專利名稱：：皮膚護(hù)理組合物以及處理的制作方法皮月夫護(hù)理組合物以及處理發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的領(lǐng)域是細(xì)胞培養(yǎng)以及醫(yī)藥生物技術(shù)，特別是含有培養(yǎng)的皮膚試劑(culturedskinagents)的組合物，所述皮膚試劑是從獲自皮膚的培養(yǎng)細(xì)胞合成的。皮膚細(xì)胞例如角質(zhì)形成細(xì)胞以及真皮成纖維細(xì)月包是在細(xì)胞培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)的，在培養(yǎng)的過程中培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)合成并且分泌試劑到細(xì)胞培養(yǎng)基中。收集含有試劑的培養(yǎng)基并且摻入局部制劑用于處理個(gè)人。該制劑纟支用于個(gè)人的皮膚,并對(duì)細(xì)胞和組織有更新的作用，以減少細(xì)紋和鈹紋的出現(xiàn)。本發(fā)明背景的簡(jiǎn)述隨著皮膚老化,干燥及彈性喪失會(huì)變得越來越普遍。另外,暴露于日光,風(fēng),污染及其他外來刺激和環(huán)境壓力會(huì)加重皮膚的老化。作為長(zhǎng)時(shí)間紫外線照射的結(jié)果，皮膚結(jié)構(gòu)及功能成分的改變共同地;波稱為光老化或光損傷。認(rèn)為光老化的大多數(shù)臨床特征是隨時(shí)間發(fā)生的老化特征，即，老年斑(光化斑點(diǎn))及皺紋。可以預(yù)料當(dāng)前的生活方式有所轉(zhuǎn)變，皮膚在太陽下的暴露越來越多以及人造的紫外源及對(duì)皮膚隨后的紫外線(UV)慢性效應(yīng)，因此要求醫(yī)治以改善異常皮膚的光老化患者的數(shù)目會(huì)越來越多。在一般群體中，光老化的差異取決于皮膚類型(如，淺色的皮膚會(huì)比深色的皮膚更容易光老化)，并且，在過早老化的皮膚中在色素沉著方面的變化似乎是比皺紋更重要的特征。這些差異可能是由于個(gè)體在日光暴露下的內(nèi)在差別以及對(duì)陽光長(zhǎng)期暴露的天然防衛(wèi)機(jī)理的關(guān)系。紫外線的長(zhǎng)期暴露會(huì)引起皮膚細(xì)胞成分的特征變化。一些臨床體征，包括細(xì)及粗的皺紋，色素的改變，粗糙，松弛，灰黃以及毛細(xì)血管擴(kuò)張(凸出的細(xì)血管)，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)過早的老化并且對(duì)某些生活質(zhì)量方面產(chǎn)生顯著影響。在組織學(xué)上觀察到表皮的萎縮以及發(fā)育異常，真皮的彈性組織變性及增強(qiáng)的黑素細(xì)胞活性。發(fā)育異常及肺瘤的改變例如光化性角化病及基底和鱗狀細(xì)胞癌同樣是光老化皮膚的極端特征。盡管老化已被認(rèn)為是不可逆的，但是在上個(gè)十年間進(jìn)行的研究顯示一些局部的化合物和外科方法能夠改善老化相關(guān)的表皮損傷。手術(shù)和介入性處理包括面部提升，皮膚擦除術(shù)，激光表面重修(resurfacing),肉毒素注射和膠原注射。這些手術(shù)處理在光老化皮膚中產(chǎn)生了臨床和組織學(xué)的改良，但是帶有一定風(fēng)險(xiǎn)，并且不包含預(yù)防成分。為改善皮膚外觀，已經(jīng)開發(fā)了許多皮膚護(hù)理產(chǎn)品和皮膚護(hù)理處理。此外，已經(jīng)開發(fā)了各種醫(yī)學(xué)處理方法用于處理慢性皮膚問題，例如4分刺，癌前病變，疤痕，色素沉著紊亂，皺紋等等。目前有一些正在被使用或被研究的最近的局部施用的皮月夫護(hù)理產(chǎn)品和皮膚護(hù)理處理。例如，維生素-A(視黃醇)和被稱為類視黃醇的維生素-A衍生物是局部處理，被認(rèn)為通過放松皮膚的頂層并且促使細(xì)胞更新而發(fā)揮作用。局部施用能夠中和自由基的維生素C(抗壞血酸)可修復(fù)皮膚并且減少細(xì)紋及皺紋。局部施用維生素K可幫助修復(fù)石皮裂的血管，網(wǎng)狀靜脈，瘀傷，黑眼圈及皮膚紅斑。a-羥酸(AHAs)及P國(guó)羥酸(BHAs)是改善皮膚活力及預(yù)防粉刺的局部脫落劑(exfoHant)。局部施用表皮生長(zhǎng)因子(EGF)可以改善皮膚功能并產(chǎn)生總體更年輕的外觀。研究人員繼續(xù)研究那些導(dǎo)致老化外觀的皮膚特征。在老化研究中的一個(gè)使人感興趣的皮膚特征是Grenz區(qū)域。Grenz區(qū)域是均質(zhì)物質(zhì)的一個(gè)條帶，其在真皮中被發(fā)現(xiàn)，緊挨在缺少耐酸纖維(oxytalanfiber)(即，彈性蛋白纖維)的表皮之下。Grenz區(qū)i或是嗜酸性的，即當(dāng)用蘇木精和伊紅染料染色時(shí)呈現(xiàn)粉紅色。雖然有人定義Grenz區(qū)域相當(dāng)于真皮乳頭，^f旦是事實(shí)并非如此。Grenz區(qū)域構(gòu)成不同程度的真皮乳頭，但是其并非等同于真皮乳頭，因?yàn)镚renz區(qū)域的染色特性十分獨(dú)特。Grenz區(qū)域是新膠原(I和III型)沉積的結(jié)果，最近的研究顯示Grenz區(qū)域變厚是膠原mRNA合成增多的結(jié)果。在近幾年的文獻(xiàn)中記載在Grenz區(qū)域中會(huì)有一些新彈性蛋白的沉積(緊挨著在基底膜之下)。在光致?lián)p傷和老化誘導(dǎo)的改變中，由于在真皮乳頭中光老化與斷裂物質(zhì)(即，斷裂的老化彈性蛋白)的積累相關(guān)，所以增加的Grenz區(qū)域厚度可以通過新膠原的沉積來彌補(bǔ)這種組織柔韌性的損失。作為以獲取更年輕皮膚外觀為目的進(jìn)行的整形或面部手術(shù)的一種替代，許多人選擇介入性小于手術(shù)方法的皮膚表面重修處理。這些方法包括激光去皮術(shù)，化學(xué)去皮術(shù)，皮膚擦除術(shù)和皮膚光滑術(shù)(dermaplanmg)。所有的皮膚表面重修處理基本上以同樣的方式發(fā)揮作用。首先，剝離受損皮膚的外層，達(dá)到皺紋和疤痕水平的深度到周圍皮膚的水平。至于表淺的或中間的表面重修術(shù)，去除的各層皮膚組織可被限制在表皮和真皮乳頭。至于較深的表面重修術(shù)，還可以去除網(wǎng)狀真皮的上層水平。不同的穿透可以處理特定的斑點(diǎn)或皺紋。在處理之后的時(shí)間內(nèi)，由于在修復(fù)過程期間新細(xì)胞增殖并遷移到表面重^f'務(wù)的區(qū)域，會(huì)呈現(xiàn)出更光滑、緊致、更顯年輕的皮膚。在修復(fù)過程期間，皮膚護(hù)理產(chǎn)品被用于處理過的區(qū)域以增強(qiáng)和加速皮膚修復(fù)。廣泛存在各種能改善光老化皮膚的化妝品制劑，但其效果并不清楚。因此，考慮到如此大量的效果未知的處理，鑒定那些對(duì)控制光老化有效且安全的制劑對(duì)我們來說是十分重要的。由此，化妝品工業(yè)和制藥公司的持續(xù)目標(biāo)是研制皮膚護(hù)理產(chǎn)品和皮膚護(hù)理處理，用于改善皮膚外觀及增進(jìn)受損皮膚的修復(fù)過程。發(fā)明概述本發(fā)明根據(jù)下述發(fā)現(xiàn)經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基(conditionedcellmedium)可被制備到組合物或制劑中，用于局部地處理皮膚。本發(fā)明的組合物是經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，其含有一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑，所述試劑由來自培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞合成和分泌，該組合物可用作藥物制劑或作為皮膚護(hù)理產(chǎn)品。作為藥物制劑，含有經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基的該產(chǎn)品局部施用，用于處理皮膚狀況，例如促進(jìn)傷口愈合。該局部組合物可以包括任何適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受載體。作為皮膚護(hù)理產(chǎn)品或作為皮膚護(hù)理處理，含有經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基的該產(chǎn)品以足以增加細(xì)胞增殖和產(chǎn)生的量被局部地施用于皮膚，用于改進(jìn)皮力夫的外觀，并且減少細(xì)力包衰老。本發(fā)明還涉及制備組合物或制劑的方法，該組合物或制劑含有經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有由培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑。該方法包括在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)皮膚細(xì)胞，所述皮膚細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，或優(yōu)選共培養(yǎng)這兩種細(xì)胞類型，以使皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)，然后誘導(dǎo)細(xì)胞合成并分泌一種或多種細(xì)胞因子到培養(yǎng)基中。因此將制備的經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基一一目前含有一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑——與培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞分離并用于制備組合物或制劑，用于局部施用到皮膚。圖1描述了用于形成皮膚構(gòu)建體的儀器，所述皮膚構(gòu)建體能產(chǎn)生細(xì)胞因子并將其沉積到周圍培養(yǎng)基中用于對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)。附圖2顯示經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞集落大小的作用。附圖3顯示經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用。附圖4顯示經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞在血纖蛋白上遷移的作用。附圖5顯示經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞螺旋轉(zhuǎn)角的作用，其沿著血纖蛋白基質(zhì)遷移。附圖6顯示經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)對(duì)內(nèi)皮細(xì);l包增殖的作用。附圖7顯示經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的作用。附圖8顯示經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)對(duì)成纖維細(xì)月包增殖的作用。附圖9顯示培養(yǎng)基，棉墊和皮膚構(gòu)建體細(xì)胞提取物中經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)細(xì)胞因子的表征。附圖IO表明經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)的作用不依賴于EGF受體途徑。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基組合物，其含有培養(yǎng)的皮膚試劑，該試劑由培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞產(chǎn)生，所述細(xì)胞例如真皮成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞。在經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)的皮膚試劑是生物學(xué)活性分子，可用于配制藥物，化妝品和傷口愈合制劑。當(dāng)來自細(xì)胞的培養(yǎng)的皮膚試劑用于化妝品制劑領(lǐng)域時(shí)，它們能使消費(fèi)者獲益，用于皮膚整體更新，包括柔韌性、柔軟度和彈性增強(qiáng)的外觀；皺紋減少；減少老化進(jìn)程以及修復(fù)皮膚。當(dāng)日常且周期性使用，例如每天使用時(shí)，培養(yǎng)的皮膚試劑為皮膚所吸收并且引發(fā)新皮膚細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，在皮膚中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵細(xì)胞類型)的增殖和產(chǎn)生，并減少細(xì)胞衰老和支持皮膚細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)成分，例如成纖維細(xì)胞從頭合成彈性蛋白以及膠原，并在Grenz區(qū)域沉積，以便通過Grenz區(qū)域的加厚來延遲，停止或逆轉(zhuǎn)皮膚起皴以及皺紋外觀。還會(huì)^f吏皮月夫色素沉著呈現(xiàn)更均勻的狀態(tài)。作為藥物制劑，在經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)的皮膚試劑可用于增強(qiáng)二度燒傷、皮膚處理、保濕后的修復(fù)過程；減少疼痛；增強(qiáng)光滑度，并在皮膚擦除，皮膚光滑術(shù)，表皮脫落，化學(xué)脫皮，激光處理，曬傷，風(fēng)傷，輻射傷，皮膚處理，起水泡，溫泉處理及其他方法或能引起皮膚創(chuàng)傷的事件之后更快地用新皮膚形成更完整的修復(fù)。同時(shí)還能處理脂肪團(tuán)(cellulite),脫發(fā)，神經(jīng)病，拉伸痕跡(亦稱妊娠紋(straie))。妊娠紋是當(dāng)皮膚快速拉伸時(shí)可能出現(xiàn)的拉伸痕跡。它們通常與妊娠時(shí)腹部的膨大相關(guān)聯(lián)。在迅速長(zhǎng)胖的孩子身上能夠看到它們。它們?cè)谀行院团缘那啻浩跁r(shí)迅速生長(zhǎng)的期間也可能出現(xiàn)。妊娠紋大多數(shù)通常位于乳房，髖部，大腿，臀部，腹部和脅腹。拉伸痕跡表現(xiàn)為平行的紅色斑紋，變薄的有光澤的皮膚，隨著時(shí)間而發(fā)白，并看上去^f象疤痕。拉伸痕跡可能會(huì)有一點(diǎn)下凹，其紋理可能不同于正常皮膚。妊娠紋還可能作為異常膠原形成的結(jié)果存在，或由防礙膠原形成的藥物或化學(xué)物質(zhì)而導(dǎo)致。它們還可能與長(zhǎng)期施用可的松化合物，糖尿病，庫(kù)欣氏病和妊娠后有關(guān)。含有培養(yǎng)的皮膚試劑的制劑還可以用來促進(jìn)組織血管生成。含有面。、、*5口、口"在傷口愈合制劑中，含有來自經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的培養(yǎng)的皮膚試劑的制劑通過直接將該制劑施用到傷口床，或通過摻入到傷口敷料中而使用。通過用該制劑涂覆到移植物表面、整個(gè)移植物或傷口床，該制劑可以用作該移植物，例如自體移植物(從患者移走并再施用到相同患者的其它地方)或培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的輔助物。當(dāng)在傷口愈合中用作輔助物時(shí)，該傷口愈合制劑所含的培養(yǎng)的皮膚試劑通?？赏ㄟ^誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖及產(chǎn)生，以及形成肉芽組織和血管而增加和改善傷口閉合。經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基是指已經(jīng)接觸了組織培養(yǎng)物并已被該組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞作為營(yíng)養(yǎng)物，維生素，激素和無機(jī)化合物及鹽來源的培養(yǎng)基，并且通過接觸該組織培養(yǎng)物，此刻已經(jīng)加入了細(xì)胞產(chǎn)物，或"培養(yǎng)的皮膚試劑"，例如細(xì)胞因子，蛋白質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)成分，或其任何組合，其由該細(xì)胞合成并分泌到該培養(yǎng)基中。"調(diào)節(jié)，，是細(xì)胞在接觸，暴露，交換及在細(xì)胞和培養(yǎng)基之間相互作用一定時(shí)間，優(yōu)選6小時(shí)到3天一次，更優(yōu)選12小時(shí)到2天，向新鮮的培養(yǎng)基中合成及分泌細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)成分的過程，用于調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基。然后從培養(yǎng)儀器(其在培養(yǎng)物中含有皮膚構(gòu)建體)移走經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，收集經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，純化其中的培養(yǎng)的皮膚試劑，或全部或部分地用作藥物、化妝品或傷口愈合組合物，或用于體外細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞因子是導(dǎo)致細(xì)胞功能或活性(例如分化，增殖，分泌或運(yùn)動(dòng)性)變化的各種蛋白質(zhì)。生長(zhǎng)因子是一個(gè)亞組的細(xì)胞因子，也是能夠引起功能或活性變化的蛋白質(zhì)，能促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖，遷移或其它相關(guān)的細(xì)胞事件。趨化因子是另一個(gè)亞組的細(xì)胞因子，其在體內(nèi)吸引并指導(dǎo)T細(xì)胞，B細(xì)胞及其他趨化因子反應(yīng)性細(xì)胞到特定組織。淋巴因子是另一個(gè)亞組的細(xì)胞因子，其參與免疫應(yīng)答。在此，術(shù)語"細(xì)胞因子，，，包括細(xì)胞因子，其包括生長(zhǎng)因子，趨化因子及淋巴因子，并不限于其正常結(jié)構(gòu)與功能，還可以包括其天然存在的變體和雜交體。本發(fā)明的培養(yǎng)的皮膚試劑包含細(xì)胞因子。在皮膚構(gòu)建體的構(gòu)造過程中以及當(dāng)完全形成時(shí)，培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體會(huì)包含活細(xì)胞，其合成和分泌一系列細(xì)胞因子及其他物質(zhì)進(jìn)入到該構(gòu)建體的基質(zhì)以及容納該構(gòu)建體的培養(yǎng)基之內(nèi)。培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體中的培養(yǎng)細(xì)月包典型地由真皮成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞組成,表皮細(xì)J包也稱為角質(zhì)形成細(xì)胞。