPS)對(duì)單核細(xì)胞的活化，從而牽涉P2-整合素(Cuzz0la等，.//附m朋o/2000;164:5871-5876;Medvedev等，J/wm/朋/1998;160:4535-4542)。已發(fā)現(xiàn)CD83在巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(GCA)中起作用，該病為影響中型和大型動(dòng)脈(主要是主動(dòng)脈弓的顱外分枝和主動(dòng)脈本身)的系統(tǒng)性血管炎，該病造成血管狹窄和并發(fā)的組織缺血以及嚴(yán)重的失明、腦卒中和主動(dòng)脈弓綜合征并發(fā)癥(Weyand和Goronzy，W五wg/JA^d2003;349:160-169;Hunder和Valente，來源InflammatoryDiseasesofBloodVessels(血管炎癥疾病)，G.S.Hoffman和C.M.Weyand編，MarcelDekker，NewYork,2002:255-265)。還發(fā)現(xiàn)CD83的抗體可消除人GCA的SCID小鼠模型的血管炎(Ma-Krupa等，JEx/MM2004;199:173-183)，這暗示研究人員，在激活時(shí)表達(dá)CD83的樹突狀細(xì)胞是GCA中重要的抗原加工細(xì)胞。在這些研究中，他們使用了鼠抗CD83Mab(來自ResearchDiagnostics的IgGl克隆HB15e)。TNF家族成員CD154表達(dá)于CD4陽性T淋巴細(xì)胞的表面，并且已報(bào)道CD154的人源化單克隆抗體對(duì)活動(dòng)期系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者有顯著的臨床受益(Grammar等，</C//w/nv"t2003;112:1506-1520)。此外，還有報(bào)道表明此抗體可用于其他自身免疫疾病(Kelsoe,/C//w/wveW2003;112:1480-1482)。事實(shí)上，還報(bào)道此抗體對(duì)難治性特發(fā)性血小板減少性紫癜患者有效(Kuwana等，2004;103:1229-1236)。已表明重組白介素-1受體拮抗劑、IL-lRa或阿那白滯素(Kineret⑧)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效果(Cohen等，爿朋W/2ewwDw2004;63:1062-8;Cohen，尺/^wwZ^C7/"A^W/2y4w2004;30:365-80)。對(duì)這些受治療者(迄今尚需要進(jìn)行甲氨蝶呤聯(lián)合治療)的治療改進(jìn)是將阿那白滯素與所述一個(gè)或多個(gè)抗促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子或抗促炎效應(yīng)物趨化因子(如上所舉)組合使用。實(shí)際上，在對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗體治療的綜述中，Taylor(Cw/r(9;/"尸/arwaco/2003;3:323-328)提出，除了TNF之外，也可使用針對(duì)此類細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、IL畫8、IL陽15、IL-17和IL-18)的其他抗體。一些更優(yōu)選的靶標(biāo)組合如下所示。此表列出了優(yōu)選組合的實(shí)例，但并非旨在是窮盡性的。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可為包含至少兩個(gè)單獨(dú)的抗體和/或受體或者與所述不同把標(biāo)結(jié)合的它們的配體的混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述輩巴標(biāo)選自由先天性免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物、凝血因子、補(bǔ)體因子和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，以及與炎癥或免疫失調(diào)疾病、與病理性血管生成或癌癥、或者與傳染性疾病特異性相關(guān)的靶標(biāo)組成的組。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可與，如LPS、IL-1、IL-IO、IL-6、MIF、HMGB1、TNF、IFN、組織因子、凝血酶、CD14、CD27和CD134的受體或其乾分子結(jié)合。其中許多蛋白既作為受體也作為在血液中的可溶形式存在。與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的結(jié)合造成其被從血液中快速清除，然后由所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的第二個(gè)組分將其靶向至另一細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)，以進(jìn)行運(yùn)輸并由該細(xì)胞(尤其是溶酶體)進(jìn)行降解。這在所述第二個(gè)靶向組分針對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)化抗原(如CD74)時(shí)特別有效。這與Hansen,第6,458,933號(hào)美國專利公開的內(nèi)容一致，但是集中在炎性細(xì)胞因子和其他免疫調(diào)節(jié)分子，以及免疫失調(diào)疾病的受體和用于免疫治療這些癌癥的癌癥抗原。治療癌癥的優(yōu)選穩(wěn)定^f全結(jié)結(jié)構(gòu)包括針對(duì)CD55和上述任何癌癥抗原的抗體、針對(duì)CD46和上述任何癌癥抗原的抗體、針對(duì)CD59和上述任何癌癥抗原的抗體、針對(duì)MIF和上述任何癌癥抗原的抗體、針對(duì)NF-kB和上述任何癌癥抗原的抗體，以及針對(duì)IL-6和除IL-6外的上述任何癌癥抗原的抗體。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可與一個(gè)或多個(gè)第二治療劑聯(lián)合使用。所述第二治療劑可為影響先天性免疫系統(tǒng)組分的治療劑。替代地，其可影響獲得性免疫系統(tǒng)的組分。所述第二治療劑還可為影響凝血、癌癥或自身免疫疾病的組分，如細(xì)胞毒藥物。具有診斷劑或治療劑的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可作為用于人或哺乳動(dòng)物治療和診斷的試劑盒而提供于藥學(xué)可接受注射介質(zhì)、優(yōu)選為生理pH和濃度的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。所述制品優(yōu)選為無菌的，尤其是當(dāng)其預(yù)定為人用時(shí)。此類試劑盒的任選組分包括穩(wěn)定劑、緩沖液、標(biāo)記試劑、放射性同位素、順磁化合物、增強(qiáng)清除的另一抗體和常規(guī)的注射器、柱、管形瓶等。喧菌體展示在一些替代實(shí)方案中，構(gòu)建DDD和/或AD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合肽可通過本領(lǐng)域公知的噬菌體展示方法確定。例如，與DDD結(jié)構(gòu)域結(jié)合并因而可用天然存在的AD序列取代的肽可通過針對(duì)DDD二聚體的噬菌體展示淘選，并選擇具有高結(jié)合親和力的噬菌體來確定。選擇性或特異性結(jié)合特定檢測(cè)。各種噬菌體展示方法和制備多樣化肽群體的技術(shù)在本領(lǐng)域?yàn)楣?。例如，?,223,409;5,622,699和6,068,829號(hào)美國專利(其均通過引用結(jié)合入本文)公開了制備噬菌體文庫的方法。噬菌體展示技術(shù)包括對(duì)噬菌體進(jìn)行遺傳操作，以使小分子肽可在其表面表達(dá)(Sm池和Scott，1985，Science228:1315-1317;Smith和Scott,1993，Meth,Enzymol.21:228-257)。過去十年見證了噬菌體展示肽文庫構(gòu)建和開發(fā)使用所述文庫分離肽配體的篩選方法的長(zhǎng)足進(jìn)步。例如，肽文庫的使用，使得鑒定許多蛋白的相互作用位點(diǎn)和受體-配體結(jié)合才莫體成為可能，所述蛋白質(zhì)如參與炎性反應(yīng)的抗體或介導(dǎo)細(xì)胞粘附的整合素。此方法還用于確定可充當(dāng)開發(fā)狀才莫擬藥物或顯像劑的前導(dǎo)物的新的肽配體(Arap等，1998a,Science279:377-380)。除了肽之外，大型蛋白結(jié)構(gòu)域(如單鏈抗體)也可在噬菌粒表面展示(Arap等，1998a)。選擇性靶向給定靶標(biāo)分子的靶向氨基酸序列可通過淘選分離(Pasqualini和Ruoslahti,1996，Nature380:364-366;Pasqualini，1999，TheQuart.J.Nucl.Med.43:159-162)。簡(jiǎn)單而言，即將包含假定靶向肽的噬菌體文庫施用至靶分子，然后收集包含結(jié)合噬菌體的樣品。例如，靶分子可連接至96孔板的微滴定孔底部。與耙結(jié)合的噬菌體可洗脫下來，然后可通過在宿主細(xì)菌中培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，可在兩輪淘選之間在宿主細(xì)菌中繁殖所述噬菌體。所述細(xì)菌不是被該噬菌體裂解，而是分泌具有特定插入的多拷貝噬菌體。如杲需要，可再次讓擴(kuò)增的噬菌體接觸所述靶分子，并收集噬菌體進(jìn)行附加輪次的淘選?？蓤?zhí)行多輪淘選，直至獲得選擇性或特異性結(jié)合的群體。所述肽的氨基酸序列可通過對(duì)噬菌體基因組中該靶向肽的插入部分的DNA進(jìn)行測(cè)序來確定。所鑒定的靶向肽然后可通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)生成為合成肽(Arap等，1998a;Smith等，1985)。適體在某些實(shí)施方案中，用于形成構(gòu)建體的前體可包含適體。構(gòu)建適體和確定其結(jié)合特性的方法在本領(lǐng)域?yàn)楣?。例如，此類技術(shù)可參見第5,582,981、5,595,877和5,637,459號(hào)美國專利，其均通過引用結(jié)合入本文。適體可通過任何已知的方法(包括合成、重組和純化方法)制備，并可單獨(dú)使用或者與同一靶標(biāo)的其他特異性配體組合使用。一般而言，最少約3個(gè)核苷酸，優(yōu)選地至少5個(gè)核苷酸是影響特異性結(jié)合所必需的。雖然序列短于10個(gè)城基的適體是可行的，但是優(yōu)選10、20、30或40個(gè)核香酸的適體。適體需要包含決定結(jié)合特異性的序列，但是可通過側(cè)翼區(qū)域進(jìn)行延長(zhǎng)或者通過其他方式進(jìn)行衍生。在優(yōu)選實(shí)施方案中，適體結(jié)合序列的側(cè)翼可帶有引物結(jié)合序列，以便通過PCR或其他擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增所述適體。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述側(cè)翼序列可包含特異序列，該特異序列優(yōu)選識(shí)別或結(jié)合能夠增強(qiáng)所述適體對(duì)底物的固定作用的部分。適體可像常規(guī)DNA或RNA分子一樣進(jìn)行分離、測(cè)序和/或擴(kuò)增或合成。替代地，所述適體可包含經(jīng)過修飾的低聚物。適體內(nèi)通常包含的任何羥基都可替換為膦酸酯基、磷酸基團(tuán)，用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)，或者被激活以生成與其他核苷酸的連接，或者軛合至固體載體。一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯連接可替換為替代連接基團(tuán)，如P(O)O替換為P(O)S、P(0)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR2,其中R為H或烷基(1-20C),且R'為烷基(1-20C);此外，此基團(tuán)可通過o或s連接至相鄰核苷酸。低聚物中的所有連接不必全部相同。制備和篩選與感興趣的特定耙標(biāo)結(jié)合的適體的方法為公知，例如請(qǐng)參見第5,475,096號(hào)美國專利和第5,270，163號(hào)美國專利，其均通過引用結(jié)合入本文。該方法一般包括從候選適體混合物中進(jìn)行選擇和逐步重復(fù)結(jié)合、分離結(jié)合適體與未結(jié)合適體以及擴(kuò)增。由于所述混合物中僅有少量序列(也許僅有一個(gè)適體分子)具有最高的親和力，因此通常需要設(shè)定分離標(biāo)準(zhǔn)，以便分離過程中混合物中能夠保留大量適體(約5-50%)。每個(gè)循環(huán)都富集對(duì)靶標(biāo)具有高親和力的適體?？芍貜?fù)3-6個(gè)選擇和擴(kuò)增循環(huán)以制備高親和力和特異性結(jié)合所述靶標(biāo)的適體。Avimer在某些實(shí)施方案中，本文所述前體、組分和/或復(fù)合體可包含一個(gè)或多個(gè)avimer序列。Avimer是親和力和特異性有些類似于抗體的、針對(duì)不同靶分子的一類結(jié)合蛋白。它們是通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人胞外受體結(jié)構(gòu)域生成的(Silverman等，2005，Nat:Biotechnol.23:1493-94;Silverman等，2006,Nat.Biotechnol.24:220)。得到的多結(jié)構(gòu)域蛋白可包含多個(gè)獨(dú)立的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與單表位結(jié)合蛋白相比，此蛋白可表現(xiàn)出更高的親和力(某些情況下為次納摩)和特異性。(W.)例如，在不同實(shí)施方案中，avimer可連4婁至例如AD和/或DDD序列，以用于本發(fā)明要求保護(hù)的方法和組分。有關(guān)構(gòu)建和使用avimer的方法的其他詳情，請(qǐng)參見，例如，第20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384號(hào)美國專利申請(qǐng)公布，其實(shí)施例部分均通過引用結(jié)合入本文。蛋白質(zhì)和肽多種多肽或蛋白質(zhì)可用于本發(fā)明要求保護(hù)的方法和組分范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)可包含抗體或包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。在其他實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)或肽可為效應(yīng)分子，如酶、激素、細(xì)胞因子、結(jié)合蛋白或毒素。如此處所用，蛋白質(zhì)、多肽或肽泛指但不限于大于約200個(gè)氨基酸、最大為從基因翻譯的全長(zhǎng)序列的蛋白質(zhì)；大于約IOO個(gè)氨基酸的多肽；和/或大約3個(gè)到大約IOO個(gè)氨基酸的肽。方便起見，術(shù)語"蛋白質(zhì)"、"多肽"和"肽"在本文可交替使用。因此，術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"肽"包括包含至少一種天然存在蛋白中發(fā)現(xiàn)的20種常見氨基酸或者至少一種修飾或罕見氨基酸的氛基酸序列。如此處所用，"氨基酸殘基"指本領(lǐng)域已知的任何天然存在的氨基酸、任何M酸衍生物或任何氨基酸模擬物。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)或肽的殘基是連續(xù)的，沒有中斷所述氨基酸殘基序列的任何非氨基酸。在其他實(shí)施方案中，所述序列可包含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸部分。在特定實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)或肽的殘基序列可被一個(gè)或多個(gè)非氨基酸部分中斷。因此，術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"肽"包括包含至少一種天然存在蛋白中發(fā)現(xiàn)的20種常見氨基酸或者至少一種修飾或罕見氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、(3-丙氨酸、P-氨基-丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、Y-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、鎖鏈素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基天冬酰胺、羥賴氨酸、另'J-羥賴氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、異鎖鏈素、另"-異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-曱基異亮氨酸、6-N-曱基賴氨酸、N-曱基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。替代地，所述蛋白質(zhì)或肽可在天然存在的L-氨基酸之外包含一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸，或用一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸取代天然L-氨基酸。例如，包含D-氨基酸的肽的制備方法公開于例如第20050025709號(hào)美國專利申請(qǐng)公布(McBride等，2004年6月14日提交)。蛋白質(zhì)或肽可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)制備，所述技術(shù)包括通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽，從天然來源中分離蛋白質(zhì)或肽，或化學(xué)合成蛋白質(zhì)或肽。不同基因相應(yīng)的核苦酸和蛋白質(zhì)、多肽、肽序列已公開，并可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫中找到。其中一類數(shù)據(jù)庫為美國國家生物技術(shù)信息中心的Genbank數(shù)據(jù)庫和GenP印t數(shù)據(jù)庫。已知基因的編碼區(qū)可使用本文公開的，或者本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增和/或表達(dá)。替代地，蛋白質(zhì)、多肽和肽的各種市售制品對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知。應(yīng)模擴(kuò)制備多肽的另一實(shí)施方案為使用肽模擬物。模擬物是模擬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的含狀分子。例如，請(qǐng)參見Johnson等，"PeptideTurnMimetics"(肽轉(zhuǎn)角才莫擬物)，選自S/(97^C//M〕L<9G}047VD尸/^4臉MCr，Pezzuto等編，ChapmanandHall,NewYork(1993),其通過引用結(jié)合入本文。使用肽模擬物的原理在于，蛋白質(zhì)肽骨架的存在主要是為了定位氨基酸側(cè)鏈以促進(jìn)分子間相互作用，如抗體和抗原的相互作用。肽才莫擬物預(yù)期允許類似于天然分子的分子間相互作用。這些原理可用于改造具有本發(fā)明公開的結(jié)合肽的許多天然特性、但是某些特征發(fā)生改變或者得到改進(jìn)(如胃或腸的吸收增加，和/或體內(nèi)穩(wěn)定性或活性增加)的二代分子。不同實(shí)施方案可包含融合蛋白。這些分子通常是將肽的整體或其實(shí)質(zhì)部分通過N-或C-末端連接至另一多肽或蛋白質(zhì)的整體或部分。例如，融合可使用其他物種的前導(dǎo)序列，以實(shí)現(xiàn)蛋白在異源宿主中的重組表達(dá)。另一有用的融合包括添加免疫活性結(jié)構(gòu)域，如抗體表位。另一有用的融合形式可包括連接可用于純化的部分，如FLAG表位(Prickett等，1989,說otec/m,^7:580-589;Castrucci等，1992,/Mra/66:4647-4653)。融合蛋白的另一用途包括構(gòu)建本發(fā)明要求保護(hù)的拴結(jié)復(fù)合體的組分，例如提供與第一個(gè)單體連接的DDD序列和與第二個(gè)單體連接的AD序列。