專利名稱：含有對映體牛尿酚的組合物和產物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對映體牛尿酚(equol)化合物，即S-牛尿酚和R-牛尿酚的制備和分離，以及含有對映體牛尿酚化合物的食物和藥物，所述食物和藥物用于治療哺乳動物和人類的疾病和病情。
背景技術：
大豆和由純化大豆蛋白制備的食物的營養(yǎng)價值是眾所周知的，而再次對大豆食物產生興趣主要是對異黃酮的潛在健康益處的證明研究的結果，其中異黃酮是大豆中富含的一類植物雌激素。盡管最近FDA許可大豆食物制造商可聲稱每份含至少6.25g大豆蛋白的大豆食物有利心臟健康(FDA，1999)，這還是沒有認識到大豆中異黃酮組分的價值，現(xiàn)在的研究表明植物雌激素具有降低膽固醇的作用，同時還具有有助于降低心血管危險因子的重要非類固醇性質。經常食用大豆的亞洲國家的激素依賴性疾病的低發(fā)病率據(jù)稱部分是由于大豆異黃酮的作用。
植物雌激素，尤其是來自大豆，三葉草和野葛(kudzu)的異黃酮，例如染料木素(genistein)、葛根黃豆苷元(daidzein)、黃豆黃素(glycitein)、peurarin及其糖苷衍生物、雞豆黃素(biochanin)A和芒柄花黃素(formononetin)，及其糖苷衍生物，在一些哺乳動物和人組織中顯示雌激素的性質，并在其它組織中通過在雌激素受體位點競爭性抑制雌激素結合而顯示抗-雌激素的性質。和雌激素不同，這些異黃酮植物雌激素似乎與乳腺癌和子宮癌的危險增高無關，并實際上可抑制乳腺癌和前列腺癌的發(fā)病。
心血管疾病是發(fā)病率和死亡率的主要病因，特別在美國和西歐國家更是如此。數(shù)種致病因子參與心血管疾病的發(fā)病，包括對該疾病的遺傳素因、性別、生活方式因子例如吸煙和飲食、年齡、高血壓、高脂血癥，包括高膽固醇血癥。數(shù)種這些因子，尤其是高脂血癥和高膽固醇血癥，導致動脈硬化的發(fā)病，而動脈硬化是血管和心臟疾病的主要病因。
高血膽固醇濃度是人類血管疾病和冠心病的關鍵危險因子之一。升高的低密度脂蛋白膽固醇(下文稱″LDL-膽固醇″)和總膽固醇與冠心病危險增高直接相關(Cholesterol and Mortality30 Years of Follow-Up from theFramingham Study，Anderson，Castelli，& Levy，JAMA，Vol.257，pp.2176-80(1987))，而低水平的高密度脂蛋白膽固醇(下文稱″HDL-膽固醇″)也是誘病因子。數(shù)個臨床實驗支持HDL-膽固醇對動脈硬化的保護作用。研究還顯示，婦女的血HDL-膽固醇每增加1-mg/dL，冠狀血管疾病的危險性就降低3％(High-density Lipoprotein Cholesterol and Cardiovascular DiseaseFour ProspectiveAmerican Studies，Gordon，Probstfield，and Garrison et.al.，Circulation，Vol.79，pp.8-15(1989))。
雌激素在調節(jié)脂質代謝和保持血管健康方面起重要作用，正如絕經后血漿膽固醇增加，以及在美國和大多數(shù)西方國家中死于心血管疾病的婦女多于男子這一事實可證明。為此，一直相信HRT能通過預防CVD來使絕經后婦女受益。最近對16,608名以上絕經后堅持HRT 8年以上的婦女進行的婦女健康初步研究(Women′s Health Initiative Study)沒有顯示這種益處，并且實際上發(fā)現(xiàn)由于血栓栓塞和心臟疾病導致的死亡危險增加，尤其是在聯(lián)用雌激素和孕激素的第一年中，同時乳腺癌的危險性顯著增加。由于這些報道的結果，HRT使用急劇減少，而且現(xiàn)在婦女不斷地尋找雌激素的替代形式來改善絕經后雌激素缺乏。植物雌激素如異黃酮通過與雌激素受體的構象結合而起到天然選擇性雌激素受體調節(jié)物的作用，是潛在有吸引力的替代物，并且雖然公開了很多大豆或三葉草異黃酮的用途，但是關于重要的代謝物質牛尿酚的潛在價值只有很少的數(shù)據(jù)。
最近研究表明，大豆異黃酮對于降低動物內血總膽固醇和LDL-膽固醇濃度有重要作用，從而抑制動脈硬化發(fā)病。異黃酮對人血膽固醇水平的作用更加有爭議，但數(shù)項研究現(xiàn)在表明需要大豆中存在異黃酮來觀察到膽固醇-降低作用。Crouse等人的重要研究顯示，血清總膽固醇和LDL-膽固醇和大豆蛋白中的異黃酮量之間的劑量依賴關系。與異黃酮可具有膽固醇自身平衡的作用無關，有證據(jù)顯示異黃酮對血管具有重要影響。研究已顯示脂質過氧化減少，動脈活性、血流和血壓的改善，以及血小板聚集的降低。我們最近發(fā)現(xiàn)，包含異黃酮的每日飲食可降低C-反應性蛋白的水平，所述蛋白是炎癥的重要標志物，并被認為是心血管疾病的加速因子之一。所有上述內容都是重要的心血管疾病危險性降低因子。
異黃酮顯示對減少骨質損失的作用(bone-sparing effect)。目前的17項體外培養(yǎng)骨細胞研究，24項絕經后骨質疏松動物模型的體內研究，以及17項飲食干預研究顯示，異黃酮具有減少骨質損失的作用。在所有這些研究中都檢驗大豆異黃酮或三葉草異黃酮。我們首次表明，牛尿酚是重要的骨質營養(yǎng)因子，與雌激素不同，它對絕經后婦女不僅具有降低骨再吸收細胞的活性的能力，實際上還具有增加骨鹽密度的作用。
盡管大量科學文獻關注大豆或三葉草中的天然異黃酮，很少有報道關于它們的腸來源代謝物的作用和效果，并仍需要進一步發(fā)展能在哺乳動物和人中安全提供治療或預防作用的化合物和方法。
1932年，非類固醇雌激素牛尿酚(7-羥基-3-(4′-羥基苯基)-苯并二氫呋喃(chroman))首次從懷孕的母牛尿液中分離并鑒定，并隨后在食用大豆食物的人的尿中鑒定。牛尿酚的結構類似于類固醇雌激素雌二醇(estradiol)。牛尿酚在異黃酮類物質中是獨特的，這是因為它具有手性中心，并因此以兩種不同的對映體形式即R-和S-對映體形式而存在。以前對牛尿酚的所有研究似乎都利用牛尿酚的外消旋形式進行的。通常對兩種形式的牛尿酚的存在缺乏認識，并且就我們的知識而言，對于單個對映體的具體作用或活性尚未有過報道。當牛尿酚最初在母牛的尿中鑒定時，據(jù)報道其是光學活性的，以R-對映體而存在。隨后，發(fā)現(xiàn)這是錯誤的，并有證據(jù)表明從馬尿中分離的牛尿酚形式實際上是S-對映體。我們第一次證明了人腸中產生的牛尿酚形式只是S-對映體，且我們合成并分離了獨立的對映體，并顯示了它們對雌激素受體(ER)即ERα和ERβ的親合力有明顯差異。
雖然最初發(fā)現(xiàn)將大劑量的牛尿酚注射到卵巢切除后的小鼠時，牛尿酚沒有顯示雌激素作用，后來的發(fā)現(xiàn)顯示它是造成綿羊的不育綜合癥的原因。
最初也報道過(-)牛尿酚在卵巢切除后的小鼠中不具有雌激素活性，但隨后證實牛尿酚的外消旋混合物作為弱雌激素起作用，而其前體，葛根黃豆苷元和芒柄花黃素沒有或具有可忽略的雌激素活性。
牛尿酚不通常存在于大多數(shù)健康成人的尿中，除非他們吃了大豆。牛尿酚在體內的形成僅依賴于腸道微生物區(qū)系，這可從以下的發(fā)現(xiàn)證實無細菌的動物不分泌牛尿酚，以及在從出生起就僅喂給大豆食物的新生嬰兒的血漿和尿中沒有發(fā)現(xiàn)牛尿酚。
牛尿酚完全是一種不天然存在于任何基于植物的產物中的非類固醇雌激素。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及用于制備商業(yè)產品的組合物，其包含S-牛尿酚。
本發(fā)明還涉及用于制備商業(yè)產品的組合物，其包含R-牛尿酚。
本發(fā)明還涉及商業(yè)制品，其包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
本發(fā)明還涉及食品組合物，其包含添加劑組分，所述添加劑組分選自S-牛尿酚，R-牛尿酚，以及S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
本發(fā)明還涉及局部用于皮膚的組合物，其包含添加劑組分，所述添加劑組分選自S-牛尿酚，R-牛尿酚，以及S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
本發(fā)明還涉及將牛尿酚的外消旋混合物分離成第一和第二對映體的方法，包括以下步驟(1)提供包含牛尿酚的外消旋混合物的組合物；(2)提供包含手性相的HPLC柱；(3)使用流動相，使一定量的所述組合物通過所述HPLC柱的入口，所述流動相包含C3-C7烷烴(alkyl)和C2-C4醇；(4)自通過步驟起第一段時間后，從HPLC柱出口收集包含第一對映體的第一流出物；并(5)自通過步驟起第二段時間后，從柱出口收集包含第二對映體的第二流出物。
本發(fā)明還涉及進行研究的方法，其中將異黃酮給藥人類受試者，并測定該受試者的至少一種生理數(shù)據(jù)，其包含以下步驟1)將一定劑量的異黃酮給藥至少選定受試組中一個人類受試者2)檢測所述受試者的尿中牛尿酚的水平，和3)鑒定所述受試者為牛尿酚產生者還是非-牛尿酚產生者。
本發(fā)明還涉及制備包含S-牛尿酚的組合物的方法，包括以下步驟1)提供第一組合物，其包含能夠轉化成S-牛尿酚的異黃酮；2)將第一組合物和能將異黃酮轉化成S-牛尿酚的生物體一同培養(yǎng)，3)將所述培養(yǎng)組合物溫育足夠時間，以使部分異黃酮轉化成S-牛尿酚。
本發(fā)明還涉及制備包含S-牛尿酚的組合物，包括以下步驟1)提供包含能轉化成S-牛尿酚的異黃酮的第一組合物，2)將第一組合物和選自下組的酶結合從能夠將異黃酮轉化為S-牛尿酚的細菌中提取的酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，或果膠酶，及其混合物；和3)將所述混合組合物溫育足夠的時間以將部分異黃酮轉化成S-牛尿酚。
