專利名稱：用作gsk－3的抑制劑的吡唑組合物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)激酶抑制劑，特別是糖原合酶激酶-3(GSK-3)(一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的抑制劑。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的抑制劑的組合物，和利用該組合物治療各種病癥比如糖尿病、阿爾茨海默氏病、杭廷頓氏舞蹈病、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化(MS)、中風、神經(jīng)病癥和神經(jīng)變性病和精神病的方法。
背景技術(shù)：
近年來，對酶和其它與目標疾病有關的生物分子的結(jié)構(gòu)的深入理解已經(jīng)極大地幫助了新治療劑的研究。已經(jīng)成為廣泛研究主題的一類重要的酶是蛋白激酶。
蛋白激酶介導細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。它們通過影響磷?；扇姿岷塑辙D(zhuǎn)移至參與信號路徑的蛋白受體來做到這一點。通過許多激酶和途徑，細胞外的與其它的刺激導致在細胞內(nèi)部發(fā)生各種細胞應答。這類刺激的例子包括環(huán)境與化學應激反應信號(例如，滲透壓震擾、熱震擾、紫外輻射、細菌內(nèi)毒素和H2O2)，細胞因子(例如白細胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α))，和生長因子(例如粒細胞巨噬細胞-集落-刺激因子(GM-CSF)，和成纖維細胞生長因子(FGF))。細胞外的刺激可以影響一種或多種細胞應答，涉及細胞生長、遷移、分化、激素分泌、轉(zhuǎn)錄因子活化、肌肉收縮、葡萄糖代謝、蛋白質(zhì)合成控制和細胞周期調(diào)節(jié)。
許多疾病與蛋白激酶介導的活動引發(fā)的異常細胞應答有關。這些疾病包括自身免疫疾病，炎癥性疾病，骨疾病，新陳代謝病，神經(jīng)學和神經(jīng)變性疾病，癌癥，心血管疾病，變態(tài)反應和哮喘，阿爾茨海默氏病和與激素相關的疾病。因此，藥物化學界一直在努力發(fā)現(xiàn)蛋白激酶抑制劑，它們是有效的治療劑。糖原合酶激酶-3(GSK-3)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由α和β異構(gòu)體構(gòu)成，各自被不同的基因編碼[Coghlan等，Chemistry & Biology，7，793-803(2000)；Kim和Kimmel，Curr Opinion Genetics Dev，10，508-514(2000)]。GSK-3和各種疾病有牽連，包括糖尿病、阿爾茨海默氏病、CNS病癥(比如躁狂抑郁的病癥和神經(jīng)變性的疾病)和心肌肥大[參見，例如，WO 99/65897；WO 00/38675；Kaytor和Orr，Curr Opin Neurobiol，12，275-8(2000)；Haq等，J.Cell Biol，151，117-30(2000)；Eldar-Finkelman，TrendsMol.Med，8，126-32(2002)]。這些疾病與GSK-3在其中起作用的某些細胞信號傳導路徑的異常運行有關。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GSK-3能磷酸化并調(diào)控許多調(diào)節(jié)蛋白的活性。這些蛋白質(zhì)包括糖原合酶，即糖原合成所需要的限速酶，與微管有關的蛋白Tau，基因轉(zhuǎn)錄因子β-聯(lián)蛋白，翻譯起始因子e1F-2B，以及ATP檸檬酸裂解酶，蟲漆脂(axin)，熱休克因子-1，c-Jun，c-myc，c-myb，CREB和CEPBα。這些不同的目標在細胞代謝、增殖、分化和發(fā)育的許多方面都牽連到GSK-3。
在II型糖尿病治療相關的GSK-3介導的路徑中，胰島素誘導的信號導致細胞葡萄糖攝取和糖原合成。在此路徑中，GSK-3是胰島素誘導信號的負調(diào)節(jié)物。通常，胰島素的存在導致GSK-3介導的磷酸化的抑制和糖原合酶的失活。GSK-3的抑制導致糖原合成和葡萄糖攝取的增加[Klein等，PNAS，93，8455-9(1996)；Cross等，Biochem.J.，303，21-26(1994)；Cohen，Biochem.Soc.Trans.，21，555-567(1993)；和Massillon等，Biochem.J.299，123-128(1994)；Cohen和Frame，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，2，769-76(2001)]。然而，在胰島素應答被削弱的糖尿病患者中，盡管存在比較高的胰島素血液水平，糖原合成和葡萄糖攝取也沒能提高。這就導致了異常高的葡萄糖血液水平，其急性和慢性后果可最終導致心血管疾病、腎衰竭和失明。GSK-3在這類患者中，正常的胰島素誘導的的抑制沒能發(fā)生。另據(jù)報道，GSK-3在II型糖尿病患者中過度表達[WO 00/38675]。因此GSK-3的治療性抑制劑可用于治療胰島素應答被削弱的糖尿病患者。