制備融合蛋白的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知。例如，此類蛋白可通過以下方法制備使用雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)連接，從頭合成完整的融合蛋白，或者將編碼第一個(gè)蛋白或肽的DNA序列連接至編碼第二個(gè)蛋白或肽的DNA序列，然后表達(dá)完整的融合蛋白，如下文的實(shí)施例所示。可根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液中或在固體載體上完整或者部分合成蛋白質(zhì)或肽。各種自動(dòng)合成儀已經(jīng)上市，并可按已知的實(shí)驗(yàn)方案使用。例如，請(qǐng)參見Stewart和Young(1984,So/Wi^o^Pe/"cfeS，Ae^y(固相肽合成)，第2版，PierceChemicalCo,);Tam等(1983，</爿w.C/e附，Soc，105:6442);Merrifield(1986，&/ewce,232:341-347);以及Barany和Merrifield(1979,T7iei^/7"'cfes(肽)，Gross和Meienhofer編,AcademicPress,NewYork,第1-284頁)。此類方法可很容易地合成較短的肽序列，通常從約6個(gè)氨基酸，直到約35-50個(gè)氨基酸。替代地，可使用重組DNA技術(shù)，即將編碼感興趣的肽的核香酸序列插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，然后在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)。肽施用本發(fā)明要求保護(hù)的方法和/或組分的不同實(shí)施方案可涉及施用至受治療者的一種或多種基于肽的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。施用可采取本領(lǐng)域已知的任何途徑，包括但不限于口服、經(jīng)鼻、經(jīng)口、吸入、直腸、陰道、局部、原位、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。未修飾的肽口服施用至受治療者時(shí)可在消化道內(nèi)被降解，并且，根據(jù)其序列和結(jié)構(gòu)，可表現(xiàn)出差的腸道上皮吸收。但是，對(duì)肽進(jìn)行化學(xué)修飾以使它們不易被內(nèi)源蛋白酶降解或更易被消化道吸收的方法為公知(例如，請(qǐng)參見Blondelle等，1995，Biophys.J.69:604-11;Eeker和Crooke,1995，Biotechnology13:351-69;Goodman和Ro，1995,BURGER'SMEDICINALCHEMISTRYANDDRUGDISCOVERY,第I巻，Wollf編，JohnWiley&Sons;Goodman和Shao，1996，Pure&Appl.Chem.68:1303-08)。制備肽類似物，如包含D氨基酸的肽；由模擬肽結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子組成的肽模擬物；或類肽(如乙烯類肽)的文庫的方法也已有^Jt,并可用于構(gòu)建基于肽的適合受治療者口服施用的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)肽鍵連接可被一個(gè)或多個(gè)替代連接基團(tuán)(如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH=CH、CO-CH2、CHOH-CH2及類似基團(tuán))所取代。制備肽模擬物的方法為公知(例如，Hruby，1982,h/e31:189-99;Holladay等，1983,r"ra/e^W724:4401-04;Jennings-White等，1982，r"ra/^/raw丄W.23:2533;Almquiest等，1980,丄C77e附.23:1392-98;Hudson等，1979，/W.J.尸e,W仏14:177-185;Spatola等，1986，h/eS".38:1243-49;第5,169,862;5,539,085;5,576,423、5,051,448、5,559,103號(hào)美國專利，其均通過引用結(jié)合入本文)。與其肽類似物相比，肽模擬物可表現(xiàn)出增強(qiáng)的體內(nèi)穩(wěn)定性和/或吸收。替代地，肽口服遞送施用時(shí)可利用N-末端和/或C-末端加帽，以避開外肽酶活性。例如，C-末端可使用酰胺肽進(jìn)行加帽，而N-末端可通過肽的乙?；M(jìn)行加帽。肽還可進(jìn)行環(huán)化，例如通過形成環(huán)狀酰胺、二M/睫、醚、硫化物等，以封閉外肽酶。肽穩(wěn)定性還可通過用D-氨基酸取代天然存在的L-氨基酸(尤其是在已知的內(nèi)肽酶作用位點(diǎn))來實(shí)現(xiàn)。內(nèi)肽酶結(jié)合和切割序列在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?，并且制備和使用包含D-氨基酸的肽的方法也已有報(bào)道(例如，第20050025709號(hào)美國專利申請(qǐng)公布，McBride等，2004年6月14日提交，其通過引用結(jié)合入本文)。在某些實(shí)施方案中，肽和/或蛋白質(zhì)可通過與蛋白酶和/或肽酶抑制劑制成復(fù)合制劑進(jìn)行口服施用。治療肽口服遞送的其他方法請(qǐng)參見Mehta("Oraldeliveryandrecombinantproductionofpeptidehormones"(狀類^t素的口刀良遞送禾口重纟且制備)，2004年6月，說oP/wnw/mew""朋a/)。所述月太以與U武形劑制成的腸溶固體劑型施用，所述賦形劑調(diào)節(jié)腸的蛋白水解活性，并增強(qiáng)肽的跨腸壁運(yùn)輸。使用此技術(shù)的完整肽的相對(duì)生物利用度為所施劑量的1%-10%。胰島素已通過與膽酸鈉和蛋白酶抑制劑制成腸溶微膠嚢成功施用至狗(Ziv等，1994，J.8o"eA//"eK18(Suppl.2):792-94)。已通過使用?；鈮A作為滲透增強(qiáng)劑和腸溶衣對(duì)肽進(jìn)行口服施用(EudragitL30D-55,RohmPharmaPolymers,請(qǐng)參見Mehta,2004)。用于口服施用的賦形劑一般可包括腸蛋白酶/肽酶的一種或多種抑制劑，以及增強(qiáng)肽的溶解性或吸收性的去污劑或其他試劑，所述賦形劑可包括在腸溶膠嚢或片劑內(nèi)(Mehta，2004)。所述膠嚢內(nèi)可包括有機(jī)酸，當(dāng)所述膠嚢在腸內(nèi)溶解后，所述有機(jī)酸可對(duì)腸進(jìn)行酸化，并抑制腸蛋白酶活性(Mehta，2004)。肽口服遞送的另一替代實(shí)施方案可包括與基于聚乙二醇(PEG)的兩性低聚物軛合，以增強(qiáng)吸收和對(duì)酶解的抗性(Soltero和Ekwuribe,2001，尸/2"ra7.!Tec/mo/.6:110)。在其他實(shí)施方案中，肽可通過軛合至某些蛋白如IgGl的Fc區(qū)(請(qǐng)參見實(shí)施例3-7)進(jìn)行修飾，以便用于口服或吸入施用。例如，制備和使用肽-Fc扼合物的方法請(qǐng)參見Low等(2005,/7w附.We/rad20:1805-13)和Dumont等(2005，./.爿emw/.A/ed18:294-303)，其均通過引用結(jié)合入本文。Low等(2005)公開了通過在CHO細(xì)胞中使用重組表達(dá)，將FSH的a和|3亞基以單鏈或異型二聚體形式輒合至IgGl的Fc區(qū)。所述軛合Fc的肽通過肺或腸的表皮細(xì)胞被介導(dǎo)運(yùn)輸系統(tǒng)的新生Fc受體吸附。與原來的肽相比，所述輒合Fc的肽表現(xiàn)出增強(qiáng)的體內(nèi)穩(wěn)定性和吸收性。同時(shí)還觀察到異型二聚體軛合物的活性要高于單鏈形式。交聯(lián)劑在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)、肽或其他大分子可使用本領(lǐng)域已知的各種交聯(lián)試劑(如同型雙功能、異型雙功能和/或光敏交聯(lián)試劑)共價(jià)交聯(lián)在一起。此類試劑的非限制性實(shí)例包括雙酰亞胺酯(bisimidates);1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)；辛二酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯；酒石酸二琥珀酰亞胺酯；二甲基-3,3'-二硫-雙丙酰亞胺酯(dimethyl國3,3'-dithio-bispropionimidate);N-琥珀酰亞胺基-3-(2-外匕"定二石克)丙酉交西旨(N-succinimidyl-3誦(2-pyridyldithio)propionate);4-(;臭#^乙基)-2-硝基苯基疊氮化物；和4-疊氮基乙二醛。在示例性實(shí)施方案中，碳二亞胺交聯(lián)劑，如DCCD或EDC可用于將酸性殘基交聯(lián)至氨基或其他基團(tuán)。此類試劑可進(jìn)行修飾，以連接至不同類型的標(biāo)記，如熒光標(biāo)記。雙功能交聯(lián)試劑已廣泛用于各種用途。攜帶兩個(gè)相同官能團(tuán)的同型雙功能試劑已證明在誘導(dǎo)相同和不同大分子或大分子的亞基之間的交聯(lián)，以及將多肽配體連接至其特異性結(jié)合位點(diǎn)方面非常有效。異型雙功能試劑包含兩個(gè)不同的官能團(tuán)。通過利用所述兩個(gè)不同官能團(tuán)的不同反應(yīng)活性，可以同時(shí)選擇性且順序性地控制交聯(lián)。所述雙功能交聯(lián)試劑可根據(jù)其官能團(tuán)的特異性進(jìn)行劃分，所述官能團(tuán)例如氨基、巰基、胍基、。引咮、羧基特異性基團(tuán)。其中，針對(duì)自由氨基的試劑由于其已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化、易于合成和反應(yīng)條件溫和而特別受歡迎。大部分異型雙功能交聯(lián)試劑包含伯胺反應(yīng)基團(tuán)和巰基反應(yīng)基團(tuán)。另一實(shí)例描述了異型雙功能交聯(lián)試劑和使用這些交聯(lián)試劑的方法(第5,889,155號(hào)美國專利)。所述交聯(lián)試劑同時(shí)具有親核肼殘基和親電馬來酰亞胺殘基，允許在一個(gè)實(shí)例中將醛偶聯(lián)至自由巰基。所述交聯(lián)試劑可進(jìn)行修飾以交聯(lián)不同的官能團(tuán)?？贵w不同實(shí)施方案可涉及靶標(biāo)的抗體。術(shù)語"抗體"在此指任何具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體樣分子，并包括抗體片段，如Fab'、Fab、F(ab')2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)及類似片段。制備和使用各種基于抗體的構(gòu)建體和片段的方法在本領(lǐng)域?yàn)楣?。制備和鑒定抗體的方法在本領(lǐng)域同樣為7>知(例如，請(qǐng)參見Harlowe和Lane，1988,v4""6o(i,^:爿丄"/orato/7Mam^/(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，ColdSpringHarborLaboratory)。所用抗體還可從多種已知來源購買獲得。例如，許多分泌抗體的雜交瘤系可購自AmericanTypeCultureCollection(ATCC，Manassas，VA)。本發(fā)明要求保護(hù)的方法和/或組分的某些實(shí)施方案可涉及抗體片段。此類抗體片段可通過使用常規(guī)方法對(duì)全長(zhǎng)抗體進(jìn)行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化獲得。例如，可用胃蛋白酶對(duì)抗體進(jìn)行酶切來制備抗體片段，以提供F(ab')2片段。此片段可進(jìn)一步使用巰基還原劑裂解，并任選地使用針對(duì)二硫鍵斷裂產(chǎn)生的巰基的封閉基團(tuán)，以制備Fab'單價(jià)片段。替代地，使用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和一個(gè)Fc片段。制備抗體片段的方法示例請(qǐng)參見第4,036,945號(hào)美國專利；第4,331,647號(hào)美國專利；Nisonoff等，1960，Arch.Biochem.Biophys.，89:230;Porter,1959,Biochem.J.，73:119;Edelman等，1967，METHODSINENZYMOLOGY(酶學(xué)方法)，第422頁(AcademicPress),和Coligan等編，1991，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(免疫學(xué)當(dāng)前方案)，(JohnWiley&Sons)。也可使用裂解抗體的其他方法，如分離重鏈以形成單價(jià)輕-重鏈片段、進(jìn)一步裂解片段或其他酶學(xué)、化學(xué)或遺傳技術(shù)，只要所述片段能與完整抗體識(shí)別的抗原結(jié)合。例如，F(xiàn)v片段包含Vh和V^鏈的締合。此締合可為非共價(jià)的，如I油ar等，1972，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,69:2659所述。替代地，所述可變的鏈(variablechain)可通過分子間二硫鍵連接，或通過化學(xué)劑(如戊二醛)交聯(lián)。請(qǐng)參見San他u，1992,Crit.Rev.Biotech.,12:437。優(yōu)選地，所述Fv片段包含用肽連接體連接的Vh和Vt鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)通過構(gòu)建包含編碼Vh和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因制備，其中，Vh和VL結(jié)構(gòu)域用寡核苷酸連接體序列連接。所述結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體，該載體隨后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，如大腸桿菌。所迷重組宿主細(xì)胞合成單個(gè)多肽鏈，其中兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域由連接體肽橋接。制備sFv的方法在本領(lǐng)域?yàn)楣?。?qǐng)參見Whitlow等，1991，Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology(方法酶學(xué)方法指南)2:97;Bird等，1988,Science,242:423;第4,946，778號(hào)美國專利；Pack等，1993，Bio/Technology,11:1271，和Sandhu，1992,Crit.Rev.Biotech.，12:437。抗體片段的另一形式為編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽("最小識(shí)別單元")可通過構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體的CDR的基因獲得。例如，此類基因通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA合成所述可變區(qū)來制備。請(qǐng)參見Larrick等，1991，Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology(方法酶學(xué)方法指南)2:106;Ritter等編，1995,MONOCLONALANTIBOD正S:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION(單克隆抗體制備、改造和臨床應(yīng)用)，第166-179頁(CambridgeUniversityPress);Birch等編，1995，MONOCLONALANTIBOD正S:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS(單克隆抗體原理和應(yīng)用)，第137-185頁(Wiley-Liss,Inc.)。嵌合;^乂源^^謬?yán)?，嵌合抗體是人抗體的可變區(qū)被鼠抗體的可變區(qū)(包括該鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))取代的重組蛋白。嵌合抗體在施用至受治療者時(shí)表現(xiàn)出免疫原性下降，且穩(wěn)定性增加。構(gòu)建嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域?yàn)楣?例如，Leung等，1994，Hybridoma.13:469)。嵌合單克隆抗體可通過將該鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的鼠CDR轉(zhuǎn)移到人抗體的相應(yīng)可變區(qū)而進(jìn)行人源化。該嵌合抗體中的框架區(qū)(FR)也替換為人FR序列。為了保留所述人源化單克隆抗體的穩(wěn)定性和抗原特異性，一個(gè)或多個(gè)人FR殘基可替換為相應(yīng)的鼠殘基。人源化單克隆抗體可用于治療受治療者。人源化抗體對(duì)靶標(biāo)的親和力也可通過選定的CDR序列修飾得以提高(WO0029584Al)。制備人源化單克隆抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域?yàn)楣?例如，請(qǐng)參見Jones等，1986,Nature,321:522;Riechmann等，Nature,1988,332:323;Verhoeyen等，1988,Science,239:1534;Carter等，1992，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA,89:4285;Sandhu，Crit.Rev.Biotech.,1992，12:437;Tempest等，1991，Biotechnology9:266;Singer等，丄Immunol.,1993，150:2844)。其他實(shí)施方案可包含非人靈長(zhǎng)類抗體。例如，培養(yǎng)在狒狒中有效的治療抗體的一般技術(shù)可參見Goldenberg等，WO91/11465(1991)和Losman等，Int.J.Cancer.46:310(1990)。乂戎謬使用組合方法或轉(zhuǎn)有人免疫球蛋白位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備完全人抗體的方法在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?例如，Mancini等，2004,」VewM,cra6zo/.27:315-28;Conrad和Scheller，2005，Co附Z).CZew.州ghJ7jraMg/2/^Scree".8:117-26;Brekke和Loset，2003，Cmr(9pz力.尸/wmaco/.3:544-50;其均通過引用結(jié)合入本文)。此類完全人抗體與嵌合或人源化抗體相比表現(xiàn)出的副作用更少，并基本上可作為內(nèi)源人抗體在體內(nèi)行使功能。在某些實(shí)施方案在一個(gè)替代實(shí)施方案中，噬菌體展示技術(shù)可用于制備人抗體(例如，Dantas-Barbosa等，2005，Mo/.We義4:126-40，其通過引用結(jié)合入本文)。人抗體可從正常人或表現(xiàn)出特定疾病狀態(tài)如癌癥(Dantas-Barbosa等，2005)的人中制備。從患病個(gè)體中構(gòu)建人抗體的好處在于全套循環(huán)抗體庫可能對(duì)疾病相關(guān)抗原抗體具有偏好性。在此方法的一個(gè)非限制性實(shí)例中，Dantas-Barbosa等(2005)構(gòu)建了骨肉瘤患者的人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫。一般而言，總RNA獲自循環(huán)血淋巴細(xì)胞(M)。從p、y和K鏈全套抗體庫中克隆重組Fab，并將其插入噬菌體展示文庫(W.)。RNA可通過4吏用對(duì)重鏈和輕鏈免疫3求蛋白序列特異的引物轉(zhuǎn)化為cDNA，并用于制備FabcDNA文庫(Marks等，1991,JMo/.說W.222:581-97，其通過引用結(jié)合入本文)。文庫構(gòu)建按Andris誦Widhopf等(2000，選自尸/zageD/^/ay丄a6orato/^A^3"wa/，Barbas等編，第1版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY第9.1-9.22頁，其通過引用結(jié)合入本文)進(jìn)行。