在構(gòu)造和培養(yǎng)雙層皮膚構(gòu)建體的過程中,表皮和真皮組織層為細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用提供了一種組織樣環(huán)境,類似于在天然的哺乳動(dòng)物和人皮膚中存在的環(huán)境，所述組織樣環(huán)境是一種摻入了細(xì)胞外基質(zhì)的組構(gòu)的共培養(yǎng)物。在構(gòu)建體發(fā)育過程中的這些相互作用促4吏廣i普細(xì)胞因子表達(dá)并分泌到培養(yǎng)基中，用于誘導(dǎo)培養(yǎng)物中的其它細(xì)胞行使胞外基質(zhì)發(fā)育、基底膜產(chǎn)生以及細(xì)胞增殖和分化的功能。本發(fā)明的一個(gè)特征是由培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體生產(chǎn)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，這些因子包括，但不限于堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF);表皮生長(zhǎng)因子(EGF);角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a(TGFa);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P(TGFp),包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p-l(TGFpl)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P-2(TGF^2);粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF);胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肺瘤壞死因子(TNF)。在趨化因子亞組中，白細(xì)胞介素能影響細(xì)胞凋亡。包括白細(xì)胞介素-l,白細(xì)胞介素-6,白細(xì)胞介素-8,白細(xì)胞介素-11在內(nèi)的許多白細(xì)胞介素也被發(fā)育中的皮膚構(gòu)建體合成，也作為本發(fā)明的一個(gè)特征。應(yīng)該注意括號(hào)中的上述術(shù)語是公知的縮略語，在本領(lǐng)域內(nèi)用于代表它們之前的正式術(shù)語。本發(fā)明的培養(yǎng)的皮膚試劑包含的其它細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子包括雙調(diào)蛋白；血管生成素；血管生成素-2;DTK;EGF-R;ENA-78;FAS;FGF-1;FGF-2;FGF隱6;FGF-7;FGF國(guó)9;FIT-3配體；GCP畫2;G-CSF;GM曙CSF;GRO誦oc;HGF;IGF國(guó)1;IGF曙2;IGFBP-2;IL-11;IL-1oc;IL國(guó)1P;L-IRA;IL-6;IL畫6R;IL-8;瘦素；MCP-I1;MCP-2;M-CSF;骨保護(hù)素(Osteoprotegrin);PDGF;PIGF;RANTES;干纟田月包因子；TGFa;TGFP1;TGFP2;TGFP3;TIMP-I;TIMP-2;TRAIL;UPAR;和VEGF。應(yīng)當(dāng)注意上述術(shù)i吾是^^知并且用于本領(lǐng)域的縮略語，各術(shù)語的全稱并入本文作為參考。優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基是由皮膚細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞，真皮成纖維細(xì)^M或二者)的培養(yǎng)細(xì);9包產(chǎn)生，更伊乙選同時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)月包，作為角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)物。本發(fā)明的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基最優(yōu)選產(chǎn)生的情形是當(dāng)所述共培養(yǎng)物是具有至少一個(gè)真皮層和一個(gè)表皮層的培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體時(shí)，并且其方向排列為類似于天然的皮膚。真皮層包含成纖維細(xì)胞，優(yōu)選真皮來源的成纖維細(xì)胞和胞外基質(zhì)，主要是膠原。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解通過有意填加或者持續(xù)培養(yǎng)來自原始來源的成纖維細(xì)胞的結(jié)果，該培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體可含有皮膚及其他胞外基質(zhì)成分中存在的其它細(xì)胞。優(yōu)選用于本發(fā)明的細(xì)胞類型來源于間充質(zhì)。更優(yōu)選的細(xì)胞類型是成纖維細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，及其他支持性結(jié)締組織的細(xì)胞，或者，在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，是人真皮成纖維細(xì)胞。人成纖維細(xì)胞株可源自于許多來源，包括但不限于男性新生兒包皮，真皮，腱，肺，臍帶，軟骨，尿道，角膜基質(zhì)，口腔粘膜，和腸。人的細(xì)胞可包括但不限于成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，軟骨細(xì)胞及其他間充質(zhì)來源的結(jié)締組織細(xì)月包。優(yōu)選，然而并非必要，用于生產(chǎn)組織構(gòu)建體的產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞的來源是在使用本發(fā)明培養(yǎng)法之后將要類似或者模擬的那種組織類型。例如，多層的片狀構(gòu)建體是用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的，形成存活的結(jié)締組織構(gòu)建體；或者用成肌細(xì)胞形成骨骼肌構(gòu)建體?？墒褂靡粋€(gè)以上細(xì)胞類型構(gòu)造組織構(gòu)建體。細(xì)胞供體可在發(fā)育和年齡方面不同。細(xì)胞可以來源于胚胎、新生兒或者更年長(zhǎng)個(gè)人，包括成人的供體組織。胚胎一且細(xì)胞例如間充質(zhì)千細(xì)胞可用于本發(fā)明并誘導(dǎo)分化，發(fā)育為期望的組織。盡管本發(fā)明優(yōu)選使用人的細(xì)胞，但是用于本方法的細(xì)胞不限于人來源的細(xì)胞。來自其它哺乳動(dòng)物物種包括但不限于，馬科動(dòng)物，犬科動(dòng)物，豬科動(dòng)物，?？苿?dòng)物，貓科動(dòng)物，山羊，及綿羊的細(xì)胞也可以^吏用。還可使用鼠細(xì)胞及其他來自嚙齒動(dòng)物來源的細(xì)胞。此外，能自發(fā)地、化學(xué)地或者經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染的遺傳工程化細(xì)胞也可用于本發(fā)明。對(duì)于那些摻入一種以上細(xì)胞類型的實(shí)施方案，可以使用正常及遺傳學(xué)修飾或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞的混合物，可以使用兩個(gè)或更多物種或者組織來源的細(xì)胞的混合物，或者上述兩者。重組細(xì)l包或者遺傳工程化的細(xì)胞可以用于該組織構(gòu)建體的生產(chǎn)，形成能作為藥物運(yùn)送移植物一樣發(fā)揮作用的組織構(gòu)建體，用于需要提高天然細(xì)胞產(chǎn)物或需要用治療劑處理的患者。在連續(xù)的時(shí)間段內(nèi)，或根據(jù)培養(yǎng)物中的條件，當(dāng)發(fā)出生物學(xué)，化學(xué)或熱信號(hào)時(shí)，該細(xì)胞可產(chǎn)生重組細(xì)胞產(chǎn)物，生長(zhǎng)因子，激素，肽或蛋白質(zhì)。細(xì)胞還可以被遺傳工程化以表達(dá)細(xì)胞因子，蛋白質(zhì)或不同類型的胞外基質(zhì)成分，該成分或者是'正常的'但高水平表達(dá)，或以某種方式被修飾以產(chǎn)生治療上有利于改善傷口愈合，促進(jìn)或者指導(dǎo)新血管生成的細(xì)胞產(chǎn)物。這些方法是本領(lǐng)域公知的,在Sambrook等,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)中浮皮描述，并入本文作為參考。上述所有提及的細(xì)胞類型均可用于本發(fā)明，用于制備培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體，其能合成含有細(xì)胞因子的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體中的細(xì)胞是在基質(zhì)中被培養(yǎng)，該基質(zhì)能支持模擬正常皮膚的排列和組成的細(xì)月包。膠原是一種常見并優(yōu)選用于培養(yǎng)皮膚等同物的組合物。雖然膠原是最優(yōu)選的用于制備皮膚等同物的胞外基質(zhì)組合物，其產(chǎn)生并分泌細(xì)胞因子及其他培養(yǎng)的皮膚試劑以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，但是可以使用其它胞外基質(zhì)成分。這些胞外基質(zhì)成分可以單獨(dú)使用，或者優(yōu)選與膠原一起使用，以模擬天然的真皮基質(zhì)。這些胞外基質(zhì)成分可以包括其它膠原，它們是膠原家族例如II,III,IV,V,VI，VII,VIII,IX,X,XI,XII，XIII,XIV,XV,XVI，XVII,XVIII,XIX型膠原的纖維狀和非纖維狀膠原，其它基質(zhì)，其包括但不限于彈性蛋白，蛋白聚糖例如核心蛋白聚糖或者雙糖鏈蛋白聚糖，或者糖蛋白例如腱生蛋白，玻連蛋白，纖連蛋白，層粘連蛋白，血小板反應(yīng)蛋白I，以及糖胺聚糖(GAG)例如透明質(zhì)酸(HA)。真皮基質(zhì)可以在組成以及結(jié)構(gòu)方面不同。膠原海綿狀物(collagensponge),生物相容的，可生物重塑的，去細(xì)胞的真皮，或者膠原凝膠。它們并不是提供胞外基質(zhì)成分到真皮細(xì)胞，而是能在生物可降解的篩構(gòu)件(例如尼龍或者polygalactin(PGA))上培養(yǎng)，以提供一種培養(yǎng)支持物，并培養(yǎng)以產(chǎn)生胞外基質(zhì)，直至細(xì)胞以及其基質(zhì)包圍該支持物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，真皮層是收縮的膠原凝膠(contractedcollagengel)，通過成纖維細(xì)胞收縮，例如在Bell的美國(guó)專利No.4,485,096中的描述，并入本文作為參考。在一個(gè)更優(yōu)選具體實(shí)施方式中，收縮的膠原凝膠被排列在位于多孔膜上的大塊無細(xì)胞膠原層上，用于將凝膠錨定到該膜上，預(yù)防凝膠過度的放射狀收縮。用于摻入大塊無細(xì)胞膠原層的方法描述于Kemp等人的美國(guó)專利No.5,536,656,Wilkins,L.M.等，DevelopmentofaBilayeredLivingSkinConstructforClinicalApplications.BiotechnologyandBioengineering,43巻，747-756頁(1994),以及Parenteau,N.L.Skinequivalents.,T.Leigh禾口F.Watt(eds),TheKeratinocyteHandbook.CambridgeUniversitypress,London(1994),其公開文本并入本文作為參考。本發(fā)明的組織等同物和無細(xì)胞的水合膠原凝膠都可以使用來源于皮膚和腱，包括大鼠尾腱，小牛皮膠原和小牛伸肌腱的膠原制備。其它來源的^1交原也可4吏用。在Kemp的美國(guó)專利No.5,106,949中/>開了一種來源于小牛普通趾伸肌腱的特別優(yōu)選的膠原組合物及得到所述膠原的方法，其公開文本并入本文作為參考。在本發(fā)明的一個(gè)方法中，參見圖1,從包含大約0.5到2.0mg/ml,優(yōu)選約0.9到1.1mg/ml膠原和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的膠原組合物制備無細(xì)胞的水合膠原凝膠25。該膠原組合物加入到內(nèi)容器20中，維持在能^f吏該膠原組合物凝固并形成尺寸合適的無細(xì)胞的水合膠原凝膠的條件下，所述尺寸通常是約1到5mm厚度，優(yōu)選大約2到約3mm厚度范圍。無細(xì)胞的水合膠原凝膠25的厚度優(yōu)選足夠可以使當(dāng)細(xì)胞從組織等同物向無細(xì)胞的水合膠原凝膠中遷移時(shí)一部分保持無細(xì)胞，薄度則足夠可以使該組織等同物不會(huì)不理想地從外容器10中提供的營(yíng)養(yǎng)源處移開。使用根據(jù)前述專利的方法接下來將真皮等同物澆鑄到無細(xì)月包的水合膠原凝膠上，如以下所述。將含有膠原和成纖維細(xì)胞的澆鑄混合物加入內(nèi)容器20的無細(xì)胞的水合膠原凝膠25之上，并維持在能夠形成組織等同物的條件下。當(dāng)該組織等同物在無細(xì)胞的水合膠原凝膠25上形成時(shí)，它會(huì)放射狀地收縮。通常，真皮層26的側(cè)面會(huì)向水合膠原凝膠25的外周傾斜，以形成如圖1在52所示的平頂高臺(tái)形狀。此刻用上皮細(xì)胞接種該真皮層26,形成表皮層28。該表皮細(xì)胞以約0.3x106到約30x106個(gè)細(xì)胞/1111的濃度接種在培養(yǎng)基中。接種的表皮體積取決于該平頂高臺(tái)的尺寸。可以控制膠原的濃度，細(xì)胞的數(shù)目和澆鑄混合物的體積，使該活組織等同物的直徑和厚度達(dá)到最優(yōu)化。該澆鑄混合物包含營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的約1.25x104到約5x104個(gè)細(xì)胞/1111濃度的細(xì)胞和大約0.5到約2.0mg/ml的膠原。優(yōu)選細(xì)胞濃度是大約2.5x1(^個(gè)細(xì)胞/ml。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于組織等同物的澆鑄混合物的體積與用于無細(xì)胞的水合膠原凝膠的澆鑄混合物的體積的比能對(duì)細(xì)胞存活力和分化產(chǎn)生影響。組織等同物澆鑄混合物與膠原凝膠澆鑄混合物的有用體積與體積(v/v)比大約為3:1到1:3。當(dāng)細(xì)胞在膠原網(wǎng)格(lattice)中大約是2.5x104個(gè)細(xì)胞/ml的濃度時(shí)，此時(shí)的優(yōu)選比是3:1。該培養(yǎng)物被維持在培養(yǎng)箱內(nèi)，確保細(xì)胞培養(yǎng)的充足環(huán)境條件，即，受控的溫度，濕度和氣體混合物。優(yōu)選的條件為大約34。C到大約38°C,更優(yōu)選37土rC，空氣為大約5-10±1%C02,相對(duì)濕度(Rh)為大約80畫90%。用于將表皮細(xì)胞提供給真皮基質(zhì)的方法和其培養(yǎng)方法，包括誘導(dǎo)表皮的分化和角質(zhì)化以形成分化的角質(zhì)形成細(xì)胞層，都是本領(lǐng)域已知的，描述于Parenteau等人的美國(guó)專利No.5,712,163和Kemp等人的美國(guó)專利No.5,536，656,Wilkins(1994),同上文，和Parenteau(1994),同上文，其教導(dǎo)并入本文作為參考。為進(jìn)行細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的表皮化，通常將角質(zhì)形成細(xì)胞接種到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上并在其上培養(yǎng)，直至該層達(dá)到一到三個(gè)細(xì)胞層的厚度。然后誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分化，形成多層表皮，然后誘導(dǎo)角質(zhì)化以形成角質(zhì)層。在形成分化的表皮層的方法中，從細(xì)胞庫(kù)儲(chǔ)存物中取出傳代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，擴(kuò)充其細(xì)胞數(shù)目。當(dāng)已經(jīng)獲得了需要數(shù)目的細(xì)胞時(shí)，從培養(yǎng)物基質(zhì)中釋放細(xì)胞，懸浮，計(jì)數(shù)，稀釋然后以大約4.5xl(^個(gè)細(xì)胞/cm2到大約5.0x1()5個(gè)細(xì)胞/cm2,更優(yōu)選大約1.0x104個(gè)細(xì)胞/cm2到大約1.0x105個(gè)細(xì)胞/cm2,最優(yōu)選以大約4.5x104個(gè)細(xì)胞/112的密度接種到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的上表面。然后在37土rC，10。/oC02下孵育該構(gòu)建體約60到約90分鐘，讓角質(zhì)形成細(xì)胞附著。孵育之后，將該構(gòu)建體浸在表皮化培養(yǎng)基中。經(jīng)過一段充足時(shí)間的培養(yǎng)之后，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并播散，形成跨細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的匯合單層。匯合后，該細(xì)胞培養(yǎng)基的配方轉(zhuǎn)變?yōu)榉只囵B(yǎng)基，以誘導(dǎo)細(xì)胞分化。當(dāng)已經(jīng)形成多層上皮時(shí)，使用角質(zhì)化培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)物被放置在氣-液界面上。為了使角質(zhì)形成細(xì)胞分化和角質(zhì)化，將細(xì)胞暴露于干燥或者低濕度的氣-液界面。干燥或者低濕度界面的特征在于設(shè)法復(fù)制皮膚的低水分的水平。當(dāng)暴露于這些條件時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞會(huì)隨時(shí)間表達(dá)大多數(shù)或者所有角蛋白及在天然的皮膚中發(fā)現(xiàn)的其他特征。當(dāng)完全形成時(shí)，表皮層是一種多層的、分層的、分化良好的角質(zhì)形成細(xì)胞層，顯示出基底層，基底上層，顆粒層和角質(zhì)層?；啄さ脑蛘咄暾幕啄ご嬖谟谡嫫?表皮的接合處，半橋粒周圍最厚，以VII型膠原組成的錨定原纖絲為標(biāo)志，這是通過透射電子顯微術(shù)(TEM)觀察到的?？吹藉^定纖絲從基底膜形成區(qū)域引出，將膠原纖絲截留在真皮層中。