本發(fā)明還涉及制備S-牛尿酚產品的方法，包括以下步驟1)提供包含主要由S-牛尿酚組成的牛尿酚對映體的組合物，所述組合物通過生物體的異黃酮代謝在生物合成中產生；2)從所述組合物提取S-牛尿酚，以形成包含S-牛尿酚的產物，所述提取選自a)溶劑提取，包括將所述組合物與低分子量醇混合以使得醇和水的比例為至少40∶60且不超過95∶5，和b)含水酸提取，包括在約4.0-約5.5的pH混合所述組合物；3)將所述提取物濃縮使得固體含量為約15％到約55％；4)將濃縮物稀釋到固體含量為約6％到約13％；和5)將所述固體沉淀從稀釋的溶液中分離，從而形成S-牛尿酚產物。
本發(fā)明還涉及將S-牛尿酚遞送給哺乳動物以預防或治療疾病或相關病情的方法，包括將包含S-牛尿酚或其偶聯(lián)的類似物的組合物給藥所述哺乳動物。
本發(fā)明還涉及將R-牛尿酚遞送給哺乳動物以預防或治療疾病或相關病情的方法，其包括將包含R-牛尿酚或其偶聯(lián)的類似物(conjugated analog)的組合物給藥所述哺乳動物。
本發(fā)明還涉及用酶水解葡糖苷的方法，包括將所述葡糖苷與來自Helixpomatia在一定條件下接觸一段時間，所述條件和時間足以使該葡糖苷轉化成相應的糖苷配基。
附圖簡述

圖1顯示R-牛尿酚和S-牛尿酚對映體的化學結構。
圖2顯示將芒柄花黃素和葛根黃豆苷元轉化成牛尿酚的化學反應圖3顯示通過與Helix pomatia消化液中存在的酶一同溫育從大豆細菌水解異黃酮糖苷的速率。
圖4顯示來自食用大豆的成人的尿樣的牛尿酚對映體洗出物與通過光學二向色性表征的純對映體標準物的比較質譜圖。
圖5顯示對合成牛尿酚的三甲基硅醚(trimethylsilyl ether)衍生物進行的GC-MS分析。
圖6顯示從外消旋混合物手性分離S-牛尿酚和R-牛尿酚的另一質譜圖。
圖7顯示手性分離的質譜圖，所述分離是從培養(yǎng)自“牛尿酚-產生者”的腸細菌對葛根黃豆苷元進行細菌轉化產生的溫育產物。
圖8顯示手性分離的質譜圖，所述分離是從培養(yǎng)自“非牛尿酚-產生者”的腸細菌對葛根黃豆苷元進行細菌轉化產生的溫育產物。
圖9顯示從手性相柱分離并洗脫牛尿酚對映體。
圖10顯示健康成年婦女在口服給藥后體內(±)牛尿酚的血漿出現(xiàn)/消失曲線。
圖11顯示染料木素和(±)牛尿酚對未成熟大鼠的子宮的雌激素活性。
發(fā)明詳述牛尿酚與大多數(shù)異黃酮的區(qū)別在于其由于缺乏雜環(huán)中的雙鍵而具有手性中性。來自大豆、葛根黃豆苷元、黃豆黃素和染料木素、來自三葉草、芒柄花黃素和雞豆黃素A，以及來自野葛，peurarin的植物雌激素異黃酮都不具有手性中心。圖1R-牛尿酚和S-牛尿酚的化學結構。
R-和S-對映體的構象不同，并且預測這將影響牛尿酚如何恰好進入二聚體化ER復合物的腔中的結合位點。許多不同的體外實驗系統(tǒng)已經用于比較異黃酮的動情力。與所用實驗系統(tǒng)無關，牛尿酚，葛根黃豆苷元和雌二醇對子宮胞苷酸受體的相對摩爾結合親合力的數(shù)據(jù)分別為0.4、0.1和1.0。然而這些數(shù)據(jù)在認識到存在不同的ER亞型以及ERβ的發(fā)現(xiàn)之前，因此相對結合親合力反映對ERα的親合力(這是由于ERα是子宮內最主要的受體)，并且沒有將牛尿酚的對映體形式的可能的結構-活性差異考慮在內數(shù)種植物雌激素包括牛尿酚由于其對ERβ蛋白的優(yōu)先結合而在許多雌激素樣物質中是獨特的，并且這解釋了大豆異黃酮在表達這種受體亞型的組織中的一些有益作用，所述組織例如骨、腦和血管內皮。最近，將牛尿酚對人ERα和ERβ的結合親和力與多種其它異黃酮比較。牛尿酚與這兩種受體的結合與染料木素類似，但牛尿酚誘導的基因轉錄比其它任何異黃酮都強，尤其是與ERα結合的時候。有趣的是，這些體外系統(tǒng)中的葛根黃豆苷元顯示極低的親合力和轉錄活性。
大約50％的牛尿酚以游離或未結合的形式循環(huán)，并認為它們比血漿中的游離葛根黃豆苷元(18.7％)或雌二醇(4.6％)的比例高得多。由于未結合的部分可用于進行受體占據(jù)，這可有效增強牛尿酚的總效力。此外，R-牛尿酚和S-牛尿酚都通過在體外和體內拮抗二氫睪酮的能力而具有獨特的抗雄激素性質，由此擴大了R-牛尿酚作為雄激素相關疾病的潛在藥劑的潛在治療作用。我們預計R-牛尿酚也可作為新型雌激素受體ERβ2的配體，所述受體在調節(jié)雌激素受體ERα和ERβ的表達中起作用，并由此證明是治療或預防乳腺癌以及與這些受體介導的信號途徑相關的激素疾病的潛在藥劑。R-牛尿酚也具有抗氧化活性。所以當R-牛尿酚不是在胃腸道中對異黃酮攝入而生理產生時，其是目前沒有認識到的獨特的異黃酮，并可能是重要的藥劑。
如實驗部分所示，確定牛尿酚的S-對映體僅在食用大豆食物的成年人即“牛尿酚產生者”的尿和血漿中發(fā)現(xiàn)。這提示牛尿酚的細菌產生在腸內可能是對映體特異性的，并如實驗部分的實驗(d)所示，S-牛尿酚是體外培養(yǎng)的人腸細菌所產生的唯一牛尿酚對映體。
含有S-牛尿酚的組合物本發(fā)明的組合物包含S-牛尿酚，并通常主要由S-牛尿酚組成。所述組合物用于制備商業(yè)和實驗產品(institutional product)。所述組合物或由其制備的產品，可口服食用或局部應用。
所述產物通常包含出售的或實驗食品、藥物、OTC藥物、油膏、液體、乳膏或其它適合局部應用的物質。每份食品組合物可包含至少1mg到200mg的S-牛尿酚。每劑口服給藥的藥物可包含至少1mg到200mg的S-牛尿酚。
局部應用的產品可包含至少0.1％到10％重量的S-牛尿酚。本發(fā)明的局部組合物可包括其它化妝品或藥物活性物質和賦形劑。適宜的化妝品和藥劑包括但不限于，抗真菌劑、維生素、抗炎劑、抗微生物劑、止痛劑、一氧化氮合酶抑制物、驅昆蟲劑、自染色劑(self-tanning agents)、表面活性劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、殺菌劑、稠化劑、潤滑劑、保濕劑、鰲合劑、皮膚滲透增強劑、潤膚劑、香料和著色劑。
S-牛尿酚也可是牛尿酚偶聯(lián)物，其在C-4′或C-7位置與以下偶聯(lián)物偶聯(lián)葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷及其混合物。
用于給藥受試者以治療和/或預防與其相關的疾病，或降低對所述疾病的易患性的組合物或制劑，其也可含本領域抑制的一或多種可藥用的佐劑，載體和/或賦形劑，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients，secondedition，American Pharmaceutical Association，1994(在此引入作為參考)所述的那些。S-牛尿酚可以片劑、膠囊、用于溶解的粉末、糖漿、食物(例如棒、餅干、點心和其它本領域抑制的標準食品形式)或飲料配制物。飲料可含有調味劑、緩沖液等。
本發(fā)明的組合物可包括適合口服，經直腸，經眼，經頰(例如舌下)，經胃腸外(例如皮下，肌肉內，皮內和靜脈內)以及透皮給藥。在任何情況下最適合的途徑取決于被治療疾病的性質和嚴重性，以及患者的狀態(tài)。
本發(fā)明還包括商業(yè)制品，其包含含有牛尿酚非外消旋混合物的組合物，并通常包含主要由S-牛尿酚組成的牛尿酚。所述商業(yè)制品可以是食物，包括軟飲料，以及健康或個人護理產品。
通常所述組合物可通過從R-牛尿酚和S-牛尿酚的外消旋混合物(也稱(±)牛尿酚)中分離S-牛尿酚對映體來制備。通常所述外消旋混合物是通過合成途徑制備的合成外消旋混合物，例如本文所述的混合物。通常，S-牛尿酚組合物中S-牛尿酚的對映體純度為90％最小對映體過量(″EE″)。通常，可制備其中的S-牛尿酚具有96％最小EE，甚至具有98％最小EE的更純的所述組合物。
本發(fā)明的組合物也可包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物，所述混合物具有S-牛尿酚的EE為至少0％到小于90％。具有0％的EE的組合物是兩種對映體為50∶50的外消旋混合物。所述組合物可直接從外消旋混合物通過從所述外消旋混合物不完全分離和去除R-牛尿酚對映體來制備。所述組合物也可通過將包含含有牛尿酚的非外消旋混合物和外消旋混合物的混合物的第一牛尿酸組分，和包含主要由S-牛尿酚組成的第二組分混合來制備。這樣產生的非外消旋組合物具有過量的S-牛尿酚。相反，非外消旋混合物也可被制備成具有過量的R-牛尿酚對映體，所述混合物可通過將包含含有牛尿酚的非外消旋混合物和外消旋混合物的混合物第一牛尿酚組分，與包含主要由R-牛尿酚組成的第二組分混合來制備。根據(jù)組合物中S-牛尿酚和R-牛尿酚的具體益處或指示，可制備一種組合物，其中包含的S-牛尿酚和R-牛尿酚的比例為大于約50∶50到約99.5∶1，更優(yōu)選約51∶49到約99∶1，以及從小于約50∶50到約1∶99.5，更優(yōu)選約49∶51到約1∶99。
所述S-牛尿酚組合物可為食品組合物(其也包括軟飲料)的添加劑成分。所述食品組合物可包括幼兒食品(probiotic food)、胎兒食品(prebiotic food)或飲食食品。通常所述食品將包含的S-牛尿酚水平為每份至少1mg到約100mg，但更優(yōu)選為每份5-50mg的S-牛尿酚。
本發(fā)明的食品組合物也可包含作為本文所述的(±)牛尿酚的非外消旋混合物的組分的S-牛尿酚。
本發(fā)明的示例性組合物可包含一或多種可藥用的或工業(yè)標準填充物(filler)。所述填充物必須對用所述組合物處理的受試者無害。所述填充物可以是固體和/或液體。所述填充物可和活性S-牛尿酚一起配制為單位劑量，例如片劑，其通?？珊屑s10％-80％重量的S-牛尿酚。組合物可通過任何已知的制藥方法制備，例如混合各種成分，任選包括制藥領域已知的賦形劑，稀釋劑(例如水)和輔助劑。
適宜口服給藥的組合物可存在于分離的單位中，例如膠囊、扁膠囊(cachet)、錠劑或片劑，每種都含有預定量的提取物；作為粉末或顆粒；作為溶液或水性或非水性液體中的懸浮液；或者作為水包油或油包水的乳液。這種組合物可通過任何適宜的制藥方法制備，其包括將活性S-牛尿酚與一或多種適宜的載體(其可包含一或多種上述附加成分)接觸的步驟。通常，本發(fā)明的組合物的制備可通過將S-牛尿酚與液體和/或微?；墓腆w載體均勻且密切地混合，并隨后如必要使產生的混合物成型來進行。例如，片劑可通過包含或模制(moulding)含有所述提取物的粉末或顆粒以及任選的一或多種附加成分來制備。壓縮的片劑可通過將粉末或顆粒形式的提取物在適宜的機器中壓制來制備，所述提取物任選與粘合劑，潤滑劑，惰性稀釋劑，和/或表面活性劑/分散劑混合。模制的片劑可通過在適宜的機器中對用惰性液體粘合劑濕潤的粉末狀化合物進行模制來制備。