最終的Fab片段用限制性核酸內(nèi)切酶消化，然后插入噬菌體基因組以制備所述噬菌體展示文庫。此類文庫可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)噬菌體展示方法進(jìn)行篩選。熟練的技術(shù)人員將了解，此技術(shù)僅為示例，并且可利用任何已知的通過噬菌體展示制備和篩選人抗體或抗體片段的方法。在另一替代實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫實(shí)驗(yàn)方案，經(jīng)過基因工程改造以制備人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于制備針對(duì)基本上任何免疫靶的抗體。此系統(tǒng)的非限制性示例為Abgenix(Fremont,CA)的Xeno小鼠⑧(例如，Green等，1999,/附w朋o/.MeAoA.231:11-23,其通過引用結(jié)合入本文)。在Xeno小鼠⑧和相似動(dòng)物中，鼠抗體基因已被失活，并替換為功能性人抗體基因，但是鼠免疫系統(tǒng)的剩余部分仍保持完整。Xeno小鼠⑧已轉(zhuǎn)化了種系配置的YAC(酵母人工染色體)，該YAC包含部分人IgH和IgK基因座，包括可變區(qū)序列的大部分區(qū)域，以及輔助基因和調(diào)控序列。人可變區(qū)庫可用于制備產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，而B細(xì)胞可通過已知技術(shù)融合至雜交瘤。用靶抗原免疫的Xeno小鼠⑧將通過正常的免疫反應(yīng)產(chǎn)生人抗體，所述人抗體可通過上述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行收獲和/或制備。有多個(gè)種系的Xeno小鼠⑧可用，每個(gè)種系均能產(chǎn)生不同類別的抗體。此類人抗體可通過化學(xué)交聯(lián)或其他已知方法偶聯(lián)至其他分子。使用轉(zhuǎn)基因方法制備的人抗體已顯示出治療潛力，并保留了普通人抗體的藥物動(dòng)力學(xué)特性(Green等，1999)。熟練的技術(shù)人員將了解，本發(fā)明要求保護(hù)的組合物和方法并不限于使用Xeno小鼠⑧系統(tǒng)，而是可以使用已經(jīng)過基因工程改造來制備人抗體的任何轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。病組織檢測(cè)、診斷和顯像方法《f:^弱齡麵本發(fā)明包括穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)在體外和/或體內(nèi)篩選生物樣品中存在的疾病相關(guān)抗原的用途。在示例性免疫分析中，包含抗體、融合蛋白或其片段的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可使用液相或者結(jié)合于固相栽體，如下文所述。在優(yōu)選實(shí)施方案，特別是包括體內(nèi)施用的實(shí)施方案中，所述抗體或其片段為人源化的。同樣優(yōu)選地，所述抗體或其片段為完全人抗體。更優(yōu)選地，所述融合蛋白包含人源化抗體或完全人抗體。熟練的技術(shù)人員將了解，已知有多種技術(shù)用于確定特定基因的表達(dá)水平，并且任何此類已知方法，如免疫分析、RT-PCR、mRNA純化和/或制備cDNA后與基因表達(dá)分析芯片雜交，均可用于確定個(gè)體受治療者和/或組織中的表達(dá)水平。使用體外分析的示例包括RIA、ELISA、夾心ELISA、Western雜交、狹縫雜交、斑點(diǎn)雜交及類似分析。雖然此類技術(shù)是使用完整抗體開發(fā)的，但是也可使用包含抗體、抗體片段或其他結(jié)合部分的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。包含抗體、融合蛋白、抗體片段和/或其他結(jié)合部分的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)也可用于檢測(cè)從組織標(biāo)本制備的組織切片中是否存在耙抗原。此原位檢測(cè)可用于確定是否存在所述抗原，以及確定該抗原在所;險(xiǎn)查的組織中的分布。原位檢測(cè)可通過對(duì)冷凍或石蠟包埋的組織切片使用可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)。原位檢測(cè)的一般技術(shù)對(duì)普通技術(shù)人員為公知。例如，請(qǐng)參見Ponder，"CellMarkingTechniquesandTheirApplication"(細(xì)月包標(biāo)記4支術(shù)及其應(yīng)用)，選自MAMMALIANDEVELOPMENT:APRACTICALAPPROACH(哺乳動(dòng)物發(fā)育實(shí)驗(yàn)方法)113-38Monk編(IRLPress1987),和Coligan,第5.8.1-5.8.8頁。穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可用任何合適的標(biāo)志物部分進(jìn)行檢測(cè)標(biāo)記，例如，放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記、染料、顯色劑、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、生物發(fā)光標(biāo)i己物或順石茲沖示i己物。所述標(biāo)志物部分可為放射性同位素，其可通過使用Y計(jì)數(shù)器或P-閃爍計(jì)數(shù)器等手段，或通過放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述診斷軛合物為P-或正電子輻射同位素。標(biāo)志物部分指會(huì)在預(yù)定條件下產(chǎn)生信號(hào)的分子。標(biāo)志物部分的實(shí)例包括放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記和順磁標(biāo)記。標(biāo)志物部分與穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的結(jié)合可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。此方面的經(jīng)典方法請(qǐng)參見Kennedy等，Clin.Chim.Acta70:1(1976);Schurs等，Clin.Chim.Acta81:1(1977);Shih等，Int'lJ.Cancer46:1101(1990)。^于雄麟,/"歸在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可包括核酸部分。在特定實(shí)施方案中，可通過分析核酸，尤其是使用核酸擴(kuò)增方法，來確定結(jié)合水平。各種形式的擴(kuò)增方法在本領(lǐng)域?yàn)楣?，并且任何此類方法均可使用。一般而言，擴(kuò)增包括使用與要擴(kuò)增的靶核酸序列選擇性或特異性雜交的一個(gè)或多個(gè)引物。如此處所定義，術(shù)語"引物"意在包括能夠在模板依賴性過程中引導(dǎo)新生核酸合成的任何核酸。用于選擇和設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物的計(jì)算機(jī)程序可從熟練的技術(shù)人員公知的商業(yè)和/或公共來源獲得。有多個(gè)模板依賴性過程可用于擴(kuò)增給定樣品中存在的標(biāo)志物序列。最著名的擴(kuò)增方法之一就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱PCR)，其詳情請(qǐng)參見第4,683,195、4,683,202和4,800,159號(hào)美國專利。但是，也可使用已知的其他擴(kuò)增方法。使用標(biāo)記的肽或MAb進(jìn)行診斷顯像已是眾所周知。例如，在免疫顯像技術(shù)中，配體或抗體使用Y輻射》文射性同位素標(biāo)記，然后導(dǎo)入患者體內(nèi)。Y才聶像機(jī)用于檢測(cè)Y輻射放射性同位素的定位和分布。例如，請(qǐng)參見Srivastava編，RADIOLABELEDMONOCLONALANTIBODIESFORIMAGINGANDTHERAPY(用于顯像和治療的放射性標(biāo)記單克隆抗體)(PlenumPress1988);Chase,"MedicalApplicationsofRadioisotopes"(力丈射性同位素的醫(yī)學(xué)應(yīng)用)，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(雷明頓氏藥物科學(xué))，第18版，Gennaro等編，第624-652頁(MackPublishingCo.，1990》和Brown,"ClinicalUseofMonoclonalAntibodies"(單克隆抗體的臨床應(yīng)用)，選自BIOTECHNOLOGYANDPHARMACY(生物技術(shù)與制藥)227-49,Pezzuto等編(Chapman&Hall1993)。同樣優(yōu)選的還有正電子輻射放射性核素(PET同位素)，如能量為511keV的放射性核素，如"F、68Ga、"Cu和1241。此類顯像可通過直接標(biāo)記所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)或使用預(yù)靶向顯像方法執(zhí)行，所述預(yù)靶向顯像方法請(qǐng)參見Goldenberg等，"AntibodyPre-targetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy"(4元體預(yù)輩巴向？文善了癌癥的放射免疫檢測(cè)和放射免疫治療)，(JClinOncol2006;24:823-834)，另請(qǐng)參見第20050002945、20040018557、20030148409和20050014207號(hào)美國專利公布，其均通過引用結(jié)合入本文。向患者施用的同位素劑量保持在盡可能低的水平，這通過選擇半衰期最短，在體內(nèi)停留時(shí)間最短，以及進(jìn)行檢測(cè)和精確測(cè)量所需的同位素量最小的最佳組合同位素實(shí)現(xiàn)。適合進(jìn)行診斷顯像的放射性同位素的實(shí)例包括99mTc和mIn。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，或者與其結(jié)合的半抗原或載體，也可用順磁離子和各種放射性造影劑進(jìn)行標(biāo)記，以用于體內(nèi)診斷。對(duì)磁共振成像特別有用的造影劑包括釓、錳、鏑、鑭或鐵離子。其他試劑包括鉻、銅、鈷、鎳、錸、銪、鋱、鈥或釹。配體、抗體及其片段也可軛合至超聲造影劑/增強(qiáng)劑。例如，一個(gè)超聲造影劑為包含人源化IgG或其片段的脂質(zhì)體。同樣優(yōu)選地，所述超聲造影劑為充氣的脂質(zhì)體。^^麻々^"浙^^在,許多合適的顯像劑以及將它們連接至蛋白質(zhì)或肽的方法在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?例如，請(qǐng)參見第5,021,236和4，472,509號(hào)美國專利,其均通過引用結(jié)合入本文)。某些連接方法包括使用金屬螯合復(fù)合體，例如，所述復(fù)合體使用連接至蛋白質(zhì)或肽的有機(jī)螯合劑(如DTPA)(第4,472,509號(hào)美國專利)。蛋白質(zhì)或肽也可在存在偶聯(lián)劑(如戊二醛或高碘酸)的條件下與酶反應(yīng)。具有熒光標(biāo)志物的軛合物在存在這些偶聯(lián)劑的條件下制備，或者通過與異硫氰酸酯反應(yīng)來制備。可用作顯像劑的順磁離子的非限制性實(shí)例包括鉻(m)、錳(n)、鐵(in)、鐵(n)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、銣(m)、釤(ni)、鐿(in)、軋(ni)、釩(n)、鋱(in)、鏑(ni)、4火(ni)和鉺(ni),其中特別優(yōu)選的為釓?？捎糜谄渌椒?如x射線成像)的離子包括但不限于鑭(m)、金(in)、鉛(n),尤其是鉍(m)。可用作顯像劑或治療劑的放射性同位素包括砹211、碳14、鉻51、氯36、鈷57、鈷58、銅62、銅64、銅67、Eu152、氟18、鎵67、鎵68、氫3、碘123、碘124、碘125、碘131、銦U1、鐵52、鐵59、镥177、磷32、磷33、錸186、錸1S8、SC47、石西75、銀，硫35、*94m、锝"m、釔，釔^和鋯，某些實(shí)施方案經(jīng)常優(yōu)選使用I125，而锝"m和銦m也由于其低能量和適合遠(yuǎn)程探測(cè)而經(jīng)常獲得優(yōu)選使用。放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。例如，它們可以通過與捵化鈉或碘化鉀，和化學(xué)氧化劑(如次氯酸鈉)或酶氧化劑(如乳過氧化物酶)反應(yīng)進(jìn)行碘標(biāo)記。蛋白質(zhì)或肽可通過配體交換過程或直接標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行锝"m標(biāo)記，所述配體交換過程例如，使用亞錫溶液還原高锝酸鹽，將還原的锝螯合至S印hadex(交聯(lián)葡聚糖)柱，然后將所述肽加至此柱；所述直接標(biāo)記技術(shù)例如，將高锝酸鹽、還原劑(如SNCl2)、緩沖液(如鄰苯二曱酸鈉鉀溶液)和所述肽一起孵育。經(jīng)常用于將金屬離子形式的放射性同位素結(jié)合至肽的中間官能團(tuán)包括二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、卟啉螯合劑和乙二胺四乙酸(EDTA)。同樣可用的還有熒光標(biāo)記，包括若丹明、熒光素異硫氰酸酯和腎造影劑。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)或肽可連接至二級(jí)結(jié)合配體或與顯色底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物的酶(酶標(biāo)簽)。合適酶的實(shí)例包括脲酶、堿性磷酸酶、(辣根過氧化物酶)過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶。優(yōu)選的二級(jí)結(jié)合配體為生物素和親和素或鏈霉親和素化合物。此類標(biāo)記的用途對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員為公知，并可參見，例如，第3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149和4,366,241號(hào)美國專利;其均通過引用結(jié)合入本文。這些熒光標(biāo)記優(yōu)選用于體外用途，但也可用于體內(nèi)用途，特別是內(nèi)窺鏡或血管內(nèi)檢測(cè)程序。在替代實(shí)施方案中，配體、抗體或其他蛋白質(zhì)或肽可用熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記?？晒鈾z測(cè)的標(biāo)記的非限制性實(shí)例包括Alexa350、Alexa430、層CA、^J^丫咬、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY誦FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5隱羧基國4',5'-二氯畫2',7'-二曱氡基熒光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基胺、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy5、6曙FAM、丹磺酰氯、熒光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧-l,3-二唑)、俄勒岡綠488(OregonGreen488)、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(lán)、鄰苯二甲酸、對(duì)苯二曱酸、間苯二曱酸、甲酚固紫、曱盼藍(lán)紫、亮?xí)醴铀{(lán)、對(duì)氨基苯曱酸、赤蘚紅、酞菁、甲亞胺、菁、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、稀土金屬穴《立^匕合物、三4關(guān)p比口定二胺銪(europiumtrisbipyridinediamine)、銪穴位化合物或螯合物、二胺、二花青苷、LaJolla藍(lán)色染料(LaJollabluedye)、另'J藻青素(allopycocyanin)、allococyaninB、藻青素C、藻青素R、硫胺素、藻紅藍(lán)蛋白、藻紅蛋白R(shí)、REG、若丹明綠、若丹明異硫氰酸酯、若丹明紅、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基若丹明異辟L醇)、四曱基若丹明、Edans和得克薩斯紅。這些和其他熒光標(biāo)記可獲自商業(yè)來源，如MolecularProbes(Eugene，OR)和EMDBiosciences(SanDiego，CA)。有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物可包括魯米諾、異魯米諾、芳基吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯或生物發(fā)光化合物，如熒光素、熒光素酶和水母素。例如，"^斷軛合物可用于外科手術(shù)、內(nèi)窺鏡或血管內(nèi)腫瘤或疾病"^斷。在不同實(shí)施方案中，有用的標(biāo)記可包含金屬納米粒子。制備納米粒子的方法為已知(例如，請(qǐng)參見第6,054,495;6,127,120;6,149,868號(hào)美國專利；Lee和Meisel，,P/".C&附.86:3391-3395，1982)。納米粒子也可獲自商業(yè)來源(葉列^口，NanoprobesInc.,Yaphank，NY;Polysciences,Inc.,Warrington,PA)。經(jīng)過》f飾的納米粒子已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，如Nanoprobes,Inc.(Yaphank,NY)的Nanogold⑧納米粒子。用于軛合蛋白質(zhì)或肽的功能化納米粒子也可通過商業(yè)途徑購得。實(shí)施例下列實(shí)施例用以說明，而不是限制本文要求保護(hù)的發(fā)明。制備由三個(gè)Fab亞基組成的非共價(jià)a2b復(fù)合體的方法實(shí)施例1.制備模塊化Fab亞基的一般策略Fab模塊可制備成包含DDD或AD序列的融合蛋白。為每個(gè)Fab融合蛋白設(shè)計(jì)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。當(dāng)制備時(shí)，如果需要，模塊可進(jìn)行純化或保存在細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中。制備之后，(Fab-DDD)2模塊和Fab-AD模塊之間可任意組合，以生成雙特異性三價(jià)Fab(bsTF)。質(zhì)粒載體pdHL2已用于制備多種抗體和基于抗體的構(gòu)建體。請(qǐng)參見Gillies等，JImmunolMethods(1989),125:191-202;Losman等，Cancer(Phila)(1997)，80:2660-6。雙順反子哺乳動(dòng)物表達(dá)載體介導(dǎo)IgG重鏈和輕鏈的合成。許多不同IgG-pdHL2構(gòu)建體的載體序列絕大部分都是相同的，僅在可變區(qū)(VH和V。序列存在差異。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)工具，可將這些IgG表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為Fab-DDD或Fab-AD表達(dá)載體。為了制備產(chǎn)生Fab-DDD表達(dá)載體，重鏈的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的編碼序列替換為編碼所迷鉸鏈的前4個(gè)殘基、14個(gè)殘基的Gly-Ser連接體和人Rlla的前44個(gè)殘基的序列(稱為DDD1，圖1)。為了制備Fab-AD表達(dá)載體，IgG的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的序列替換為編碼所述鉸鏈的前4個(gè)殘基、15個(gè)殘基的Gly-Ser連接體和名為AKAP-/S的17個(gè)殘基的合成AD的序列(稱為AD1，圖2)，該序列系使用生物信息學(xué)和肽陣列技術(shù)制備，并顯示出非常高的與RIIa二聚體結(jié)合的親和力(0.4nM)。請(qǐng)參見Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.