這些錨定纖絲以及其它基底膜成分是由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的。還知道雖然角質(zhì)形成細(xì)胞能夠獨(dú)自分泌基底膜成分，但是如果缺少成纖維細(xì)胞則不會(huì)形成可辨別的基底膜。本發(fā)明的皮膚構(gòu)建體的免疫組織化學(xué)染色還顯示存在一種基底膜蛋白質(zhì)一一層粘連蛋白。在培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的形成中，通過接觸培養(yǎng)基而使該構(gòu)建體獲得營(yíng)養(yǎng)，所述培養(yǎng)基由于皮膚構(gòu)建體中的細(xì)胞而變成經(jīng)調(diào)節(jié)的，因?yàn)檫@些細(xì)胞代謝該培養(yǎng)基的成分并向其中分泌細(xì)胞因子及其他蛋白質(zhì)。確定成分培養(yǎng)基是指一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其含有化學(xué)確定的成分并且不含有不確定的動(dòng)物器官或者組織提取物，例如血清，垂體提取物，下丘腦提取物，胎盤提取物，或者胚胎提取物或者飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和因子。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基不含有不確定的成分，并且確定的生物成分來源于非人的來源。盡管并不優(yōu)選添加不確定的成分，但是仍然可以根據(jù)該公開的方法在培養(yǎng)過程中的任一時(shí)間點(diǎn)使用不確定的成分，以便成功地制造組織構(gòu)建體。當(dāng)使用來源于并非非人來源生物成分的化學(xué)確定成分，采用篩選的培養(yǎng)的人細(xì)胞進(jìn)行本發(fā)明時(shí)，得到的組織構(gòu)建體是確定的人組織構(gòu)建體。使用這種構(gòu)建體制造本發(fā)明的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是可消除組織構(gòu)建體或者經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基之中存在偶發(fā)性動(dòng)物或者交叉物種病毒污染以及感染的顧慮。新鮮的和從未用過的培養(yǎng)基包含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基(nutrientbase),通常進(jìn)一步補(bǔ)充有其它成分。技術(shù)人員通過合理的預(yù)期可以確定動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中的合適營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基，用于成功制造本發(fā)明的組織構(gòu)建體和經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。許多市售營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)源可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。這些包括能提供無機(jī)鹽，能量源，氨基酸，和B-維生素的市售營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)源，例如Dulbecco的改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM);極限必需培養(yǎng)基(MEM);M199;RPMI1640;Iscove的改良Dulbecco培養(yǎng)基(EDMEM)。極限必需培養(yǎng)基(MEM)和M199需要額外補(bǔ)充磷脂前體和非必需氨基酸。能提供額外氨基酸，核酸，酶輔因子，磷脂前體和無機(jī)鹽的市售的富含維生素的混合物包括Ham'sF-12，Ham'sF-10,NCTC109和NCTC135。雖然有不同的濃度，不過所有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基都能為細(xì)胞提供葡萄糖，氨基酸，維生素和無機(jī)離子連同其它基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分形式的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)源。本發(fā)明最優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含無鈣或者低鈣Dulbecco改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基，其含有4.5g/L葡萄糖，鎂和7.25mML國(guó)谷氨酰胺，不含丙酮酸鈉，還含有3:1的Ham'sF-12。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充了諸如氨基酸，生長(zhǎng)因子和激素這些成分。用于進(jìn)4亍本發(fā)明細(xì)月包培養(yǎng)的確定成分培養(yǎng)基描述在Parenteau的美國(guó)專利No.5,712,163和國(guó)際PCT公開No.WO95/31473,其公開文本并入本文作為參考。本領(lǐng)域還已知其它培養(yǎng)基，諸如在Ham和McKeehan,MethodsinEnzymology,58:44-93(1979)中公開的那些，或者在Bottenstein等人，MethodsinEnzymology,58:94隱109(1979)中乂>開的其它適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)確定成分培養(yǎng)基。在優(yōu)選具體實(shí)施方式中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的下列成分胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，三碘甲腺原氨酸(T3)和單獨(dú)乙醇胺或o-磷酰-乙醇胺或這二者，這些補(bǔ)充物的濃度和代替物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。胰島素是多肽激素，能促進(jìn)葡萄糖和氨基酸的攝取，可在多個(gè)世代提供長(zhǎng)期益處。對(duì)于長(zhǎng)期培養(yǎng)則必須補(bǔ)充胰島素或者胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，因?yàn)榧?xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸的能力將最終耗盡且細(xì)胞表型可能降解。對(duì)于連續(xù)培養(yǎng)而言補(bǔ)充胰島素是推薦的，以優(yōu)選約0.5jug/ml到約50jug/ml的濃度范圍，更優(yōu)選約5jug/ml提供給培養(yǎng)基。對(duì)于胰島素樣生長(zhǎng)因子諸如IGF-I或IGF-2的適當(dāng)補(bǔ)充濃度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)選用于培養(yǎng)的細(xì)胞類型而輕易地確定。轉(zhuǎn)鐵蛋白存在于培養(yǎng)基中用于鐵的運(yùn)送調(diào)控。鐵是血清中的一種必須微量元素。由于游離態(tài)的鐵可能對(duì)細(xì)胞有毒害作用，所以其在血清中以與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的狀態(tài)提供給細(xì)胞，濃度范圍優(yōu)選在約0.05到約50jug/ml,更優(yōu)選約5jugml。三碘曱腺原氨酸(T3)是一種基本成分，是甲狀腺激素的活性形式，包含在培養(yǎng)基中以維持細(xì)胞代謝的速率。三碘甲腺原氨酸以約0到約400pM,更優(yōu)選約2到約200pM,最優(yōu)選以約20pM的濃度補(bǔ)充到培養(yǎng)基中。加入單獨(dú)的乙醇胺和o-石舞酰-乙醇胺或者二者，它們?yōu)?粦脂，功能為肌醇途徑和脂肪酸代謝中的一種重要前體。在無血清培養(yǎng)基中必須補(bǔ)充通常在血清中存在的一些脂類。乙醇胺和o-磷酰-乙醇胺以約10-6到約l(T2M,更優(yōu)選約1x1(T4M的濃度添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)期間，基礎(chǔ)培養(yǎng)基需要另外補(bǔ)充其它成分，諸如氬化可的松，硒和L-谷氨酸鹽，用于誘導(dǎo)合成或分化或用于改善細(xì)胞生長(zhǎng)。已經(jīng)顯示在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)中氫化可的松能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞表型從而增強(qiáng)分化特征，諸如套膜蛋白(involucnn)和角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶含量(Rubin等,J.CellPhysiol.,138:208-214(1986))。因此，在這些特征為有利的情況下，諸如形成角質(zhì)形成細(xì)胞層移植物或皮膚構(gòu)建體的情況下，氬化可的松是一種理想的添加劑。氫化可的松可以約0.04jug/ml到約4.0jug/ml的濃度范圍，最優(yōu)選約0.4jug/ml的濃度提供。向無血清培養(yǎng)基中加入踴，以補(bǔ)充通常由血清提供的微量元素勵(lì)。硒的添加濃度為約10力M到約1(T7M;最優(yōu)選約5.3x1(T8M。氨基酸L-谷氨酰胺存在于一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基中，當(dāng)不存在或量不足時(shí)，可以添加。L-谷氨酰胺也可以穩(wěn)定形式添加，例如以商標(biāo)GlutaMAX—1TM(GibcoBRL,GrandIsland,NY)出售的那種。GlutaMAX—1TM是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的穩(wěn)定二肽形式，可以與L-谷氨酰胺互換使用，可以等摩爾濃度添加，作為L(zhǎng)-谷氨酰胺的替代品。在儲(chǔ)存過程和孵育期間，該二肽能隨時(shí)間給L-谷氨酰胺提供穩(wěn)定性，防止降解，避免在培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺的有效濃度不確定。通常，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充以優(yōu)選約1mM到約6mM,更優(yōu)選約2mM到約5mM,最優(yōu)選4mM的L-谷氨酰胺或GlutaMAX-1TM。還可以向該培養(yǎng)基加入生長(zhǎng)因子例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，通過細(xì)胞4妄比例增加和接種來輔助培養(yǎng)物的形成?？梢?lt;吏用天然形式或重組形式的EGF。當(dāng)制造不包含非人生物成分的皮膚等同物時(shí)，優(yōu)選在該培養(yǎng)基中使用天然或重組的人EGF。EGF是一種任選的成分，可以約1到約15ng/mL,更優(yōu)選約5到約10ng/mL的濃度提供。上述培養(yǎng)基通常如下面所述制備。但是，應(yīng)該理解，本發(fā)明的各成分可以<吏用與其物理性質(zhì)相容的常*見方法制備和組裝。本領(lǐng)域/>知出于可獲得性或經(jīng)濟(jì)目的而使用適當(dāng)?shù)念愃莆锘蚬δ苌系韧饔玫脑噭﹣砣〈承┏煞?，并且可以達(dá)到類似的效果。當(dāng)用于實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可以用具有類似質(zhì)量和結(jié)果的重組或合成的生長(zhǎng)因子代替天然存在的生長(zhǎng)因子。本發(fā)明的培養(yǎng)基均為無菌的。無菌成分可購(gòu)買，或用常規(guī)方法除菌，如制備后過濾除菌。正確的無菌操作在以下實(shí)施例的全程中使用?；旌螪MEM和F-12,然后加入各個(gè)成分以補(bǔ)充培養(yǎng)基。所有成分的原液儲(chǔ)存于-20。C,但營(yíng)養(yǎng)源可以儲(chǔ)存于4°C。所有原液以上文所列的500X終濃度制備。胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、和三碘甲腺原氨酸(均來自Sigma)的原液均如下制備三碘甲腺原氨酸先溶于2:1的無水乙醇與IN鹽酸(HC1)中。胰島素溶于稀HC1(約0.IN),轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于水。然后將這三者混合，用水稀釋至500X濃度。乙醇胺和o-磷酰-乙醇胺溶于水至500X濃度并過濾除菌。孕酮溶于無水乙醇并用水稀釋。氬化可的松溶于無水乙醇并用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。硒溶于水至500X的濃度并過濾除菌。EGF為無菌商品，將其溶于PBS。腺嘌呤難以溶解，但可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何多種方法溶解?？杉尤肴搜灏椎鞍?HSA)或牛血清白蛋白(BSA),從而維持孕酮和EGF原液的活性，延長(zhǎng)保存時(shí)間。培養(yǎng)基可在制備好后馬上投入使用，也可儲(chǔ)存于4。C。如果是儲(chǔ)存，先不加EGF,使用前再加。通過向培養(yǎng)儀器中吸取，傾注或泵送的形式向培養(yǎng)物供應(yīng)新鮮培養(yǎng)基。通過使培養(yǎng)基與培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體接觸充足的時(shí)間，通常約為6小時(shí)到3天或更多，發(fā)生培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)，以使構(gòu)建體從新鮮的培養(yǎng)基吸收或攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等等以及向培養(yǎng)基中分泌細(xì)胞因子。由于培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體處于一種恒定的代謝狀態(tài)，因此只需要短暫的時(shí)間來調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基。優(yōu)選使構(gòu)建體和培養(yǎng)基彼此接觸進(jìn)行交換，直至新鮮培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物幾乎耗盡為止。在每次新鮮培養(yǎng)基與經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基交換時(shí)，通過吸取，抽出，傾注，引流，虹吸或泵送的方式從培養(yǎng)物中取出并收集經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。在構(gòu)造培養(yǎng)的皮膚等同物時(shí)，當(dāng)真皮成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞一起存在于該構(gòu)建體中時(shí)，優(yōu)選從含有該構(gòu)建體的儀器中收集經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的收集物可以作為單獨(dú)的收集物分別地使用，或合并在一起使用。經(jīng)培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的發(fā)育以一些事件為標(biāo)志，所述試劑會(huì)產(chǎn)生經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基在各個(gè)收集點(diǎn)具有不同細(xì)胞因子譜。作為單獨(dú)的收集物，經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基會(huì)具有某些細(xì)胞因子，可能是特定處理適應(yīng)癥或產(chǎn)物所期望的。當(dāng)通過將收集物合并在一起而進(jìn)行組合時(shí)，經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基將有大范圍適于處理法或產(chǎn)品的細(xì)胞因子。本發(fā)明細(xì)胞因子收集的另一形式來自于吸收墊，其位于膜的下面，皮膚構(gòu)建體形成在該膜上。該墊放置在該膜之下，當(dāng)培養(yǎng)物上升到氣-液界面時(shí)，其通過毛細(xì)作用在空中將培養(yǎng)基帶到膜上，輔助角質(zhì)形成細(xì)胞層的角質(zhì)化。該墊可以是任一吸收性材料，但優(yōu)選無毒的并且和細(xì)胞培養(yǎng)物相容，例如棉花。參見圖1,該墊沿著膜24的底面排列，在外室60底部上的膜24之間。該墊顯示具有更高濃度的某些細(xì)胞因子。但是并不希望被理論束縛，因?yàn)樵搲|是緊密地對(duì)著該發(fā)育的皮膚構(gòu)建體，其能收集許多由該皮膚構(gòu)建體分泌的細(xì)胞因子。雖然仍然位于該墊上，但是當(dāng)其#皮用作繃帶或繃帶部分時(shí)可以使用該細(xì)胞因子，或可從該墊上提取或引流出來。一旦收集，經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基可以按照收集的狀態(tài)使用，或在該培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步加工用于純化，或輕松施用，或在使用之前儲(chǔ)存。可以凍干或蒸發(fā)經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，以去掉組合物的液體或水的部分。去除水后經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基呈現(xiàn)晶體粉末形式，含有培養(yǎng)的皮膚試劑細(xì)胞因子，蛋白質(zhì)和胞外基質(zhì)成分，并且體積縮小。該形式使其更易制備含有較高劑量的培養(yǎng)的皮膚試劑組合物的產(chǎn)品而不用稀釋該制劑，由于其體積減小因此使其更易儲(chǔ)存。還可以使用過濾法，特別是利用分子量截流或一系列分子量濾器的過濾法濃縮經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。分子量濾器的使用可以去掉在培養(yǎng)基中存在的大成分例如白蛋白，以及在血清中存在的某些大分子量成分，細(xì)胞和細(xì)胞碎片。盡管并非必要，但是可能期望在用較小孔濾器過濾之前預(yù)先過濾經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基以去掉這些較大的成分，防止阻塞以及削弱隨后使用的任一濾器的過濾能力?？梢允褂闷渌^濾及透析方法，從細(xì)胞產(chǎn)物組合物中去掉鹽。例如，可以使用切向流過濾來提高經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)的皮膚試劑的濃度。