適宜的填充劑包括，例如糖(如乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇)，纖維素制備物和/或磷酸鈣(例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣)，粘合劑(例如淀粉漿糊，所述淀粉漿糊利用例如玉米，小麥，大米或馬鈴薯淀粉，明膠，西黃蓍膠，甲基纖維素和/或聚乙烯吡咯烷酮)，并且如需要可包含崩解物(例如上述淀粉，以及羧甲基淀粉，交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂或褐藻酸或其鹽，例如褐藻酸鈉)。賦形劑可以是流動調節(jié)劑和潤滑劑，例如硅酸，滑石，硬脂酸或其鹽，例如硬脂酸鎂或鈣，和/或聚乙二醇。對糖丸核心可提供適宜并任選的腸溶性包衣，所述包衣可使用包含阿拉伯樹膠(gum Arabic)、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦的濃縮糖溶液，或者適當?shù)挠袡C溶劑或溶劑混合物中的包衣液，或者用于制備腸溶性包衣的適宜纖維素制備物(如乙酰纖維素鄰苯二甲酸酯或者羥基丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯)的溶液。染料或色素可加入片劑或糖丸包衣中，例如用于鑒定的目的或表明活性成分的不同劑量。
其它可口服給藥的藥物組合物是由例如明膠制備的干充填(dry-filled)膠囊，以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨醇制備成的密封軟膠囊。干充填膠囊可包含顆粒形式的提取物，例如與填充物以及適當?shù)姆€(wěn)定劑混合，所述填充物例如乳糖，粘合劑如淀粉和/或glicants(例如滑石或硬脂酸鎂)。在軟性膠囊中，所述提取物優(yōu)選溶解或懸浮于適宜的液體中，例如脂肪油類，石蠟油，或液體聚乙二醇，所述液體中也可加入穩(wěn)定劑。
為對食物進行營養(yǎng)強化(fortification)，將S-牛尿酚與多種食物或食物成分混合，所述食物包括谷類、酸奶、豆奶、湯、奶酪、面食、醬(spread)、糖棒(candy bar)、運動食物棒(sports bar)、飲料或飲食食物。
適宜經頰(舌下)給藥的制劑包括錠劑，其包含位于有味道的基質(通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或者西黃蓍膠)中的提取物；和軟錠劑(pastille)，其包含位于惰性基質例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中的化合物。
適宜直腸給藥的配制劑優(yōu)選為單位劑量的栓劑。這些可通過將異黃酮與一或多種常用固相載體如可可油(cocoa butter)混合，隨后使產生的混合物成型來制備。
含有R-牛尿酚的組合物本發(fā)明的組合物可包含R-牛尿酚，并通常主要由R-牛尿酚組成。所述組合物用于制備商業(yè)和實驗產品。所述組合物，或者由其制成的產物或商業(yè)制品，可口服使用或局部應用。
所述產物可包含本發(fā)明上述的任何與S-牛尿酚相關的產品，其中R-牛尿酚的劑量水平和組合物水平與對S-牛尿酚所述的相同。
所述R-牛尿酚也可是牛尿酚偶聯(lián)物，其在C-4′或C-7位置與選自葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶聯(lián)物偶聯(lián)。
包含R-牛尿酚的組合物或制備物也可包含一或多種可藥用的佐劑，載體和/或賦形劑，并且是如上述與S-牛尿酚相關的產物的形式，所述組合物或制備物給藥受試者以治療和/或預防疾病和相關病情，或者用于降低對所述疾病和相關病情的易患性。
所述組合物通?？赏ㄟ^從R-牛尿酚和S-牛尿酚的外消旋混合物分離R-牛尿酚對映體來制備，如上文對S-牛尿酚的相關敘述。
鑒定牛尿酚產生者和非-牛尿酚產生者健康成人中利用[13C]葛根黃豆苷元和[13C]染料木素示蹤物進行的研究明確表明，牛尿酚從葛根黃豆苷元而不是從染料木素形成。水解來自大豆的葛根黃豆苷元糖苷偶聯(lián)物，以及甲氧基化的異黃酮芒柄花黃素或在三葉草中所發(fā)現(xiàn)的其糖苷偶聯(lián)物以后，形成了牛尿酚。在所有情況下，所述反應通過二氫中間體繼續(xù)，如圖2所示。一旦形成，牛尿酚顯示為代謝惰性，除了階段II代謝或肝中的較小程度的另外的羥基化作用，其不經過任何進一步的生物轉化。對于葛根黃豆苷元和染料木素而言，最主要的階段II反應是葡糖醛酸化(glucuronidation)，以及很小程度的硫酸鹽化作用。最初發(fā)現(xiàn)牛尿酚存在于尿液是大豆食物消化的功能以后，觀察到即使每天用大豆食物攻擊，大約50-70％的成年人群的尿中也不分泌牛尿酚，而原因不明確。此外，即使給予純異黃酮化合物，由此去除食物基質的任何影響，顯示許多人不將葛根黃豆苷元轉化成牛尿酚。這一現(xiàn)象導致將人定義為“牛尿酚-產生者”或“非-牛尿酚產生者”(或“牛尿酚-產生較少者”)來描述這兩種不同的人群。
根據(jù)經驗產生截斷值，使得個體分配到這些種類之一中。血漿牛尿酚濃度低于10ng/mL(40nmol/L)的人可被分類為“非-牛尿酚產生者”，而血漿牛尿酚濃度高于10ng/mL(40nmol/L)的人稱為“牛尿酚產生者”。這一區(qū)分也可從尿中的水平獲得，牛尿酚產生者排尿的牛尿酚高于1000nmol/L。盡管牛尿酚的排出在個體中高度可變，可產生牛尿酚以及不能產生牛尿酚的人之間有很大差別，這與催化該反應的酶動力學中的前體-產物關系一致。因此尿中的葛根黃豆苷元和牛尿酚水平之間存在相反關系(reverserelationship)，并因此沒有發(fā)現(xiàn)明顯的性別差異。
作為牛尿酚產生者或非-牛尿酚產生者的個體的狀態(tài)對于招募用于評估異黃酮(尤其是葛根黃豆苷元，染料木素，芒柄花黃素和雞豆黃素A)給藥的臨床研究受試者很重要。例如，進行的許多骨和大豆飲食研究都有可變的結果。使用骨轉化(bone-turnover)的替代型標志物進行的12周以下的短期研究表明，當飲食中包含含異黃酮的大豆食物時，骨轉化降低，所述標志物例如尿吡啶啉和脫氧吡啶啉(deoxypyrodinoline)交聯(lián)，血漿/血清骨鈣蛋白，堿性磷酸酶，和IGF-1。據(jù)報道多個為期9個月以下的臨床研究顯示對減少骨質損失的作用(bone-sparing effect)。所有研究都在各個位點都測定到骨鹽密度(BMD)改變，并且所述結果與四個中有兩個沒有顯示任何影響相矛盾。在除一項研究以外的所有研究中，沒有意圖限定牛尿酚的狀態(tài)。在所述的一項研究中，發(fā)現(xiàn)當牛尿酚產生者使用大豆食物兩年以上時，其BMD明顯增加。因此，基于我們的數(shù)據(jù)，牛尿酚是骨營養(yǎng)劑(bone-trophic agent)，并因此將個體鑒定為“牛尿酚產生者”具有治療含義，而遞送牛尿酚將對防止骨質損失和增加骨形成有益。
本發(fā)明包括進行研究的方法，其中將異黃酮給藥人類受試者并測定至少一種生理數(shù)據(jù)，包括以下步驟1)將一定劑量的牛尿酚前體異黃酮給藥至少選定受試組中一個人類受試者；2)檢測所述受試者的尿或血中牛尿酚的水平，和3)鑒定所述受試者為牛尿酚產生者或非-牛尿酚產生者。所述生理數(shù)據(jù)通常可被異黃酮的雌激素活性影響。將受試者鑒定為牛尿酚產生者或非-牛尿酚產生者后，可清楚地分析從研究收集的數(shù)據(jù)，從而獲自一或多個鑒定為牛尿酚產生者的數(shù)據(jù)和來自一或多個鑒定為非牛尿酚產生者的數(shù)據(jù)可被收集，分離，分析或報道。鑒定為牛尿酚產生者或非-牛尿酚產生者的個體可從研究受試組中排除(或包括在內)。
牛尿酚的化學合成在該過程中，使用標準化學處理氫化雜環(huán)的雙鍵并用來去除位置C-3上的羰基。常用起始物質是異黃酮，例如葛根黃豆苷元、染料木素、黃豆黃素、peurarin、芒柄花黃素和雞豆黃素A及其糖苷偶聯(lián)物。任何偶聯(lián)形式將通過上述定義的水解還原成其糖苷配基。該反應的適宜溶劑包括有機酸，例如冰醋酸，低級醇例如異丙醇，及其混合物。通常采用的還原催化劑包括鈀，例如木炭上10％的Pd。反應溫度可為環(huán)境溫度到60℃，壓力從略高于環(huán)境壓力到200psig(14atm.gauge)，反應時間為達30小時以上。
反應完成后，去除催化劑和蒸發(fā)任何濾出物。純化粗殘余物，通常通過采用硅膠柱進行層析，使用的洗脫液包含C2-C4醇，C3-C7烷烴，及其混合物。純化的殘余物可從正己烷結晶以產生純(+-)牛尿酚產物(通常99％)，其產率通常至少75％。牛尿酚結晶產物是無色的，不吸濕的，并在空氣中是穩(wěn)定的，而且在最后的過濾步驟中不分解。
所述牛尿酚產物可通過以下方法來證明三甲基硅醚，或叔丁基二甲基硅醚，或合成產物的任何其它異揮發(fā)衍生物的GC-MS分析為單一的純物質峰，且其質譜與可信牛尿酚的三甲基硅(TMS)醚衍生物的公開的電離譜一致。
從外消旋牛尿酚分離單獨的R-和S-對映體的方法本發(fā)明還涉及將牛尿酚的外消旋混合物分離成其兩種單獨的對映體的方法。所述方法利用通常獲自如上述化學合成的外消旋牛尿酚混合物。使用流動相，將一定量的外消旋牛尿酚導入HPLC柱的入口，所述流動相包含C4-C8烷烴和C2-C4醇。從使消旋混合物進入所述入口第一段時間以后，從HPLC柱的出口收集第一流出物，所述時間取決于柱的類型，洗脫液的類型，洗脫液流速，溫度，以及外消旋混合物質量。第一洗出物將包含第一對映體，通常是S-牛尿酚。從使消旋混合物進入所述入口第二段時間以后，從HPLC柱的出口收集第二流出物，所述時間取決于柱的類型，洗脫液的類型，洗脫液流速，溫度，以及外消旋混合物質量。所述第二洗出物將包含第二對映體，通常為R-牛尿酚。