、U.S.A(2003),100:4445-50。設(shè)計(jì)了兩個(gè)穿梭載體，以利于將IgG-pdHL2載體轉(zhuǎn)化為Fab-DDD1或Fab-AD1表達(dá)載體，如下所述。CH1的制備CHI結(jié)構(gòu)域系使用pdHL2質(zhì)粒載體作為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得。左側(cè)PCR引物由CHI結(jié)構(gòu)域的上游(5')和Sac11限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(即CHI編碼序列的5'端)組成。右側(cè)引物由編碼鉸鏈的前4個(gè)殘基(PKSQ后接GGGGS(最后兩個(gè)密碼子(GS)，包含BamHI限制性酶切位點(diǎn))的序列組成。CW蘭磨參W端5'GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3'(SEQIDNO:5)TGCTGG誦3'(SEQIDNO:6)將410bpPCR擴(kuò)增片段克隆至pGemTPCR克隆載體(Promega，Inc.),然后篩選克隆以獲得T7(5')方向的插入物。(G4S)2DDD1的構(gòu)建使用SigmaGenosys(Haverhill,UK)合成雙鏈寡核香酸(命名為(G4S)2DDD1),以編碼DDD1的氨基酸序列，所述DDD1前面有連接肽的11個(gè)殘基，其中前兩個(gè)密碼子包含BamHI限制性酶切位點(diǎn)。終止密碼子和Eagl限制性酶切位點(diǎn)位于3'端。編碼的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSHIOIPPGLTELLOGYTVEVLROOPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEOIDNO:7)合成兩個(gè)寡核苷酸(命名為RIIA1-44上和RIIA1-44下，它們的3'端有30個(gè)堿基對(duì)的重疊)(SigmaGenosys)，并將它們組合在一起以包含174bpDDDl序列的154個(gè)居中堿基對(duì)。對(duì)寡核香酸進(jìn)行退火，然后使用Taq聚合酶進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。AG國3'(SEQIDNO:8)G-3'(SEQIDNO:9)引物延伸之后，使用以下引物對(duì)所述雙鏈進(jìn)行擴(kuò)增5'-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3'(SEQIDNO:10)7-"茅乂五ag》5'-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3'(SEQIDNO:11)[0314將此擴(kuò)增片段克隆至pGemT，然后篩選T7(5')方向的插入物。(G4S)2-AD1的構(gòu)建合成雙鏈寡核苷酸(命名為(G4S)2-AD1)(SigmaGenosys)，以編碼AD1的氨基酸序列，所述AD1前面有連接肽的11個(gè)殘基，其中前兩個(gè)密碼子包含BamHI限制性酶切位點(diǎn)。終止密碼子和Eagl限制性酶切位點(diǎn)位于3'端。編碼的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSOIEYLAKOIVDNAIOOA(SEQIDNO:12)合成兩個(gè)互補(bǔ)并有重疊的寡核苷酸(命名為AKAP-IS上和AKAP-IS下)。GGCCG-3'(SEQIDNO:13)5'CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCATCC-3'(SEQIDNO:14)使用下列引物對(duì)所述雙鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增5'-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3'(SEQIDNO:15)H/S浮乂~力5'隱CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3'(SEQIDNO:16)將此擴(kuò)增片段克隆至pGemT載體，然后篩選T7(5')方向的插入物。連接DDD1和CH1使用BamHI和Notl限制性內(nèi)切酶將編碼DDD1序列的190bp片段從pGemT上切下，然后將該片段連接至CHl-pGemT的相同位點(diǎn)，以生成穿梭載體CHl-DDDl-pGemT。連接AD1和cm使用BamHI和Notl將含有AD1序列的110bp片段從pGemT上切下，然后將該片段連接至CHl-pGemT的相同位點(diǎn)，以生成穿梭載體CHl-ADl-pGemT。將CH1-DDD1或CH1-AD1克隆至基于pdHL2的載體使用此模塊化設(shè)計(jì)，CH1-DDD1或CHI-AD1均可包含于pdHL2載體中的任何IgG構(gòu)建體。通過去除pdHL2的SacII/Eagl限制性片段(CHl-CH3)，并將其替換為從相應(yīng)pGemT穿梭載體上切下的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/Eagl片段，整個(gè)重鏈恒定區(qū)即替換為上述構(gòu)建體之一。N-末端DDD結(jié)構(gòu)域DDD或AD的位置并不限于CH1的羧基末端。已改造了DDDl序列連接至VH結(jié)構(gòu)域氨基末端的構(gòu)建體。實(shí)施例2:表達(dá)載體h679-Fd-ADl-pdHL2的構(gòu)建h679-Fd-ADl-pdHL2是用于制備h679Fab的表達(dá)載體，其中AD1通過由14個(gè)氨基酸殘基組成的柔性Gly/Ser肽間隔區(qū)扼合至Fd的CHI結(jié)構(gòu)域的羧基末端。將包含h679的可變區(qū)的基于pdHL2的載體的SacII/Eagl片段替換為CH1-AD1片段(由SacII和Eagl從CH1-AD1-SV3穿梭載體上切下)，該載體即轉(zhuǎn)化為h679-Fd-ADl-pdHL2。C國DDDl國Fd國hMN-14誦pdHL2的構(gòu)建C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2是用于制備包含兩個(gè)拷貝的融合蛋白C-DDDl-Fab-hMN-14的穩(wěn)定二聚體的表達(dá)載體，在所述融合蛋白中，DDD1通過柔性肽間隔區(qū)連4妄至hMN-14Fab的CH1羧基末端。質(zhì)粒載體hMN14(I)-pdHL2(已用于制備hMN-14IgG)通過用SacII和Eagl限制性核酸內(nèi)切酶消化以去除CH1-CH3結(jié)構(gòu)域，然后插入CH1-DDDl片段(由SacII和Eagl從CHI-DDDl-SV3穿梭載體上切下)，即轉(zhuǎn)化為C隱DDD1-Fd-hMN-14-p膽L2。N-DDDl-Fd畫hMN-14-pdHL2的構(gòu)建N-DDD卜Fd-hMN-14-pdHL2是用于制備包含兩個(gè)拷貝的融合蛋白N-DDDl-Fab-hMN-14的穩(wěn)定二聚體的表達(dá)載體，在所述融合蛋白中，DDDl通過柔性肽間隔區(qū)連接至hMN-14Fab的VH的氨基末端。按如下方式對(duì)所述表達(dá)載體進(jìn)行改造。使用下面所示的兩個(gè)引物對(duì)DDDl結(jié)構(gòu)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5'CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3'(SEQIDNO:17)CAGGCGGGTG-3'(SEQIDNO:18)PCR之后，Ncol限制性酶切位點(diǎn)和連接體(G4S)2中包舍BamHI限制性酶切位點(diǎn)的部分的編碼序列即分別連接到5'和3'末端。將170bpPCR擴(kuò)增片段克隆至pGemT載體，然后篩選克隆以獲得T7(5')方向的插入物。194bp插入物由Ncol和Sail限制性內(nèi)切酶從所迷pGemT載體上切下，并克隆至所述SV3穿梭載體(使用相同的酶消化制備而成)，以生成中間載體DDD1-SV3。使用下面所示的寡核苷酸引物對(duì)hMN-14Fd序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5'-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3'(SEQIDNO:19)dC浮乂5'-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3'(SEQIDNO:20)PCR之后，BamHI限制性酶切位點(diǎn)和連接體(G4S)的部分編碼序列即連接到擴(kuò)增片段的5'端。終止密碼子和Eagl限制性酶切位點(diǎn)則連接至3'端。將該1043bp擴(kuò)增片段克隆至pGemT。使用BamHI和Eagl限制性內(nèi)切酶將hMN-14-Fd插入物從pGemT上切下，然后將該插入物連接至DDD1-SV3載體(使用相同的酶消化制備而成)，以生成構(gòu)建體N-DDDl-h畫-14Fd-SV3。使用Xhol和Eagl限制性內(nèi)切酶將N-DDDl-hMN-14Fd序列切下，然后將該1.28kb插入片段連接至經(jīng)相同酶消化的C-hMN-14-pdHL2的載體片段。最終的表達(dá)載體即為N-DDDl-Fd-hMN-14-pDHL2。實(shí)施例3.h679-Fab-ADl的制備和純化h679-Fd-ADl-pdHL2載體用Sail限制性核酸內(nèi)切酶消化而被線性化，然后通過電穿孔方法轉(zhuǎn)染Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞。該雙順反子表達(dá)載體介導(dǎo)h679K輕鏈和h679Fd-AD1兩者的合成和分泌，它們結(jié)合形成h679Fab-AD1。電穿孔之后，用所述細(xì)胞涂布96孔組織培養(yǎng)^反，并用0.05甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)化克隆。使用涂布BSA-IMP-260(HSG)軛合物的微滴定板通過ELISA篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并使用軛合HRP的山羊抗人Fab進(jìn)行檢測(cè)。BIAcore分析使用HSG(IMP-239)傳感器芯片，通過測(cè)量注射的稀釋培養(yǎng)基樣品的初始斜率來確定生產(chǎn)率。產(chǎn)量最高的克隆的初始生產(chǎn)率約為30mg/L。使用單步IMP-291親和層析，從4.5升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)230mgh679-Fab-ADl。在加至IMP-291-a伍gel柱之前，培養(yǎng)基用超濾方法濃縮了約10倍。使用PBS將該柱洗脫至基線，然后使用1M咪唑、lmMEDTA、O.lMNaAc、pH4.5洗脫h679-Fab-ADl。對(duì)洗脫液的SE-HPLC分析表明存在保留時(shí)間(9.63分鐘)對(duì)應(yīng)于50kDa蛋白(未顯示)的單一銳峰。在還原SDS-PAGE分析中，僅有代表h679-ADl的多肽組分的兩個(gè)條帶可見(未顯示)。實(shí)施例4.N-DDDl-Fab-hMN-14和C-DDDl-Fab-hMN-14的制備和純化C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2載體和N-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2載體通過電穿孔轉(zhuǎn)入Sp2/0衍生的骨髓瘤細(xì)胞。C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2為雙順反子表達(dá)載體，其介導(dǎo)hMN-14k輕鏈和hMN-14Fd-DDD1兩者的合成和分泌，它們結(jié)合形成C-DDD1-hMN-14Fab。N-DDDl-hMN-14-pdHL2為雙順反子表達(dá)載體，其介導(dǎo)hMN-14k輕鏈和N-DDDl-Fd-hMN-14兩者的合成和分泌，它們結(jié)合形成N-DDDl-Fab-hMN-14。每個(gè)融合蛋白均通過DDD1結(jié)構(gòu)域的相互作用形成穩(wěn)定的同型二聚體。電穿孔之后，用所述細(xì)胞涂布96孔組織培養(yǎng)板，并用0.05pM甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)化克隆。使用涂布WI2(hMN-14的鼠抗id單克隆抗體)的微滴定板通過ELISA篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并使用軛合HRP的山羊抗人Fab進(jìn)行檢測(cè)。C-DDDl-Fab-hMN14Fab和N-DDDl-Fab-hMN14Fab產(chǎn)量最高的克隆的初始生產(chǎn)率分別為60mg/L和6mg/L。使用ADl-Afftgel親和純化N-DDDl-hMN-14和C-DDDl-hMN-14使用DDD/AD相互作用對(duì)包含DDD1的構(gòu)建體進(jìn)行親和純化。AD1-C是通過合成制備的由AD1序列和羧基末端半胱氨酸殘基組成的肽(請(qǐng)參見實(shí)施例6)，所述半胱氨酸殘基用于將該肽輒合至Affigel(根據(jù)巰基與氯乙酸酐的反應(yīng))。包含DDD的a2結(jié)構(gòu)在中性pH下特異性結(jié)合AD1-C-Affigel樹脂，并可在低pH(例如，pH2.5)下洗脫。使用單步AD1-C親和層析，從1.2升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)81mgC-DDDl-Fab-hMN-14。在加至ADl-C-affigel柱之前，培養(yǎng)基用超濾方法濃縮了約10倍。使用PBS將該柱洗脫至基線，然后使用0.1M甘氨酸、pH2.5洗脫C-DDDl-Fab-hMN-14。對(duì)洗脫液的SE-HPLC分析表明存在保留時(shí)間(8.7分鐘)對(duì)應(yīng)于107kDa蛋白(未顯示)的單一蛋白峰。純度還經(jīng)還原SDS-PAGE分析確認(rèn)，僅顯示代表C-DDDl-Fab-hMN-14的兩個(gè)多肽組分的兩個(gè)條帶(未顯示)。如上所述，使用單步AD1-C親和層析，從1.2升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)10mgN-DDDl-hMN-14。對(duì)洗脫液的SE-HPLC分析表明存在保留時(shí)間(8.77分鐘)類似于C-DDDl-Fab-hMN-14并對(duì)應(yīng)于107kDa蛋白(未顯示)的單一蛋白峰。還原SDS-PAGE分析僅顯示對(duì)應(yīng)于N-DDD1-Fab-hMN-14的多肽組分的兩個(gè)條帶(未顯示)。C-DDDl-Fab-hMN-14的結(jié)合活性通過樣品的SE-HPLC分析確定，在所述樣品中，該測(cè)試品與不同量的WI2混合。WI2Fab和C-DDDl-Fab-hMN-14按0.75:1的摩爾比混合制成的樣品顯示三個(gè)峰，對(duì)應(yīng)于未結(jié)合的C-DDDl-Fab-hMN14(8.71分鐘)、結(jié)合一個(gè)WI2Fab的C-DDD1-Fab-hMN-14(7.95分4中)和結(jié)合兩個(gè)WI2Fab的C-DDDl-Fab-hMN14(7.37分鐘)(未顯示)。當(dāng)分析的樣品包含的WI2Fab和C-DDDl-Fab-hMN-14的摩爾比為4時(shí)，僅觀察到一個(gè)7.36分鐘的峰(未顯示)。這些結(jié)果證明，hMN14-Fab-DDDl為二聚體，并且有兩個(gè)活性結(jié)合位點(diǎn)。使用N-DDD1-Fab-hMN-14重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果非常相似。竟?fàn)嶦LISA證明，C-DDD1-Fab-hMN-14和N-DDD1-Fab-hMN-14均以和hMN-14IgG類似的親和力與CEA結(jié)合，并且親和力顯著強(qiáng)于單價(jià)hMN-14Fab(未顯示)。使用包含hMN-14特異的CEA表位(A3B3)的融合蛋白涂布ELISA平板。實(shí)施例5.a2b復(fù)合體的形成a2b復(fù)合體形成的證據(jù)是由包含等摩爾的C-DDD1-Fab-hMN-14(即a2)和h679-Fab-ADl(即b)的混合物的SE-HPLC分析首先提供的。對(duì)此樣品進(jìn)行分析時(shí)，觀察到保留時(shí)間為8.40分鐘的單一峰，這與形成了大于任何單獨(dú)的h679-Fab-ADl(9.55分鐘)或C-DDD1-Fab-hMN-14(8.73分鐘)的新蛋白一致(未顯示)。當(dāng)hMN-14F(ab')2與h679-Fab-ADl混合，或者C-DDD1-Fab-hMN-14與679-Fab-NEM混合時(shí)，均未觀察到此高磁場(chǎng)位移，證明此相互作用是通過DDD1和AD1結(jié)構(gòu)域特異介導(dǎo)的。使用h679-Fab-ADl和N-DDD1-Fab-hMN-14時(shí)得到了非常類似的結(jié)果(未顯示)。使用BIAcore進(jìn)一步證明和鑒定了DDI和AD1融合蛋白之間的特異性相互作用。此實(shí)-驗(yàn)過程如下首先讓h679-Fab-ADl或679-Fab-NEM結(jié)合到高密度的HSG偶聯(lián)的(IMP239)傳感器芯片，然后注射C-DDD1-Fab-hMN-14或hMN-14F(ab')2。不出所料，當(dāng)注射后者時(shí)，僅有h679-Fab-ADl和C-DDDl-Fab-hMN-14組合造成響應(yīng)單元的進(jìn)一步增加(未顯示)。使用N-DDD1-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD1得到了類似的結(jié)果(未顯示)。執(zhí)行了平衡SE-HPLC實(shí)驗(yàn)，以確定相應(yīng)融合蛋白的AD1和DDDl之間的特異性相互作用的結(jié)合親和力。h679-Fab-ADl與C-DDD1-Fab-hMN-14、N-DDDl-hMN-14和重組人RIIaa的商業(yè)化樣品結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)分別為15nM、8nM和30nM。其他相關(guān)方法實(shí)施例6.雙-ADl的制備在此實(shí)施例中，通過合成制備了具有如下所示的氨基酸序列的小多肽(ADl-C)。肌隱KOIEYLAKOIVDNAIOOAKGC隱COOH(SEQIDNO:37)在ADl-C中，AD1氨基酸序列(標(biāo)有下劃線)的N-末端側(cè)翼為賴氨酸殘基，且羧基末端側(cè)翼為KGC三肽。引入了兩個(gè)賴氨酸(K)殘基以增加溶解性，并在C-末端半胱氨酸之前插入甘氨酸(G)殘基以提供更多的柔性。用DMSO處理之后，ADl-C氧化形成二聚體，命名為雙-ADl，雙-ADl通過RP-HPLC純化。雙-ADl的結(jié)構(gòu)示意圖如下所示(=指示二硫橋)。NH"KQIEYLAKOIVDNAIQQAKGC=CGKAOOIANDVIOKALYEIOK-NH2(SEQIDNO:21)雙-ADl或ADl-C中有許多官能團(tuán)可用于進(jìn)行進(jìn)一步修飾。例如，雙-AD1和ADl-C中分別包含的8個(gè)和4個(gè)伯胺基團(tuán)可用于扼合藥物、毒素、蛋白質(zhì)或其他效應(yīng)物。此外，雙-ADl和AD1-C還分別有2個(gè)和1個(gè)酪氨酸殘基，它們可用于進(jìn)行放射碘標(biāo)記。最后，AD1-C包含自由的半胱氨酸殘基，其也可用于輒合凌文應(yīng)物或形成包含效應(yīng)物的雙-ADl類似物。實(shí)施例7.新的預(yù)靶向方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的方法提供了新的預(yù)靶向方法。下面提供了無需半抗原結(jié)合抗體的預(yù)靶向系統(tǒng)的實(shí)例，該系統(tǒng)使用親和力增強(qiáng)系統(tǒng)(LeDoussal等，JNuclMed(1989)，30:1358-66)。C-DDDl-Fab-hMN-14或N-Fab-DDD2-hMN-14的二聚體(按實(shí)施例4所述方法制備)可用于預(yù)靶向腫瘤。該107kDa蛋白首先靜脈內(nèi)施用至受治療者，然后其將從血液和正常組織中清除，而與腫瘤上的CEA結(jié)合。稍后，靜脈內(nèi)施用攜帶治療性(例如，90Y)或診斷性放射性同位素(例如，min)的雙價(jià)肽，如雙-ADl的DOTA軛合物。此小狀(5000Da)很快從血液和正常組織中清除，但由于其包含兩個(gè)AD序列而定位于腫瘤，AD序列可與已^f皮所述腫瘤截留的C-DDDl-Fab-hMN-14發(fā)生特異性作用。C-DDDl-Fab-hMN-14與雙-ADl的體外交聯(lián)已#1SE-HPLC證實(shí)。當(dāng)C-DDDl-Fab-hMN-14與雙-ADl混合時(shí)，蛋白峰從8.67分鐘遷移到7.95分鐘，表明形成了交聯(lián)結(jié)構(gòu)(未顯示)。