細胞凋亡與缺血性腦損傷的病理生理學有關(Li等，1997；Choi，等，1996；Charriaut-Marlangue等，1998；Grahm和，Chen，2001；Murphy等，1999；Nicotera等，1999)。近期出版物表明，GSK-3β的活化可能涉及細胞凋亡的機理(kaytor和Orr，2002；Culbert等，2001)。在因大腦中動脈閉塞(MCAO)導致的缺血性中風的大鼠模型的研究中顯示，局部缺血后GSK-3β表達增加(Wang等，Brain Res，859，381-5，2000；Sasaki等，Neurol Res，23，588-92，2001)。成纖維細胞生長因子(FGF)可減輕大鼠永久性的大腦中動脈閉塞(MCO)后的缺血性腦損傷(Fisher等1995；Song等2002)。實際上，大鼠局部缺血模型中所顯示的FGF神經(jīng)保護效應可由PI-3激酶/AKT依賴的GSK-3β滅活作用介導(Hashimoto等，2002)。因此，腦缺血反應活動后GSK-3β的抑制可以改善缺血性腦損傷。
GSK-3還和心肌梗塞有關。見Jonassen等，Circ Res，891191，2001(在再灌注中通過給予胰島素減少心肌梗塞是由Akt依賴性信號路徑介導的)；Matsui等，Circulation，104330，2001(Akt活化作用可在暫時心臟局部缺血后體內(nèi)地保持心臟功能并預防心肌細胞損傷；Miao等，J Mol Cell Cardiol，322397，2000(冠狀動脈內(nèi)的腺病毒-介導的Akt基因送遞可體內(nèi)地減小局部缺血-再灌注損傷后的總梗塞面積)；和Fujio等，Circulation等，101660，2000(Akt信號可體外地抑制心肌細胞程序性死亡并防止小鼠心臟局部缺血-再灌注損傷。
GSK-3活性在頭外傷中起一定的作用。見Noshita等，NeurobiolDis，9294，2002(Akt/PI3-激酶路徑的上調(diào)可能對外傷性腦損傷后的細胞存活是至關緊要的)和Dietrich等，J Neurotrauma，13309，1996(外傷后給予bFGF可顯著地減少外傷性腦損傷大鼠模型中損傷的皮層神經(jīng)元和總的挫傷體積)。
還已知GSK-3在精神病學障礙中起一定作用。見Eldar-Finkelman，Trends Mol Med，8126，2002；Li等，Bipolar Disord，4137，2002(LiCl和丙戊酸，抗精神病的、情緒穩(wěn)定化藥物，可減少GSK3活性并增加β-聯(lián)蛋白)和Lijam等，Cell，90895，1997(散亂的KO小鼠顯示出異常的社會行為和有缺陷的感覺運動控制。散亂的，WNT路徑中涉及的細胞質(zhì)蛋白，可抑制GSK3β活性)。
已經(jīng)表明，鋰和丙戊酸對GSK3的抑制作用會引起軸突改變并改變突觸的接合。見Kaytor & Orr，Curr Opin Neurobiol，12275，2002(GSK3的下調(diào)導致與微管有關的蛋白tau，MAP1 & 2的改變)和Hall等，Mol Cell Neurosci，20257，2002(鋰和丙戊酸誘發(fā)沿著軸突的生長錐狀結(jié)構(gòu)的形成)。
GSK-3活性還與阿爾茨海默氏病有關。該疾病的特征為存在眾所周知的β-淀粉樣肽并形成細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)。神經(jīng)纖維纏結(jié)合有過磷酸化的Tau蛋白，其中Tau在異常位點上被磷酸化。細胞和動物模型中已經(jīng)顯示GSK-3磷酸化這些異常位點。此外，已表明GSK-3的抑制作用可預防Tau在細胞中的過磷酸化[Lovestone等，Curr.Biol，4，1077-86(1994)；和Brownlees等，Neuroreport8，3251-55(1997)；Kaytor和Orr，Curr Opin Neurobiol，12，275-8(2000)]。
在過表達GSK3的轉(zhuǎn)基因小鼠中，觀察到Tau過磷酸化的顯著增加和神經(jīng)元的異常形態(tài)[Lucas等，EMBO J，2027-39(2001)]?；钚訥SK3在失纏結(jié)的神經(jīng)元的細胞質(zhì)中堆集，可以導致患有AD的患者腦中神經(jīng)纖維纏結(jié)[Pei等，J Neuropathol Exp Neurol，58，101019(1999)]。因此，GSK-3的抑制可減緩或阻止神經(jīng)纖維纏結(jié)的產(chǎn)生，并由此治療阿爾茨海默氏病或降低阿爾茨海默氏病的嚴重程度。
現(xiàn)已有體外證據(jù)表明GSK-3在阿爾茨海默氏病中的作用。見Aplin等，(1996)，J Neurochem 67699；Sun等(2002)，Neurosci Lett32161(GSK3b可磷酸化淀粉樣前體蛋白(APP)的細胞質(zhì)域且GSK3b的抑制可減少APP-轉(zhuǎn)染的細胞中Ab40 & Ab42的分泌)；Takashima等(1998)，PNAS 959637；Kirschenbaum等(2001)，J Biol Chem 2767366(GSK3b與早老素基因(presenilin-1)絡合并將其磷酸化，而早老素基因(presenilin-1)與從APP合成Aβ中的γ-分泌酶活性有關)；Takashima等(1998)，Neurosci Res 31317(由Ab(25-35)進行的GSK3b活化可提高海馬神經(jīng)元中tau的磷酸化作用。