將牛尿酚分離成S-牛尿酚和R-牛尿酚可在手性相柱上進行。手性相柱的一個常見例子是Chiralcel OD柱或OJ柱，由Daicel Chemical Industries Ltd.提供。用于分離商業(yè)數(shù)量的各對映體的柱可在工業(yè)系統(tǒng)中制備，所述系統(tǒng)包括產品和流動相泵，工業(yè)化體積的柱，各種器械和控制系統(tǒng)。所述流動相包括C3-C7烷烴或類似的極性溶劑，C2-C4醇，及其混合物。所述流動相包含己烷與丙醇，其比例通常為95∶5-5∶95，更優(yōu)選為50∶50-90∶10。所述流動相的常見實例包括70％的己烷和30％的乙醇。
牛尿酚對映體從柱的洗脫可通過在260-280nm處UV吸收來檢測或通過更特定的檢測系統(tǒng)例如質譜儀并監(jiān)測對牛尿酚特異的離子來檢測。可最優(yōu)化所述條件以完全分離S-牛尿酚和R-牛尿酚對映體(通過分析性HPLC證實)。
手性相柱通常包括硅石基質，所述硅石基質可用來選擇性分離牛尿酚對映體的物質。常見的選擇物質包括纖維素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纖維素三(4-甲基苯甲酸酯)。
S-牛尿酚的生物制備S-牛尿酚可大批量(in bulk)制備，并可利用常規(guī)食物技術在多種食品中原位制備。可提供堿性溶液介質，食品或植物提取物，其包含葛根黃豆苷元或可衍生葛根黃豆苷元的另一種相關的異黃酮。所述葛根黃豆苷元或其它異黃酮可通過標準細菌或酶發(fā)酵法轉化成S-牛尿酚，以提供包含S-牛尿酚的本體溶液(bulk solution)，食品或植物提取物。
食品中S-牛尿酚的產生可通過利用在食物中生長的細菌的代謝活性來實現(xiàn)，所述食品包含令人滿意的起始物質，例如大豆黃素、葛根黃豆苷元、芒柄花黃素或peurarin，或其偶聯(lián)物或混合物。如圖2所示，葛根黃豆苷元轉化為牛尿酚包括三個主要步驟1)任何葡糖苷偶聯(lián)基團的水解，2)將異黃酮糖苷配基轉化成二氫中間體，和3)將所述二氫-中間體轉化成牛尿酚。所述代謝途徑和三個步驟中每一步所需的酶不必要存在于一個細菌中。來自對人的研究的證據(jù)提示可有一種或多種細菌，它們聯(lián)合進行這些反應，如通常二氫葛根黃豆苷元可以大量存在于血漿和尿中而牛尿酚的量可較低或基本不能檢測到這一事實可證明。盡管牛尿酚可通過單一生物體從葛根黃豆苷元制備，認為當使用各種細菌的混合物時可實現(xiàn)更好或更有效的轉化，其中每種所述細菌都具有自己的代謝圖譜。有效轉化成S-牛尿酚的重要條件包括細菌生物體或生物體混合物的選擇，溫育的條件，以及所述生物體可利用的氧的量。這些條件可通過本領域技術人員已知的技術來優(yōu)化。用于實現(xiàn)該轉變的生物體可通過食品工業(yè)中所用的標準技術失活，或可選擇地允許其以活性狀態(tài)保留在所述產品中。
用于發(fā)酵過程中以將葛根黃豆苷元和/或其它結構相關的異黃酮，或中間化合物轉化成S-牛尿酚的細菌，可包括在人，馬，嚙齒類或其它是“牛尿酚產生者”的哺乳動物的腸道內建群(colonize)的一或多種細菌菌株。由于哺乳動物體內的腸細菌見于糞便中，產牛尿酚的細菌也可在“牛尿酚產生者”哺乳動物的糞便中發(fā)現(xiàn)。
通常用于發(fā)酵過程中的細菌應顯示優(yōu)化的轉化率和轉化程度，使得牛尿酚的生物制備有效。
通常，需要一或多種細菌菌株將葛根黃豆苷元(或其它相關異黃酮)經中間產物轉變成S-牛尿酚，這通常涉及三個主要反應中的一或多個將異黃酮糖苷配糖基(glycone)轉化成糖苷配基異黃酮；將糖苷配基異黃酮轉化成二氫異黃酮；并將二氫異黃酮轉化成產物牛尿酚。例如，從馬糞便分離的生物體的混合培養(yǎng)物和來自已知是“牛尿酚產生者”人的胃腸道的生物體混合培養(yǎng)物可將糖苷配糖基葛根黃豆苷元轉化成最終產物S-牛尿酚，這和它們在體內的表現(xiàn)一致。
可將糖苷配糖基轉化成糖苷配基(例如將葛根黃豆苷元轉化成葛根黃豆苷元)的常見細菌菌株包括糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、威氏利斯特氏菌(Listeria welshimeri)、分離自牛尿酚產生哺乳動物的腸道的生物體混合培養(yǎng)物、脆弱擬桿菌(Bacteriodesfragilis)、乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、粘液真桿菌(Eubactrialimosum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilous)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、費氏丙酸桿菌(Proprionobacteriumfreudenreichii)和Sacharomyces boulardii，及其混合物。
可將糖苷配基轉化為牛尿酚(例如將葛根黃豆苷元轉化為S-牛尿酚)的常見的細菌菌株包括費氏丙酸桿菌；乳酸雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌、屎腸球菌、干酪乳桿菌和唾液乳桿菌的混合培養(yǎng)物；和分離自牛尿酚產生哺乳動物腸道的生物體混合培養(yǎng)物。
葡糖苷到糖苷配基，或糖苷配基到牛尿酚產物的細菌轉化所需的時間將取決于細菌相關因子，尤其是濃度，氧可利用度，以及溫育系統(tǒng)的溫度和pH。在大多數(shù)情況下，可在24小時內實現(xiàn)基本完全的轉化。
異黃酮葡糖苷到糖苷配基異黃酮的細菌轉化的pH范圍是從約3到約9。最佳pH主要依賴于所用的細菌類型，并應相應選擇。
葡糖苷到糖苷配基以及糖苷配基到牛尿酚產物的酶轉化所需的時間取決于酶相關的因子，尤其是濃度，以及該系統(tǒng)的溫度和pH。在大多數(shù)情況下，可在24小時內實現(xiàn)基本完全的轉化，更優(yōu)選在約2小時以內，且最優(yōu)選在約1小時以內。
在生物制備牛尿酚的可選擇的方法中，S-牛尿酚可通過葛根黃豆苷元或其它結構相關的異黃酮，酶轉化為S-牛尿酚在食品或其它適宜的基質中原位產生。適宜的酶可利用分離和純化這些酶的標準技術從細菌中分離并濃縮，所述細菌可有效地將葛根黃豆苷元或結構相關的異黃酮轉化成牛尿酚。這些是已知的，并被本領域以及酶學和生物化學領域的技術人員使用。所述牛尿酚的制備可通過有效轉化而無需細菌在食物本身中生長而獲得。
用于將葛根黃豆苷元和/或其它相關異黃酮，或中間化合物轉化成牛尿酚的酶，可包括從細菌或細菌混合物中分離的酶，所述酶顯示出可將適宜的異黃酮轉化成牛尿酚。這種細菌或細菌混合物的實例可包括，但不限于，在人，馬，或其它是“牛尿酚產生者”的哺乳動物的腸道中建群的細菌。通常用于將葛根黃豆苷元或中間體化合物轉化成牛尿酚的過程中的酶應顯示優(yōu)化的轉化率和轉化程度，以使得牛尿酚的生物制備效率較高。
可用的酶可從一或多種細菌或其混合物中分離，所述細菌為本文所述用于將葛根黃豆苷元或結構相關的異黃酮，或中間體化合物轉化成牛尿酚的細菌。
在常用的方法中，細菌在營養(yǎng)性胰蛋白胨培養(yǎng)液中在無氧條件、約37℃培養(yǎng)約15小時到約72小時，更優(yōu)選從約24小時到36小時。所述細菌隨后通過常規(guī)技術從培養(yǎng)液中分離，最通常通過在約1500g到25000g以及25,000g以上的重力下進行離心。所述細胞在鹽水溶液(從約0.1％到約5％，并優(yōu)選約0.9％)中通過將它們懸浮于所述鹽水溶液中，并再次離心懸液而得以洗滌。利用酶學和生物化學領域的技術人員已知的技術，用所述洗滌后的分離細胞制備活性酶提取物。酶粗提混合物可原樣用作酶提取物，或者可通過常規(guī)酶制備技術進一步純化。
制備的酶提取物可加入到食物中，所述食物含有適宜的異黃酮，例如葛根黃豆苷元、大豆黃素或芒柄花黃素?？杉尤肫渌蛛x的酶，其中一些是可購得的，以加快酶介導的反應途徑中起始物質到中間體的轉化。所述產物通常在約25℃到約45℃的溫度，優(yōu)選在約30℃至約40℃地溫度下溫育，所述溫度優(yōu)選從約30℃到約40℃，同時在正在生長的樣品中保持適當?shù)臒o氧條件。葛根黃豆苷元型化合物轉化成牛尿酚的速率取決于加入食物基質中的活性酶的量。當轉化迅速進行時獲得最好的結果(在約2小時內基本完全)，但更長的轉化時間在低酶活性時是必要的。食物中產生的牛尿酚的量可通過限制食物中含葛根黃豆苷元的化合物的量，或者通過在溫育開始后適當?shù)臅r間失活所述酶，例如將產生的食物產品加熱到約95到100℃來控制。
S-牛尿酚的酶制備的第一步是將葡糖苷轉化為糖苷配基。作為利用以上述方式分離的酶來實現(xiàn)該轉化的替換，可使用可購得的酶。葡糖苷到糖苷配基的酶轉化可通過在適宜的pH和溫度使適宜的酶與異黃酮葡糖苷接觸來進行。已經發(fā)現(xiàn)異黃酮葡糖苷到糖苷配基異黃酮的轉化取決于多種類型的因子，包括所用酶的類型，酶的活性，以及轉化過程中溫育的溶液的pH和溫度。實現(xiàn)所述轉化所需的酶是能夠斷裂異黃酮葡糖苷的異黃酮部分和葡萄糖分子之間的糖苷鍵連的酶。在優(yōu)選實施方案中，所述酶是能夠斷裂1，4-糖苷鍵的糖酶或葡糖淀粉酶。