當(dāng)hMN-14F(ab')2與雙-ADl混合時(shí)，未觀察到此類遷移，證明所述交聯(lián)是由DDD1和AD1之間的相互作用介導(dǎo)的。為了證明所述峰遷移確實(shí)由C-DDDl-Fab-hMN-14的特異性交聯(lián)引起，使用DTT還原該復(fù)合體以斷裂雙-AD1的二硫鍵連接，結(jié)果該峰又遷回8.67分鐘(未顯示)。實(shí)施例8.DDD或AD融合蛋白的親和純化可通過制備具有較低親和力?？康腄DD或AD蛋白來開發(fā)通用的親和純化系統(tǒng)。與RIIa相比，RIa二聚體形成的DDD與AKAP-IS(ADl)結(jié)合的親和力要弱500倍(225nM)。因此，可制備由前44個(gè)氨基酸殘基形成的RIa二聚體，并將其軛合至樹脂制成有吸引親和力的基質(zhì)，以純化任何包含AD1的融合蛋白。自然界存在許多較低親和力(O.l^M)AKAP錨定結(jié)構(gòu)域。如果需要，可引入高度可預(yù)測(cè)的氨基酸取代以進(jìn)一步降低所述結(jié)合親和力。低親和力AD可通過合成或生物學(xué)方法制備，并可扼合至樹脂以用于任何DDD1融合蛋白的親和純化。與制備穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)相關(guān)的方法實(shí)施例9.用于制備由三個(gè)Fab片段組成的二硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的載體N-DDD2-Fd-hMN國14-pdHL2N-DDD2-hMN-14-pdHL2是用于制備N-DDD2-Fab-hMN-14的表達(dá)載體，該結(jié)構(gòu)擁有與Fd的氛基末端連接的DDD2的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域序列(圖4)。DDD2通過15個(gè)氨基酸殘基的Gly/Ser肽連接體軛合至Vh結(jié)枸域。DDD2具有與DDD1的序列相同的二聚化序列和停靠序列，但是在它們之前具有半胱氨酸殘基。分泌的融合蛋白由兩個(gè)相同拷貝的hMN-14Fab組成，它們通過DDD2結(jié)構(gòu)域的非共價(jià)相互作用連接(圖3B)。按如下方式對(duì)所述表達(dá)載體進(jìn)行改造。通過合成制備兩個(gè)包含DDD2的1-13位殘基的重疊的互補(bǔ)寡核苷酸(DDD2上和DDD2下)。所述寡核苷酸進(jìn)行退火，并用T4多核苷酸激酶(PNK)磷酸化，以在5'和3'端形成適合與分別用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI和Pstl消化的DNA連接的外伸。CA-3'(SEQIDNO:22)5'GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3'(SEQIDNO:23)所述雙鏈DNA與載體片段DDDl-hMN14Fd-SV3(通過用Ncol和Pstl消化制備)連接，以生成中間構(gòu)建體DDD2-hMN14Fd-SV3。使用Xhol和Eagl限制性核酸內(nèi)切酶，將包含DDD2-hMN14Fd編碼序列的1.28kb插入片段從所述中間構(gòu)建體上切下，然后將該片段連接至使用相同酶消化制備的hMN14-pdHL2載體DNA。所得表達(dá)載體即為N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2(圖4)。C國DDD2-Fd畫hMN-14-pdHL2C-DDD2-Fd-固N(yùn)-14-pdHL2是用于制備。0002-Fab-hMN-14的表達(dá)載體，在該結(jié)構(gòu)中，DDD2的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域序列通過14個(gè)氨基酸殘基的Gly/Ser肽連接體連接至Fd的羧基末端(圖5A)。分泌的融合蛋白由兩個(gè)相同拷貝的hMN-14Fab組成，它們通過DDD2結(jié)構(gòu)i或的非共《介相互作用連接(圖5B)。按如下方式對(duì)所述表達(dá)載體進(jìn)行改造。通過合成制備兩個(gè)包含連接體肽的部分序列(GGGGSGGGCG，SEQIDNO:38)和DDD2的1-13位殘基的重疊的互補(bǔ)寡核苷醵。所述寡核苷酸進(jìn)行退火，并用T4PNK磷酸化，以在5'和3'端形成適合與分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和PstI消化的DNA連4妄的外伸。ATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA誦3'(SEQIDNO:24)5'GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3'(SEQIDNO:25)所述雙鏈DNA與穿梭載體CHl-DDDl-pGemT(通過用BamHI和Pstl消化制備)連接，以生成穿梭載體CH1-DDD2-pGemT。使用SacII和Eagl將507bp片段從CHl-DDD2-pGemT上切下，然后將該片段連接至使用SacII和Eagl消化制備的IgG表達(dá)載體hMN14(I)-pdHL2。所得表達(dá)構(gòu)建體即為C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2(圖6)。h679-Fd畫AD2-pdHL2h679-Fab-AD2設(shè)計(jì)作為B,與N-DDD2-Fab-hMN-14或C-DDD2-Fab-hMN-14配對(duì)。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于制備h679-Fab-AD2的表達(dá)載體，在該結(jié)構(gòu)中，AD2的錨定結(jié)構(gòu)域序列通過14個(gè)氨基酸殘基的Gly/Ser肽連接體連接至CH1的羧基末端。AD2在AD1錨定結(jié)構(gòu)域序列的前后各有一個(gè)半胱氨酸殘基。按如下方式對(duì)所述表達(dá)載體進(jìn)行改造。通過合成制備兩個(gè)包含AD2的編碼序列和部分連接體序列的重疊的互補(bǔ)寡核苷酸。所述寡核苷酸進(jìn)行退火，并用T4PNK磷酸化，以在5'和3'端形成適合與分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和Spel消化的DNA連接的外伸。爿D2j:GAA-3'(SEQIDNO:26)EQIDNO:27)所述雙鏈DNA與穿梭載體CHl-ADl-pGemT(通過用BamHI和Spel消化制備)連接，以生成穿梭載體CHl-AD2-pGemT。使用SacII和Eagl載體上切下，然后將該片段連接至使用相同酶消化制備的h679-pdHL2載體。最終的表達(dá)載體即為h679-Fd-AD2-pdHL2。實(shí)施例10.h679-Fab-AD2的制備h679-Fd-AD2-pdHL2載體通過電穿孔轉(zhuǎn)入Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞。此雙順反子表達(dá)載體介導(dǎo)h679k輕鏈和h679Fd-AD2兩者的合成和分泌，它們結(jié)合形成h679-Fab-AD2。AD任一末端的半胱氨酸殘基提供了兩個(gè)潛在的活性巰基。電穿孔之后，用所述細(xì)胞涂布96孔組織培養(yǎng)板，并用0.05^iM甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)化克隆。使用涂布BSA-IMP-260(HSG)輒合物的微滴定板通過ELISA篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并使用山羊抗人Fab-HRP進(jìn)行檢測(cè)。BIAcore分析使用HSG(IMP-239)傳感器芯片，通過測(cè)量注射的稀釋培養(yǎng)基樣品的初始斜率來確定生產(chǎn)率。產(chǎn)量最高的克隆的初始生產(chǎn)率約為50mg/L。使用單步IMP-291親和層析，從2.9升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)160mgh679-Fab-AD2。在加至IMP-291-affigel柱之前，培養(yǎng)基用超濾方法濃縮了約10倍。使用PBS將該柱洗脫至基線，然后使用1M咪唑、lmMEDTA、O.lMNaAc、pH4.5洗脫h679-AD2。SE-HPLC分析表明存在保留時(shí)間(10分鐘)對(duì)應(yīng)于50kDa蛋白(未顯示)的單一銳峰。當(dāng)此材料與hMNl4-Fab-DDD1混合時(shí)，SE-HPLC跡線上觀察到對(duì)應(yīng)于所述二元復(fù)合體的新峰，表明僅l/3發(fā)生了反應(yīng)(未顯示)。但是使用TCEP還原h(huán)679-Fab-AD2得到100%的活性(未顯示)。這表明(1)AD2的兩個(gè)半胱氨酸殘基可形成分子內(nèi)二硫鍵，阻止了與DDD的結(jié)合，但是也防止了所述巰基與其他物質(zhì)反應(yīng)；和(2)所述分子內(nèi)二硫橋可通過還原斷裂，得到具有兩個(gè)自由巰基的DDD反應(yīng)性錨定結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例11.32結(jié)構(gòu)形式的N-DDD2-Fab-hMN-14的制備N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2載體通過電穿孔轉(zhuǎn)入Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞。此雙順反子表達(dá)載體介導(dǎo)hMN-14k輕鏈和N-DDD2-hMN-14Fd兩者的合成和分泌，它們結(jié)合形成N-DDD2-hMN14Fab。通過DDD2的二聚化可形成A2結(jié)構(gòu)，得到兩個(gè)由每個(gè)DDD2的半胱氨酸殘基提供的潛在反應(yīng)性巰基。電穿孔之后，用所述細(xì)胞涂布96孔組織培養(yǎng)板，并用0.05甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)化克隆。使用涂布WI2(hMN-14抗Id)的微滴定板通過ELISA篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并使用山羊抗人Fab-HRP進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)量最高的克隆的初始生產(chǎn)率約為10mg/L。使用蛋白L親和層析，從1.8升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)16mgN-DDD2-hMN-14。在加至蛋白L柱之前，培養(yǎng)基用超濾方法濃縮了約10倍。使用PBS將該柱洗脫至基線，然后使用1mMEDTA、0.1MNaAc(pH2.5)洗脫N-DDD2-hMN14，并立即用Tris-HCl中和。SE-HPLC分析顯示存在四個(gè)蛋白峰(未顯示)，其中兩個(gè)稍后被鑒定為N-DDD2-Fab-hMN-14的a4(7.9分鐘)和a2(8.8分鐘)形式，剩下兩個(gè)為所述k鏈的二聚體和單體。此混合物幾乎沒有顯示出對(duì)h679-Fab-ADl的結(jié)合活性，直至加入巰基還原劑(如TCEP)將大部分a4形式轉(zhuǎn)化為32形式(未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明(1)兩個(gè)32結(jié)構(gòu)通過DDD2中的半胱氨酸連接形成了a4,進(jìn)而阻止了與AD的結(jié)合，但同時(shí)也阻止了所述巰基與其他物質(zhì)反應(yīng)；和(2)所述分子內(nèi)二碌^橋可通過還原斷裂，得到a2結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有包含兩個(gè)自由巰基的AD反應(yīng)性DDD二聚體。請(qǐng)注意，此副產(chǎn)物(a》由四個(gè)活性Fab亞基組成。即使具有高的TCEP濃度和長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，總N-DDD2-Fab-hMN-14中仍有15%在還原之后保持A4形式(未顯示)。這表明，除了二硫橋之外，其他機(jī)制(如結(jié)構(gòu)域交換)可能參與了34形式的形成。實(shí)施例12.C-DDD2-Fab-hMN-14的制備C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2載體通過電穿孔轉(zhuǎn)入Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞。此雙順反子表達(dá)載體介導(dǎo)hMN-14k輕鏈和C-DDD2-Fd-hMN-14兩者的合成和分泌，它們結(jié)合形成C-DDD2-Fab-hMN14。像N-DDD2-Fab-hMN-14—樣，通過DDD2的二聚化可形成a2結(jié)構(gòu)，得到兩個(gè)由每個(gè)DDD2的半胱氨酸殘基提供的潛在反應(yīng)性巰基。電穿孔之后，用所述細(xì)胞涂布96孔組織培養(yǎng)板，并用0.05曱氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)化克隆。使用涂布WI2(hMN-14抗Id)的微滴定板通過ELISA篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并使用山羊抗人Fab-HRP進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)量最高的克隆的初始生產(chǎn)率約為100mg/L，比N-DDD2-Fab-hMN-14的產(chǎn)量高10倍。使用蛋白L親和層析，從1.8升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)200mgC-DDD2-hMN-14,如實(shí)施例3所述。蛋白L純化C-DDD2-Fab-hMN-14的SE-HPLC圖譜(未顯示)與N-DDD2-Fab-hMN-14的圖鐠相似。四個(gè)蛋白中有兩個(gè)被鑒定為C-DDD2-Fab-hMN-14的a4(8.40分鐘)和a2(9.26分鐘)形式，剩下兩個(gè)代表所述k鏈的二聚體和單體。此混合物幾乎沒有顯示出對(duì)h679-ADl的結(jié)合活性，直至加入巰基還原劑(如TCEP)將大部分a4形式轉(zhuǎn)化為32形式，然后32與h679-ADl親和性結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明C-DDD2-Fab-hMN-14是N-DDD2-hMN-14的功能等同物。實(shí)施例13.TF1的制備h679-Fab-AD2設(shè)計(jì)作為B組分，以與a2組分(如N-DDD2-hMN-Fab-14或C-DDD2-hMN-14)配對(duì)，當(dāng)混合在一起時(shí)，它們很容易結(jié)合形成a2b結(jié)構(gòu)(圖7A)，該結(jié)構(gòu)可經(jīng)進(jìn)一步誘導(dǎo)通過二石克鍵進(jìn)行共價(jià)結(jié)合(圖7B)。由于對(duì)N-DDD2-和AD2-構(gòu)建體的鑒定證實(shí)其均需進(jìn)行還原以實(shí)現(xiàn)完全的DDD/AD相互作用，因此，此過程包括還原步驟。最初使用固定的TCEP作為還原劑，以節(jié)省去除還原劑所需的時(shí)間。在室溫還原l小時(shí)之后，離心去除TCEP-瓊脂糖，然后向反應(yīng)溶液中加入DMSO至終濃度為10%。存在共價(jià)連接的a2b復(fù)合體(自此命名為TF1)的第一個(gè)證據(jù)是通過BIAcore分沖斤{正實(shí)的。通過使用固定TCEP的小規(guī)模反應(yīng)建立可行性之后，TF1的大規(guī)模制備按下述方法執(zhí)行。N-DDD2-Fab-hMN-14(經(jīng)蛋白L純化)和h679-Fab-AD2(經(jīng)IMP-291純化)首先按大致化學(xué)計(jì)量濃度在lmMEDTA、PBS、pH7.4中混合。加入TCEP之前，SE-HPLC未顯示a2b形成的任何證據(jù)(未顯示)。相反，存在代表a4(7.97分鐘；200kDa)、a2(8.91分鐘；100kDa)和B(10.01分鐘；50kDa)的峰。加入5mMTCEP很快就有a2b復(fù)合體形成，表現(xiàn)為8.43分鐘處出現(xiàn)新峰，對(duì)應(yīng)于150kDa蛋白(未顯示)。顯然，此實(shí)驗(yàn)中B過剩，因?yàn)榇嬖趯?duì)應(yīng)于h679-Fab-AD2(9.72分鐘)的明顯的峰，而未觀察到對(duì)應(yīng)于32或a4的明顯峰(未顯示)。還原一個(gè)小時(shí)之后，TCEP通過過夜透析(多次更換PBS)除去。所得溶液加入DMSO至終濃度為10%，并在室溫下放置過夜。使用SE-HPLC進(jìn)行分析時(shí)，代表a2b的峰更加銳利，并且保留時(shí)間略有下降，下降了0.1分鐘至8.31分鐘(未顯示)，根據(jù)我們以前的發(fā)現(xiàn)，這表明結(jié)合親和力的增加。該復(fù)合體進(jìn)一步使用IMP-291親和層析純化，以除去K鏈污染物。不出所料，過量的h679-AD2也一起純化出來，并通過稍后的制備性SE-HPLC加以去除(未顯示)。TF1為高度穩(wěn)定的復(fù)合體。測(cè)試TF1與HSG(IMP-239)傳感器芯片的結(jié)合時(shí)，樣品注射后觀測(cè)的反應(yīng)未出現(xiàn)明顯下降。相比之下，在相似條件下測(cè)試包含C-DDDl-Fab-hMN-14和h679-Fab-ADl的等摩爾混合物溶液時(shí)，觀測(cè)的響應(yīng)單元數(shù)的增加伴有樣品注射過程中和剛注射完畢時(shí)的可檢測(cè)下降，表明最初形成的a2b結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。此外，隨后注射WI2造成TF1的響應(yīng)單元數(shù)顯著增加，而C-DDD1/AD1混合物的則無明顯增加。響應(yīng)單元數(shù)的額外增加(由WI2與固定在傳感器芯片上的TF1的結(jié)合造成)對(duì)應(yīng)于兩個(gè)完全的功能性結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)均由N-DDD2-Fab-hMN-14的一個(gè)亞基提供。這已為TF1能夠結(jié)合WI2的兩個(gè)Fab片段所證實(shí)(未顯示)。使用BIAcore分析包含h679-AD2和N-DDDl-hMN14(已按照與TF1完全相同的方式進(jìn)行還原和氧化)的混合物時(shí)，幾乎沒有額外的WI2結(jié)合(未顯示)，表明二硫鍵穩(wěn)定的a2b復(fù)合體(如TFl)只能通過DDD2和AD2的相互作用形成。對(duì)此過程進(jìn)行了兩項(xiàng)改進(jìn)，以減少此過程的時(shí)間和降低效力。第一，使用34/32結(jié)構(gòu)的混合物與h679-Fab-AD2反應(yīng)時(shí)，使N-DDD2-Fab-hMN-14的摩爾數(shù)稍微過量，以便不會(huì)剩下自由的h679-Fab-AD2，并且任何未與h679-Fab-AD2拴結(jié)的34/32結(jié)構(gòu)，以及輕鏈均可通過IMP-291親和層析去除。第二，使用疏水相互作用層析(HIC)替代透析或滲濾作為還原之后去除TCEP的手段，這不僅縮短了過程時(shí)間，而且增加了潛在的病毒去除步驟。N-DDD2-Fab-hMN-14和679-Fab-AD2混合，并使用5mMTCEP在室溫下還原1小時(shí)。向該溶液中加入終濃度0.75M的石克酸銨，然后加至ButylFFHIC柱。使用0.75M硫酸銨、5mMEDTA、PBS洗滌該柱以去除TCEP。還原的蛋白使用PBS從HIC柱洗脫，然后加入終濃度10%的DMSO。在室溫孵育過夜之后，通過IMP-291親和層析分離得到高度純化的TF1(未顯示)。無需其他純化步驟，如凝膠過濾。實(shí)施例14.TF2的制備成功制備TF1之后，命名為TF2的類似物(圖8)也通過使C-DDD2-Fab-hMN-14與h679-Fab-AD2反應(yīng)獲得。TF2有兩個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)超過了TF1。第一，C-DDD2-Fab-hMN-14的制備水平比N-DDD2-Fab-hMN-14高IO倍。第二，具有C-末端DDD結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的CEA-結(jié)合親和力顯著高于具有N-末端DDD結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。這很可能歸因于結(jié)構(gòu)域的排列方式，其中N-DDD變體的結(jié)合可能由于位阻干擾而受到影響。TF2試驗(yàn)批次的制備產(chǎn)量>90%，方法如下。蛋白L純化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)與h679-Fab-AD2(60mg)按1.4:1的摩爾比混合?？