此外，可以使用切向流過濾減少經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的鹽濃度。由于經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的含水成分被去除，為減少鹽的濃度，以水代替。實(shí)際上，培養(yǎng)的皮膚試劑的濃縮及鹽濃度的降低可以重復(fù)至少一次，以便有效地洗掉培養(yǎng)的皮膚試劑的鹽。該培養(yǎng)的皮膚試劑可^皮進(jìn)一步純化，破碎或偶聯(lián)，以形成純的細(xì)胞因子，蛋白質(zhì)，或胞外基質(zhì)組合物，或被增強(qiáng)用于直接運(yùn)送到特定組織，組織結(jié)構(gòu)或細(xì)胞類型。該培養(yǎng)的皮膚試劑的純化及鹽濃度的降低使其更相容，因此優(yōu)選用于配制本發(fā)明的局部制劑。含有由皮膚構(gòu)建體產(chǎn)生的細(xì)胞因子的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，或單獨(dú)的本發(fā)明細(xì)胞因子可用于細(xì)胞培養(yǎng)。含有細(xì)胞因子的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基一皮用于通過增進(jìn)存活的新皮膚細(xì)胞的細(xì)胞增殖及產(chǎn)生培養(yǎng)及維持細(xì)胞系，控制干細(xì)胞及祖細(xì)胞的增殖和分化，以及間充質(zhì)分化(例如間充質(zhì)細(xì)胞到肌細(xì)胞的分化)。經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基還被用于制造其它用于以特定層或方向抑制或刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的組織構(gòu)建體。經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的作用是濃度依賴性的，較高的濃度會(huì)比較低濃度獲得更大的作用。本發(fā)明的培養(yǎng)的皮膚試劑組合物特別適用于處理皮膚所用的制劑。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括用作藥物制劑或皮膚護(hù)理產(chǎn)品的經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有下列的任何一種或多種細(xì)胞因子，蛋白質(zhì)以及胞外基質(zhì)成分，其由被培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞合成及分泌。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種皮膚護(hù)理組合物，包含培養(yǎng)的皮膚試劑有所述培養(yǎng)的皮膚試劑的組合物類型的配制方法取決于所述試劑的特定形式及其預(yù)定用途。上皮組織處理領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定將配制在藥物或化妝品制劑中的培養(yǎng)的皮膚試劑的有效量。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種用于護(hù)理及改善皮膚外觀的化妝品制劑，用于局部施用到皮膚，其含有經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基成分。該化妝品制劑可用作下列非限制性產(chǎn)品實(shí)例或作為其一種成分保濕劑，晚霜，粉底霜，曬黑霜，防曬劑，護(hù)手霜，化妝品及化妝品基，面膜或油膏。本發(fā)明的一個(gè)特別的益處是在人體局部施用組合物于皮膚，用于增進(jìn)皮膚細(xì)胞，即角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生及增殖，減少表皮細(xì)胞衰老及維持皮膚合成胞外基質(zhì)成分，或二者兼有。該方法不需要對(duì)完整皮膚進(jìn)行預(yù)先處理以刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，使其成為一種特別簡(jiǎn)易的皮膚局部施用方法，不需要通過整形外科技術(shù)或任何方式的創(chuàng)傷來磨損完整皮膚。但是，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該皮膚被預(yù)先處理，去除了全部或幾層角質(zhì)層。該預(yù)處理可以是機(jī)械的，例如用微粒擦洗器、絲瓜穰(loofa)等等擦除，也可以是化學(xué)的，包括生物化學(xué)的，例如角質(zhì)層溶解劑，例如a-羥酸或維生素A(retin-A)處理，或用化妝品學(xué)可接受的油處理。還可以實(shí)行使用機(jī)械、化學(xué)或激光手段的手術(shù)擦除。用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)的皮膚試劑制劑最優(yōu)選以適當(dāng)組合物的形式施用，該組合物含有來自經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的培養(yǎng)的皮膚試劑和載體試劑。該載體應(yīng)該是基本上惰性的，因此不與培養(yǎng)的皮膚試劑反應(yīng)而削弱其活性。優(yōu)選該載體能增強(qiáng)及改善細(xì)胞因子向皮膚的滲透性，以提高其效力。合適的惰性載體包括水，聚乙二醇，礦物油或石油凝膠，丙二醇及本領(lǐng)域已知的其它試劑。為制備本發(fā)明的藥物組合物，將有效量的特定培養(yǎng)的皮膚試劑作為活性成分與藥學(xué)可接受載體混合成緊密的混合物，該載體可以施用所需的制劑形式而采取多種形式。期望該藥物組合物是單元?jiǎng)┬停貏e是適用于局部的或經(jīng)皮的施用。還包括固態(tài)制劑，打算在即將使用之前將其轉(zhuǎn)化為液態(tài)制劑。在適合于經(jīng)皮施用的組合物中，所述載體任選地含有滲透增強(qiáng)劑和/或合適的潤(rùn)濕劑，其可任選地與小比例的任何性質(zhì)的適宜添加劑組合，所述添加劑不會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生顯著的有害影響。由于本發(fā)明的培養(yǎng)的皮膚試劑通常是大分子，所以本發(fā)明的皮膚護(hù)理組合物還含有一種"滲透增強(qiáng)劑"，有時(shí)被稱為"透過增強(qiáng)劑"，用于促進(jìn)所述培養(yǎng)的皮膚試劑穿過角質(zhì)層。滲透增強(qiáng)劑是能降低皮膚行使其屏障功能的能力的試劑。如果沒有某種輔助，許多物質(zhì)將不能以治療有意義的速率和數(shù)量擴(kuò)散到皮膚中。滲透增強(qiáng)劑使得皮膚更具有通透性，允許物質(zhì)以更快的速率或更高的濃度，或既快速又高濃度地穿越皮膚。應(yīng)當(dāng)注意一種物質(zhì)的特定滲入途徑主要上取決于皮膚的狀況和需要增強(qiáng)滲透的物質(zhì)的理化性質(zhì)。人皮膚的通透性依賴于人之間以及身體不同的區(qū)域之間的差異。個(gè)體之間的通透性不同?；颊叩哪挲g可影響物質(zhì)穿過皮膚的通透性。新生兒和老年人的皮膚比其它年齡組具有更強(qiáng)的通透性。雖然不希望,皮理論束縛，但是種族也是一種皮膚通透性的因素；例如，白種人的皮膚比美裔非洲人的更具通透性。身體各區(qū)域之間的通透性不同。最具通透性的區(qū)域是粘膜，陰嚢皮膚和眼瞼。中度通透性的區(qū)域包括面部，頭部，胸部，背部，臀部，腹部和上臂及腿部。通透性最小的區(qū)域是手掌及腳底表面及指曱。通透性隨皮膚或狀況而變。含水皮膚比干燥皮膚更具通透性。例如，水是一種滲透增強(qiáng)劑。通過提高角質(zhì)層的水合，皮膚的屏障功能可被降低，因此提高皮膚通透性。阻塞劑能抑制正常的經(jīng)表皮的水分丟失并增加皮膚的通透性。通過利用阻塞劑，天然的皮膚水合作用就變成一種自然的滲透增強(qiáng)劑。在破裂或受刺激的皮膚中，物質(zhì)可以更輕易地繞過角質(zhì)層，從而提高通透性。溫暖的皮膚更具通透性。剛剛被曬傷的皮膚通透性較弱，但如果發(fā)生脫皮則通透性增強(qiáng)。熱燹傷的皮膚更具通透性。受濕滲影響的皮膚區(qū)域顯示出增強(qiáng)的通透性。受牛皮齊影響的皮膚區(qū)域更厚，通透性較弱?；瘜W(xué)去皮法能去除角質(zhì)層并且增強(qiáng)皮膚的通透性。不僅滲透增強(qiáng)劑的效果會(huì)在各皮膚類型和皮膚狀況之間變化，而且滲透途徑也會(huì)根據(jù)滲透增強(qiáng)劑及需要滲透增強(qiáng)的物質(zhì)而有不同。有一些主要途徑，通過該途徑，物質(zhì)可以越過皮膚未破損的角質(zhì)層并到達(dá)系統(tǒng)循環(huán)。一種直接途徑稱作跨細(xì)胞途徑，通過直接經(jīng)過磷脂膜和死亡的角質(zhì)形成細(xì)胞(構(gòu)成角質(zhì)層)的胞質(zhì)，物質(zhì)跨過皮膚。盡管這是最短距離的路徑，但是物質(zhì)仍可能遇到顯著的滲透阻力，這是由于該藥物必須越過每個(gè)細(xì)胞的親脂膜，然后是含有角蛋白的親水性細(xì)胞內(nèi)容物，然后又是該細(xì)胞的磷脂雙層。必須經(jīng)過包含角質(zhì)層的大量細(xì)胞意味著該阻力在有些情況下會(huì)較高。一些滲透增強(qiáng)劑能從皮膚中去除脂類，暫時(shí)破壞皮膚的屏障功能。其它化學(xué)物質(zhì)可以更復(fù)雜的方式增強(qiáng)滲透，其是通過抑制角質(zhì)層形成或促進(jìn)其破裂，來削弱皮膚的屏障功能，或許還能增強(qiáng)滲透。穿過皮膚的另一途徑是通過胞間途徑，憑借該途徑穿過皮膚的物質(zhì)必須經(jīng)過皮膚細(xì)胞之間的小間隙，因此該途徑更為曲折。盡管角質(zhì)層的厚度只有約20pm,但是大多數(shù)分子穿過皮膚的實(shí)際擴(kuò)散路徑在400inm的數(shù)量級(jí)。滲透分子的實(shí)際路徑增加了20倍，大大地降低了滲透速率。滲透的另一途徑是毛嚢途徑。毛嚢穿過角質(zhì)層到達(dá)真皮，允許更直接到達(dá)真皮基質(zhì)中的細(xì)胞。毛嚢滲透增強(qiáng)劑通過在毛孔濃縮并通過皮膚分配而耙向毛嚢運(yùn)送，將試劑攜帶到角質(zhì)層下面的皮膚細(xì)胞。毛嚢途徑取決于皮膚中毛嚢的存在。滲透增強(qiáng)劑可以區(qū)分為各類型，例如"毛嚢滲透增強(qiáng)劑"，"化學(xué)滲透增強(qiáng)劑，，和"活性滲透增強(qiáng)劑"。毛嚢滲透增強(qiáng)劑的實(shí)例包括磷脂酶A2和磷脂酰膽堿依賴性的磷脂酶C。化學(xué)滲透增強(qiáng)劑的實(shí)例包括醇，比如乙醇，甲醇，和異丙醇；氯仿；薄荷醇；辟烯；丙酮；去污劑；堿；丙二醇；吡咯烷酮；二甲基乙酰胺；二甲基曱酰胺；二甲亞砜；烷基亞砜；氧化膦；表面活性劑；己內(nèi)酰胺，比如azone;胺和酰胺；烷基N,N-分布的氨基醋酸酯；癸曱基亞^l;吡略坑酉同；pirotiodecane(HPE國(guó)101);benzlyalkonium;benzylalkoniumchloride;基于硅酮的聚合物；脂肪酸；環(huán)狀尿素；辟烯；和環(huán)糊精；和角質(zhì)溶解劑(kemtinolytics)比如水楊酸尿素。優(yōu)選的基于硅酮的滲透增強(qiáng)劑包括環(huán)狀聚二曱基硅氧烷和含聚氧乙烯或聚氧丙烯側(cè)鏈的聚二曱基硅氧烷(PEG/PPG-18/18聚二甲基硅氧烷)?；钚詽B透增強(qiáng)劑的實(shí)例包括脂質(zhì)體，富勒烯(fullerenes)和磷脂，例如在Waugh的美國(guó)專利申請(qǐng)20040220100中描述的那些磷脂。還可以使用物理技術(shù)增強(qiáng)本發(fā)明的皮膚護(hù)理試劑的通透性，包括離子電滲，超聲波，電穿孔，膠帶剝離，基因槍或其它推進(jìn)設(shè)備的使用，尖齒例如用于TB尖齒測(cè)試的尖齒或能刺穿皮膚外表面的微針頭，或能去除皮膚外層的擦除劑。優(yōu)選的化學(xué)滲透增強(qiáng)劑是基于硅酮的聚合物。用于本發(fā)明的優(yōu)選的基于硅酮的聚合物選自環(huán)狀聚二甲基硅氧烷和含聚氧乙烯或聚氧丙烯側(cè)鏈的聚二甲基硅氧烷(PEGZPPG-18/18二甲聚硅氧烷)?？梢澡b定其它基于硅酮的聚合物并與摻入含有培養(yǎng)的皮膚試劑的制劑，以幫助培養(yǎng)的皮膚試劑滲入到個(gè)體的皮膚中。不希望由理論束縛，但是基于硅酮的滲透作用的機(jī)理是基于硅酮的聚合物能在皮膚上提供一種水分屏障，因此與沒有基于硅酮的聚合物相比，該皮膚的水合程度更高。正如以上的討論，水合皮膚比干燥皮膚通透性更強(qiáng)，通過增強(qiáng)角質(zhì)層的水合作用降低了皮膚的屏障功能，因此皮膚通透性有所增強(qiáng)，允許培養(yǎng)的皮膚試劑通過，進(jìn)入皮膚層。除直接局部施用培養(yǎng)的皮膚試劑制劑之外，本發(fā)明的組合物能通過其他的方法局部施用，例如，包封在溫度和/或壓力敏感的基質(zhì)中或在可溶于體液的膜或固體載體等等中，用于隨后的釋放，優(yōu)選持續(xù)釋放活性成分。作為適于局部施用的組合物，可以提到通常用于局部施用治療劑的所有組合物，如霜，膠凍，敷料，洗發(fā)水，酊劑，糊，油膏，軟膏，粉末，乳劑，液體或半液體的制劑等等。所述組合物的施用可以通過氣溶膠，例如含有推進(jìn)劑如空氣，氮?dú)?，二氧化碳，氟利昂，或不含推進(jìn)劑，例如泵送噴霧，噴霧器，液滴，洗液，或半固體，例如增稠的組合物可以通過拭子施用。具體的，半固體組合物例如軟膏，霜，糊，膠凍，油膏等等可方便地使用。如上所述，本發(fā)明的培養(yǎng)的皮膚試劑能夠用于被認(rèn)為是皮膚護(hù)理用途的許多應(yīng)用，例如維持皮膚的年輕外觀。一種維持這種外觀的方法是停止或逆轉(zhuǎn)皮膚細(xì)胞中的細(xì)胞衰老。許多研究顯示正常的二倍體細(xì)胞在體外連續(xù)傳代期間會(huì)經(jīng)歷多次的細(xì)胞的，生理學(xué)的，生物化學(xué)的及分子的變化。大多數(shù)變化是漸進(jìn)性和累積的，導(dǎo)致不可逆的增殖停滯，然后細(xì)胞死亡。這些變化已經(jīng)被認(rèn)為是體外細(xì)胞老化的標(biāo)志。簡(jiǎn)而言之，體內(nèi)以及體外老化可以總結(jié)為無法修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。類似地，這些事件發(fā)生在體內(nèi)，并能在皮膚上肉眼可見。許多研究人員正在研究停止或逆轉(zhuǎn)衰老從而維持群體年輕、健康，以及患者組織中的合成和增殖的細(xì)胞。使用本發(fā)明的培養(yǎng)的皮膚試劑處理皮膚細(xì)胞，能導(dǎo)致在細(xì)胞中合成胞外基質(zhì)成分以維持并恢復(fù)周圍的胞外基質(zhì)并支持它們。于是胞外基質(zhì)的維持和恢復(fù)引起老化標(biāo)記，包括細(xì)紋和皺紋外觀的停止及逆轉(zhuǎn)。特別優(yōu)選的是本領(lǐng)域公知用于在皮膚上局部使用的皮膚護(hù)理組合物，優(yōu)選是低變應(yīng)原性和pH控制的，包括盥洗用香水，面膜，洗液，潤(rùn)膚乳或乳液除所述培養(yǎng)的皮膚試劑之外本制劑還含有通常用于這類制劑的各種成分，起到培養(yǎng)的細(xì)胞因子的載體的作用。這種載體成分的實(shí)例是油，脂肪，蠟，表面活性劑，保濕劑，增稠劑，抗氧化劑，粘度穩(wěn)定劑，螯合劑，緩沖液，防腐劑，香水，染料，低級(jí)烷醇等等。如果需要，可進(jìn)一步向該組合物中摻入成分，如抗炎劑，抗細(xì)菌劑，抗真菌劑，消毒劑，維生素，防曬劑，抗生素，皮膚增白劑，修復(fù)增強(qiáng)劑/成纖維細(xì)胞增殖化合物，神經(jīng)肌肉阻斷劑，防曬劑，或其它抗粉刺劑。作為種載體試劑的油的實(shí)例包括脂肪和油，比如橄欖油和氬化油；蠟，比如蜂蠟和羊毛脂；烴化合物，比如液體石蠟，地蠟，和角鯊烯；脂肪酸，比如硬脂酸和油酸；醇，比如鯨蠟醇，硬酯醇，羊毛脂醇，和十六烷醇；以及酯，比如肉豆蔻酸異丙酯，棕櫚酸異丙酯和硬脂酸丁酯。作為載體試劑的表面活性劑的實(shí)例，可以提到陰離子表面活性劑，例如硬脂酸鈉，辛基硫酸鈉，聚氧乙烯月桂基醚磷酸酯，N-?；劝彼徕c；陽離子表面活性劑，例如硬脂基二甲基千基氯化銨和硬脂基三曱基氯化銨；兩性表面活性劑，如鹽酸烷基氨基乙基甘氨酸溶液和卵磷脂；以及非離子型表面活性劑，例如，甘油單硬脂酸酯，失水山梨醇單硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯，丙二醇單硬脂酸酯，聚氧乙烯油基醚，聚乙二醇單硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨醇醚單棕櫚酸酯，聚氧乙烯椰油脂肪酸單乙醇酰胺，聚氧丙烯二醇(polyoxypropyleneglycol)(例如以商標(biāo)"Pluronic，，銷售的材料)，聚氧乙烯蓖麻油，以及聚氧乙烯羊毛脂。作為載體試劑的保濕劑的實(shí)例包括甘油，1,3-丁二醇，以及丙二醇；^氐級(jí)醇的實(shí)例包括乙醇和異丙醇；增稠劑的實(shí)例包括黃原膠，羥丙基纖維素，羥丙基曱基纖維素，聚乙二醇以及羧甲基纖維素鈉?？寡趸瘎┑膶?shí)例包括2,6-二叔丁基對(duì)曱酚，叔丁基對(duì)羥基茴香醚，沒食子酸丙酯，檸檬酸，乙氧基會(huì)，ot辟u辛酸，維生素C,維生素E,輔酶Q-10，和艾地苯醌(idebenone);植物性抗氧化劑包括類胡蘿卜素，例如番茄紅素；類黃酮，水飛薊素(乳薊)、水飛薊賓(silybin)、水飛薊寧(silydianin),水飛薊亭(silychristine);大豆(異黃素)，葡萄籽提取物；多酚，例如綠茶提取物，迷迭香酸(迷迭香)，金絲桃素(圣約翰草)，油橄欖苦素(橄欖葉)，姜黃素(curcurmin)(姜黃根)，四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin),和pycogenol海洋白皮+》)?？寡讋┑膶?shí)例包4舌抗炎4直物藥材，例如尿嚢素，聲薈，銀杏，綠茶(也被認(rèn)為是一種抗氧化劑)。皮膚增白劑的實(shí)例是氫醌或曲酸。修復(fù)增強(qiáng)劑/成纖維細(xì)胞增殖化合物的實(shí)例包括銅肽或棕櫚酰五肽(pal-KTTKS)。神經(jīng)fL肉阻斷劑的實(shí)例例如乙?；?(argirdine)或二曱氨基乙醇。螯合劑的實(shí)例包括乙二胺四乙酸二鈉和乙醇羥基二石壽酸鹽(ethanohydroxydiphosphate)。作為載體i式劑的緩沖液的實(shí)例包括檸檬酸，檸檬酸鈉，硼酸，硼砂和磷酸氳二鈉；防腐劑的實(shí)例是對(duì)羥基苯曱酸甲酯，對(duì)羥基苯曱酸乙酯，脫氫乙酸，水楊酸和苯甲酸。為制備油膏，霜，盥洗用香水，乳液等等，通常向該組合物中摻入約0.01到約卯％，特別是約0.1到約20%,更特別是約0.2到約25%的活性成分，如培養(yǎng)的細(xì)胞因子。在油膏或乳膏劑中，舉例來說該載體由以下組成1到20%,特別是5到15%的保濕劑，0.1到10%,特別是0.5到5%的增稠劑和水；或者所述載體可以由以下組成70到99%,特別是20到95%的表面活性劑，和0到20%,特別是2.5到15%的脂肪；或80到99.9%，特別是90到99%的增稠劑；或5到15%的表面活性劑，2畫15%的保濕劑，0到80%的油，^艮少量(<2%)的防腐劑，著色劑和/或香水，以及水。在盥洗用香水中，舉例來i兌該載體由以下組成2到10%的低級(jí)醇，0.1到10%或特別是0.5到1%的表面活性劑，1到20%,特別是3到7%的保濕劑，0到5%的緩沖液，水以及少量(<2%)防腐劑，染料和/或香水。在乳液中，該載體通常由10-50%的油，1到10%的表面活性劑，50-80%的水以及0到3%的防腐劑和/或香水組成。