這種觀點提供了Aβ和神經(jīng)纖維纏結(jié)之間的聯(lián)系，神經(jīng)纖維纏結(jié)由過磷酸化的tau組成，其為AD的另一種病理標志)；Takashima等(1993)，PNAS 907789(GSK3b表達或活性的阻抑可防止Ab-誘發(fā)的皮層和海馬原始培養(yǎng)物的神經(jīng)退化)；Suhara等(2003)，Neurobiol Aging 24437(細胞內(nèi)Ab42由于防礙Akt/GSK-3b信號-依賴性機理的活化作用而對內(nèi)皮細胞是有害的)；De Ferrari等(2003)Mol Psychiatry8195(鋰可保護N2A細胞&原始海馬神經(jīng)元免于AD原纖維-誘導的細胞毒性并減少核移位/β-聯(lián)蛋白的去穩(wěn)定作用)；和Pigino等，J Neurosci，234499，2003(阿爾茨海默氏病的presenilin 1中的突變可以去調(diào)節(jié)(deregulate)和增加GSK-3活性，其反過來削弱神經(jīng)元的軸突運輸。受影響的神經(jīng)元中的軸突運輸?shù)碾S即減少可最終導致神經(jīng)變性)。
現(xiàn)已有體內(nèi)證據(jù)表明GSK-3在阿爾茨海默氏病中起作用。見Yamaguchi等(1996)，Acta Neuropathol 92232；Pei et al(1999)，J Neuropath Exp Neurol 581010(AD腦的易感部位中GSK3b免疫反應性被提高)；Hernandez等(2002)，J Neurochem 831529(具有條件性GSK3b過量表達的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出類似于AD轉(zhuǎn)基因APP小鼠模型中的認知缺陷；DePerrari等(2003)Mol Psychiatry 8195(長期鋰治療可救護由海馬內(nèi)注射AP原纖維所引起的神經(jīng)變性和行為損傷(Morris水迷宮))；McLaurin等，Nature Med，81263，2002(AD的轉(zhuǎn)基因模型中用Aβ免疫可減少類AD神經(jīng)病理學和空間記憶損傷)；和Phiel等(2003)Nature 423435(GSK3可在AD tg小鼠中通過γ分泌酶的直接抑制調(diào)節(jié)淀粉樣-β肽的生產(chǎn))。
Presenilin-1和驅(qū)動蛋白-1還是GSK-3的底物，且與GSK-3在阿爾茨海默氏病中起作用的另一種機理有關，如最近Pigino，G等所述，Journal of Neuroscience(234499，2003)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)GSK3β磷酸化驅(qū)動蛋白-I輕鏈，其可導致驅(qū)動蛋白-1由結(jié)合膜的細胞器分離，從而導致迅速順行軸突運輸?shù)臏p少(Morfini等，2002).作者提出PS1中的突變可以去調(diào)節(jié)(deregulate)和增加GSK-3活性，其反過來削弱神經(jīng)元的軸突運輸。感染的神經(jīng)元中的軸突運輸?shù)碾S即減少可最終導致神經(jīng)變性。
GSK-3還與肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)有關。見Williamson和Cleveland，1999(在mSOD1小鼠中ALS的極早期中軸突運輸被延緩)；Morfini等，2002(GSK3可磷酸化驅(qū)動蛋白輕鏈并抑制順行的軸突運輸)；Warita等，Apoptosis，6345，2001(大多數(shù)脊運動神經(jīng)元在前述ALS SOD1 tg動物模型中神經(jīng)元顯著損失的早期和癥狀發(fā)生前期可失去對PI3-K和Akt二者的免疫反應性)；和Sanchez等，2001(PI-3K的抑制作用引起GSK3活化作用介導的軸突退縮)。
GSK-3活性還與脊髓和周圍神經(jīng)損傷有關。已經(jīng)表明通過鋰和丙戊酸的GSK3抑制作用可以引起軸突改變并改變突觸的接合。見Kaytor & Orr，Curr Opin Neurobiol，12275，2002(GSK3的下調(diào)導致微管與有關的蛋白tau，MAP1 & 2的改變)和Hall等，Mol CellNeurosci，20257，2002(鋰和丙戊酸可誘導沿著軸突的生長錐狀結(jié)構(gòu)的形成)。也參見Grothe等，Brain Res，885172，2000(FGF2刺激施旺細胞增殖并抑制軸突生長期間的髓鞘形成)；Grothe和Nikkhah，2001(在神經(jīng)壓碎后5小時內(nèi)近端和末梢神經(jīng)殘端中的FGF-2被上調(diào))；和Sanchez等，2001(PI-3K的抑制作用引起GSK3活化作用介導的軸突退縮)。