偟鞍诐舛葹?.5mg/ml(用含1mMEDTA的PBS配制)。隨后的步驟，包括TCEP還原、HIC層析、DMSO氧化和IMP-291親和層析，與TF1的步驟相同。加入TCEP之前，SE-HPLC未顯示a2b形成的任何證據(jù)(未顯示)。相反，存在對(duì)應(yīng)于34(8.40分鐘；215kDa)、a2(9.32分鐘；107kDa)和b(10.33分鐘；50kDa)的峰。加入5mMTCEP很快就有a2b復(fù)合體形成，表現(xiàn)為8.77分鐘處出現(xiàn)新峰，對(duì)應(yīng)于所述二元結(jié)構(gòu)預(yù)期的150kDa蛋白(未顯示)。TF2經(jīng)IMP-29.1親和層析純化至接近同質(zhì)(未顯示)。對(duì)未結(jié)合IMP-291的組分的SE-HPLC分析證明已去除a4、a2，并且該產(chǎn)物中沒有K鏈(未顯示)。非還原性SDS-PAGE分析表明，絕大部分TF2以大的共價(jià)結(jié)構(gòu)存在，其相對(duì)遷移率接近IgG的遷移率(未顯示)。其他條帶暗示實(shí)驗(yàn)條件下二硫鍵的形成不夠充分。還原性SDS-PAGE表明，在非還原性凝膠中顯著的任何其他條帶都是產(chǎn)物相關(guān)的(未顯示)，因?yàn)樵谶€原性SDS-PAGE中，僅有代表TF2組成性多肽的條帶可見。但是，這四個(gè)多肽的相對(duì)遷移率均非常接近，以至于難以分離。MALDI-TOF質(zhì)譜(未顯示)得到156,434Da的單峰，該分子量在TF2的計(jì)算質(zhì)量(157,319Da)的99.5%范圍內(nèi)。TF2的功能通過BIACORE確定，方法與TF1的相同。TF2、C-DDDl-hMN-14+h679-ADl(用作非共價(jià)a2b復(fù)合體的對(duì)照樣品)，或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未還原的a;j和b組分的對(duì)照樣品)稀釋至1嗎/ml(總蛋白)，然后經(jīng)過用HSG固定的傳感器芯片。TF2的反應(yīng)約為兩個(gè)對(duì)照樣品反應(yīng)的兩倍，表明對(duì)照樣品中僅有h679-Fab-AD組分結(jié)合并保留在傳感器芯片上。隨后的WI2IgG注射表明，僅有TF2具有與h679-Fab-AD緊密結(jié)合的DDD-Fab-hMN-14組分，這可從增加的信號(hào)反應(yīng)判斷出。響應(yīng)單元數(shù)的額外增加(由WI2與固定在傳感器芯片上的TF2的結(jié)合造成)還對(duì)應(yīng)于兩個(gè)完全的功能性結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)均由C-DDD2-Fab-hMN-14的一個(gè)亞基提供。這已為TF2能夠結(jié)合WI2的兩個(gè)Fab片段所證實(shí)(未顯示)。TF2的相對(duì)CEA結(jié)合親和力通過竟?fàn)嶦LISA確定。使用包含CEA的A3B3結(jié)構(gòu)域(可為hMN-14識(shí)別)的融合蛋白涂布平板(0.5昭/孔)。制備TF1、TF2和hMN-14IgG的四倍系列稀釋液，然后在包含軛合HRP的hMN-14IgG(1nM)孔中孵育。數(shù)據(jù)表明，TF2與CEA的結(jié)合親和力至少等于IgG的親和力，并比TF1高出兩倍(未顯示)。這并不奇怪，因?yàn)橹霸谙嗨频姆治鲋邪l(fā)現(xiàn)，C-DDDl-Fab-hMN-14的CEA結(jié)合親和力強(qiáng)于hMN-14IgG5，而其結(jié)合親和力又強(qiáng)于N-DDD1-Fab-hMN-14。C-DDD-Fab-hMN-14的親和力相對(duì)親本IgG有顯著的提高，可能的解釋是前者的Gly/Ser連接體提供了一個(gè)比IgG更加柔軟的分子。雖然N-DDD變體也擁有柔性肽連接體，但是其CEA結(jié)合位點(diǎn)彼此靠近，并且鄰近DDD二聚體，導(dǎo)致親和力下降。實(shí)施例15.tf1和tf2的血清穩(wěn)定性TF1和TF2設(shè)計(jì)成為可用于體內(nèi)血液和組織^皮嚴(yán)重稀釋的場(chǎng)合的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)。使用BIACORE評(píng)估了TF2在人血清中的穩(wěn)定性。TF2用人新鮮血清(釆集自四名捐血者)稀釋至0.1mg/ml，然后在37。C，5%(302條件下孵育7天。每天的樣品按1:25稀釋，然后使用IMP-239HSG傳感器芯片進(jìn)行BIACORE分析。注射WI2IgG以確定完整并且具有完全活性的TF2的數(shù)量。血清樣品與直接從貯液稀釋而來的對(duì)照樣品進(jìn)行比較。TF2在血清中高度穩(wěn)定，7天后保留98%的雙特異性結(jié)合活性(未顯示)。TF1在人或鼠血清中均獲得了相似的結(jié)果(未顯示)。實(shí)施例16.tf2在荷瘤小鼠中的生物分布TF2的生物分布研究在皮下荷有人大腸腺癌異種移植物(LS174T)的雌性無胸腺棵鼠中進(jìn)行。細(xì)胞在組織培養(yǎng)基中擴(kuò)增，直至獲得足夠皮下注射50只小鼠(每只小鼠lxl(f個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞。一周之后，對(duì)腫瘤進(jìn)行測(cè)量，并將小鼠按每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠進(jìn)行分組。研究開始時(shí)平均腫瘤大小為0.141±0.044cm3。所有小鼠均注射40昭125I-TF2(250皮摩，2^Ci)。然后在注射后0.5、2、4、16、24、48和72小時(shí)對(duì)它們進(jìn)行處死并尸體剖檢。本研究共使用了35只小鼠。摘除紳瘤以及各種組織，并將其置于y-計(jì)數(shù)器中，以確定組織在各時(shí)間點(diǎn)的每克注射劑量百分比(。/。ID/g)。125I-TF2的放射碘標(biāo)記得到2.7%的未結(jié)合同位素，比活為1.48mCi/mg。然后將標(biāo)記的樣品單獨(dú)和在與20倍摩爾過量的CEA混合之后進(jìn)行SE-HPLC。約有83%的TF2洗脫下來的保留時(shí)間為10.1分鐘。標(biāo)記的TF2中存在9%的聚合物質(zhì)(RT二9.03分鐘)和8%低分子量物質(zhì)(RT二14.37分鐘)。與CEA混合時(shí)，95%的標(biāo)記TF2遷移至高分子量物類(RT-7.25分鐘)。這些結(jié)果表明，所述標(biāo)記的制品可有效施用至所述荷瘤小鼠。表1提供了腫瘤和各組織中的計(jì)算。/oID/g值。肺瘤吸收峰值出現(xiàn)于注射后4h(10.3±2.1%ID/g)。注射后16和24h,紳瘤中的TF2量差異不顯著(5.3±l.l%ID/g和5.37土0.7%ID/g)，表明取決于血液值，月太可在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的任意時(shí)間施用，而不影響腫瘤定位。在正常組織中的吸收和清除與之前TF1的觀察非常相似。TF1和TF2看來均便于通過RES系統(tǒng)(脾和肝)清除。同時(shí)還評(píng)估了荷瘤小鼠中TF2的血液PK，并發(fā)現(xiàn)該值表現(xiàn)出兩階段清除。這些數(shù)據(jù)的分析使用WinNonlin非線性預(yù)測(cè)程序(4.1版)中提供的雙房室分析，確定的參數(shù)顯示于表2。實(shí)施例17.荷瘤小鼠中TF2的預(yù)靶向TF2的預(yù)靶向研究在皮下荷有人大腸腺癌異種移植物(LS174T)的雌性無胸腺棵鼠中進(jìn)行。細(xì)胞在組織培養(yǎng)基中擴(kuò)增，直至獲得足夠皮下注射55只小鼠(每只小鼠lxl(^個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞。一周之后，對(duì)腫瘤進(jìn)行測(cè)量，并將小鼠按每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠進(jìn)行分組。研究開始時(shí)平均腫瘤大小為0.105±0.068cm3。20只小鼠注射80嗎125I-TF2(500皮摩，2gCi)，并在16h后施用99mTc-IMP-245(40nCi,92ng，50皮摩)。在注射后0.5、1、4和24小時(shí)將小鼠處死并進(jìn)行尸體剖檢。此外，24h時(shí)間點(diǎn)組的3只小鼠在注射l、4和24h后用丫4聶像機(jī)顯像。作為對(duì)照，3只其他小鼠僅接受99mTc-IMP-245(無預(yù)靶向)，并在注射l、4和24h后進(jìn)行顯像，24h顯像期之后進(jìn)行驗(yàn)尸。摘除腫瘤以及各種組織，并將其置于，計(jì)數(shù)器中，以確定組織在各時(shí)間點(diǎn)的。/。ID/g。使用125I-TF2預(yù)靶向確定的125I-TF2和99mTc-IMP-245的。/。ID/g值分別總結(jié)于表3和表4。TF2水平在肽注射后的前4個(gè)小時(shí)(或TF2施用后20h)內(nèi)保持相對(duì)不變，從肽注射后0.5h(TF2施用后16.5h)的6.7±1.6%ID/g到4h時(shí)間點(diǎn)(TF2注射后20h)的6.5±1.5%ID/g。使用TF2預(yù)耙向時(shí)，肽注射后0.5、1、4和24h后IMP-245的腫瘤吸收值(o/。ID/g)分別為22士3%、30±14%、25±4%和16±3%。對(duì)于正常組織，在檢查的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，使用TF2進(jìn)行預(yù)耙向的小鼠的肝、肺和血液中的肽顯著少于使用目前已開發(fā)的其他預(yù)乾向劑獲得的結(jié)果(Rossi等，ClinCancerRes.2005;11(19Suppl):7122s國7129s)。這些數(shù)據(jù)表明，TF2得以從正常器官中有效清除，沒有留下可與隨后施用的肽結(jié)合的任何殘留片段。高肺瘤吸收伴以正常組織中的低水平，產(chǎn)生了極好的腫瘤非肺瘤(T/NT)比(表5)，進(jìn)而確認(rèn)了TF2是將基于雙-HSG的效應(yīng)物定位至產(chǎn)生CEA的腫瘤的合適預(yù)靶向劑。實(shí)施例18.使用谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)制備TF2作為上述實(shí)施例13和14中公開的方法的替代實(shí)施方案，可使用谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)來制備穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)(如TF1或TF2),以形成特異性二硫鍵將所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)連接在一起。制備TF2的簡(jiǎn)單而有效的方法如下所示。整個(gè)過程在室溫下進(jìn)行。C-DDD2-Fab-hMN-14(經(jīng)蛋白L純化)和h679-Fab-AD2(經(jīng)IMP-291純化)首先按大致化學(xué)計(jì)量濃度在lmMEDTA、PBS、pH7.4中混合。加入還原型谷胱甘肽至終濃度為1mM。30分鐘之后，加入氧化型谷胱甘肽至終濃度為2mM。BIACORE分析表明，加入氧化型谷胱甘肽后2分鐘，TF2形成已達(dá)50%，4小時(shí)內(nèi)達(dá)100%。TF2經(jīng)IMP-291親和層4斤純化至4妾近同質(zhì)，如上文實(shí)施例14所述。實(shí)施例19.粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的位點(diǎn)特異性聚乙二醇化重組人GM-CSF(14kDa)在臨床上用于治療多種血液病。當(dāng)前GM-SCF產(chǎn)品的局限在于循環(huán)半衰期短，因此其必須通過每天注射施用至受治療者以達(dá)到最佳效果。用于延長(zhǎng)蛋白治療劑的循環(huán)半衰期的一個(gè)方法是對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行聚乙二醇(PEG)修飾，以增加其有效大小。但是，所有目前已知的將PEG軛合至蛋白(聚乙二醇化)的方法均不理想，并且通常需要對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行修飾，以實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)(Doherty等，BioconjugateChem.2005、16:1291-1298)。而且，即使經(jīng)過此類修飾，扼合產(chǎn)率仍然有所差異，并且所得產(chǎn)物可能達(dá)不到均質(zhì)。高產(chǎn)率GM-CSF位點(diǎn)特異性聚乙二醇化可通過本發(fā)明實(shí)現(xiàn)(以下命名為?？亢玩i定(DNL)方法或技術(shù))，如下所述。DDD2序列通過間隔區(qū)軛合至GM-CSF的C-末端，以生成GM-SCF的二聚體，進(jìn)而生成AD2的停靠位點(diǎn)，而AD2與PEG軛合形成PEG-AD2。在與所述TF2方法相似的條件下混合GM-CSF-DDD2和PEG-AD2，即可形成聚乙二醇化的GM-CSF。值得注意的是，除了延長(zhǎng)循環(huán)半衰期之外，聚乙二醇化產(chǎn)物中的GM-CSF二聚體結(jié)構(gòu)要比目前單體形式的GM-CSF更加有效。此策略可用于其他細(xì)胞因子(如重組人IL-2)、酶(如重組人精氨酸酶)或生物活性肽(如血小板生成素受體的肽激動(dòng)劑，請(qǐng)參見Cwirta等，Science1997，276:1696-1699)或需要增加循環(huán)半衰期以改善治療效果的肽模擬物。實(shí)施例20.DNL技術(shù)促成的新免疫藥物可制備作為允許軛合目標(biāo)細(xì)胞毒性藥物的B組分的融合蛋白，并使用該融合蛋白軛合作為A組分制備的靶向蛋白，從而得到如下所示的新類型的免疫藥物。第一，選擇表達(dá)良好的免疫球蛋白人輕鏈作為支架(scafold)或載體蛋白，此支架或載體蛋白的C-末端融合至AD2序列。為防止形成輕鏈二聚體，將末端的半胱氨酸(與Fd鏈形成二硫鍵連接)替換為絲氨酸。此外，該輕鏈內(nèi)設(shè)計(jì)了至少一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(三肽序列N-X-T)以便添加寡糖，其可通過重組以高產(chǎn)率制備，純化至均質(zhì)和可用作通過合適化學(xué)軛合藥物的底物(例如，請(qǐng)參見Shih等將蒽環(huán)類抗生素(anthracyclin)輒合至(CancerRes.1991;51:4192-4198)。此包含藥物的B組分可與多種包含的A組分結(jié)合，其中所述DDD2連接至具有定位和內(nèi)化功能的結(jié)合結(jié)構(gòu)。替代地，使用AD2衍生的包含藥物的氨基葡聚糖與合適的A組分結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)靶特異性的藥物治療。其他表達(dá)良好的重組分子也可用作軛合藥物的支架或載體蛋白。實(shí)施例21.將病原體靶向至嗜中性粒細(xì)胞殺死最近已報(bào)道包含重組人表面活性蛋白片段D(rfhSP-D)和抗CD89抗體的Fab的化學(xué)軛合物為廣譜抗感染劑，可用于治療由多種病原體(包括甲型流感病毒、白色念珠菌和大腸桿菌)引起的疾病(Tacken等，J.Immunol.2004，172:4934-4940)。DNL技術(shù)可用于制備可將病原體靶向至嗜中性粒細(xì)胞殺死的穩(wěn)定拴結(jié)復(fù)合體，如下所示。包含a-螺旋巻曲螺旋頸部結(jié)構(gòu)域和C-末端糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)的hSP-D截短片段的N-末端與DDD2融合，以生成通過CRD與病原體多價(jià)結(jié)合的A結(jié)構(gòu)。為了給嗜中性粒細(xì)胞上的FcR提供靶標(biāo)，所述A結(jié)構(gòu)連接至由抗CD89Fab和AD2的融合蛋白組成的B組分，得到由hSP-D的兩個(gè)CRD和抗CD89的一個(gè)Fab組成的穩(wěn)定復(fù)合體。通過將人表面活性蛋白A(hSP-A)替換為hSP-D和其他抗體(如針對(duì)CD3和CD64的抗體)，可制備類似的抗感染劑。實(shí)施例22.使用非PKA和AKAP衍生的蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域制備多價(jià)、多特異性結(jié)構(gòu)預(yù)想了兩種基本策略。第一種策略依賴于搜索和評(píng)估適合取代DDD和AD的作用的其他天然蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域。例如，HNF-1a的N-末端二聚化結(jié)構(gòu)域可取代DDD，而HFN-l二聚化輔助因子(DcoH)可取代AD。第二種策略如下所示。人p53是由離散的功能結(jié)構(gòu)域組成的模塊化蛋白。人p53的C-末端殘基325-355(圖示I)(稱為四聚化結(jié)構(gòu)域(p53tet)在溶液狀態(tài)下自發(fā)形成四聚體，該四聚體事實(shí)上是二聚體的二聚體，兩個(gè)二聚體之間具有微弱的親和力(Kd2uM)。但是，每個(gè)二聚體中的兩個(gè)單體為強(qiáng)力結(jié)合，報(bào)道其Kd低于10-15M(Brokx等，J.Biol.Chem.2003;278:2327-2332)。因此，包含p53tet的融合蛋白預(yù)期可形成非常緊密結(jié)合的二聚體，就像包含PKA類型的人RIIa的DDD序列的融合蛋白一樣。為了將第二個(gè)結(jié)構(gòu)連接至p53tet的二聚體，使用酵母雙雜交系統(tǒng)或合適的噬菌體展示文庫選擇與p53tet結(jié)合的Kd為1uM或更小，并包含15-50個(gè)殘基的肽。親和力最高(即Kd值最小)的肽使用半胱氨酸衍生(如果需要)，并融合至目標(biāo)蛋白，該蛋白可穩(wěn)定拴結(jié)至p53tet的二聚體。圖示IGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQA(SEQIDNO:28)基于IgG的六價(jià)DNL結(jié)構(gòu)舊IDS)的制備和用途實(shí)施例23.六聚體構(gòu)建體使用上述制備a2b復(fù)合體的DNL技術(shù)制備六價(jià)IgGDNL結(jié)構(gòu)(HIDS)。制為重組融合蛋白的兩種類型的模塊結(jié)合以制備產(chǎn)生HIDS。按所述，F(xiàn)ab-DDD2模塊用于制備三-Fab結(jié)構(gòu)(Rossi等，PracAto/爿cW2006;1(B(18):684"6，請(qǐng)參見上文的實(shí)施例)。Fab-DDD2模塊形成與包含AD2的模塊結(jié)合的穩(wěn)定的同型二聚體。為了制備HIDS，設(shè)計(jì)兩種類型的IgG-AD2模塊以與Fab-DDD2模塊配對(duì)C-H-AD2-IgG和N-L曙AD2畫IgG。C-H-AD2-IgG模塊包含通過9個(gè)氨基酸殘基的肽連接體融合至IgG重鏈(H)的羧基末端(C)的AD2肽(圖9A)。所述連接體肽(GSGGGGSGG,SEQIDNO:29)的DNA編碼序列(后接AD2肽(CGQ正YLAKQIVDNAIQQAGC，SEQIDNO:4))通過標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)軛合至CH3(重鏈恒定區(qū)3)編碼序列的3'端，得到一個(gè)毗鄰的開放閱讀框。當(dāng)重鏈-AD2多肽與輕鏈多肽一起表達(dá)時(shí)，即形成包含兩個(gè)AD2序列的IgG分子(圖9B)，該分子進(jìn)而與兩個(gè)Fab-DDD2二聚體結(jié)合。C-H-AD2-IgG模塊可與任何Fab-DDD2模塊結(jié)合，以生成包含F(xiàn)c片段和6個(gè)Fab片段的多種六價(jià)結(jié)構(gòu)。如果C-H-AD2-IgG模塊和Fab-DDD2模塊衍生自同一親本單克隆抗體(MAb)，所得HIDS為單特異性，并具有同一抗原的六個(gè)結(jié)合臂(圖10)。如果所述模塊衍生自兩個(gè)不同MAb，則所得HIDS為雙特異性，并具有兩個(gè)C-H-AD2-IgG模塊特異性結(jié)合臂和4個(gè)Fab-DDD2模塊特異性結(jié)合臂(圖11)。N-L-AD2-IgG是IgG-AD2模塊的替代類型，其中，AD2肽通過13個(gè)氨基酸殘基的肽連接體融合至IgG輕鏈(L)的氨基末端(N)(圖12A)。所述L鏈可任選為k(K)或Lambda(人)，且在本文或圖中用具有相同意義的K表示。AD2肽(CGQ正YLAKQIVDNAIQQAGC、SEQIDNO:4)的DNA編碼序列(后接連接體肽(GGGGSGGGSGGG,SEQIDNO:30))軛合至L鏈可變區(qū)(VO編碼序列的5'端，得到一個(gè)毗鄰的開放閱讀框。當(dāng)AD2-k多肽與重鏈多肽一起表達(dá)時(shí)，即形成包含兩個(gè)AD2肽的IgG分子(圖12B)，該分子進(jìn)而與兩個(gè)Fab-DDD2二聚體結(jié)合。