在上述制劑中，所有的％符號(hào)指重量百分比。用于本發(fā)明方法的具體組合物是這樣的組合物其中培養(yǎng)的皮膚試劑配制在含脂質(zhì)體的組合物中，其中脂質(zhì)體作為該培養(yǎng)的皮膚試劑的功能性載體試劑。脂質(zhì)體是由兩性分子形成的人造液泡，所述兩性分子例如極性脂類，比如磷脂酰膽堿，乙醇胺以及絲氨酸，鞘磷脂，心磷脂，縮醛磷脂，磷脂酸以及腦苦脂。當(dāng)適宜的兩性分子能夠在水或者水溶液中膨脹形成液晶時(shí)，就形成了脂質(zhì)體，所述液晶通常是多層結(jié)構(gòu)，包含由含水物質(zhì)彼此分開的多個(gè)雙層(也稱作粗脂質(zhì)體)。另一種類型的脂質(zhì)體公知是由包封著液態(tài)材料的單個(gè)雙層組成，稱為單層液泡(unilamellarvesicle)。如果在脂類膨脹期間水相中含有水溶性的材料，它們將被截留在脂雙層之間的水層中。水溶性的活性成分，例如培養(yǎng)的皮膚試劑的各種鹽形式，被包封在該分子層之間的含水空間內(nèi)。培養(yǎng)的細(xì)胞因子的脂類可溶性活性成分，例如有機(jī)模擬物，被主要地?fù)饺朐撝悓?，盡管極性頭部基團(tuán)可能從該層中伸出到含水空間中。許多方法都能實(shí)現(xiàn)這些化合物的包封過程。最常用的方法涉及通過從有機(jī)溶劑的蒸發(fā)而將磷脂薄膜澆鑄到燒瓶壁上。當(dāng)該薄膜分散在適宜的含水介質(zhì)中時(shí)，就形成了多層脂質(zhì)體。適當(dāng)?shù)某曁幚砗?，這種粗脂質(zhì)體形成較小的類似閉合的液泡。通常通過用化合物水溶液分散澆鑄膜而摻入水溶性的活性成分。然后通過離心，層析法，透析或者其它本領(lǐng)域公知的適用方法去除這種未包封的化合物。通常在進(jìn)行膜澆鑄之前，將脂類可溶性活性成分與磷脂一起溶解于有機(jī)溶解中，從而將其摻入。如果在脂相中這種材^F的溶解度不高于或者其存在的量不多于將要與其結(jié)合的化合物，則通過上述方法制備的脂質(zhì)體含有的這種材料通常大部分都結(jié)合在脂雙層中；并不要求從未包封的材料中分離這種脂質(zhì)體。在EP-A-253,619中描述了一種特別便利的方法，用于制備脂質(zhì)體配制形式的治療劑，其中含有培養(yǎng)的皮膚試劑，該文引入本文作為參考。在該方法中，含有包封的培養(yǎng)的皮膚試劑的單個(gè)雙層脂質(zhì)體按如下制備將脂類成分溶解在有機(jī)介質(zhì)中，在壓力下將該脂類成分的有機(jī)溶液注射到含水成分中，同時(shí)用高速勻漿器或混合設(shè)備混合該有機(jī)和含水成分，于是自發(fā)地形成脂質(zhì)體。含有包封的培養(yǎng)的皮膚試劑的單個(gè)雙層脂質(zhì)體可以被直接使用，或可以在適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受載體中使用，用于進(jìn)行局部施用。脂質(zhì)體的粘度可以通過加入一種或多種適當(dāng)?shù)脑龀韯┒鰪?qiáng)，例如黃原膠，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素和其混合物。含水成分可以由單獨(dú)的水組成，或其可含有電解質(zhì)，緩沖系統(tǒng)及其他成分，例如防腐劑。可以使用的適用電解質(zhì)包含金屬鹽，例如堿金屬和堿土金屬鹽。優(yōu)選的金屬鹽是氯化鈣，氯化鈉和氯化鉀。電解質(zhì)的濃度可從O到260mM，優(yōu)選5mM到160mM。該含水成分置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，在有機(jī)成分的注射過程中，該容器通過強(qiáng)烈的旋渦而適用于實(shí)現(xiàn)勻漿。這兩種成分的勻漿作用可以在該容器之內(nèi)完成，或者該含水和有機(jī)成分可以獨(dú)立地注射到該容器外面的混合設(shè)備中。在后者情況下，脂質(zhì)體是在混合設(shè)備中形成然后被轉(zhuǎn)移到另一容器進(jìn)行收集。有機(jī)載體成分由合適的無毒藥學(xué)可接受溶劑，例如乙醇，甘油，丙二醇和聚乙二醇，和可溶于這溶劑的適當(dāng)磷脂組成?？梢允褂玫倪m當(dāng)磷脂包含卵磷脂，磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，溶血卵磷脂和磷脂酰甘油。可以使用其它的親脂性添加劑以便選擇性地改進(jìn)脂質(zhì)體特性。這種其它添加劑的實(shí)例包含硬脂胺，磷脂酸，生育酴，膽固醇和羊毛脂提取物。此外，能防止磷脂氧化的其它成分也能被加到該有機(jī)成分中。這種其它成分的實(shí)例包括生育酚，丁基對(duì)羥基茴香醚，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚，棕櫚酸抗壞血酸酯和油酸抗壞血酸酯。還可以加入防腐劑，如苯曱酸，對(duì)羥基苯曱酸甲酯和對(duì)羥苯甲酸丙酯。除了上述組合物，還可以使用覆蓋物，如石膏，繃帶，敷料，紗布?jí)|等等，其中含有本發(fā)明組合物，所述組合物含有適當(dāng)量的培養(yǎng)的皮膚試劑。在一些情況下，可以使用石膏，繃帶，敷料，紗布?jí)|等等，其中摻入了含有治療性制劑的局部制劑。組織密封劑，例如用于輔助傷口閉合的手術(shù)膠也可以含有培養(yǎng)的皮膚試劑。組織密封劑的一種優(yōu)選實(shí)例是血纖蛋白膠，這是由于其與細(xì)胞具有生物相容性。該密封劑可以是液態(tài)形式，適合于加入并混入培養(yǎng)的皮膚試劑組合物。當(dāng)本發(fā)明的培養(yǎng)的皮膚試劑加入到密封劑中時(shí)，該組合物施用于傷口以幫助傷口閉合，細(xì)胞因子能通過密封劑施用部位的細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。的皮膚試劑組合物與包含滲透增強(qiáng)劑的載體混合用于形成皮膚護(hù)理組合物，所述滲透增強(qiáng)劑可以例如是硅酮，其是化學(xué)滲透增強(qiáng)劑的一種實(shí)皮膚以減少皺紋外觀。優(yōu)選重復(fù)地局部施用，至少每天一次，更優(yōu)選每天兩次組織學(xué)表明，當(dāng)局部施用時(shí)，本發(fā)明的組合物能誘導(dǎo)皮膚中的成纖維細(xì)胞從頭合成彈性蛋白并增加皮膚grenz區(qū)域?qū)又械哪z原。照像術(shù)顯示皺紋外觀有所減少。因此，本發(fā)明的一種方法是減少皮膚中的皺紋外觀的方法，該方法包括向具有表現(xiàn)皺紋外觀的區(qū)域的皮膚局部地施用該組合物，其中該組合物能誘導(dǎo)該區(qū)域中的皮膚細(xì)胞從頭合成彈性蛋白，并且增加皮膚的grenz區(qū)域?qū)又械哪z原，使得皺紋外觀減少。在另一優(yōu)選的用培養(yǎng)的皮膚試劑組合物處理皮膚的方法中，該皮膚已經(jīng)首先經(jīng)歷過一次表面重修處理法。所有的皮膚表面重修處理基本上以同樣的方式發(fā)揮作用。首先，剝離掉受損皮膚的外層。然后，由于在修復(fù)過程期間新細(xì)胞增殖并遷移到表面重修的區(qū)域，于是會(huì)呈現(xiàn)出更光滑、緊致、更顯年輕的皮膚表面。在修復(fù)過程期間，來源于經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的培養(yǎng)的皮膚試劑組合物被施用于接受過處理的區(qū)域，用于增強(qiáng)并加速皮膚修復(fù)及色素重新沉著。至于表淺的或中間的表面重+務(wù)，去除的各層皮組織可被限制在表皮和真皮乳頭。至于較深的表面重修，還可以去除網(wǎng)狀真皮的上層。不同的穿透程度可以處理特定的斑點(diǎn)或皺紋。在激光表面重修，有時(shí)叫做"激光去皮"過程中，使用二氧化碳(C02)激光一層一層地去除受損或者起皺皮膚的區(qū)域。以特定和受控的穿透水平，使用能蒸發(fā)受損皮膚上層的激光能量束進(jìn)行激光表面重修過程。該方法通常用于將細(xì)紋外觀減到最低程度，特別是嘴部和眼部周圍；但是在處理面部的疤痕或者不均勻的色素沉著區(qū)域方面也有效。激光表面重修術(shù)還可以在整個(gè)面部或者在特定區(qū)域進(jìn)行。通常，該方法與其他美容操作，例如拉皮手術(shù)或者眼瞼手術(shù)結(jié)合進(jìn)行。通過受控的手術(shù)刮擦方法，"皮膚擦除術(shù)"和"皮膚光滑術(shù)"有助于整修皮膚的頂層。該處理法能軟化不規(guī)則表面的銳邊，賦予皮膚更光滑的外觀。皮膚擦除術(shù)最常用于改善面部皮膚的意外殘留疤痕或者以前的外科手術(shù)殘留疤痕，或者消除面部的細(xì)小皺紋，例如嘴部周圍的那些，不過有時(shí)也用于去除稱作角質(zhì)骨骼的癌前生長(zhǎng)。在皮膚擦除術(shù)中，外科醫(yī)生用附著于機(jī)械化搖柄上的粗糙鋼絲刷或者帶有金剛石顆粒的磨石刮擦掉皮膚的最外層。持續(xù)刮擦直至外科醫(yī)生達(dá)到最安全的水平，使得疤痕或者皺紋不再可見。皮膚光滑術(shù)通常用于處理深的粉刺疤痕。在皮膚光滑術(shù)中，外科醫(yī)生使用一種叫做皮刀(dermatome)的手持式儀器。類似于一種電動(dòng)刮胡刀，該皮刀具有一個(gè)振動(dòng)葉，往復(fù)式移動(dòng)，以便均勻地撇去凹坑或其它面部缺陷周圍的皮膚表層。持續(xù)撇去過程，直至粉刺疤痕或皺紋的最低點(diǎn)變得與周圍皮膚更加均勻。皮膚擦除術(shù)和皮膚光滑術(shù)兩者都能在皮膚的狹小區(qū)域或在整個(gè)面部進(jìn)行。它們能夠單獨(dú)或和其它方法一起使用，例如拉皮手術(shù)，疤痕去除或修復(fù)術(shù)，或化學(xué)去皮術(shù)?；瘜W(xué)去皮術(shù)運(yùn)用一種化學(xué)溶液通過去除面部皮膚的受損外層以改善和平滑面部皮膚的紋理。苯酚，三氯乙酸(TCA)和a羥酸(AHAs)可用于該目的。盡管化學(xué)去皮術(shù)可以和拉皮手術(shù)一起進(jìn)行，但其并非是這種外科手術(shù)的替代，也不會(huì)防止或減緩老化進(jìn)程。a羥酸(AHAs)，例如乙醇酸，乳酸或水果酸是最溫和的去皮配方，會(huì)獲得輕微的剝離。AHA去皮術(shù)可以用于處理細(xì)小的皺紋，干燥區(qū)域，不均勻的色素沉著和粉刺?？梢悦恐芑蛞愿L(zhǎng)時(shí)間間隔施用各種濃度的AHA，用于獲得最佳成效。a羥酸，例如乙醇酸，還可以較小的濃度與含有細(xì)胞因子的面部洗液或霜混合，作為日常的皮膚護(hù)理方案的一部分，改善皮膚的紋理。三氯乙酸(TCA)可以多種濃度使用，不過最常用于中等深度的去皮術(shù)。細(xì)小的表面皺紋，表淺的瑕疵和色素問題通常用一種或多種TCA處理法處理。苯酚是最強(qiáng)的化學(xué)溶液，會(huì)產(chǎn)生深度的去皮效果，有時(shí)在緊接著的時(shí)期內(nèi)能增亮接受過處理的區(qū)域并且影響皮膚色素沉著。其主要用于處理具有粗糙的面部皺紋，日光暴露所引起的帶斑的區(qū)域或受損皮膚，或癌前生長(zhǎng)的患者。在皮膚表面重修方法之后，皮膚會(huì)變得非常紅肺，伴隨一些麻刺感，灼燒感，或疼痛；可以用藥物控制疼痛。幾天到一周時(shí)間內(nèi)腫脹會(huì)減退，在接受過處理的區(qū)域上形成痂或硬皮，開始修復(fù)。當(dāng)下面形成了一層新的，緊致的粉紅色皮膚時(shí)，痂或硬皮就會(huì)脫落。當(dāng)該過程結(jié)束時(shí)，外科醫(yī)生可以決定施用含有培養(yǎng)的皮膚試劑組合物的保護(hù)性霜或油膏處理表面重修的皮膚，直至完成修復(fù)。如果在外科手術(shù)之后立刻施用油膏，幾乎不會(huì)形成痂或完全不形成痂。外科醫(yī)生還可以選4李在最初的5-10天，在接受過處理的區(qū)域上施用繃帶，其將覆蓋并且保護(hù)正在修復(fù)的皮膚。施用于表面重修區(qū)域的含有培養(yǎng)的皮膚試劑組合物的油膏對(duì)患者有益能提供維持年輕的皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子，用于進(jìn)行更快的修復(fù)，并且得到改善的美容效果。提供下面的實(shí)施例以更好解釋本發(fā)明的實(shí)施，而且無論如何它們不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)發(fā)現(xiàn)在不背離本發(fā)明的精神和范圍時(shí)可以對(duì)這里所述方法進(jìn)行多種修改。實(shí)施例實(shí)施例1:培養(yǎng)雙層皮膚構(gòu)建體以生產(chǎn)經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基人新生兒包皮成纖維細(xì)胞(來自O(shè)rganognesisInc.Canton,MA)以5x105個(gè)細(xì)胞/162cm2接種于組織培養(yǎng)處理的燒瓶(CostarCorp.,Cambridge,MA,產(chǎn)品目錄號(hào)3150)并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖配方，無L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville,MD)，其中補(bǔ)加有10%新生小牛血清(NBCS)(HyClone實(shí)驗(yàn)室，Inc.，Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱于37±rC,10±1%C02氣氛下維持。每2-3天將培養(yǎng)基更換成新制備的培養(yǎng)基。培養(yǎng)8天后，細(xì)胞長(zhǎng)至匯合；即細(xì)胞沿組織培養(yǎng)瓶的底部形成緊密的單層，從培養(yǎng)瓶中將培養(yǎng)基吸出。將無菌過濾的磷酸鹽l爰沖液加到每個(gè)培養(yǎng)瓶的底部以沖洗所述單層，然后乂人瓶中吸出。向每個(gè)瓶中加入5ml胰蛋白酶-維爾烯(versene)谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)并輕輕搖動(dòng)以確保完全覆蓋所述單層，使細(xì)月包從燒瓶上消化下來。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。一旦細(xì)胞被消化下來立即向每個(gè)燒瓶中加入5mlSBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與懸浮液混合使胰蛋白酶-維爾烯的作用終止。將細(xì)胞懸浮液從燒瓶中移出并均分入無菌圓錐形離心管中。于大約800-1000g離心5分鐘收集細(xì)胞。使用類似于圖l所示的儀器進(jìn)行以下所述工作。手術(shù)前放好^隻蓋物維持無菌，進(jìn)行手術(shù)時(shí)取掉該覆蓋物。列舉該儀器的有關(guān)信息外容器10直徑38mm,容積35ml,內(nèi)容器20直徑24mm,容積4ml?？蓾B透構(gòu)件24由聚碳酸酯膜組成，孔徑約3nm(微米)，厚度5jum(微米)。如下述，在該可滲透構(gòu)件24上形成無細(xì)胞的水合膠原凝膠25:16.2mlIOX極限必需培養(yǎng)基(MEM),1.6ml200mML-谷氨酰胺，0.2ml50mg/ml慶大霉素，18.0ml胎牛血清，5.0ml71.2mg/ml碳酸氬鈉的"預(yù)混合"溶液。按照上述排序，無菌地組合所述各原液，并在無菌的50ml試管中于4。C儲(chǔ)存大約30分鐘。將約27.8g溶于0.05Q/。v/v乙酸中的1mg/ml膠原溶液(從小牛普通趾伸肌腱中通過酸^是取得到)稱量到50ml試管中，4。C儲(chǔ)存30分鐘。加入約8.2ml上述的預(yù)混合物和4mlDMEM完全培養(yǎng)基(含有10%FBS,4mML-谷氨酰胺，50|ug/ml慶大霉素)，吸取lml該等分物，加到內(nèi)容器20的膜上，在室溫下生成凝膠。用人真皮成纖維細(xì)胞澆鑄真皮層，即含細(xì)胞的水合的膠原凝膠，并如下所述接種人表皮(上皮)細(xì)胞。在Bell的美國(guó)專利4,485,096，Kemp的美國(guó)專利5,536,656和Parenteau的美國(guó)專利5,712,163中也有方法和試劑的一般說明。用于制備真皮層的澆鑄混合物包含約8.2ml的上述預(yù)混合物，并同樣如上文所述加入27.8g溶于0.05%v/v乙酸中的1mg/ml膠原溶液，和4ml密度為2.5x105個(gè)細(xì)胞的人真皮成纖維細(xì)胞。吸取3ml等分物到容器20上面的無細(xì)胞水合膠原凝膠25上，使其形成凝膠。向外容器20中加入約4.5mlDulbccco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)完全培養(yǎng)基，在36°C/10%C02條件下培養(yǎng)4到8天，使膠原收縮，形成收縮的膠原網(wǎng)格，作為真皮層52。制備如下培養(yǎng)基，用于將表皮細(xì)胞結(jié)合到真皮層52的上表面，該過程稱為表皮化(epidermalization)。按照類似于上面培養(yǎng)真皮成纖維細(xì)胞的方法培養(yǎng)并收集表皮細(xì)胞的單層培養(yǎng)物。表皮化培養(yǎng)基由3:1體積比混合的無鉤DMEM和Ham'sF-12的基礎(chǔ)混合物組成，并加入如下成分1.1mM氬化可的松，5jug/ml胰島素，5jug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，20pM三碘曱腺原氨酸(T3),lxl(r4M乙醇胺，1x10-4Mo-磷酰乙醇胺，0.18mM腺噤呤，2xlO-9M孕酮，5.26xlO-8M硒，0.3%新生小牛血清，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。澆鑄組織等同物之后在第6天開始表皮化。從內(nèi)容器20和外容器10上去掉含有真皮構(gòu)建體的培養(yǎng)基。將50jul人表皮細(xì)胞懸浮液(大約3.33xl(^個(gè)細(xì)胞ml)置于該真皮構(gòu)建體上。然后在36。C和10%C02條件下孵育容器4小時(shí)，然后向外室中加入12.0ml表皮化培養(yǎng)基，向孔中加入4ml。將培養(yǎng)物再放回同一培養(yǎng)箱。表皮化后兩天，向表皮化培養(yǎng)基配方中加入4丐，誘導(dǎo)表皮層的分化。從培養(yǎng)皿上去掉經(jīng)調(diào)節(jié)的表皮化培養(yǎng)基，放置，以分化培養(yǎng)基代替。分化培養(yǎng)基由3:1體積比混合的無鈣DMEM和Ham'sF-12的基礎(chǔ)混合物組成，并加入如下成分1.1mM氬4^可的+>,5jug/ml月夷島素，5(ag/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，20pM三碘曱腺原氨酸(T3)，lxlO-4M乙醇胺，Ixl(T4Mo-石粦酰乙醇胺，0.18mM腺嘌呤，2x10—9M孕酮，5.26xl()-8M硒，0.3%新生小牛血清，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和1.8mM氯化4丐。將培養(yǎng)物再方支回同一培養(yǎng)箱。在5天表皮化后，空氣提升培養(yǎng)物，使培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的正在形成的表皮層表面處于氣-液界面，也就是說，-使該表皮表面接觸空氣。乂人平皿容器的內(nèi)室和外室去除培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基，放置，取出內(nèi)容器，將棉墊放置在外室10的底板內(nèi)部，向下室加入角質(zhì)化培養(yǎng)基，浸透該棉墊。小心地將內(nèi)容器20放回到該被浸透的棉墊上，確保在容器和墊之間沒有氣泡。