GSK-3的另一種底物是β-聯(lián)蛋白，其在GSK-3磷酸化作用后被降解。已經(jīng)報到在精神分裂癥患者中β-聯(lián)蛋白水平降低，且也與其它與神經(jīng)元的細胞死亡增加有關的疾病相關。[Zhong等，Nature，395，698-702(1998)；Takashima等，PNAS，90，7789-93(1993)；Pei等，J.Neuropathol Exp，56，70-78(1997)；和Smith等，Bio-org.Med.Chem 11，635-639(2001)]。此外，β-聯(lián)蛋白和Tcf-4通過抑制血管平滑肌細胞程序性死亡并促進增殖，而在血管改變中起雙重作用(Wang等，Circ Res，90340，2002)。因此，GSK-3與血管生成疾病有關。也參見Liu等，F(xiàn)ASEBJ，16950，2002(GSK3的活化可減少肝細胞生長因子，從而導致內(nèi)皮細胞屏障功能的改變和血管完整性的減小)和Kim等，k J Biol Chem，27741888，2002(用Matrigel栓測定GSK3β活化作用可體內(nèi)地抑制血管形成GSK3β信號的抑制增進毛細管形成)。
已表明GSK-3和杭廷頓氏舞蹈病之間的關聯(lián)。見Carmichael等，J Biol Chem，27733791，2002(GSK3β抑制作用可通過在β-聯(lián)蛋白和其有關的轉(zhuǎn)錄路徑中的提高而保護細胞免于聚谷酰胺誘導的神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞死亡)。GSK3的過量表達可減少熱休克轉(zhuǎn)錄因子-1和熱休克蛋白HSP70的活化(Bijur等，J Biol Chem，2757583，2000)，其表明體外HD模型中聚(Q)聚集體和細胞死亡的減少(Wyttenbach等，Hum Mol Genet，111137，2002)。
GSK-3影響FGF-2水平，且它們的受體在腦聚集體培養(yǎng)物使大鼠腦再形成髓鞘期間也增加。見Copelman等，2000，Messersmith，等，2000；以及Hinks和Franklin，2000。還發(fā)現(xiàn)FGF-2在髓鞘再形成中通過涉及FGF的少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞誘導突起長出(Oh和Yong，1996；Gogate等，1994)?，F(xiàn)已表明FGF-2基因療法可增進實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)小鼠的康復(Ruffini，等，2001)。
GSK-3還與頭發(fā)生長有關，因為已表明Wnt/β-聯(lián)蛋白信號在毛囊形態(tài)形成和分化中起舉足輕重的作用(Kishimotot等，Genes Dev，141181，2000；Millar，J Invest Dermatol，118216，2002)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，患有皮膚中Wnt信號抑制劑的構(gòu)成性過量表達的小鼠不能形成毛囊。毛囊的初始形成需要Wnt信號，且GSK3可通過抑制β-聯(lián)蛋白構(gòu)成性地調(diào)節(jié)Wnt路徑。(Andl等，Dev Cell 2643，2002)。瞬時的Wnt信號通過活化上皮毛囊前體中的β-聯(lián)蛋白和TCF-調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄，可為新頭發(fā)生長周期的開端提供關鍵的初始刺激(Van Mater等，Genes Dev，171219，2003)。
因為GSK-3活性與精子活力有關，GSK-3抑制作用可有效地用于男性避孕。現(xiàn)已表明牛和猴子的精子中GSK3活性的降低與附睪中精子的活力演變有關(Vijayaraghavan等，Biol Reprod，54709，1996；Smith等，J Androl，2047，1999)。此外，在公牛中GSK3的酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸化作用在游動的精子中比在不能游動的精子中高(Vijayaraghavan等，Biol Reprod，621647，2000)。這種效果也被人類的精子所證實(Luconi等，Human Reprod，161931，2001)。
由于目前對于與GSK-3蛋白激酶有關的大多數(shù)病癥仍沒有可用的治療選擇，仍非常需要可抑制這種蛋白目標的新的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供式I的化合物或其藥學可接受的鹽來滿足這種需要 其中W，R1和Ry如下所述。
本發(fā)明的化合物能夠抑制GSK-3活性。根據(jù)本發(fā)明，這些化合物也可用于組合物中，和用于抑制GSK-3活性的方法中以及用于治療或減輕患者中與GSK-3有關的疾病或病癥的嚴重程度的方法中。
本發(fā)明的方法適用的疾病或病癥包括，例如，神經(jīng)學以及神經(jīng)變性障礙，糖尿病，精神病學障礙，多發(fā)性硬化(MS)，心肌梗塞，再灌注/局部缺血，禿頂，以及中風。


圖1描述了在大腦中動脈閉塞模型(MCAO)后6小時給藥，用式I的化合物與賦形劑對照組相比較的治療效果(以總梗塞體積、皮層梗塞體積，紋狀體缺血性損傷，以及浮腫形成的減少表示)。
圖2描述了與賦形劑對照組相比較用式I的化合物處理大鼠，在實驗進程中大鼠的神經(jīng)學功能。