N-L-AD2-IgG模塊可與任何Fab-DDD2^t塊結(jié)合，以生成包含F(xiàn)c片段和6個(gè)Fab片段的多種六價(jià)結(jié)構(gòu)，其排列方式如圖13所示。實(shí)施例24.C-H-AD2-IgG-pdHL2表達(dá)載體的產(chǎn)生pdHL2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體已用于介導(dǎo)許多重組IgG的表達(dá)。制備質(zhì)粒穿梭載體以便將任何IgG-pdHL2載體轉(zhuǎn)化為C-H-AD2-IgG-pdHL2載體。以pdHL2載體為才莫板，并以寡核苷酸FcBg///i和Fc5aw-五coi7右作為引物，擴(kuò)增Fc(CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)的基因。Fc頓/蘭5'誦AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG誦3'(SEQIDNO:31)5'-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3'(SEQIDNO:32)將此擴(kuò)增片段克隆至pGemTPCR克隆載體。使用Xbal和BamHI限制性內(nèi)切酶將Fc插入片段從pGemT上切下，并將其連接至AD2-pdHL2載體(使用Xbal和BamHI消化h679-Fab-AD2-pdHL2制備而成)，以生成穿梭載體Fc-AD2-pdHL2(圖14A)。為了將任何IgG-pdHL2表達(dá)載體(圖"B)轉(zhuǎn)化為C-H-AD2_IgG-pdHL2表達(dá)載體(圖14C),將861bpBsrGI/Ndel限制性片段從前一個(gè)載體上切下，并替換為從Fc-AD2-pdHL2載體上切下的952bpBsrGI/Ndel限制性片段。BsrGI切割CH3結(jié)構(gòu)域，且Ndel切割所述表達(dá)盒的下游(3')。實(shí)施例25.C-H-AD2-hLL2IgG的制備依帕珠單抗(Epratuzumab)或hLL2IgG為人源化抗人CD22MAb。按實(shí)施例24所述方法，使用hLL2IgG-pdHL2制備C-H-AD2-hLL2IgG的表達(dá)載體，然后將該載體用于通過電穿孔轉(zhuǎn)染Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染之后，用所述細(xì)胞涂布96孔板，并在包含曱氨蝶呤的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因克隆。使用涂布hLL2特異性抗獨(dú)特型MAb的96孔微滴定板通過夾心ELISA篩選克隆的C-H-AD2-hLL2IgG生產(chǎn)率，并《吏用軛合過氧化物酶的抗人IgG進(jìn)行檢測(cè)。使用轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增克隆以制備蛋白質(zhì)，并使用單步蛋白-A親和層析從耗盡的培養(yǎng)基中純化C-H-AD2-hLL2IgG。SE-HPLC分析顯示兩個(gè)蛋白峰(圖15)。慢洗脫峰的保留時(shí)間(8.63分鐘)與hLL2IgG類似。快洗脫峰的保留時(shí)間(7.75分鐘)對(duì)應(yīng)于300kDa蛋白。后來確定此峰代表C-H-AD2-hLL2-IgG的二硫鍵連接二聚體。此二聚體在DNL反應(yīng)中還原為單體形式。SDS-PAGE分析表明，純化的C-H-AD2-hLL2-IgG由模塊的單體和二硫鍵連接的二聚體兩種形式組成(圖16)。代表這兩種形式的蛋白條帶在非還原性條件下的SDS-PAGE中清晰可見，但是在還原條件下，所有形式均被還原為代表組成性多肽(重鏈-AD2和K鏈)的兩個(gè)條帶。未檢測(cè)到其他污染條帶。實(shí)施例26.C-H-AD2-hA20IgG的制備hA20IgG為人源化抗人CD20MAb。按實(shí)施例24所述方法，使用hA20IgG-pDHL2制備C-H-AD2-hA20IgG的表達(dá)載體，然后將該載體通過電穿孔轉(zhuǎn)染Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染之后，用所述細(xì)胞涂布96孔板，并在包含甲氨蝶呤的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因克隆。使用涂布hA20特異性抗獨(dú)特型MAb的96孔,效滴定板通過夾心ELISA篩選克隆的C-H-AD2-hA20IgG生產(chǎn)率，并使用軛合過氧化物酶的抗人IgG進(jìn)行檢測(cè)。使用轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增克隆以制備蛋白質(zhì)，并使用單步蛋白-A親和層析從耗盡的培養(yǎng)基中純化C-H-AD2-hA20IgG。SE-HPLC和SDS-PAGE分析得到的結(jié)果與實(shí)施例25中C-H-AD2-hLL2IgG的結(jié)果類似。實(shí)施例27.N-L-AD2-hA20IgG的制備制備了包含輕鏈前導(dǎo)肽、AD2、13個(gè)殘基的肽連接體和hA20Vk的前4個(gè)殘基(均在一個(gè)框內(nèi))的編碼序列的197bpDNA雙鏈，如下所示。使用Taq聚合酶通過引物延伸將兩個(gè)100-mer合成寡核苷酸(有35bp的重疊)制備為完全雙鏈。CAGATC(SEQIDNO:33)GCCACAGC(SEQIDNO:34)通過PCR擴(kuò)增所述序列，分別向5'和3'端添加了XbaI和PvuII限制性酶切位點(diǎn)。將所述擴(kuò)增片段克隆至pGemT。CAGCTGGATGTCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCC(SEQIDNO:36)將197bpXbal/PvuII片段從pGemT上切下，然后將其連接至hA20VK穿梭載體h2B8-Vk-pBR2(使用Xbal和PvuII消化制成)。得到新的穿梭載體AD2-K-hA20-pBR2。將536bpXbal/BamHI限制性片段從AD2-K-hA20-pBR上切下，然后將其連接至hA20-IgG-pDHL2載體(使用Xbal和BamHI消化制成)以制備表達(dá)載體N-L-AD2-hA20-IgG-pdHL2。使用N-L-AD2-hA20-IgG-pdHL2通過電穿孔轉(zhuǎn)染Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染之后，用所迷細(xì)胞涂布96孔板，并在包含甲氨蝶呤的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因克隆。使用涂布hA20特異性抗獨(dú)特型MAb的96孔微滴定板通過夾心ELISA篩選克隆的C-H-AD2-hLL2IgG生產(chǎn)率，并使用軛合過氧化物酶的抗人IgG進(jìn)行檢測(cè)。使用轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增克隆以制備蛋白質(zhì)，并使用單步蛋白-A親和層析從耗盡的培養(yǎng)基中純化N-L-AD2-hA20IgG。尺寸排阻HPLC表明，制品中絕大部分的N-L-AD2-hA20IgG為單體形式，其保留時(shí)間類似于IgG。還觀察到兩個(gè)其他峰，它們很可能代表二硫鍵連接的二聚體和三聚體形式，并且每種形式占總蛋白的大約15%(圖17A)。溫和還原制品(如DNL反應(yīng)中所用)使二聚體和三聚體形式轉(zhuǎn)化為單體形式(圖17B)。三種形式的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)略圖如圖18所示。實(shí)施例28.Hex-hA20的制備使用DNL方法將C-H-AD2-hA20IgG(請(qǐng)參見實(shí)施例26)和hA20-Fab-DDD2組合，以制備單特異性抗CD20HIDS，即Hex-hA20。Hex-hA20結(jié)構(gòu)包含六個(gè)抗CD20Fab片段和一個(gè)Fc片段(圖10)。Hex-hA20的制備包括四步。步黎/，必#:210%摩爾等量的(hA20-Fab-DDD2)2與C-H-AD2-hA20IgG混合。使用此摩爾比是因?yàn)閮蓚€(gè)Fab-DDD2二聚體偶聯(lián)至各個(gè)C-H-AD2-hA20IgG分子，前者附加10%過量以確保偶l關(guān)反應(yīng)完成。C-H-AD2-hA20IgG和(hA20-Fab-DDD2)2的分子量分別為168kDa和107kDa。作為實(shí)例，134mghA20-Fab-DDD2與100mgC-H-AD2-hA20IgG混合，以達(dá)到前者的210%摩爾等量。此混合物通常使用含1mMEDTA的pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)制備。#錄"，加入終濃度1mM的還原型谷胱甘肽(GSH),然后將溶液在室溫(16-25°。);改置1-24小時(shí)。##3，溫々真^:還原之后，向反應(yīng)混合物中直4秦加入終濃度2mM的氧化型谷胱甘肽(GSSH),然后將溶液在室溫放置1-24小時(shí)。#錄"，^岸LW丄Z參氧化之后，將反應(yīng)混合物直接加至蛋白-A親和層析柱。使用PBS洗滌該柱，并使用0.1M甘氨酸、pH2.5洗脫Hex-hA20。因?yàn)榉磻?yīng)中使用了過量的hA20-Fab-DDD2,所以不存在未輒合的C-H-AD2-hA20IgG或僅包含一個(gè)(hA20-Fab-DDD2)2部分的不完整DNL結(jié)構(gòu)。未輒合的過量hA20-Fab-DDD2不與親和樹脂結(jié)合；因此，經(jīng)蛋白A純化的物質(zhì)僅包含所需產(chǎn)物。才艮據(jù)組成性多肽的推測(cè)氨基酸序列計(jì)算的分子量為386kDa。尺寸排阻HPLC分析顯示保留時(shí)間對(duì)應(yīng)于375-400kDa的蛋白結(jié)構(gòu)的單一蛋白峰(圖19)。非還原條件下的SDS-PAGE分析顯示一簇高分子量條帶，表明形成了大的共價(jià)結(jié)構(gòu)(圖20A,泳道3)。還原條件下的SDS-PAGE(圖20B,泳道3)顯示^又存在三個(gè)預(yù)期的多肽鏈融合AD2的重鏈(HC-AD2)、融合DDD2的Fd鏈(Fd-DDD2)和k鏈。實(shí)施例29.Hex-hLL2的制備使用DNL方法將C-H-ADthLL2IgG(請(qǐng)參見實(shí)施例2》和hLL2-Fab-DDD2組合，以制備單特異性抗CD22HIDS(Hex-hLL2)。DNL反應(yīng)按實(shí)施例28中描述的制備Hex-hA20的方法進(jìn)行。根據(jù)組成性多肽的推測(cè)氨基酸序列計(jì)算的分子量為386kDa。尺寸排阻HPLC分析顯示保留時(shí)間對(duì)應(yīng)于375-400kDa的蛋白結(jié)構(gòu)的單一蛋白峰(圖21)。非還原條件下的SDS-PAGE分析顯示一簇高分子量條帶，表明形成了大的共價(jià)結(jié)構(gòu)(圖20A，泳道4)。還原條件下的SDS-PAGE(圖20B,泳道4)顯示Y義存在三個(gè)預(yù)期的多肽鏈HC-AD2、Fd-DDD2和K鏈。實(shí)施例30.DNL1和DNL1C的制備使用DNL方法制備雙特異性HIDS,將C-H-AD2-hLL2IgG(請(qǐng)參見實(shí)施例25)和hLL2-Fab-DDD2組合以獲得DNL1,或者與hMN-14-DDD2組合以獲得DNL1C。DNL1具有四個(gè)CD20結(jié)合臂和兩個(gè)CD22結(jié)合臂。因?yàn)閔MN-14為癌胚抗原(CEA)的人源化MAb，所以DNL1C具有四個(gè)CEA結(jié)合臂和兩個(gè)CD22結(jié)合臂。DNL反應(yīng)按實(shí)施例28中描述的制備Hex-hA20的方法進(jìn)行。對(duì)于DNL1和DNL1C而言，根據(jù)組成性多肽的推測(cè)氨基酸序列計(jì)算的分子量均為~386kDa。尺寸排阻HPLC分析顯示每個(gè)結(jié)構(gòu)均存在保留時(shí)間對(duì)應(yīng)于375-400kDa的蛋白結(jié)構(gòu)的單一蛋白峰(DNLl,圖22A;DNL1C,圖22B)。非還原條件下的SDS-PAGE分析顯示一簇高分子量條帶，表明形成了大的共價(jià)結(jié)構(gòu)(圖20A，泳道l&5)。還原條件下的SDS-PAGE(圖20B,泳道l&5)顯示所述大的共價(jià)結(jié)構(gòu)僅由三個(gè)預(yù)期的多肽組成HC-AD2、Fd-DDD2和K鏈。實(shí)施例31.DNL2和DNL2C的制備使用DNL方法制備雙特異性HIDS，將C-H-AD2-hA20IgG(請(qǐng)參見實(shí)施例26)和hLL2-Fab-DDD2組合以獲得DNL2，或者與hMN-14-DDD2組合以獲得DNL2C。DNL2具有四個(gè)CD22結(jié)合臂和兩個(gè)CD20結(jié)合臂。DNL2C具有四個(gè)CEA結(jié)合臂和兩個(gè)CD20結(jié)合臂。DNL反應(yīng)按實(shí)施例28中描述的制備Hex-hA20的方法進(jìn)行。對(duì)于DNL2和DNL2C而言，根據(jù)組成性多肽的推測(cè)氨基S吏序列計(jì)算的分子量均為~386kDa。尺寸排阻HPLC分析顯示每個(gè)結(jié)構(gòu)均存在保留時(shí)間對(duì)應(yīng)于375-400kDa的蛋白結(jié)構(gòu)的單一蛋白峰(圖23)。非還原條件下的SDS-PAGE分析顯示一簇高分子量條帶，表明形成了大的共價(jià)結(jié)構(gòu)(圖20A,泳道2&6)。還原條件下的SDS-PAGE(圖20B，泳道2&6)顯示所述大的共價(jià)結(jié)構(gòu)僅由三個(gè)預(yù)期的多肽組成HC-AD2、Fd-DDD2和k鏈。實(shí)施例32.K-Hex-hA20的制備使用DNL方法將N-L-AD2-hA20IgG(請(qǐng)參見實(shí)施例2"和hA20-Fab-DDD2組合，以制備單特異性抗CD20HIDS(K-Hex-hA20)。DNL反應(yīng)按實(shí)施例28中描述的制備Hex-hA20的方法進(jìn)行。根據(jù)組成性多肽的推測(cè)氨基酸序列計(jì)算的分子量為386kDa。非還原條件下的SDS-PAGE分析顯示一簇高分子量條帶，表明形成了大的共價(jià)結(jié)構(gòu)(圖24，泳道2&3)。還原條件下的SDS-PAGE(圖24，泳道2R&3R)顯示所述大的共Y介結(jié)構(gòu)僅由四個(gè)預(yù)期的多肽組成Fd-DDD2、H鏈、k鏈和AD2-k。實(shí)施例33.DNL3的制備通過組合N-L-AD2-hA20IgG(請(qǐng)參見實(shí)施例27)和hLL2-Fab-DDD2制備了雙特異性HIDS。DNL反應(yīng)按實(shí)施例28中描述的制備Hex-hA20的方法進(jìn)行。根據(jù)組成性多肽的推測(cè)氨基酸序列計(jì)算的分子量為386kDa。尺寸排阻HPLC分析顯示保留時(shí)間對(duì)應(yīng)于375-400kDa的蛋白結(jié)構(gòu)的單一蛋白峰(圖25)。非還原條件下的SDS-PAGE分析顯示一簇高分子量條帶，表明形成了大的共4介結(jié)構(gòu)(圖24，泳道l)。還原條件下的SDS-PAGE(圖24,泳道l)顯示所述大的共價(jià)結(jié)構(gòu)僅由四個(gè)預(yù)期的多肽組成Fd-DDD2、H鏈、k鏈和AD2-k。實(shí)施例34.HIDS的體外鑒定如圖26和27所示，按實(shí)施例28-33所述方法制備的HIDS保留了其親本Fab/IgG的結(jié)合特性。使用竟?fàn)嶦LISA研究不同HIDS的結(jié)合親和力，使用hA20的鼠抗獨(dú)特型MAb(WR2)以評(píng)估hA20組分的結(jié)合活性，或者使用hLL2的鼠抗獨(dú)特型MAb(WN)以評(píng)估hLL2組分的結(jié)合活性。為了評(píng)估hA20結(jié)合，使用hA20IgG涂布ELISA板，然后讓所述HIDS與固定的IgG竟?fàn)嶹R2結(jié)合。為了評(píng)估hLL2結(jié)合，使用hLL2IgG涂布平板，然后讓所述HIDS與固定的IgG竟?fàn)嶹N結(jié)合。與固定的IgG結(jié)合的抗Id的相對(duì)量使用軛合過氧化物酶的抗鼠IgG進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)CD20結(jié)合親和力顯示于圖26A。DNL2(具有兩個(gè)CD20結(jié)合基團(tuán))顯示出與hA20IgG(也具有兩個(gè)CD20結(jié)合臂)相似的結(jié)合親和力。DNLl(具有四個(gè)CD20結(jié)合基團(tuán))的相對(duì)親和力強(qiáng)于(4倍)DNL2或hA20IgG。Hex-hA20(具有六個(gè)CD20結(jié)合基團(tuán))的相對(duì)親和力更強(qiáng)于(10倍)hA20IgG。CD22結(jié)合有類似發(fā)現(xiàn)，如圖26B所示。DNL1(具有兩個(gè)CD20結(jié)合基團(tuán))顯示出與hLL2IgG(也具有兩個(gè)CD22結(jié)合臂)相似的結(jié)合親和力。DNL2(具有四個(gè)CD22結(jié)合基團(tuán))的相對(duì)親和力強(qiáng)于(>5倍)DNL1或hLL2IgG。Hex-hLL2(具有六個(gè)CD22結(jié)合基團(tuán))的相對(duì)親和力更強(qiáng)于(>10倍)h!X2IgG。因?yàn)镈NL2和DNL3均包含兩個(gè)hA20Fab和四個(gè)hLL2Fab,所以它們對(duì)同一抗id抗體顯示出相似的結(jié)合強(qiáng)度(圖27)。其中某些HIDS顯示出對(duì)淋巴瘤細(xì)胞系的有效抗增殖活性。DNL1、DNL2和Hex-hA20在體外抑制Daudi伯基特淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖28)。使用10nM濃度處理所述細(xì)胞時(shí)，所述HIDS確實(shí)比利妥昔單抗更加有效(圖28A)。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，預(yù)計(jì)DNL1和DNL2的效力要比利妥昔單抗的效力大出100倍，而Hex-hA20表現(xiàn)出更強(qiáng)的效力(圖28B)。這已為MTS增殖分析證實(shí)，該分析生成了使用不同濃度的HIDS處理Daudi細(xì)胞的劑量-反應(yīng)曲線(圖29)。與利妥昔單抗相比，雙特異性HIDS(DNL1和DNL2)和Hex-hA20分別表現(xiàn)出>100倍和>10000倍的效力。實(shí)施例35.HIDS的體內(nèi)抗腫瘤活性在使用人伯基特淋巴瘤模型的小鼠中，HIDS表現(xiàn)出體內(nèi)治療效力(圖30)。低劑量(12嗎)的DNL2和Hex-hA20使荷瘤小鼠的存活時(shí)間增加兩倍以上。使用高劑量(60jLig)治療得到長(zhǎng)期存活者。實(shí)施例36.HIDS和親本IgG對(duì)淋巴瘤細(xì)胞系的效應(yīng)比較使用MTS增殖分析，比較了三種不同的淋巴瘤細(xì)胞系中HIDS(DNL1、DNL2、Hex-hA20)與親本IgG(hA20IgG)的劑量-反應(yīng)曲線(圖31)。在Daudi淋巴瘤細(xì)胞中(圖31，上組)，與親本hA20IgG相比，雙特異性結(jié)構(gòu)DNL1(未顯示)和DNL2表現(xiàn)出〉100倍的有效抗增殖活性，且Hex-hA20顯示出>10,000倍的有效活性。Hex-hLL2和對(duì)照結(jié)構(gòu)(DNL1-C和DNL2-C)在此分析中幾乎未表現(xiàn)出抗增殖活性(未顯示)。在Raji淋巴瘤細(xì)胞中(圖31，中組)，與hA20IgG相比，Hex-hA20顯示出有效的抗增殖活性，但DNL2僅顯示出極小的活性。在Ramos淋巴瘤細(xì)胞中(圖31，下組)，與hA20IgG相比，DNL2和Hex-hA20均顯示出有效的抗增殖活性。這些結(jié)果表明，HIDS的效力高于親本IgG并不限于特定細(xì)胞系，而是具有合適靶標(biāo)的細(xì)胞的普遍現(xiàn)象。實(shí)施例37.交^tHIDS和親本IgG的效力的影響已表明，抗CD20單克隆抗體的交聯(lián)可增強(qiáng)它們?cè)隗w外的效力。圖32使用MTS分析，顯示了交聯(lián)對(duì)HIDS相對(duì)親本IgG的效力的影響。如圖32所示，與非交聯(lián)hA20IgG相比，使用通過山羊抗人IgGFc特異性交聯(lián)劑交聯(lián)的hA20IgG治療Daudi淋巴瘤細(xì)胞時(shí)同樣存在此影響。但是，未觀察到存在交聯(lián)劑條件下DNL2或Hex-hA20抗增殖活性的增加。如下所述，這可能是因?yàn)楫?dāng)其他四個(gè)Fab基團(tuán)拴結(jié)至HIDS的羧基末端時(shí)，其Fc部分變得無法接近。實(shí)施例38.血清中的穩(wěn)定性圖33顯示DNL1和DNL2在人血清中的穩(wěn)定性，采用雙特異性ELISA分析確定。10pg/ml的所述蛋白結(jié)構(gòu)與新鮮采集的人血清在37。C和5%C02條件下孵育五天。對(duì)于第O天的樣品，小份試樣在用血清稀釋后立即用液氮冷凍。