角質(zhì)化培養(yǎng)基由1:1體積比混合的無鈣DMEM和Ham'sF-12的基礎(chǔ)混合物組成，并加入如下成分1.1mM氪化可的松，5jug/ml胰島素，5jug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，20pM三碘曱腺原氨酸(T3),1x1(TV[乙醇胺，Ix10-4Mo-磷酰乙醇胺，0.18mM腺嘌呤，5.26xl()-8M硒，2.0%新生小牛血清，和2mM抗壞血酸鈉。將培養(yǎng)的皮"夫構(gòu)建體方t回培養(yǎng)箱，在35.5。C和10%(:02條件下培養(yǎng)。每4天取出經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，放置，以新鮮的加鈣維持培養(yǎng)基代替。該維持培養(yǎng)基由1:1體積比混合的無鈣DMEM和Ham'sF-12的基礎(chǔ)混合物組成，并加入如下成分1.1mM氬化可的+A,5jug/ml胰島素，5pg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，20pM三碘曱腺原氨酸(T3),lxl(T4M乙醇胺，Ix10—4Moj粦酰乙醇胺，0.18mM腺噤呤，5.26xlO-8lVUS,和1.0%新生小牛血清。此時(shí)，在真皮層52的上表面形成了良好分層的表皮層28，其呈現(xiàn)正常的天然皮膚的許多形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。使用細(xì)胞增殖，遷移和ELISA測(cè)定，檢驗(yàn)從制造培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的過程中所收集的培養(yǎng)的表皮化、分化、角質(zhì)化和維持培養(yǎng)基。實(shí)施例2:通過人新生兒包皮成纖維細(xì)胞體外形成由內(nèi)源產(chǎn)生的膠原基質(zhì)所形成的皮膚構(gòu)建體通過雙層皮膚構(gòu)建體生產(chǎn)經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，該構(gòu)建體具有由真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)源性生產(chǎn)的基質(zhì)，所述成纖維細(xì)月包描述在Murphy的國(guó)際PCT專利申請(qǐng)公開號(hào)WO00/29553中，該公開文本引入本文。培養(yǎng)人新生兒包皮成纖維細(xì)胞，擴(kuò)充數(shù)目，從它們的基質(zhì)中釋放，計(jì)數(shù)，濃縮，然后重懸到3乂106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，在六孔板中以3.0x106個(gè)細(xì)胞/丁\￥(6.6x1(^個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度接種于孔徑為0.4微米，直徑為24mm的組織培養(yǎng)處理的膜插入物上。用培養(yǎng)基維持該細(xì)胞，并每2-3天換以新鮮的培養(yǎng)基，培養(yǎng)25天。更具體地it，該培養(yǎng)基含有DMEM和HamsF畫12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物；4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)及添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),0.4jug/ml氫化可的松(Sigma,St.Louis,MO)，lx10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma,NY產(chǎn)品目錄#02400ACS等級(jí))，lxl(T4Mo-磷酰乙醇胺(Sigma,St.Loms,MO)，5|ug/ml胰島素(Sigma,St.Loms,MO)，5jug/ml轉(zhuǎn)4失蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三石與甲&t原氨酸(Sigma,St.Loms，MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗壞血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc),0.2g/mlL-脯氨酸(Sigma,StLoms，MO)，O.ljug/ml甘氨酸(Sigma,St.Louis,MO)和0.050/0聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Loms,MO)。使用如上述形成的25天的真皮構(gòu)建體，將正常人新生兒包皮表皮角質(zhì)形成細(xì)胞接種在細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的上表面，形成皮膚構(gòu)建體的表皮層。從培養(yǎng)插入物上及其周圍無菌地去掉培養(yǎng)基。使用來自冷凍的傳代培養(yǎng)細(xì)胞儲(chǔ)存物，按比例擴(kuò)大以傳代4次從而匯合的正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。然后使用胰蛋白酶-維爾烯從培養(yǎng)皿釋放細(xì)胞，合并，離心形成細(xì)胞沉淀，在表皮化培養(yǎng)基中重懸，計(jì)數(shù)并以4.5x1(^個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在膜頂部。然后在37±1。C,10%。02下孵育該構(gòu)建體約90分鐘，讓角質(zhì)形成細(xì)胞附著。孵育之后，將該構(gòu)建體浸在表皮化的培養(yǎng)基中。該表皮化培養(yǎng)基包含Dulbecco的改進(jìn)型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(不含葡萄糖并且無釣，BioWhittaker，Walkersville,MD)和HamsF隱l2培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)'混合物，并#卜充有0.4ing/ml氪葉匕可的+〉(Sigma,St.Louis,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4Mo-磷酰乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5jug/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5iug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三》典甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),6.78ng/ml石西(Aldrich),24.4jug/ml腺噤呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI)，4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)，50jug/mlL陽抗壞血酸鈉鹽(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),16jliM亞油酸(Sigma,St.Loms,MO),1|aM醋酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO)和50jug/ml硫酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。該構(gòu)建體在37±1°C,10±1%C02條件下在該表皮化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。2天后用如上組成的新鮮培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基，放回到設(shè)定為37±rC,10±1。/oC02的培養(yǎng)箱中2天。2天后，含有該構(gòu)建體的載體一皮無菌地轉(zhuǎn)移到帶有足量培養(yǎng)基的新培養(yǎng)盤中，使得液面水平剛剛到達(dá)該載體膜的表面，發(fā)育中的構(gòu)建體處于氣-液界面上。接觸到形成中的表皮層上表面的空氣能使上皮層分層。在37±1°C,10。/。C02和低濕度條件下在培養(yǎng)基中孵育該構(gòu)建體7天，并每2-3天更換培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基含有Dulbecco改進(jìn)型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(不含葡萄糖并且無4丐，BioWhittaker，Walkersville,MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)1:l的混合沖勿，并-卜充有0.4jlig/ml氬化可的爭(zhēng)〉(Sigma,St.Loms，MO),5xl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY)，5xl(T4Mo-磷酰乙醇胺(Sigma,St.Louis，MO),5mg/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO)，5jug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),6.78ng/ml石西(Aldrich),24.4jug/ml腺噤呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI)，4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)，2.65jug/ml氯化4丐(Mallinckrodt,Chesterfield,MO)，16|uM亞油酸(Sigma,St.Louis,MO)，liaM醋酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO),1.25mM絲氨酸(Sigma,St.Louis，MO),0.64mM氯化膽堿(Sigma,St.Louis,MO)和50jug/ml硫酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。每2畫3天給培養(yǎng)物補(bǔ)灃牛，共14天。將表皮細(xì)胞施用到真皮構(gòu)建體后，從培養(yǎng)盤吸出含有發(fā)育中的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，并冷凍直到直接使用，或經(jīng)過處理以濃縮或純化細(xì)胞產(chǎn)生的皮膚試劑。實(shí)施例3:向個(gè)體施用含有培養(yǎng)的皮膚試劑的組合物為測(cè)定含有實(shí)施例1的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的局部霜對(duì)皮膚衰老的影響，將受試者入選到研究中，比較受試組合物與對(duì)照組合物，所述對(duì)照組合物不含有來自經(jīng)調(diào)節(jié)的組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)的皮膚試劑。用兩種不同的霜制劑局部地處理志愿受試者。試驗(yàn)區(qū)被分成四個(gè)區(qū)域，即每個(gè)前臂肘窩遠(yuǎn)端兩厘米處的區(qū)域和每個(gè)前臂肘窩近端兩厘米的區(qū)域。每個(gè)試驗(yàn)區(qū)每天處理兩次，共60天。在施用期間將l毫升各自的霜施用于每個(gè)試驗(yàn)區(qū)。在60天末，從每個(gè)受試者上各試驗(yàn)區(qū)處獲得各自的照片，此外從各試馬全區(qū)處獲得2mm穿刺活組織檢查物。這些活組織檢查物在胰蛋白酶溶液中孵育十二小時(shí)，使表皮與真皮分離。表皮被分離后，接受流式細(xì)胞術(shù)分析，測(cè)定S相中的角質(zhì)形成細(xì)胞百分比。結(jié)果顯示受試制劑相對(duì)于對(duì)照能明顯增加細(xì)胞分裂速度，表明來自經(jīng)調(diào)節(jié)的組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)的皮膚試劑能發(fā)揮促有絲分裂作用，對(duì)衰老表皮細(xì)胞周期有逆轉(zhuǎn)或停止作用。為測(cè)定經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基組合物的強(qiáng)中胚層作用是否能產(chǎn)生真皮作用，進(jìn)一步分析真皮的羥脯氨酸含量，作為細(xì)胞活動(dòng)的一個(gè)間接量度。羥脯氨酸試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示對(duì)照制劑似乎沒有對(duì)真皮發(fā)揮統(tǒng)計(jì)學(xué)作用，而獲自被培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的含有培養(yǎng)的皮膚試劑制劑的受試霜增加了羥脯氨酸含量。實(shí)施例4:角質(zhì)形成細(xì)胞的克隆密度培養(yǎng)評(píng)價(jià)集落規(guī)才莫評(píng)價(jià)來自培養(yǎng)的雙層皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基對(duì)角質(zhì)形成細(xì)月包遷移的作用，4吏用方法如GreenH,KchindcO,ThomasJ:"Growthofhumanepidermalcellsintomultiplecpitheliasuitableforgrafting"ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA76:5665-5668(1979)中所教導(dǎo)，其引入本文作為參考?？諝馓嵘?PAL)10到12天從培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體上取出經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。對(duì)照培養(yǎng)基是與新鮮的FAD培養(yǎng)基1:1混合的新鮮的、未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基，和新鮮的FAD培養(yǎng)基(100%);受試培養(yǎng)基是與新鮮的FAD培養(yǎng)基1:1混合的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。用I型膠原包被100mm或60mm培養(yǎng)皿。用1.5畫5.0xK)S絲裂霉素處理過的3T3細(xì)胞接種到該膠原包被的平皿上作為飼養(yǎng)層。該3T3細(xì)胞培養(yǎng)在不含EGF的FAD培養(yǎng)基10%FCS。以每100mm平皿100個(gè)細(xì)胞或每60mm平皿50個(gè)細(xì)胞的密度接種角質(zhì)形成細(xì)胞。每2-3天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)的第12天固定培養(yǎng)物。使用酸性品紅染色平皿觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，測(cè)定角質(zhì)形成細(xì)胞集落的面積測(cè)量值。數(shù)據(jù)列于表1和圖2。表l經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>該結(jié)果顯示經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞集落大小和數(shù)目有顯著作用，表明含有生物活性成分的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基相對(duì)于新鮮的對(duì)照培養(yǎng)基能夠增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移。實(shí)施例5:測(cè)量角質(zhì)形成細(xì)胞增殖為研究來自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用，使用實(shí)施例1描述的3T3培養(yǎng)系統(tǒng)。在包被了膠原的24-孔板上進(jìn)行增殖試驗(yàn)。接種3T3飼養(yǎng)細(xì)胞到板中的FAD培養(yǎng)基。以1x103個(gè)細(xì)胞/孔接種角質(zhì)形成細(xì)胞到該飼養(yǎng)層，培養(yǎng)9天，每2-3天更換培養(yǎng)基。受試的培養(yǎng)基條件是A.100%未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。B.100%未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基±10ng/mlEGF。C.90Q/o未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基/10。/oPAL10到12天來自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。D.50%未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基/50%PAL10到12天來自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。E.100%PAL10到12天來自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，如圖3所示，條件E的培養(yǎng)基相對(duì)于條件B的含EGF的未經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基能增加增殖。此外，條件D的未經(jīng)調(diào)節(jié)的和經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的1:1混合物相對(duì)于條件C的未經(jīng)調(diào)節(jié)的和經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的9:1混合物增加了角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，條件C的培養(yǎng)基相對(duì)于條件A的100%未經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基具有更大的增殖作用。這些結(jié)果表明經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基含有不同于EGF的其它細(xì)胞因子，其能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。實(shí)施例6:血纖蛋白基質(zhì)上經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞遷移的作用使用Ronfard,V.和Barrandon,Y.