發(fā)明的詳細說明本發(fā)明提供了式I的化合物 或其藥學可接受的鹽，其中W是氮或CH；R1選自氫或氟；和Ry是C1-4脂族基，任選被N(R2)2或具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫雜原子的5-6元飽和環(huán)所取代，其中每個R2獨立地選自氫或任選被OH、N(R3)2、或具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫雜原子的5-6元飽和環(huán)所取代的C1-3脂族基；并且其中每個R3獨立地選自氫或C1-3脂族基；
條件是當R1是氫并且W是CH時，Ry不是甲基。
本文中使用的術(shù)語“脂族的”或“脂族基”，是指完全飽和的或含有一個或多個不飽和單元的直鏈或支鏈C1-C4烴鏈，或完全飽和的或含有一個或多個不飽和單元的單環(huán)C3-C4烴，但其不是芳族的(本文中也稱作“碳環(huán)”或“環(huán)烷基”)，其與分子的其余部分具有單個的聯(lián)結(jié)點。例如，合適的脂族基包括，但不局限于，直鏈或支鏈的烷基，鏈烯基，炔基和其雜化物，例如(環(huán)烷基)烷基，(環(huán)烯基)烷基或(環(huán)烷基)鏈烯基。
術(shù)語“烷基”、“鏈烯基”和“炔基”單獨或作為較大部分的一部分使用時，均包括含有一到四個碳原子的直鏈和支鏈，并且就鏈烯基而論，包括至少兩個碳原子和一個雙鍵，就炔基而論，至少包括兩個碳原子和一個三鍵。
本發(fā)明所使用的化合物限于那些化學上是可行和穩(wěn)定的化合物。因此，對于如上所述化合物的取代基或變量的組合，只有這樣的組合產(chǎn)生穩(wěn)定的或化學上可行的化合物時才是允許的。穩(wěn)定的化合物或化學上可行的化合物是一種當溫度在40℃或更低、在沒有濕度或其它化學反應條件的情況下保持至少一周而基本上沒有改變的化合物。
對本領域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的某些化合物可以以互變異構(gòu)形式存在，化合物的所有這類互變異構(gòu)形式都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
除非另有說明，本文中所描述的結(jié)構(gòu)還包括該結(jié)構(gòu)的所有立體化學形式；即每個不對稱中心的R和S構(gòu)型。為此，本發(fā)明化合物的單一立體化學異構(gòu)體、以及對映體和非對映體的混合物都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。除非另有說明，本文中所描述的結(jié)構(gòu)還包括僅在存在一或多種同位素富集原子方面不同的化合物。例如，具有本結(jié)構(gòu)的化合物，只不過用氘或氚替換氫、或用13C-或14C-富集的碳替換碳，都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的化合物落入PCT公開WO 02/22607中所描述的化合物的種類范圍內(nèi)。然而，申請人發(fā)現(xiàn)本化合物在保護神經(jīng)元細胞防止缺血性損傷和中風治療方面能夠令人驚訝地和出乎意料地增加功效。
本發(fā)明的一方面涉及一種式I的化合物，其中Ry是未取代的C1-4脂族基。優(yōu)選式I化合物的脂族基是烷基。這樣的烷基優(yōu)選甲基，乙基，環(huán)丙基，叔丁基或異丙基。更優(yōu)選式I的烷基是甲基、環(huán)丙基和叔丁基。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明涉及一種式I的化合物，其中Ry是被具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫雜原子的6元飽和環(huán)取代的C1-4脂族基。這樣的6元飽和環(huán)包括嗎啉基，哌啶基和哌嗪基。
根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及一種式I的化合物，其中Ry是被N(R2)2取代的C1-4脂族基。
在某些實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中R2是氫。
根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及一種式I的化合物，其中R2是未取代的C1-3脂族基。
還有另一個實施方案涉及一種式I的化合物，其中R2是被OH或N(R3)2取代的C1-3脂族基。
還有另一個實施方案涉及一種式I的化合物，其中R2是被具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫雜原子的6元飽和環(huán)取代的C1-3脂族基。這樣的6元飽和環(huán)包括嗎啉基，哌啶基和哌嗪基。
按照一個實施方案，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中W是氮。
按照另一個個實施方案，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中W是CH。
按照又一個實施方案，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中R1是氫。
按照另一個實施方案，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中R1是氟。