這類酶是可購得的α-和β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，和果膠酶。這些酶的常見例子包括可得自Deltagen，Redwood City California的Biopectinase 200AL(其優(yōu)選在約2.5到約6.5的pH范圍使用)，Biolactase30,000(最佳pH范圍從約3到約6)和中性乳糖酶(Neutral Lactase)(最佳pH范圍從約6到約8)，均可得自Quest International，1833 57th Street，Post OfficeBox 3917，Sarasota，F(xiàn)la.34243。其它具體優(yōu)選的補充酶包括乳糖酶(Lactase)NL(最佳pH范圍從約6到約8)和Enzeco真菌乳糖酶濃縮物(FungalLactase Concentrate)(最佳pH范圍從約4.5到約6.5)，可得自EnzymeDevelopment Corporation，2 Penn Plaza，Suite 1102，360 West 31stStreet，NewYork，NY 10001；來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶(最佳pH從約6.0到約8.0)，其由Worthington Biochemicals生產，并得自ScimaR，4 Ruskin Close，Templestowe，Victoria.3106，Australia；Lactozyme 3000L(which優(yōu)選在約6至約8地pH范圍內使用)，和A-Gal 600L(其優(yōu)選在約4到約6.5的pH范圍使用)，得自Novo Nordisk Bioindustrials，Inc.，33 Turner Road，Danbury，Conn.06813；Maxilact L2000(其優(yōu)選在約4到約6的pH范圍使用)，得自DSM FoodSpecialties PO Boxl，2600MA，Delft，The Netherlands。
異黃酮葡糖苷到糖苷配基異黃酮的轉化的pH范圍為約3到約9。所用pH主要取決于所用酶的類型，并應當相應選擇。所述酶在其生產商說明的最佳pH范圍內有活性，如上文對數(shù)種具體的酶的說明。通常所述酶在中性pH范圍即從約6-8，或酸性pH范圍即從約3-6有活性。
用于葡糖苷到糖苷配基的轉化的富含異黃酮物質的溫度范圍是從約5℃到約75℃。該溫度明顯影響酶的活性，并由此影響轉化率。所述酶可在70℃以上有活性，例如A-Gal 600L在75℃有活性。然而，優(yōu)選在低溫下進行所述轉化以避免酶失活。在優(yōu)選實施方案中，所述轉化在約35℃-45℃進行。
葡糖苷到糖苷配基的轉化所需的時間取決于酶相關因子，尤其是濃度，以及系統(tǒng)的溫度和pH。在大多數(shù)情況下，可在24小時內實現(xiàn)基本完全的轉化，然而優(yōu)選加入所述酶以急劇增加反應速率。選定的酶，酶濃度，pH和溫度優(yōu)選使轉化在約2小時以內，并優(yōu)選在1小時內基本完成。
將Helix Pomatia用作β-葡糖苷酶本發(fā)明還涉及用酶水解葡糖苷，尤其是異黃酮葡糖苷的新方法，包括將葡糖苷與來自Helix pomatia的含酶提取物在一定條件下接觸一段時間，使得足以將葡糖苷轉化成相應的糖苷配基。含酶提取物通常是Helix Pomatia的消化液。
在從牛尿酚的異黃酮葡糖苷起始物質合成牛尿酚的過程中，發(fā)現(xiàn)Helixpomatia的消化液可有效地作為β-葡糖苷酶來將異黃酮葡糖苷轉化為糖苷配基異黃酮。Helix pomatia消化液以β-葡糖醛酸糖苷酶和硫酸酯酶制備物在市場上購買，并且其作為用于水解類固醇和異黃酮偶聯(lián)物的酶制劑選擇已有30年。其用作β-葡糖苷酶是未知并且是意料之外的。β-葡糖苷酶活性足以能夠在體外完全水解和糖苷配糖基偶聯(lián)的異黃酮。
所述消化液可以原樣形式，或者以純化的形式使用。Helix pomatia消化液水解異黃酮糖苷的效率通過于37℃下，在體外，將各自100μg的大豆黃素(daizin)和100μg的染料木苷(genistin)與0.1mL的Helixpomatia消化液(懸于10mL的0.05M乙酸鈉緩沖液中，pH4.5)一同溫育而確定。加入所述酶/緩沖液混合物之前，將所述混合物通過固相C18 Bond Elut過濾管柱(cartridge)以去除我們過去發(fā)現(xiàn)存在于該酶制備物中的殘余量的異黃酮。保存下來的大豆黃素和染料木苷，以及溫育過程中形成的葛根黃豆苷元和染料木素的濃度通過對在隨后的24小時內間隔取出的混合物的等分樣品進行HPLC確定。
圖3顯示Helix pomatia對大豆黃素和染料木苷進行水解的時間過程，該過程是通過HPLC從保存在溫育混合物中的糖苷對糖苷配基的比例來確定的。這些體外研究顯示在采用的分析條件下，Helix pomatia在15分鐘內完全水解成大豆黃素和染料木苷，并且這種酶制備物除了具有β-葡糖醛酸糖苷酶和硫酸酯酶活性以外，還是β-葡糖苷酶的有用來源。
從本體溶液分離S-牛尿酚大批量生產的S-牛尿酚可從細菌或酶生成S-牛尿酚的本體溶液中通過本領域已知的方法分離，包括結晶，溶劑提取，蒸餾，和沉淀/過濾。產生的本體溶液可含有未反應的葛根黃豆苷元或使用的其它相關異黃酮，副產物，以及任何反應物。這種方法可包括反相(reverse phase)或正相(straightphase)液相層析柱，并且這些方法可以和手性相層析結合。
從本體溶液或固相中去除S-牛尿酚的常用方法是提取。將提取劑溶液加入含有S-牛尿酚的溶液或固相中。通常，所述提取劑是低分子量醇，例如甲醇、乙醇、異丙醇或丙醇，或pH范圍為3.5到5.5的水溶液。通常如果使用含水醇(aqueous alcohol)法，加入足量的醇以使得醇/水比例在最小為40∶60到最大為95∶5的范圍之內。更常見，所述比例至少60∶40，或更常見為65∶35到90∶10。
如果使用含水酸提取法，制備含水酸溶液，將其pH調節(jié)到約3.5到約5.5，甚至更優(yōu)選pH范圍在約4.0-5.0的范圍內。將足量的水加入以產生具有足夠低粘度的稀釋液，以使得可通過離心或過濾從液體中分離固體。
從其中去除了不溶性固體物質的液體可通過常規(guī)去除液體的方法濃縮。常用方法包括，但不限于，通過蒸發(fā)去除溶劑，優(yōu)選在減壓下。殘余的液體濃縮到含至少約15％的固體到約55％的固體，更常見濃縮到含30％到50％的固體。所述濃縮物隨后用水稀釋以降低固體含量并增加水和醇的比例。加入的水的量可在大范圍內變化，但最終固體含量為6％-15％，且更優(yōu)選為約13％。將混合物的pH調節(jié)到約pH3.0-pH 6.5，優(yōu)選為約pH4.0-pH5.0。通常所述溫度在約2℃-10℃，更常見為約5℃-7℃。
隨后通過標準分離技術(離心或過濾)從液體中分離所述固體物質，并產生富含牛尿酚的固體物質。
所述富含牛尿酚的物質可任選純化，通常通過利用硅膠柱進行層析，并采用包含C2-C4醇、C3-C7烷烴、及其混合物的洗脫液。純化的殘留物可從正己烷中結晶以產生純S-牛尿酚產物，其純度通常為至少99％，產率通常為至少75％。所述牛尿酚結晶產物是無色、不吸濕的并在空氣中是穩(wěn)定的，而且不在最終的過濾步驟中分解。
所述S-牛尿酚產物可如下證實三甲基硅醚或叔丁基二甲基硅醚，或合成產物的任何其它易揮發(fā)性衍生物的GC-MS分析為單一的純物質峰，且其質譜與可信牛尿酚的三甲基硅(TMS)醚衍生物的公開的電離譜一致。產物的確認還可通過在將樣品通過HPLC手性相柱導入儀器后利用電噴射電離進行直接質譜法來進行。
通過給藥S-牛尿酚治療疾病本發(fā)明提供使受試個體克服不能在體內產生牛尿酚的問題的方法，所述方法通過直接遞送牛尿酚對映體，具體為S-牛尿酚或S-牛尿酚和R-牛尿酚混合物，避開需要腸細菌來產生牛尿酚的需要。S-牛尿酚的遞送也可補充“牛尿酚-產生者”和“非-牛尿酚產生者”體內的S-牛尿酚產量。
本發(fā)明提供了遞送足夠量的S-牛尿酚以對健康產生益處的方法。所述活性S-牛尿酚物質可通過直接攝入或給藥純S-牛尿酚化合物或S-牛尿酚的任何偶聯(lián)的類似物來遞送。通常，可給藥足量的含S-牛尿酚組合物以在哺乳動物中產生至少5納克每毫升(nanogram per milliliter，ng/mL)，或更常見為至少10ng/mL以上的血漿S-牛尿酚瞬時水平，或者大于1000nmol/L的尿S-牛尿酚瞬時水平。所述S-牛尿酚也可是S-牛尿酚偶聯(lián)物，在C-4′或C-7位置與選自葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶聯(lián)物偶聯(lián)。通常，所述組合物以至少約1mg(更常見為至少5mg)到至多100mg(或更常見為至多50mg)的劑量給藥。
認為遞送足量S-牛尿酚的能力在數(shù)個方面優(yōu)于遞送牛尿酚的外消旋混合物。首先，預測S-牛尿酚的效力是外消旋混合物的至少兩倍。其次，人體僅產S-牛尿酚，并因此僅包含S-牛尿酚的組合物代表具有機體所熟悉的S-牛尿酚成分的“天然”產物。第三，由于認為人體不產生R-牛尿酚對映體，僅包含或基本僅包含S-對映體的治療組合物不會引入機體不熟悉的物質。
本發(fā)明的組合物可用于治療各種激素依賴性疾病和與其相關病情。
本發(fā)明包括S-牛尿酚在治療和預防疾病或病情中的用途，所述疾病或病情包括腦疾病，阿爾茨海默型癡呆，以及其它與年齡增長和短期及長期記憶喪失相關的認知功能降低或障礙。S-牛尿酚的雌激素活性通過增強神經傳遞和恢復突觸密度從而在腦內起作用。認為S-牛尿酚在腦內起作用的位點和雌激素的相同，顯示雌激素反應。
本發(fā)明包括S-牛尿酚在治療和預防骨質減少和骨質疏松中的用途。
在兩年的隨機研究中，絕經后婦女每天喝兩杯有或沒有異黃酮的豆奶。數(shù)據(jù)顯示，在食用有可忽略量的異黃酮的組中，兩年中腰椎BMD和BMC分別降低4.0％和4.3％(p＜0.01)。這些水平與自然絕經第一個兩年中正常預期的5-7％的骨質損失接近。反之，食用含有50mg異黃酮的豆奶的婦女顯示腰椎BMD和BMC分別增加1.1％和2％(相對于基線值)。這項研究顯示與缺乏異黃酮的大豆蛋白相反，含異黃酮的大豆蛋白在兩年的時間中可保持骨質穩(wěn)定。所述數(shù)據(jù)表明，通過腰椎BMD中的變化測定的骨質損失可在異黃酮存在下得以預防。
應提到該差異不是僅在一年之后才觀察到。由于骨轉化率較慢，前一項骨研究的數(shù)據(jù)的變異率很可能是大豆食物短期飲食介入的結果。