的評(píng)價(jià)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的方法進(jìn)行細(xì)胞遷移測(cè)定，如國(guó)際PCT申請(qǐng)?zhí)朩O97/25617公開的，該方法引入本文作為參考。根據(jù)該方法在各平皿底上制備血纖蛋白凝膠基質(zhì)。在血纖蛋白基質(zhì)的頂部，將1x104個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞鋪板在50%DMEM±10%胎牛血清/50。/。受試培養(yǎng)基中。測(cè)試的受試培養(yǎng)基是不含EGF的對(duì)照培養(yǎng)基，含有EGF的對(duì)照培養(yǎng)基和經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37。C孵育20-24小時(shí)，固定，隨著螺旋轉(zhuǎn)角計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞，該轉(zhuǎn)角是細(xì)胞遷移到血纖蛋白凝膠基質(zhì)的過程中形成的。細(xì)胞遷移數(shù)據(jù)列于圖4和5。圖4顯示粘附細(xì)胞數(shù)目，包括血纖蛋白基質(zhì)上靜止的細(xì)胞和以螺旋狀才莫式遷移的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞。圖5顯示運(yùn)動(dòng)細(xì)胞在血纖蛋白基質(zhì)上造成的螺旋轉(zhuǎn)角的平均數(shù)。在經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)中的細(xì)胞與含EGF的新鮮對(duì)照培養(yǎng)基形成的轉(zhuǎn)角幾乎一樣多，顯示存在誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的生長(zhǎng)因子作用，表明經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)也含有生長(zhǎng)因子。實(shí)施例7:其它細(xì)月包的細(xì)l包增殖使用在Kratz和Haegerstrand:"ConditionedMediumfromCulturedHumanKeratinocytesHasGrowthStimulatoryPropertiesonDifferentHumanCellTypes,JournalofInvestigativeDermatology,97:1039-1043(1991)中所述的方法，進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖測(cè)定，該文獻(xiàn)的教導(dǎo)引入本文作為參考。當(dāng)用獲自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，顯示出更強(qiáng)的增殖活性。內(nèi)皮細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)列于圖6。在下面的培養(yǎng)基條件中(分別)測(cè)試平滑肌細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的增殖活性A.100%未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。B.100%未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基±10ng/mlEGF。C.90%未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基/10%PAL10到12天來自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。D.50%未經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基/50%PAL10到12天來自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。E.100%PAL10到12天來自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的維持培養(yǎng)基。平滑肌增殖試驗(yàn)結(jié)果列于圖7，真皮成纖維細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果列于圖8。對(duì)于這兩種測(cè)試的細(xì)胞類型而言，來自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基刺激細(xì)胞增殖的水平高于未經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，含有更高濃度經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，具有增加的增殖作用。該結(jié)果表明培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體能產(chǎn)生生物活性細(xì)胞因子，其對(duì)細(xì)胞增殖有顯著作用。實(shí)施例8:ELISA使用ELISA表征在經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基、未經(jīng)調(diào)節(jié)的對(duì)照培養(yǎng)基、空氣提升培養(yǎng)物使其處于氣-液界面過程中所用棉墊、和獲自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的細(xì)胞提取物中的細(xì)胞因子。具體地，針對(duì)照組細(xì)胞因子測(cè)定堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a(TGFa),所述對(duì)照細(xì)月包因子為KGF(R&DSystems,產(chǎn)品目錄#DKGOO);bFGF(R&DSystems,產(chǎn)品目錄#DFBOO);和TGFoc(oc)(OncogeneResearchProducts,產(chǎn)品目錄#QIA61)。結(jié)果如圖9所示，表明新鮮的未經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基之中存在少量的TGFa,而經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基也含有KGF,bFGF,和高于對(duì)照水平的TGFcx,表明培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的細(xì)胞在受調(diào)節(jié)過程中能產(chǎn)生這些細(xì)胞因子并將其沉積到培養(yǎng)基中。棉墊(通過從其中擠出培養(yǎng)基而獲得經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基)具有甚至更高濃度的bFGF和KGF，以及幾乎相同量的TGFa。該結(jié)果也表明獲自培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的細(xì)胞提取物比對(duì)照培養(yǎng)基含有更高水平的全部三種成分，再次強(qiáng)調(diào)了使用培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體刺激傷口愈合過程的作用。實(shí)施例9:純化/濃縮使用超濾細(xì)胞濾器過濾來自實(shí)施例1的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，去掉培養(yǎng)基中的大分子量成分。使用Amicon8050超濾細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)4亍超濾，該產(chǎn)品帶有一個(gè)上室以及一個(gè)下室，其間由一個(gè)分子量截止濾器分隔。經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基被置于許多超濾單元的上室，使用壓縮氮?dú)馄仁蛊渫ㄟ^過濾膜。將經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基保留物加入到新鮮的未經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中，加入角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)試其與新鮮的不帶該保留物的培養(yǎng)基相比的增殖能力。在含經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基濾液的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照物顯示出更強(qiáng)的增殖能力。實(shí)施例10:經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的作用不依賴于EGF-受體途徑。為測(cè)試經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物導(dǎo)致的遷移作用是否是由于EGF，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。收集實(shí)施例1中的維持培養(yǎng)基，分別使用，因?yàn)樾迈r的維持培養(yǎng)基開始時(shí)不含EGF。在100mm板中使人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合，然后胰蛋白酶化獲得細(xì)胞懸浮液。在1ml存在(GSR或ACM1R)或缺乏(GS或ACM1)濃度為10/ig抗體/104個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的中和性抗EGF受體抗體(UpstateBiotechnology,目錄#05-101)的培養(yǎng)基中，在室溫下孵育細(xì)胞0.5小時(shí)。然后，細(xì)胞鋪板到血纖蛋白基質(zhì)上，測(cè)試其遷移的能力，如先前實(shí)施例6所述。測(cè)試含有或不含EGF(10ng/ml)的未經(jīng)調(diào)節(jié)的(GS)或經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(ACM)。結(jié)果列于圖10，代表三次實(shí)驗(yàn)。該結(jié)果表明培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞能產(chǎn)生一種或多種刺激培養(yǎng)的人細(xì)胞遷移的因子，該作用類似于EGF的作用。但是，EGF抗體的加入(這樣能夠阻斷EGF作用)并未消除ACM的作用，表明經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的效果并非由EGF引起。該結(jié)果強(qiáng)調(diào)ACM能產(chǎn)生一種或多種不同于EGF的因子，其會(huì)顯著誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞按照體內(nèi)皮膚處理的需要遷移。實(shí)施例11:制備含培養(yǎng)的皮膚試劑的皮膚護(hù)理組合物以及在皮膚表面重修術(shù)后處理患者開發(fā)含來自實(shí)施例1的培養(yǎng)的皮膚試劑的局部制劑，作為皮膚護(hù)理產(chǎn)品，用于通過控制激光表面重修術(shù)之后的發(fā)紅以及不適的程度，加速患者復(fù)原。測(cè)試該局部制劑，發(fā)現(xiàn)包含至少如下成分FGF-1(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，IL-la(白介素)，IL-6(白介素)，IL-8(白介素)，IL-11(白介素)，TGF-P1(轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)因子)，TGF-P3(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)，GMCSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)。在無菌條件下，以40%v:v將濃縮的培養(yǎng)的皮力夫試劑加入凝月交皮膚護(hù)理基料(載體)形成受試產(chǎn)品，所述基料由以下成分組成羧甲基纖維素鈉，氯化鈉，三水乙酸鈉，水醋酸，對(duì)羥基苯甲酸甲酯，對(duì)羥基苯甲酸丙酯，作為防腐劑的間曱酚，作為穩(wěn)定劑的1-賴氨酸鹽酸鹽。在十名健康受試者中評(píng)價(jià)激光表面重修術(shù)后施用該受試皮膚產(chǎn)品用于改善美膚結(jié)果的潛能。該研究是在美國(guó)三個(gè)臨床中心進(jìn)行的雙盲多中心研究。在基線，全部十個(gè)受試者接受用CoherentUltrapulse5000C二氧化碳激光進(jìn)行的激光表面重修術(shù)，其中采用六角形點(diǎn)大小2，密度6,功率300毫焦耳，單次通過，第一層之后擦抹。每人都在面部?jī)蓚?cè)在下眼瞼接受處理。在術(shù)后14天，每一側(cè)隨機(jī)分配接受受試產(chǎn)品(載體中的皮膚護(hù)理試劑)或者單獨(dú)的載體。因此，每一受試者充當(dāng)他/她的自身對(duì)照。在激光表面重修術(shù)后第一個(gè)4天期間，在各自指定位點(diǎn)施用受試產(chǎn)品或?qū)φ蘸螅卵鄄€的兩側(cè)用Flexzan局部傷口敷料(DowB.Hickam,Inc.,SugarLand,TX)覆蓋。其后，該受試者再施用受試產(chǎn)品或?qū)φ?，直至研究?4天并且繼續(xù)直至研究第90天。在研究第2,4,10,14，30和卯天評(píng)價(jià)下列臨床指標(biāo)發(fā)紅，水腫，上皮形成，患者不適，受試者滿意度和整體美容效果。主要效力終點(diǎn)是在處理部位的紅斑程度。次要終點(diǎn)是水胂程度，上皮形成，受試者不適，受試者滿意度和整體美容效果。處理的確定由該受試者和研究者判斷。在研究結(jié)束時(shí)，具有處理激光表面重修術(shù)患者的專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)的內(nèi)科醫(yī)師以盲法檢查照片。紅斑以4分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估(1)沒有，(2)輕度，(3)中度，(4)重度。通過臨床觀察和受試者詢問評(píng)價(jià)安全性。所有的患者在激光表面重修術(shù)之后幾天內(nèi)經(jīng)歷了中度到重度紅斑和水肺以及不同數(shù)量的結(jié)硬皮。到手術(shù)后10天，受試產(chǎn)品組的平均紅斑得分(通過照片評(píng)定)少于對(duì)照，并在該研究的整段時(shí)期內(nèi)保持如此。平均六次隨訪的累積紅斑得分在受試產(chǎn)品處理組中是1.85,對(duì)照處理組是1.91。手術(shù)后90天所有的受試者回到基線評(píng)估值。使用單側(cè)t-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，該差異并非統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，但是小樣本規(guī)模的固有限制有希望被未來采用其它受試產(chǎn)品制劑、更精細(xì)的方法以及更大的樣本大小的研究克服。實(shí)施例12:^吏用切向流過濾濃縮及脫鹽使用過濾法濃縮來自實(shí)施例1的皮膚培養(yǎng)物的收集的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基首先通過微孔膜過濾，去掉所有的大顆粒，例如細(xì)胞及細(xì)胞碎片。去除經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的大成分使得下游過濾更加有效。用于濃縮收集的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的切向流過濾裝置是一個(gè)閉環(huán)系統(tǒng)，包括一個(gè)進(jìn)料槽，一個(gè)串聯(lián)連接蠕動(dòng)進(jìn)料泵的出口，該泵又串聯(lián)連接到一個(gè)過濾組件上，該過濾組件又串聯(lián)連接到一個(gè)閥，該閥串聯(lián)連接到進(jìn)料槽的入口。進(jìn)料槽也供連續(xù)進(jìn)料之用，用于在去除濾液時(shí)維持系統(tǒng)體積。這些元件之間的連接是通過醫(yī)學(xué)級(jí)管道。壓力閥串聯(lián)連接，位于該過濾i殳備的兩側(cè)。該過濾組件包含一個(gè)入口及一個(gè)出口，其串聯(lián)過濾環(huán)。在過濾器的相對(duì)側(cè)，有一個(gè)第二出口，從閉環(huán)系統(tǒng)中去除濾液。從冷藏儲(chǔ)存物(在大約4°C)處取出含經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的儲(chǔ)存容器，從儲(chǔ)存容器傾注或泵入過濾系統(tǒng)的進(jìn)料槽。一旦進(jìn)料槽內(nèi)具有足夠體積的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，即打開泵。當(dāng)培養(yǎng)基循環(huán)時(shí)，培養(yǎng)基是沿著膜表面切向地纟皮泵送。施加的壓力用來^f吏一部分培養(yǎng)基通過膜到達(dá)濾液一側(cè)，而太大以至于不能經(jīng)過膜孔的顆粒及大分子保留在上游側(cè)，；陂切向流掃除掉，因此被保留在循環(huán)中而不會(huì)堵塞在膜表面。泵一直開著，以保證經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基通過過濾回路進(jìn)行循環(huán)。在培養(yǎng)基經(jīng)過膜表面的每次流通過程中，施加的壓力迫使一部分流體穿越該膜到達(dá)濾液流，因此增加了該培養(yǎng)基中太大以至于無法經(jīng)過該膜的分子量成分的濃度。經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基已經(jīng)達(dá)到約20X的濃度，也就是說，未過濾的(IX)經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基濃度的約二十倍，關(guān)掉泵。該切向流過濾系統(tǒng)同樣提供一種去除濃縮的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基成分中的鹽的系統(tǒng)及方法。向該過濾系統(tǒng)的進(jìn)料槽加入無菌過濾的水，稀釋經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的水溶性鹽及大分子量成分。打開泵，使流體循環(huán)通過該系統(tǒng)，再次濃縮經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，同時(shí)去除水溶性鹽。當(dāng)經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中大分子量成分保持在系統(tǒng)中的時(shí)候，含有溶解了的鹽的含水部分通過該過濾器并作為濾液被棄去。