當然在此描述的實施方案的所有組合和亞組合都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
下面的表1中列出了式I化合物的代表性例子。
表1.式I化合物

本發(fā)明的化合物可以按照下列的反應路線I-II所示的方法和本領域技術(shù)人員已知的一般方法來制備。
反應路線I 試劑和條件(a)草酰氯，二氯乙烷，70℃；(b)二甲胺，戊烷，TiCl4；(c)NH4OAc，HOAc，THF，回流；(d)POCl3，n-Pr3N，回流；(e)160℃，純的。
上述的反應路線I表示了用于制備本發(fā)明化合物的一般方法。在步驟(a)，用草酰氯處理芳基酰胺1，形成?；惽杷狨?。如步驟(c)所示，可用?；惽杷狨?與烯胺3縮合，形成嘧啶酮4(J.Org.Chem(1993)，58，414-418；J.Med.Chem.，(1992)，35，1515-1520；J.Org.Chem.，91967，32，313-214)。用POCl3處理中間體4形成氯代化合物5，然后化合物5與氨基吲唑衍生物6化合形成式I的化合物。制備氨基-吲唑衍生物6的方法是本領域已知的。具體地，這些衍生物的合成在WO 02/22607中已列出。
反應路線II 試劑和條件(a)iLiN(TMS)2，醚，THF，iiHCl；(b)NaOEt，EtOH，回流。
上面的反應路線II表示制備嘧啶酮中間體5的另一個方法，該中間體可用于上面所描述的反應路線I中的步驟(e)的式I化合物的制備。在步驟(a)中，芳基腈7(形成)苯甲脒中間體8，然后用β-酮酯9處理，形成可如上述使用的嘧啶酮化合物5。
本領域普通技術(shù)人員可以按照說明書的教導使用易于合成或可商業(yè)購買的試劑來合成本發(fā)明的其它化合物。
在本發(fā)明中作為GSK-3抑制劑所使用的化合物的活性可在體外、體內(nèi)或在細胞系中進行測定。體外測定包括鑒定活化的GSK-3的磷酸化活性或ATP酶活性的抑制實驗。體外測定對抑制劑與GSK-3結(jié)合的能力進行定量。抑制劑的結(jié)合可以通過在結(jié)合之前將抑制劑進行放射性標記、分離抑制劑/GSK-3的配合物和確定結(jié)合的放射性標記的量來測定?；蛘?，抑制劑的結(jié)合可以通過操作一個競爭性實驗來測定，其中將結(jié)合有已知的放射性配體的GSK-3與新的抑制劑一起溫育。
按照另一個實施方案，本發(fā)明提供了包含了本發(fā)明化合物或其藥學可接受的鹽和藥學可接受的載體、輔料或賦形劑的組合物。本發(fā)明組合物中化合物的用量是在生物樣品或在患者中應有效可測地抑制蛋白激酶(特別是GSK-3)的量。優(yōu)選將本發(fā)明的組合物加以制劑用于對需要這樣組合物的患者給藥。最優(yōu)選，將本發(fā)明的組合物配制成對患者經(jīng)口給藥的形式。
本文中使用的術(shù)語“患者”是指動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人類。
術(shù)語“藥學可接受的載體，輔料，或賦形劑”是指不破壞與其配制的化合物的藥理學活性的無毒的載體，輔料，或賦形劑?？梢杂糜诒景l(fā)明組合物的藥學可接受的載體、輔料或賦形劑包括，但不局限于，離子交換樹脂，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白，例如人血清白蛋白，緩沖劑例如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，例如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)二氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯基吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，石蠟，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。
本文中使用的術(shù)語“可測地抑制”是指在包含所述組合物和GSK-3激酶的樣品以及包含GSK-3激酶而不含所述組合物的等量樣品之間GSK-3活性的可測量的改變。
“藥學可接受的鹽”是指在對接受者給藥時能夠直接或間接地提供本發(fā)明的化合物或抑制劑的活性代謝物或其殘余物的本發(fā)明化合物的任何無毒的鹽、酯、酯的鹽或其它衍生物。
本文中使用的術(shù)語“抑制劑活性的代謝物或其殘余物”是指本發(fā)明化合物的代謝物或其殘余物也是GSK-3激酶的抑制劑。
本發(fā)明化合物的藥學可接受的鹽包括那些源于藥學可接受的無機和有機酸和堿的鹽。合適的酸鹽的例子包括乙酸鹽，己二酸鹽，藻朊酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，檸檬酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊烷丙酸鹽，二葡糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙磺酸鹽，甲酸鹽，富馬酸鹽，葡庚糖酸鹽，甘油磷酸鹽，羥乙酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，丙二酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，硝酸鹽，乙二酸鹽，棕櫚酸鹽，果膠酯酸鹽，過硫酸鹽，3-苯丙酸鹽，磷酸鹽，苦味酸鹽，特戊酸鹽，丙酸鹽，水楊酸鹽，琥珀酸鹽，硫酸鹽，酒石酸酯，硫氰酸鹽，甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。其它的酸，例如草酸，盡管它們本身不是藥學可接受的，但可以用于制備可用作獲得本發(fā)明的化合物及其藥學可接受的酸加成鹽的中間體的鹽。