最引人注目的觀察是血漿牛尿酚濃度大于10ng/mL(隊列的45％)的“牛尿酚-產生者”婦女，其顯示腰椎骨鹽密度(BMD，p＝0.02)和骨鹽含量(BMC，p＝0.009)分別平均增加了2.4％和2.8％，而“非-牛尿酚產生者”組中BMD和BMC分別增加僅0.6％和0.3％。給予對照物質的婦女顯示BMD和BMC分別平均降低4.0和4.3％(與基線相比p＜0.01)。該數(shù)據(jù)顯示代謝異黃酮以產生牛尿酚的能力以及牛尿酚在機體中的存在與BMD和BMC的增加有直接聯(lián)系。這些數(shù)據(jù)提示，牛尿酚是重要的骨營養(yǎng)劑。給藥足量的含牛尿酚組合物以減少骨轉化的替代標志物，或者防止通過骨鹽密度測定的骨質流失。也可給藥足量的含S-牛尿酚組合物以增加骨形成或防止骨質疏松并減少骨折。
本發(fā)明包括S-牛尿酚在治療和預防脂質疾病例如高膽固醇(高膽固醇血癥)、脂血癥(lipidemia)、脂血(lipemia)和血脂異常(dyslipidemia)(脂質紊亂)中的用途。上述研究還包括對受試者體內膽固醇濃度的研究。結果顯示牛尿酚產生者中的血漿總膽固醇濃度與基線水平相比降低7.2％(p＝0.04)，而非-牛尿酚產生者的血漿總膽固醇濃度與基線水平相比降低3.0％(p＝NS)。大豆蛋白不能在血膽固醇水平正常的成人中顯示明顯的膽固醇-降低效應(幾乎很少有例外)，這很可能是由于研究人群在大豆異黃酮代謝以及不能認識到牛尿酚形成的關聯(lián)性方面的異質性。這些數(shù)據(jù)提示牛尿酚以有利的方式影響脂類。給藥足量的含S-牛尿酚組合物以降低血流中脂質的水平。
本發(fā)明還包括S-牛尿酚在治療和預防急性和慢性卵巢激素缺乏狀態(tài)(包括血管收縮障礙和盜汗，通常稱為“熱潮紅(hot flush)”或熱潮紅(hot flash))中的用途。這也包括用于乳癌治療的伴有熱潮紅的抗雌激素治療。
本發(fā)明還包括S-牛尿酚在治療和預防心血管疾病和肝臟疾病中的用途。
本發(fā)明還包括S-牛尿酚通過增加對血壓急性改變的反應性或適應性，改善血流，和降低血壓用來改善降低的血管質量的用途。
本發(fā)明包括S-牛尿酚在降低脂質過氧化和作為抗氧化物清除體內自由基中的用途。
本發(fā)明還包括S-牛尿酚在減輕炎癥中的用途，這可由其降低炎癥標記物例如C反應性蛋白的效果證實。
本發(fā)明還包括S-牛尿酚在治療和預防癌癥中的用途，所述癌癥包括良性乳腺癌，乳腺癌，良性前列腺癌，前列腺癌，皮膚癌和結腸癌。
本發(fā)明還包括S-牛尿酚在治療和預防腺瘤性息肉(adenomatous polyps)和家族性息肉病(familial polyposis)中的用途，所述兩種疾病都有很高的結腸癌變危險。由于雌激素在降低婦女結腸癌危險性中的重要性，有理由預期牛尿酚對映體具有類似的預防或治療作用，尤其是結腸是牛尿酚前體產生牛尿酚的主要位置。
本發(fā)明的組合物可用于治療各種非激素依賴性疾病和相關病情，包括胃腸道，前列腺，乳腺，皮膚和骨的炎性疾病。
牛尿酚分子中手性中心的存在可能與其生物效能相關。對映體的效力大于消旋體，尤其是對ERβ而言。
本發(fā)明的方法中，鈣或維生素D可共同給藥(在給藥牛尿酚前，同時，或以后)，例如作為分離的藥片，或者作為適當劑型的一部分。
牛尿酚具有與細胞功能相關的其它性質。作為多酚，其與類黃酮都具有作為氫/電子供體的能力，并由此可清除自由基。在體內在FRAP，TEAC和Cu(II)-誘導的或鐵(III)-誘導的脂質體過氧化實驗中，牛尿酚的抗氧化能力在所有檢測的異黃酮中最大。盡管異黃酮在體外檢測時被認為是弱抗氧化劑，它們的體內作用可足以造成回體脂質過氧化降低，當成人使用大豆蛋白食物時，上述現(xiàn)象在除了一項臨床研究以外的所有研究中均可觀察到。由于牛尿酚的抗氧化活性比其它異黃酮好，對“牛尿酚-產生者“或不能產生牛尿酚的那些人直接遞送牛尿酚可有以下情況作為藥劑，補充劑，或遞送到食品中。在所有情況下，增加的循環(huán)牛尿酚水平可提供對脂質過氧化更強的抑制，并由此更大程度地降低心血管疾病的危險性。
認為非-牛尿酚產生者通常比牛尿酚產生者患特定疾病的危險更高，所述疾病通常是激素依賴性疾病或病情，包括乳腺癌。對于產生牛尿酚較少或不產生的人而言，可通過口服，局部，經鼻，經皮下，或靜脈內給藥牛尿酚對映體或其混合物獲得相當?shù)囊嫣帯?br> 在牛尿酚產生者的飲食中補充牛尿酚，具體為S-牛尿酚，可在牛尿酚產生者產生的S-牛尿酚正常水平不足的情況下產生有益效果，這是由于1)攝入的用于產生牛尿酚的異黃酮不足，2)應用的抗生素消除了腸細菌從前體異黃酮產生牛尿酚的活性，或3)其它影響牛尿酚產生水平的健康因子。此外，認為牛尿酚尤其是S-牛尿酚的補充水平(supplemental level)對人的健康狀況提供了增強效果。
通過給藥R-牛尿酚治療疾病本發(fā)明還提供了使個體受試者克服不能在體內產生牛尿酚的問題的方法，其是通過直接遞送牛尿酚對映體，具體為R-牛尿酚或R-牛尿酚和S-牛尿酚的混合物，來回避產生牛尿酚對所需腸細菌。
本發(fā)明提供了遞送足量R-牛尿酚以產生對健康的益處的方法。所述R-牛尿酚物質可通過直接攝入或給藥純R-牛尿酚化合物或R-牛尿酚的任何偶聯(lián)類似物來遞送。通常，可給藥足量的含R-牛尿酚組合物以在哺乳動物中產生至少5納克每毫升(ng/mL)，或更常見為至少10ng/mL以上的血漿R-牛尿酚瞬時水平，或者大于1000nmol/L的尿S-牛尿酚瞬時水平。所述R-牛尿酚也可是R-牛尿酚偶聯(lián)物，在C-4′或C-7位置與選自葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶聯(lián)物偶聯(lián)。通常，所述組合物以至少約1mg(更常見為至少5mg)到100mg(或更常見為到50mg)的劑量口服給藥。
認為遞送足量R-牛尿酚的能力在一些情況下，例如乳腺癌預防，或用于拮抗配體與特異性ER例如ERβ1或ERβ2的結合，在一定程度上優(yōu)于遞送牛尿酚的外消旋混合物。
本發(fā)明的含R-牛尿酚組合物可用于治療各種激素依賴的疾病和相關病情。
本發(fā)明包括R-牛尿酚在治療和預防疾病或病情中的用途，所述疾病或病情包括腦疾病，阿爾茨海默型癡呆，以及其它與年齡增長和短期及長期記憶喪失相關的認知功能降低或障礙。認為R-牛尿酚在腦內起作用的位點和雌激素的相同，顯示通過在腦內特定區(qū)域內富集的特異性雌激素受體介導的雌激素反應，同時也具有防止神經元受到氧化應激的抗氧化作用。
本發(fā)明包括R-牛尿酚在治療骨質減少和骨質疏松中的用途，這是由于抗氧化劑對破骨活性具有保護性作用。
給藥足量的含R-牛尿酚組合物以減少骨轉化的替代標志物，或者防止通過骨鹽密度測定的骨質流失。也可給藥足量的含R-牛尿酚組合物以增加骨形成，或防止骨質疏松并減少骨折。
本發(fā)明包括R-牛尿酚在治療和預防脂質疾病例如高膽固醇(高膽固醇血癥)、脂血癥、脂血和血脂異常(脂質紊亂)中的用途。大豆蛋白不能在血膽固醇水平正常的成人中顯示明顯的膽固醇-降低效應(幾乎很少有例外)，這很可能是由于研究人群在大豆異黃酮代謝以及不能認識到牛尿酚形成的關聯(lián)性方面的異質性。這些數(shù)據(jù)提示牛尿酚以有利的方式影響脂類。給藥足量的含S-牛尿酚組合物以降低血流中脂質的水平并減少脂質過氧化。
本發(fā)明還包括R-牛尿酚在治療和預防急性和慢性卵巢激素缺乏狀態(tài)(包括血管收縮障礙和盜汗，通常稱為“熱潮紅(hot flush)”或熱潮紅(hot flash))中的用途。這也包括用于乳癌治療的伴有熱潮紅的抗雌激素治療。
本發(fā)明還包括R-牛尿酚在治療和預防心血管疾病和肝臟疾病中的用途。
本發(fā)明還包括R-牛尿酚通過增加對血壓急性改變的反應性或適應性，改善血流，和降低血壓用來改善降低的血管質量。
本發(fā)明包括R-牛尿酚在作為抗氧化物清除體內自由基中的用途。
本發(fā)明還包括R-牛尿酚在減輕炎癥中的用途，這可由其降低炎癥標記物例如C反應性蛋白和細胞因子的效果證實。
本發(fā)明還包括R-牛尿酚在治療和預防癌癥中的用途，所述癌癥包括良性乳腺癌，乳腺癌，良性前列腺癌，前列腺癌，皮膚癌和結腸癌。
本發(fā)明還包括R-牛尿酚在治療和預防腺瘤性息肉(adenomatous polyps)和家族性息肉病(familial polyposis)中的用途，所述兩種疾病都有很高的結腸癌變危險。由于雌激素在降低婦女結腸癌危險性中的重要性，有理由預期牛尿酚對映體具有類似的預防或治療作用，尤其是結腸是牛尿酚前體產生牛尿酚的主要位置。
實驗(a)測定“牛尿酚產生”的成年人中的牛尿酚對映體分析來自食用大豆食物的成人的尿樣品。所述成人以前鑒定為“牛尿酚產生者”。通過使樣品通過固相Bond Elut C18管柱從尿(25mL)中分離牛尿酚。用水洗滌該管柱后，用乙醇(5mL)洗脫回收異黃酮，并在氮氣流下干燥甲醇相。用Helix pomatia對樣品進行酶水解，并在Bond Elut C18管柱上再提取。所述甲醇提取物在氮氣下干燥，并溶解于HPLC流動相(100μl)。利用Chiralcel OJ手性相柱利用實施例2中的方法通過HPLC鑒定牛尿酚對映體。牛尿酚的檢測通過選定離子監(jiān)控型電噴射電離質譜(ESI-MS)實現(xiàn)。圖4顯示S-牛尿酚純標準物和來自食用大豆食品的成人的尿的質譜圖。
由于沒有檢測到牛尿酚的R-對映體保留指數(shù)和質譜確定人尿中僅分泌牛尿酚的S-對映體。分析來自相同“牛尿酚-產生者”也顯示僅有牛尿酚S-對映體。
(b)外消旋牛尿酚的化學合成葛根黃豆苷元(200mg，0.8mmol)溶解于冰醋酸(20mL)和異丙醇(20mL)的混合物中，并用木炭(150mg)上的10％Pd在55p.s.i.g.(3.7atm gauge)還原。在反應最后(2小時，TLC異丙醇/正己烷1/4)，將催化劑濾到，并蒸發(fā)濾出物。粗殘余物通過在硅膠柱上利用異丙醇和正己烷(1∶4 v/v)混合物作為洗脫液通過層析純化，以產生從正己烷結晶的純(±)牛尿酚產物(160mg，產率82％)。所述無色晶體的產物，是不可吸濕的，并在空氣中穩(wěn)定，并在最后的過濾步驟中不分解。化學合成產物在各方面都與(±)牛尿酚(外消旋牛尿酚)的可信樣品相同。圖5顯示合成產物的三甲基硅醚衍生物的GC-MS分析是單個純峰，并且其質譜和可信牛尿酚的三甲基硅(TMS)醚衍生物的公開的電離譜一致。所述分子離子和預期的一樣為m/z 470且基峰值在m/z 234處。純化的牛尿酚產物的純度大于99％，如HPLC和質譜所確定的。