再次，經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基已經(jīng)達(dá)到約20X的濃度，也就是說，未過濾的(IX)經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基濃度的約二十倍，關(guān)掉泵。結(jié)果是包含過濾并濃縮了的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基成分的保留物中鹽濃度被降低。實(shí)施例12:制備含培養(yǎng)的皮膚試劑及滲透增強(qiáng)劑的皮膚護(hù)理組合物并在光老化皮膚上測(cè)試為測(cè)定含培養(yǎng)的皮膚試劑的受試制劑改善光老化皮膚外觀的可行性，用10名35歲或更年長(zhǎng)，除具有光老化體征外均健康的研究受試者，進(jìn)行單中心、雙盲、有對(duì)照的飛行研究。該研究針對(duì)的光老化是指在臂及手上的光損傷皮膚，在兩個(gè)對(duì)側(cè)手及臂上具有2個(gè)或更多的總體集合光老化評(píng)估(參見所附標(biāo)準(zhǔn))。通過向皮膚護(hù)理基料(載體)中加入濃縮的培養(yǎng)的皮膚試劑(20%V:V)和滲透增強(qiáng)劑，配制含有培養(yǎng)的皮膚試劑的受試制劑，該基料由廣泛用于化妝品產(chǎn)品的成分組成。受試制劑的基礎(chǔ)成分包括純凈水，曱基丙烯酸聚甘油酯(AND)丙二醇，凡士林，二辛酰醚(Diccaprylylether),PEG-5硬脂酸甘油酯，甘油，聚二甲基硅氧烷(AND)聚二甲基硅烷醇，鯨蠟醇，甜杏仁油，丙烯酸酯/丙烯酸C10-30烷酯交叉聚合物，醋酸生育酚，苯氧乙醇，苯曱醇，乙二胺四乙酸鈉，氫氧化鈉，乳酸。這是受試產(chǎn)品與對(duì)照(僅僅用載體，作為安慰劑)的雙盲、有對(duì)照的飛行研究。每個(gè)受試者都有一個(gè)內(nèi)部對(duì)照(對(duì)側(cè)肢體)及一個(gè)歷史對(duì)照(基線)。受試產(chǎn)品的效果與每個(gè)受試者試驗(yàn)區(qū)的基線預(yù)處理評(píng)價(jià)以及其對(duì)側(cè)肢體相比。IO個(gè)受試者將進(jìn)入研究，他們具有光老化的體征，這些體征是通過色素沉著，血管變化，萎縮，及皮膚松弛度的表現(xiàn)確定的，這是在半定量記分卡上評(píng)定的。這些研究受試者被要求在該研究之前兩星期內(nèi)停止在該處理部位使用任何局部試劑。在12周的隨訪，/人他們的手臂的預(yù)筌定的處理及對(duì)照位點(diǎn)在基線進(jìn)4亍標(biāo)準(zhǔn)的4-6mm皮膚活組織檢查。在第0天，給每個(gè)研究受試者提供一個(gè)處理包，其中含有受試霜的各試管，標(biāo)記了"左，，及"右，，，用每個(gè)處理包中的試管上應(yīng)用的標(biāo)記"左"或"右"隨機(jī)指定，記錄具體的處理包中哪個(gè)試管含有受試產(chǎn)品以及哪個(gè)僅僅含有載體。該代碼對(duì)研究受試者或者調(diào)查者保密，直至研究完成及數(shù)據(jù)分析。每個(gè)受試者的右或左臂/手都可以充當(dāng)處理或?qū)φ?。維持醫(yī)療包的順次列表，當(dāng)新的研究受試者編入該研究時(shí)，研究者可以為他們順序地指定處理包。給研究受試者提供足量的受試產(chǎn)品及載體霜(安慰劑)，確保該研究期間夠用。研究受試者一皮要求每天兩次在前臂，腕及手背施用該受試產(chǎn)品及載體霜，堅(jiān)持14個(gè)星期。告訴研究受試者每天在處理區(qū)域使用一種溫和的肥皂及保濕劑。在處理之前-14天，第O天，4星期，8星期，12星期及14星期評(píng)價(jià)該研究受試者處理部位。在每次隨訪時(shí)，評(píng)價(jià)每個(gè)研究受試者的細(xì)小皺紋，粗缺紋，色斑色素沉著過度，雀斑，不規(guī)則的脫色，觸覺粗糙，毛細(xì)血管擴(kuò)張，彈性組織變性的外觀以及總體集合評(píng)定。任一參數(shù)都以6分的標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)。每次隨訪還進(jìn)行處理的總反應(yīng)，比較研究受試者的狀況和基線狀況，表示為7分的標(biāo)準(zhǔn)。另外，研究者會(huì)進(jìn)行非侵入性的測(cè)定，用于評(píng)價(jià)該處理及對(duì)照位點(diǎn)。這些包括照像(數(shù)字式，交叉極化，紫外的)，分光術(shù)及cutometry。分光術(shù)及cutometry是非侵入性測(cè)量，涉及在處理部位的皮膚上安插探針。激發(fā)熒光分光術(shù)使用一種光源及一種光電倍增管，檢測(cè)發(fā)色團(tuán)例如膠原，彈性蛋白的內(nèi)源熒光及細(xì)胞增殖標(biāo)記。Cutometry通過小探針末端產(chǎn)生的吸力測(cè)量皮膚彈性。還評(píng)價(jià)研究受試者的孔大小的存在及光老化相關(guān)病變(即，光化性角化病)，研究者可以在圖表中標(biāo)記是否存在這些病變及該研究霜是否改變它們。在第14星期，研究受試者完成調(diào)查表用于與基線狀況相比較地評(píng)價(jià)皮膚的美容外觀，以及用于評(píng)價(jià)其關(guān)于該研究霜的意見。每次隨訪時(shí)，詢問研究受試者是否經(jīng)歷了該研究開始后可能會(huì)發(fā)生的任何副作用，藥物的變化，或在任何方法中的偏差。為了明確和理解，通過舉例說明和實(shí)施例詳述了以上發(fā)明，4旦顯然對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)可進(jìn)行特定的變化和修飾。權(quán)利要求1.用作藥物制劑或用作皮膚護(hù)理產(chǎn)品的組合物，含有(a)載體基料；(b)經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其含有由培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞合成并分泌的一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑；以及(c)滲透增強(qiáng)劑。2.用作藥物制劑或用作皮膚護(hù)理產(chǎn)品的組合物，含有(a)載體基料；(b)經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其含有由培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞合成并分泌的一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑；(c)滲透增強(qiáng)劑；以及(d)抗氧化劑。3.權(quán)利要求1的組合物，其中該角質(zhì)形成細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞是才莫擬天然皮膚構(gòu)造的雙層構(gòu)造的共培養(yǎng)物。4.權(quán)利要求3的組合物，其中該共培養(yǎng)物包含收縮的膠原網(wǎng)4各中的成纖維細(xì)胞和所述收縮的膠原網(wǎng)格上排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。5.權(quán)利要求3的組合物，其中該共培養(yǎng)物包含內(nèi)源產(chǎn)生的基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞和所述基質(zhì)上排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。6.權(quán)利要求3的組合物，其中該共培養(yǎng)物包含膠原海綿狀物中的成纖維細(xì)胞和所述膠原海綿狀物上排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。7.權(quán)利要求6的組合物，其中該海綿狀物還含有糖胺聚糖。8.權(quán)利要求3的組合物，其中該共培養(yǎng)物包含篩構(gòu)件上的成纖維細(xì)胞和所述篩構(gòu)件上排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。9.權(quán)利要求1的組合物，其中滲透增強(qiáng)劑是化學(xué)滲透增強(qiáng)劑、活性滲透增強(qiáng)劑，或毛嚢滲透增強(qiáng)劑。10.制備含有經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基的制劑的方法，所述培養(yǎng)基含有由培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑，該方法包括(a)在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)皮膚細(xì)胞以使皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞合成并分泌一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑到培養(yǎng)基中；(b)將含一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基與培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞分離開；以及.(c)制備含有經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的制劑，所述培養(yǎng)基含一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑。11.制備含有經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基的制劑的方法，所述培養(yǎng)基含有由培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑，該方法包括(a)在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)皮膚細(xì)胞以使皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞合成并分泌一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑到培養(yǎng)基中；(b)將含一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基與培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞分離開；以及(c)增加經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)的皮膚試劑的濃度；(d)降低所述經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的鹽濃度(e)制備含有經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的制劑，所述經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基含一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述皮膚細(xì)胞是以模擬天然皮膚構(gòu)造的雙層構(gòu)造共培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞。13.權(quán)利要求12的方法，其中該雙層構(gòu)造包含收縮的膠原網(wǎng)格中的成纖維細(xì)胞和所述收縮的膠原網(wǎng)格上排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。14.權(quán)利要求12的方法，其中該雙層構(gòu)造包含內(nèi)源產(chǎn)生的基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞和所述基質(zhì)上排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。15.權(quán)利要求12的方法，其中該雙層構(gòu)造包含膠原海綿狀物中的成纖維細(xì)胞和所述膠原海綿狀物上排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。16.權(quán)利要求15的方法，其中該海綿狀物還含有糖胺聚糖。17.權(quán)利要求12的方法，其中該雙層構(gòu)造包含篩構(gòu)件上的成纖維細(xì)胞和所述篩構(gòu)件上排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。18.權(quán)利要求11的方法，其中培養(yǎng)的皮膚試劑的濃度增加了5到30倍。19.權(quán)利要求ll的方法，其中培養(yǎng)的皮膚試劑的濃度增加了10到25倍。20.權(quán)利要求ll的方法，其中培養(yǎng)的皮膚試劑的濃度增加了15到20倍。21.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(c)及(d)同時(shí)進(jìn)行。22.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(c)及(d)是重復(fù)進(jìn)行。23.權(quán)利要求ll的方法，其中步驟(c)及(d)是使用切向流過濾進(jìn)行。24.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(c)是使用切向流過濾進(jìn)行。25.權(quán)利要求ll的方法，其中步驟(d)是使用切向流過濾進(jìn)行。26.權(quán)利要求11的方法，其中經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基在濃縮之前被預(yù)過濾以去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片。27.含一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑的經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基在制備藥物制劑中的用途，所述培養(yǎng)的皮膚試劑由培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞合成及分泌。28.處理個(gè)體皮膚的方法，包括將含有經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物局部地施用于皮膚，所述培養(yǎng)基含有一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑，所述試劑由培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞合成并分泌。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體的皮膚^L處理從而增加細(xì)胞增殖和產(chǎn)生。30.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體的皮膚被處理從而降^f氐皮膚中的細(xì)胞衰老的速率。31.;f又利要求28的方法，其中所述個(gè)體的皮膚纟支處理從而減少所述皮月夫中的皺紋和細(xì)紋。32.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體的皮膚被處理從而減少脂肪團(tuán)。33.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體的皮膚被處理從而促進(jìn)血管生成。34.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體的皮膚被處理從而治療神經(jīng)病。35.權(quán)利要求28的方法，其中所迷個(gè)體的皮膚被處理從而減少瘢痕形成。36.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體的皮膚被處理從而減少疤痕外觀。37.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體的皮膚被處理從而促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。38.—種皮膚處理，包含用于增加細(xì)胞增殖和產(chǎn)生以及用于減少細(xì)胞衰老的局部施用的組合物，該組合物用經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基配制，所述培養(yǎng)基含有一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑，所述試劑由培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞合成并分泌。39.用作藥物制劑或用作皮膚護(hù)理產(chǎn)品的組合物，含有(a)載體基料；(b)經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其含有培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞合成并分泌的一種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑；以及(c)基于硅酮的滲透增強(qiáng)劑。40.權(quán)利要求39的組合物，其中所述基于硅酮的滲透增強(qiáng)劑選自環(huán)狀聚二曱基硅氧烷和含聚氧乙烯或聚氧丙烯側(cè)鏈的聚二曱基硅氧烷。41.權(quán)利要求39的組合物，其中培養(yǎng)的皮膚試劑濃縮、脫鹽，并且顯示近似中性的pH。42.處理呈現(xiàn)鈹紋外7見的皮膚區(qū)域的方法，包括的皮膚區(qū)域，所述培養(yǎng)基含;有-^種或多種培養(yǎng)的皮膚試劑，所述試劑由培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞合成并分泌，其中局部施用至少一天一次，用于處理該皮膚區(qū)域，從而誘導(dǎo)皮膚內(nèi)成纖維細(xì)胞在所述皮膚的Grenz區(qū)域中從頭合成彈性蛋白，以加厚Grenz區(qū)域。全文摘要本發(fā)明涉及含有由被培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞合成的生長(zhǎng)劑的組合物。將皮膚細(xì)胞如角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)過程中，被培養(yǎng)細(xì)胞合成并分泌試劑到該細(xì)胞培養(yǎng)基中。收集含有試劑的該培養(yǎng)基，加入到藥物制劑或化妝品制劑中，用于處理個(gè)體。施用該制劑，并且對(duì)細(xì)胞和組織有更新的作用。文檔編號(hào)A61K38/21GK101379182SQ200680052774公開日2009年3月4日申請(qǐng)日期2006年12月14日優(yōu)先權(quán)日2005年12月14日發(fā)明者A·J·尼克松申請(qǐng)人:器官發(fā)生有限公司