來源于合適的堿的鹽，包括堿金屬(例如，鈉和鉀)，堿土金屬(例如鎂)，銨和N+(C1-4烷基)4鹽。本發(fā)明也預想到了本文所公開的化合物的任何含有堿性氮的基團的季銨化作用。通過這樣的季銨化作用可以獲得水或油溶的或可分散的產(chǎn)品。
本發(fā)明的組合物可以通過經(jīng)口、胃腸外、吸入噴霧劑、局部、直腸、鼻、向頰、陰道或嵌入式儲液囊給藥。本文中使用的術(shù)語“腸胃外的”包括皮下的、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、關節(jié)內(nèi)的、滑液內(nèi)的、胸骨內(nèi)的、鞘內(nèi)的、肝內(nèi)的、病灶內(nèi)的和顱內(nèi)的注射或輸液技術(shù)。優(yōu)選，組合物以經(jīng)口、腹膜內(nèi)的或靜脈內(nèi)的方式給藥。本發(fā)明組合物的無菌注射形式可以是含水的或油性的懸浮液。這些懸浮液可以按照本領域已知的技術(shù)、使用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑來配制。無菌注射制劑還可以是在無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。其中可接受的賦形劑和可使用的溶劑是水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，通常使用無菌的不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。
為此目的，可以使用的任何溫和的不揮發(fā)油包括合成的單-或二酸甘油酯。脂肪酸，例如油酸和其甘油酯衍生物可有效用于注射劑的制備，例如天然的藥學上可接受的油類，比如橄欖油或蓖麻油，特別是它們的聚氧乙烯形式。油劑或懸浮液還可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，例如羧甲基纖維素或類似的分散劑，它們通常用在藥學可接受的劑型包括乳狀液和懸浮液的制劑中。為制劑的目的也可以使用其它通常使用的表面活性劑，例如吐溫、Spans及其它乳化劑或生物利用度增強劑，它們通常用于制造藥學可接受的固體、液體，或用作此目的的其它劑型。
本發(fā)明的藥學可接受的組合物可以以任一經(jīng)口地可接受的劑型包括但不限于膠囊、片劑、水懸浮液或溶液的形式口服給予。在用于經(jīng)口使用的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。也可典型地加入潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對于以膠囊的形式經(jīng)口給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當需要經(jīng)口使用水懸浮液時，將活性組分與乳化劑和懸浮劑相結(jié)合。如果需要的話，也可以加入某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。
作為替代的方案，本發(fā)明的藥學可接受的組合物可以以用于直腸給藥的栓劑的形式給予。這些組合物可以通過將試劑與合適的無刺激性的賦形劑混合來制備，該賦形劑在室溫下是固體，但在直腸溫度下是液體，因此能在直腸中融化以釋放藥物。這種材料包括可可脂，蜂蠟和聚乙二醇。
本發(fā)明的藥學可接受的組合物也可以局部給予，特別是當治療的靶位包括通過局部施用易達到的部位或器官的時候，包括眼病、皮膚疾病或下腸道疾病?？扇菀椎刂苽鋵τ诿總€這些部位或器官的合適的局部制劑。
用于下腸道的局部施用可以以直腸栓劑(參見上面)或合適的灌腸制劑的形式來實施。也可以使用局部-透皮貼劑。
就局部施用而言，藥學可接受的組合物可以配制成含有懸浮于或溶于一種或多種載體中的活性組分的合適的油膏形式。用于本發(fā)明化合物的局部給藥的載體包括但不局限于礦物油，液體礦脂，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蠟和水。或者，可以將藥學可接受的組合物配制成含有懸浮于或溶于一種或多種藥學可接受的載體中的活性組分的合適的洗劑或乳膏劑。合適的載體包括但不局限于礦物油，單硬脂酸山梨糖醇酐酯，聚山梨酸酯60，鯨蠟基酯蠟，鯨蠟硬脂醇，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。
就眼科用途而言，不論是否有防腐劑例如氯化芐基烷鎓存在，藥學可接受的組合物可以配制成等滲的、pH值調(diào)整的無菌的生理鹽水的微粉化懸浮液，或優(yōu)選配制成等滲的、pH值調(diào)整的無菌的生理鹽水溶液。或者，對于眼科用途，可以將藥學可接受的組合物配制在油膏比如石蠟油中。