(c)通過光學二向色性的S-和R-對映體的洗脫順序S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物通過在Chiralcel OJ柱上進行如下手性層析采用1.0mL/min的流率，并使用梯度洗脫，其初始流動相是己烷中的10％乙醇，然后將己烷中的乙醇在15分鐘的時間內根據(jù)表A的方案增加到90％
表A時間(min.) ％己烷％乙醇0 90101.0 901015.0109016.0901017.09010圖6顯示S-和R-牛尿酚外消旋混合物的離子記錄(m/z 241的質譜。
分別收集第一洗脫物質，命名為對映體-1，和第二洗脫物質，命名為對映體-2。稱重每種對映體并將稱重后的樣品溶于1mL的光譜級乙醇中。每種對映體旋光度的測定在20℃利用波長為鈉的D線的光進行。
對映體-1物質(1.6mg提取重量)第一次和第二次測定值分別為-0.023和-0.022，產生的旋光度為-14[-0.0225×1000/1.6]，這對應于牛尿酚的S-對映體。對映體-2物質(1.7mg提取重量)第一次和第二次測定值分別為+0.023和+0.023，產生的旋光度為+13.5[+0.023×1000/1.7]，這對應于牛尿酚的R-對映體。
(d)通過人腸細菌產生S-牛尿酚來自牛尿酚-產生者和非-牛尿酚產生者的新鮮排出糞便(1g)分別和9mL無菌蒸餾水，胰胨豆胨培養(yǎng)液和加入有葛根黃豆苷元(10mg/L)的腦-心浸出培養(yǎng)液一同溫育。所述培養(yǎng)液在無氧條件下在37℃溫育24小時。所述溫育混合物隨后被離心并使其通過Bond Elut C18固相管柱(Varian Inc，Harbor City，CA)分離異黃酮，并用甲醇洗脫。甲醇提取物隨后在氮氣條件下干燥并再溶解于100μL的流動相，以便通過高壓液相色譜和連接的電噴射電離質譜(ESI-MS)進行分析。
將樣品提取物(20μL)注入柱中，使用的是手性相柱和上述實驗(c)中的洗脫參數(shù)。通過兩種牛尿酚對映體特異性的、m/z 241處離子的負離子模式中的選定離子記錄實現(xiàn)。將溫育提取物的質譜與含約等比例的S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋牛尿酚純標準物進行對比。鑒定是基于兩種對映體的保留差異，其中S-牛尿酚對映體在R-牛尿酚對映體之前洗脫。
圖7顯示溫育產物的離子記錄(m/z 241)的質譜。所述產物是通過培養(yǎng)自“牛尿酚-產生者”的腸細菌將葛根黃豆苷元轉化為牛尿酚所產生的。圖7顯示對應于S-牛尿酚對映體的明顯的峰。反之，圖8顯示溫育產物的離子記錄(m/z 241)的質譜。所述產物是通過培養(yǎng)自“非-牛尿酚-產生者”的腸細菌將葛根黃豆苷元轉化為牛尿酚所產生的，表明在對應S-牛尿酚保留時間處的較小峰值檢測到為零或微量水平的S-牛尿酚。
根據(jù)ESI-MS分析，腸細菌將葛根黃豆苷元轉化為牛尿酚形成的產物是單峰(對映體-1)，其僅對應S-牛尿酚對映體。
這些研究確定了人腸細菌只產生S-牛尿酚對映體，并且這于S-牛尿酚出現(xiàn)在人血漿和尿中一致。
e)測定S-和R-對映體的受體結合能力進行體外結合研究來檢測S-和R-對映體牛尿酚與雌激素受體ERα和ERβ的相對親合力。
激素受體蛋白的合成全長大鼠ERα表達載體(pcDNA-ERα；RH PriceUCSF)和ERβ表達載體(pcDNA-ERp；TA Brown，Pfizer，Groton，CT)用于在體外利用TnT-偶聯(lián)的網狀細胞溶解物系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)和T7-RNA聚合酶，在30℃反應90分鐘合成激素受體。將翻譯反應混合物保存在-80℃?zhèn)溆谩?br> 飽和等溫線為計算并確定S-牛尿酚和R-牛尿酚對映體對ERα和ERβ的結合親合力，將100μL的網狀細胞溶解物等分試樣在濃度漸增(0.01-100nM)的[3H]17β-雌二醇(E2)的情況下在適宜的時間和溫度溫育，即室溫90分鐘(ERβ)和4℃18小時(ERα)。這些時間通過經驗測定，并代表受體與雌激素的最佳結合。非特異性結合通過使用300倍過量的ER拮抗劑乙烯雌酚在平行試管內進行評估。溫育后，通過將溫育的反應物通過1mL的親脂性Sephadex LH-20(Sigma-Aldrich Co.，Saint Louis，MO)柱分離結合和未結合的[3H]E2。根據(jù)以前公開的方案(Handa等，1986；O’Keefe andHanda，1990)，通過將一次性吸液管頭(1mL，Labcraff；Curtin MathesonScientific，Inc，Houston，TX)和TEGMD(10mM Tris-Cl，1.5mM EDTA，10％甘油，25mM鉬酸鹽，和1mM二硫蘇糖醇，pH7.4)-飽和的Sephadex組裝在一起構建。為進行層析，用TEGMD(100μl)重新平衡柱子，并將溫育反應物分別加入各柱中，并在柱上再溫育30分鐘。這次溫育后，將600μL的TEGMD加入到各柱中，收集流出物，加入4mL閃爍液，并在2900 TR Packard閃爍計數(shù)儀(Packard Bioscience，Meriden，CT)中計數(shù)樣品。
使用競爭結合實驗評估牛尿酚的S-牛尿酚和R-牛尿酚對映體的雌激素性質。根據(jù)S和R與[3H]E2競爭ER結合的能力，顯示兩種對映體對體外翻譯的ER的親合力有很大區(qū)別。S-牛尿酚對映體顯示對ERβ的親合力最大[Kd(nm)＝0.73±0.2]，而其對ERα的親合力經比較相對較低[Kd(nM)＝6.41±1.0]。所述R-牛尿酚對映體對ERβ的親合力[Kd(nm)＝15.4±1.3]和對ERα的親合力[Kd(nM)＝27.38±3.8]更低。作為對照，在該系統(tǒng)中17β-雌二醇與Erα以Kd(nM)＝0.13結合且與Erβ以Kd(nM)＝0.15結合。
該研究表明，僅S-牛尿酚對映體與ER以足夠的親合力結合，從而可能與人體中報道的循環(huán)牛尿酚水平相關。與17β-雌二醇的相比，S-牛尿酚和R-牛尿酚對映體與ERα的相對結合親合力分別低49倍和211倍。但S-牛尿酚對映體似乎大多為ERβ選擇性的，其對ERβ的親合力相對較高；而R-牛尿酚對映體與ERβ結合的親合力大約低100倍。僅S-牛尿酚見于人血漿和尿中的分離和結合的測定，就兩種對映體的結合特異性方面而言是顯著的。
實施例實施例1通過HPLC將外消旋牛尿酚分離成分離的對映體合成的S-和R-牛尿酚外消旋混合物根據(jù)實驗部分的實驗(b)所述的化學合成法制備，并通過Chiralcel OJ(0.46cm直徑×25cm長)，由Daicel ChemicalIndustries Ltd提供。所述柱使用10μm硅膠底物上的纖維素三(4-甲基苯甲酸酯)。使用的流動相是梯度洗脫液，其開始是己烷90％/乙醇10％并在15分鐘內根據(jù)表A以1毫升每分的流速(mL/min)線性增加到最終組合物即己烷10％/乙醇90％。牛尿酚從柱的洗脫通過260nm的UV吸收來檢測。圖9顯示使用手性相柱洗脫牛尿酚對映體。R-牛尿酚的保留時間為7.05min，而S-牛尿酚對映體的保留時間為7.75min。對映體的鑒定通過它們的保留指數(shù)與通過光學二向色性確定的純對映體標準物的比較來確定。
實施例2牛尿酚的吸收和生物利用度將25-mg劑量的牛尿酚以單次口服丸的形式給藥健康成年女性受試者，并檢測牛尿酚血漿濃度。通過腸道吸收快速進行，在4-6小時后，達到最大血漿濃度，并隨后從循環(huán)中消失，其終消除(terminal elimination)半衰期為8.8小時。如表B所示，(±)牛尿酚的藥代動力學與其它異黃酮的相似，但與其前體葛根黃豆苷元(Cl/F＝17.5L/h)相比，(±)牛尿酚的血漿清除率較慢(Cl/F＝6.85L/h)并顯示相對高劑量調節(jié)的生物利用度(AUC inf/F＝145.8ng/Ml/hr/mg牛尿酚)。圖10顯示(±)牛尿酚的血漿出現(xiàn)/消失曲線，其表示為對數(shù)/線性圖，顯示對健康成年女性口服給藥(±)牛尿酚以后，牛尿酚的藥代動力學。表B還顯示以前公開的健康婦女中葛根黃豆苷元的比較值。
表B成年婦女 牛尿酚 葛根黃豆苷元tl/2(h) 8.769.34Vd/F(L) 86.7236.4Cl/F(L/h)6.8517.5AUCinf(ng/Ml/hr) 36461470實施例3牛尿酚的雌激素活性將化學合成牛尿酚的外消旋混合物皮下注入(100mg和500mg劑量)幼年22天大的Sprague-Dawley大鼠以比較牛尿酚對未成熟大鼠子宮的雌激素活性。還檢驗了(500mg劑量)和DMSO(對照)。在第17，19和21天測定子宮重量。圖11顯示該模型中外消旋牛尿酚的雌激素活性是染料木素的兩倍以上，從而使得注入劑量的一半是無活性的R-牛尿酚對映體。
實施例4大豆食物中葡糖苷到糖苷配基的細菌轉化在食物中將葛根黃豆苷元轉化為牛尿酚的第一步是將異黃酮的葡糖苷形式轉化為糖苷配基形式，為將糖苷配基酶還原到牛尿酚作準備。檢測大量生物體實現(xiàn)所述轉化的能力。用實驗生物體接種含約3.5％的蛋白，8％的碳水化合物和大約16mg/L的大豆黃素的無菌大豆飲料，并在適宜溫度溫育。溫育溫度為20-40℃認為是適宜的，對于大多數(shù)實驗生物體而言，優(yōu)選30-37℃。對于大多數(shù)細菌菌株在無氧條件下進行溫育。大豆黃素轉化成葛根黃豆苷元的步驟以后，分析樣品中未反應的葛根黃豆苷元，所述樣品是在溫育開始后10小時到72小時的時間內間隔取樣的。結果顯示于表C中。在54種/菌株實驗細菌種，26種不能將大豆黃素轉化為葛根黃豆苷元。在能夠將大豆黃素轉化為葛根黃豆苷元的28中生物體中，4種能快速轉化，需要10小時到24小時來實現(xiàn)基本上100％的轉化。有12種類型的轉化是中等速率的，需要25到72小時來實現(xiàn)基本上完全的轉化。剩下的生物體提供的轉化較慢，在72小時的溫育期內低于50％的轉化完成。顯示快速轉化的生物體包括糞腸球菌，植物乳桿菌，威氏利斯特氏菌(Listeria<p>表21品種0137441的表型描述