用hA20IgG的抗Id涂布ELISA平板，然后用hLL2IgG的抗Id檢測(cè)雙特異性結(jié)合。DNL1和DNL2均顯示了高度的血清穩(wěn)定性，并保持了完全的雙特異結(jié)合活性。實(shí)施例39.CDC和ADCC活性在體內(nèi)，抗CD20單克隆抗體(如利妥昔單抗和hA20)可利用補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制/凋亡來殺傷腫瘤細(xì)胞。在體外分析中，使用Daudi細(xì)胞測(cè)試了所述六價(jià)DNL結(jié)構(gòu)(DNL1、DNL2、Hex-hA20)的CDC活性。令人驚奇的時(shí)，所有與CD20結(jié)合的六價(jià)結(jié)構(gòu)均未表現(xiàn)出CDC活性(圖34)。親本hA20IgG表現(xiàn)出有效的CDC活性(圖34),而同所預(yù)料的一樣，針對(duì)CD22的hLL2抗體未顯示活性。DNL2和Hex-hA20沒有影響是值得關(guān)注的，因?yàn)樗鼈儼琱AlO-IgG-Ad2，而該結(jié)構(gòu)顯示出與hA20IgG類似的陽性CDC活性(圖34)。使用新鮮分離的外周血單核細(xì)胞評(píng)估了DNL1的ADCC活性(圖35)。利妥昔單抗和hA20IgG均顯示出對(duì)Daudi細(xì)胞的有效活性(圖35),而DNL1則未顯示出任何可檢測(cè)的ADCC活性。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)其他四個(gè)Fab基團(tuán)拴結(jié)至其羧基末端時(shí)，所述Fc部分可變得無法發(fā)揮效應(yīng)功能(CDC和ADCC)。因此，所迷六價(jià)DNL結(jié)構(gòu)的體內(nèi)抗腫瘤活性僅依賴于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制/凋亡。表1.LS174T荷瘤棵小鼠中125I-TF2的腫瘤吸收和組織清除<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表2.LS174T荷瘤小鼠中TF2的血液藥物動(dòng)力學(xué)<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表3.LS174T荷瘤棵小鼠中TF2的胂瘤吸收和組織清除<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>表5.使用TF2預(yù)靶向"，c-肽(IMP-245)時(shí)的T/NT比率<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>表6.包含兩種類型抗原結(jié)合亞基的復(fù)合體的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>表8.具有兩種不同類型效應(yīng)物亞基的復(fù)合體的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>表IO.具有一種效應(yīng)物亞基的復(fù)合體的實(shí)例<table>complextableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>權(quán)利要求1.一種六聚穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，其包含與兩個(gè)AD2(SEQIDNO:4)部分連接的IgG抗體和四個(gè)相同或不同IgG的抗體片段，其中每個(gè)片段均與DDD2(SEQIDNO:2)部分連接；所述AD2部分與所述DDD2部分結(jié)合。2.如權(quán)利要求l所述的結(jié)構(gòu)，其中所述AD2部分通過二硫鍵與所述DDD2部分共價(jià)連4妾。3.如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)包含6個(gè)Fab片段和1個(gè)Fc片段。4.如權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)所述Fab片段都與相同的抗原表位結(jié)合。5.如權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)，其中2個(gè)所述Fab片段與第一抗原表位結(jié)合，且4個(gè)所述Fab片段與第二抗原表位結(jié)合。6.如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)，其中所述抗體或抗體片段為人、人源化或嵌合的抗體或抗體片段。7.如權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)，其中所述Fab片段選自由hMN-14、L19、hA20、hLL2、hL243、hCC49、7E3、h!Xl、hPAM4、hRS7、rHl、L49、抗CD14、抗CD111、阿達(dá)木單抗、英利昔單抗、奧馬珠單抗、帕利珠單抗和hMN-15的Fab片革史組成的組。8.如權(quán)利要求l所述的結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體和/或抗體片段與選自由以下組成的組的抗原結(jié)合碳酸酐酶IX、曱胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba733、BrE3抗原、CA125、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP誦1、EGP-2、Ep-CAM、Flt國l、Flt-3、葉酸受體、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞基、HER2/neu、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS卜4、Le-Y、巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、而C1、固C2、而C3、而C4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤生長(zhǎng)因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受體、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、ED-B纖連蛋白、17-1A抗原、血管生成標(biāo)志物、致癌基因標(biāo)志物或致癌基因產(chǎn)物。9.如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)，其進(jìn)一步包含通過共價(jià)或非共價(jià)連接與所述結(jié)構(gòu)扼合的一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)物或載體。10.如權(quán)利要求9所述的結(jié)構(gòu)，其中所述效應(yīng)物為診斷劑、治療劑、化療劑、放射性同位素、顯像劑、抗血管生成劑、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、藥物、前體藥物、酶、結(jié)合分子、細(xì)胞表面受體的配體、螯合劑、免疫調(diào)節(jié)劑、寡核苷酸、激素、可光^^測(cè)的標(biāo)記、染料、肽、毒素、造影劑、順磁標(biāo)記、超聲標(biāo)記、促凋亡劑、脂質(zhì)體、納米粒子或其組合。11.如權(quán)利要求l所述的結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體和抗體片段具有對(duì)靶分子、復(fù)合物、聚集體、細(xì)胞、抗原或組織的結(jié)合親和力。12.如權(quán)利要求l所述的結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體具有對(duì)靶分子、復(fù)合物、聚集體、細(xì)胞、抗原或組織的結(jié)合親和力，并且至少一個(gè)抗體片段具有半抗原的結(jié)合位點(diǎn)。13.如權(quán)利要求12所述的結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體具有對(duì)以下物質(zhì)的結(jié)合親和力細(xì)胞表面受體、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖普酶、tpA、鏈激酶、水蛭素、尿激酶、CA19-9、CEA、CEACAM6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD74、ED-B纖連蛋白、EGFR、GD2、G250抗原、HER2/neu、hTR、II類HLA、HMW/MAA、HN/NDV、IGF1R、IL-2R/Tac、IL-17、MUC1、PSMA、M13外殼蛋白、GpIIb/IIIa、CD74、EGP國1、CD25/Tac、LeY、間皮素、Erb誦B2、Erb國B3、EpCAM、GP240、GPlIb/IIIa、p97、CD3、IL國4R、IL-4、IL隱13、VEGFR-2、CD14、CD111/連4矣素-l、葉酸受體a、gpl20、IL-6、11-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-1、卩-胰蛋白酶、CD105/內(nèi)皮糖蛋白、TNFa、RSVF蛋白、CEA的A1B1、CEA的N結(jié)構(gòu)域、PfMSP-l、TAG-72、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、VEFGR1/Flt-1、VEGFR2/KDR或VEGRF3/Flt扁4。14.如權(quán)利要求13所述的結(jié)構(gòu)，其中至少一個(gè)抗體片段具有對(duì)IL-17、組胺琥珀酰甘氨酸(HSG)、銦-DTPA、CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt-4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2、腺病毒纖突結(jié)、M13外殼蛋白、GpIIb/IIIa、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖普酶、tpA、鏈激酶、水蛭素或尿激酶的結(jié)合親和力。15.如權(quán)利要求12所述的結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體具有對(duì)選自由CEA、ED-B纖連蛋白、CD20、CD22、CD19、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3Mt-4、HER2/neu、CD30、CD33、P歸P-1、HN/NDV、EpCAM/17-lA、hTR、IL畫2R/Tac、CA19畫9、固C1、II類HLA、GD2、G250、TAG-72、PSMA、CEACAM6、HMWMAA、CD40、Ml3外殼蛋白和GPlIb/IIIa組成的組的細(xì)胞表面抗原的結(jié)合親和力，并且其中至少一個(gè)抗體片段具有對(duì)選自由組胺琥珀酰甘氨酸(HSG)和銦-DTPA組成的組的半抗原或者選自由CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt誦4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2和腺病毒纖突結(jié)組成的組的細(xì)胞表面抗原的結(jié)合親和力。16.如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體具有對(duì)選自由M13外殼蛋白和GpIIb/IIIa組成的組的細(xì)胞表面抗原或者選自由堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、p-半乳糖苷酶、tpA、鏈激酶、水蛭素和尿激酶組成的組的生物分子的結(jié)合親和力，并且其中至少一個(gè)抗體片段具有對(duì)選自由M13外殼蛋白和GpIIb/IIIa組成的組的細(xì)胞表面抗原或者選自由堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、tpA、鏈激酶、水蛭素和尿激酶組成的組的生物分子的結(jié)合親和力。17.如權(quán)利要求l所述的結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體和所述抗體片段與相同抗原結(jié)合，所述抗原選自由CD14、CDll/連接素-l、葉酸受體a、gp120、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-1、J3-胰蛋白酶、CD105/內(nèi)皮糖蛋白、GpIIb/IIIa、TNFa、RSVF蛋白、CEA的A1B1和CEA的N結(jié)構(gòu)域組成的組。18.如權(quán)利要求5所述的結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體和所述抗體片段與下述抗原組合結(jié)合CD20/CD22;CD20/CD74;CD20/HLA-DR;CD22/CD74;CD22/HLA-DR;CD74/HLA-DR;CD74/CEA或HLA-DR/CEA。19.一種方法，其包括a)獲得權(quán)利要求l所述的六聚穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)；和b)將該結(jié)構(gòu)施用至患有疾病或病癥的受治療者；其中所述結(jié)構(gòu)對(duì)所述疾病或病癥具有治療效果。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述疾病或病癥為癌癥或自身免疫疾病。21.如4又利要求20所述的方法，其中所述疾病或病癥為癌癥，并且所述IgG抗體和/或至少一個(gè)所述抗體片段具有對(duì)選自由以下組成的組的腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合親和力碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba733、BrE3抗原、CA125、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、EGFR、EGP-1、EGP誦2、Ep-CAM、Flt-l、Flt-3、葉酸受體、G250抗原、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞基、HER2/neu、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤生長(zhǎng)因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受體、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、ED-B纖連蛋白、17-1A抗原、血管生成標(biāo)志物、致癌基因標(biāo)志物和致癌基因產(chǎn)物。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其進(jìn)一步包括將一種或多種抗癌治療與所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)聯(lián)合施用。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述治療包括施用化療劑、細(xì)胞因子、放射治療、免疫治療、放射免疫治療、局部過熱、激光照射、抗血管生成劑或手術(shù)切除。24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中至少一個(gè)所述抗體片段具有對(duì)半抗原的結(jié)合親和力。25.如權(quán)利要求24所迷的方法，其進(jìn)一步包括將所述半抗原施用至所述受治療者。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述半抗原連接至選自由抗血管生成劑、化療劑、細(xì)胞因子、藥物、前體藥物、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)劑、抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、激素、結(jié)合分子、脂質(zhì)、聚合物、膠束、脂質(zhì)體、納米粒子或其組合所組成的組的試劑。27.如權(quán)利要求19所迷的方法，其中所述疾病或病癥由真菌、病毒、細(xì)菌或寄生蟲引起。28.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述疾病或病癥為自身免疫疾病。29.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)包含選自由以下組成的組的IgG抗體和抗體片段的組合抗CD74X抗CD20、抗CD74X抗CD22、抗CD22X抗CD20、抗CD20X抗HLA-DR、抗CD19X抗CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8X抗CD25、抗CD2X抗CD147、抗CEACAM5X抗CD3、抗CEACAM6X抗CD3、抗EGFRX抗CD3、抗HER2/neuX抗CD3、抗CD20X抗CD3、抗CD74X抗CD3和抗CCD22X抗CD3。30.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述疾病或病癥為神經(jīng)退行性疾病、阿爾茨海默病、代謝性疾病、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化或器官移植排斥反應(yīng)。31.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述癌癥選自由上皮癌、間充質(zhì)癌、血液系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)腫瘤、惡瘤、黑色素瘤、肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、白血病、'淋巴瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和骨髓瘤組成的組。32.—種診斷疾病或病癥的方法，其包括a)獲得權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，其中所述IgG抗體與和所述病癥相關(guān)的靶分子、復(fù)合物、聚集體、細(xì)胞、抗原或組織結(jié)合，并且至少一個(gè)抗體片段與診斷性半抗原結(jié)合；b)將所述結(jié)構(gòu)施用至疑似患有疾病或病癥的受治療者；c)向同一受治療者施用與所述至少一個(gè)抗體片段結(jié)合的診斷性半抗原；和d)才全測(cè)與所述穩(wěn)定"f全結(jié)結(jié)構(gòu)結(jié)合的所述半抗原的存在；其中所迷半抗原至所迷病癥相關(guān)的組織的定位，確-珍所述受治療者中所述疾病或病癥的存在。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述半抗原與診斷性放射性核素、磁共振成像(MRI)造影劑、超聲成像增強(qiáng)劑、PET顯像劑、熒光劑或發(fā)光劑軛合。全文摘要本發(fā)明涉及確定組分的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的方法和組合物，所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可能具有多種功能和/或結(jié)合特異性。優(yōu)選實(shí)施方案涉及包含一個(gè)或多個(gè)IgG抗體片段的六聚穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)，并且該結(jié)構(gòu)可以是單特異性或雙特異性。所公開的方法和組合物提供了容易、通用的獲得具有基本上任何功能和/或結(jié)合特異性的穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)的途徑。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可以被施用至受治療者用于診斷和/或治療用途，例如用于治療癌癥或自身免疫疾病。所述穩(wěn)定拴結(jié)結(jié)構(gòu)可以與多種已知的效應(yīng)物結(jié)合和/或軛合，所述效應(yīng)物如藥物、酶、放射性核素、治療劑和/或診斷劑。文檔編號(hào)A61K39/00GK101374546SQ200680052809公開日2009年2月25日申請(qǐng)日期2006年12月5日優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日發(fā)明者大衛(wèi)·高德寳,張健行,愛得盟·羅希申請(qǐng)人:Ibc醫(yī)藥公司