分析和比較了0137441和其競爭品種的表現(xiàn)的特性。檢測的特性包括成熟期、植株高度、倒伏情況、種子蛋白與油含量。分析結果如下，見表22-24。
表D食物基質中各種微生物生長過程中葛根黃豆苷元的轉化(無氧條件下在37℃溫育)

實施例6食品中S-牛尿酚的細菌生產制備含有水解植物和乳蛋白以及鹽和糖的簡單，清培養(yǎng)液。將大約2mg/L水平的葛根黃豆苷元加入到培養(yǎng)液中。將所述培養(yǎng)液在壓力鍋中煮大約15分鐘，冷卻到室溫后用來自已知產生牛尿酚的人胃腸道的生物體混合培養(yǎng)物進行接種，所述的人每天常規(guī)使用豆奶。培養(yǎng)液在37℃保持24小時，隨后分析?；钪纳矬w可隨后任選通過常用于失活食品中生物體的方法來破壞。來自葛根黃豆苷元的牛尿酚(推定為S-牛尿酚)的存在通過培養(yǎng)液提取物的電噴射質譜確定。
實施例7在食品中通過酶產生S-牛尿酚將含有乳酸雙歧桿菌，嗜酸乳桿菌，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，屎腸球菌(Enterococcus faecium)，干酪乳桿菌和唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)的細菌混合培養(yǎng)物在營養(yǎng)性胰蛋白胨培養(yǎng)液中無氧條件下于37℃培養(yǎng)24-36小時。所述細菌通過在約10.000重力離心從培養(yǎng)液中分離，并將細胞懸于約0.9％的鹽水溶液中，并隨后再離心。洗滌后的分離細胞用于利用酶學和生化領域技術人員已知的技術來制備活性酶提取物。所述粗酶混合物可用作，或通過常規(guī)酶制備技術進一步純化成純化的酶提取物。
將純化的酶混合物加入含有10mg/L葛根黃豆苷元的食品中，所述組合物在溫和的無氧條件下、約30-40℃溫育約2小時。所述酶隨后通過將所述組合物加熱到約95-100℃而失活，產生含S-牛尿酚的食品。
權利要求
1.用于制備商業(yè)產品的組合物，其包含S-牛尿酚。
2.權利要求1的組合物，其中所述組合物通過從S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物中分離S-牛尿酚制備。
3.權利要求1的組合物，其中所述組合物主要由S-牛尿酚組成，并且對映體純度為90％最小對映體過量(EE)，更優(yōu)選為96％最小EE，甚至更優(yōu)選為98％最小EE。
4.用于制備商業(yè)產品的組合物，其包含R-牛尿酚。
5.權利要求4的組合物，其中所述組合物主要由R-牛尿酚組成，并且對映體純度為90％最小對映體過量(EE)，更優(yōu)選為96％最小EE，甚至更優(yōu)選為98％最小EE。
6.一種商業(yè)制品，其包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
7.權利要求6的商業(yè)制品，其中所述非外消旋混合物包含比例為約1∶99到約49∶51的S-牛尿酚與R-牛尿酚，或約51∶49到約99∶1的S-牛尿酚與R-牛尿酚。
8.權利要求6的商業(yè)制品，其中所述商業(yè)制品包括食品。
9.權利要求8的商業(yè)制品，其中所述牛尿酚的非外消旋混合物是通過將選自S-牛尿酚和R-牛尿酚的第一牛尿酚組分和由S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物組成的第二牛尿酚組分混合制成的。
10.一種食品組合物，其包含選自S-牛尿酚，R-牛尿酚和S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物的添加劑組分。
11.權利要求10的食品組合物，其中所述食品每份包括至少約1mg，至多約300mg的S-牛尿酚，更優(yōu)選至少約10mg，至多約200mg的S-牛尿酚，并甚至更優(yōu)選至少約30mg，至多約50mg的S-牛尿酚。
12.局部用于皮膚的組合物，優(yōu)選為油膏、液體或乳液的形式，所述組合物包含S-牛尿酚和賦形劑，其中S-牛尿酚為所述組合物重量的至少0.1％，至多10％。
13.權利要求12的組合物，其中所述S-牛尿酚在C-4′或C-7位置偶聯(lián)以形成選自下組的偶聯(lián)物葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷及其混合物。
14.將牛尿酚的外消旋混合物分離成第一和第二對映體的方法，包括以下步驟(1)提供包含牛尿酚的外消旋混合物的組合物；(2)提供包含手性相硅石基質的HPLC柱，優(yōu)選其中所述硅石基質包含纖維素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纖維素三(4-甲基苯甲酸酯)；(3)使用流動相，使一定量的所述組合物通過所述HPLC柱的入口，所述流動相包含C3-C7烷烴和C2-C4醇，優(yōu)選其中所述流動相包含比例為95∶5-5∶95，甚至更優(yōu)選為50∶50-90∶10的己烷∶丙醇；(4)自通過步驟起第一段時間后，從HPLC柱出口收集包含第一對映體的第一流出物；以及(5)自通過步驟起第二段時間后，從HPLC柱出口收集包含第二對映體的第二流出物。
15.進行研究的方法，其中將異黃酮給藥人類受試者，并測定至少一種生理數(shù)據(jù)，其包含以下步驟1)將一定劑量的異黃酮給藥至少選定受試組中一個人類受試者，所述異黃酮優(yōu)選選自葛根黃豆苷元，大豆黃素，染料木素，染料木苷，芒柄花黃素，雞豆黃素A和peurarin，及其混合物，2)檢測所述受試者的尿中牛尿酚的水平，和3)鑒定所述受試者為牛尿酚產生者還是非-牛尿酚產生者。
16.權利要求15的方法，其中所述生理數(shù)據(jù)受雌激素活性影響。
17.權利要求15的方法，還包括選自以下步驟的步驟(a)區(qū)別分析鑒定為牛尿酚產生者的多個受試者的數(shù)據(jù)和鑒定為非-牛尿酚產生者的多個受試者的數(shù)據(jù)，和(b)從選定的受試組中排除非-牛尿酚產生者。
18.制備包含S-牛尿酚的組合物的方法，所述組合物優(yōu)選選自食品和局部用于皮膚的組合物，包括以下步驟1)提供第一組合物，其包含能夠轉化成S-牛尿酚的異黃酮，其優(yōu)選選自葛根黃豆苷元、大豆黃素、染料木素、染料木苷、芒柄花黃素、雞豆黃素A、二氫葛根黃豆苷元、peurarin，其偶聯(lián)形式，及其混合物，2)將第一組合物和能將異黃酮轉化成S-牛尿酚的生物體一同培養(yǎng)，3)將所述培養(yǎng)組合物溫育足夠時間，以使部分異黃酮轉化成S-牛尿酚，和4)任選失活所述生物體。
19.權利要求18的方法，其中所述生物體選自糞腸球菌，植物乳桿菌菌株，威氏利斯特氏菌，從已知為“牛尿酚產生者”的哺乳動物的腸道分離的各種生物體的混合培養(yǎng)物、脆弱擬桿菌、乳酸雙歧桿菌、粘液真桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、副于酪乳桿菌、單核細胞增生利斯特氏菌、藤黃微球菌、費氏丙酸桿菌、Sacharomyces boulardii、乳酸乳球菌、屎腸球菌和唾液乳桿菌，及其混合物。
20.制備包含S-牛尿酚的組合物，包括以下步驟1)提供包含能轉化成S-牛尿酚的異黃酮的第一組合物，優(yōu)選選自葛根黃豆苷元、大豆黃素、染料木素、染料木苷、芒柄花黃素和雞豆黃素A，2)將第一組合物和選自下組的酶結合從能夠將異黃酮轉化為S-牛尿酚的細菌中提取的酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶或果膠酶，以及3)將所述混合組合物溫育足夠的時間以將部分異黃酮轉化成S-牛尿酚。
21.制備S-牛尿酚產品的方法，包括以下步驟1)提供包含主要由S-牛尿酚組成的牛尿酚對映體的組合物，所述組合物通過生物體的異黃酮代謝在生物合成中產生；2)從所述組合物提取S-牛尿酚，以形成包含S-牛尿酚的產物，所述提取選自a)溶劑提取，包括將所述組合物與低分子量醇混合以使得醇和水的比例為至少40∶60且不超過95∶5，和b)含水酸提取，包括在約4.0-約5.5的pH混合所述組合物；3)將所述提取物濃縮使得固體含量為約15％到約55％；4)將濃縮物稀釋到固體含量為約6％到約13％；和5)將所述固體沉淀從稀釋的溶液中分離；和6)任選純化和/或結晶所述固體沉淀，從而形成S-牛尿酚產物。
22.將S-牛尿酚遞送給哺乳動物以預防或治療疾病或相關病情的方法，包括將包含S-牛尿酚或其偶聯(lián)的類似物的組合物給藥所述哺乳動物。
23.將R-牛尿酚遞送給哺乳動物以預防或治療疾病或相關病情的方法，包括將包含R-牛尿酚或其偶聯(lián)的類似物的組合物給藥所述哺乳動物。
24.用酶水解葡糖苷，優(yōu)選異黃酮葡糖苷的方法，包括將所述葡糖苷與來自Helix pomatia，優(yōu)選來自Helix Pomatia的消化液的含酶提取物在一定條件下接觸一段時間，所述條件和時間足以使該葡糖苷轉化成糖苷配基。
全文摘要
用于制備商品食物和護膚品的組合物，所述組合物包含S－牛尿酚，或R－牛尿酚，或其混合物，包括S－牛尿酚和R－牛尿酚的非外消旋混合物和外消旋混合物，所述組合物可用于制備商品例如食品添加劑、藥物和藥劑。所述組合物可用于將S－牛尿酚遞送到哺乳動物以預防或治療疾病或相關病情的方法中，所述疾病或病情例如激素依賴的疾病或病情，例如心血管疾病，脂質疾病，骨質減少，骨質疏松，肝臟疾病和急性卵巢雌激素缺乏。所述S－牛尿酚對映體可由生物體對異黃酮的代謝在生物合成中產生。
文檔編號A61K47/00GK1681386SQ03822155
公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月24日 優(yōu)先權日2002年7月24日
發(fā)明者肯尼思·D·R·塞特切爾, 悉尼·J·科爾 申請人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心, 澳大利亞健康及營養(yǎng)品協(xié)會有限公司