本發(fā)明的藥學可接受的組合物也可以經(jīng)鼻用氣霧劑或吸入劑給予。這樣的組合物是按照藥物制劑領域所熟知的技術(shù)來制備的，并且可以制成生理鹽水溶液，采用苯甲醇或其它合適的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進劑、氟碳化合物和/或其它常規(guī)的增溶劑或分散劑。
最優(yōu)選地，將本發(fā)明的藥學可接受的組合物配制成口服形式。
可以與載體材料結(jié)合以制備單一劑量形式的組合物的本發(fā)明化合物的量可根據(jù)所治療的宿主和具體的給藥方式加以改變。優(yōu)選將組合物配制成能給予接受組合物的患者0.01-100mg/kg體重/天劑量的抑制劑的制劑。
還應該了解，對于任一具體患者的具體劑量和治療方案取決于多種因素，包括所采用的具體化合物的活性、年齡、體重、常規(guī)健康狀態(tài)、性別、飲食、給藥的時間、排泄速度、藥物組合、和治療醫(yī)師的判斷和所治療的具體的疾病的嚴重程度。組合物中的本發(fā)明化合物的用量還取決于組合物中所含的具體化合物。
根據(jù)治療或預防的具體病癥或疾病，在本發(fā)明的組合物中也可以存在通常用來治療或預防病癥的其它治療劑。
例如，用于治療神經(jīng)學或神經(jīng)變性障礙的神經(jīng)營養(yǎng)因子或其它試劑可以與本發(fā)明的化合物相結(jié)合以治療神經(jīng)學和神經(jīng)變性的障礙。已知的神經(jīng)營養(yǎng)因子的例子包括但不局限于，乙酰膽堿酯酶抑制劑，MAO抑制劑，干擾素，抗驚厥劑，離子通道封阻劑，利魯唑和抗似帕金森氏病的試劑。
已知的用于中風治療的例子包括ActivaseR，重組的或遺傳工程的組織纖溶酶原激活物(rt-PA)，肝素，谷氨酸鹽拮抗劑，鈣拮抗劑，阿片劑拮抗劑，GABA激動劑和抗氧化劑。
可與本發(fā)明化合物結(jié)合的試劑的其它例子包括但不限于，抗壓抑試劑，比如鹽酸舍曲林、鹽酸氟西汀、Paxil和鹽酸丁螺環(huán)酮；抗炎藥比如皮質(zhì)甾類、TNF阻斷劑、IL-1 RA、咪唑硫嘌呤、環(huán)磷酰胺和柳氮磺胺吡啶；免疫調(diào)控劑和免疫抑制劑比如環(huán)孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、mycophenolate mofetil、干擾素、皮質(zhì)甾類、環(huán)磷酰胺、咪唑硫嘌呤和柳氮磺胺吡啶；神經(jīng)營養(yǎng)因子比如乙酰膽堿酯酶抑制劑、MAO抑制劑、干擾素、抗驚厥劑、離子通道封阻劑、利魯唑和抗似帕金森氏病的試劑；用于治療心血管疾病的試劑比如β-阻斷劑、ACE抑制劑、利尿劑、硝酸脂、鈣通道阻斷劑和抑制素；用于治療糖尿病的試劑比如胰島素、胰島素類似物、麥芽糖酶抑制劑、雙縮胍和胰島素敏化劑；和用于治療免疫缺陷障礙的試劑比如丙種球蛋白。
存在于本發(fā)明組合物中的其它治療劑的用量將不超過包含該治療劑作為唯一活性劑的組合物中的正常給予量。在目前公開的組合物中，優(yōu)選其它治療劑的用量約為正常存在于包含該試劑作為唯一治療活性劑的組合物中用量的50％-100％范圍。
按照另一個實施方案，本發(fā)明涉及給予患者選自下面的其它治療劑用于治療阿爾茨海默氏病(AD)、用于治療帕金森氏癥的試劑，用于治療多發(fā)性硬化(MS)、用于治療哮喘的試劑，抗炎劑，免疫調(diào)變劑或免疫抑制劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子，用于治療中風的試劑，用于治療心血管疾病的試劑，抗抑郁藥，抗精神病試劑，或用于治療糖尿病的試劑，其中所述其它治療劑對所治療的疾病是適合的；并且所述其它治療劑可與所述組合物以單一劑一起給藥，或與所述組合物以多劑量形式的一部分分別給藥。
按照另一個實施方案，本發(fā)明涉及在生物樣品中抑制GSK-3激酶活性的方法，包含將所述生物樣品與本發(fā)明的化合物或包含所述化合物的組合物接觸的步驟。
本文中使用的術(shù)語“生物樣品”包括，但不限于，細胞培養(yǎng)物或其提取物；從哺乳動物或其提取物獲得的活組織檢查原料；和血液，唾液，尿，排泄物，精液，眼淚，或其它體液或其提取物。
抑制GSK-3在生物樣品中的活性可用于各種對于本領域熟練技術(shù)人員已知的目的。這樣的目的的例子包括但不局限于，輸血，器官移植，生物標本貯存和生物學實驗。
按照另一個實施方案，本發(fā)明涉及在患者中抑制GSK-3激酶活性的方法，包含給予所述患者本發(fā)明化合物或包含所述化合物的組合物的步驟。
按照另一個實施方案，本發(fā)明提供了一種用于治療或減輕GSK-3介導的疾病或病癥的嚴重程度的方法，包含給予所述患者按照本發(fā)明的組合物的步驟。
本文中使用的術(shù)語“GSK-3介導的疾病”是指已知GSK-3在其中起作用的任何疾病或其它有害的病癥或疾病。這樣的疾病或病癥包括但不限于，自身免疫性疾病，炎性疾病，代謝紊亂，精神錯亂，糖尿病，血管生成疾病，tauopothy，神經(jīng)學或神經(jīng)變性障礙，脊髓損傷，青光眼，禿頂或心血管疾病。
按照另一個實施方案，本發(fā)明涉及一種在需要治療的患者中治療或減輕選自下列的疾病、障礙或病癥的嚴重程度的方法自身免疫性疾病、炎性疾病、代謝紊亂、精神錯亂、糖尿病、血管生成疾病、tauopothy、神經(jīng)學或神經(jīng)變性的障礙、脊髓損傷、青光眼、禿頂或心血管疾病，包括給予所述患者本發(fā)明的化合物或其組合物。
按照另一個實施方案，本發(fā)明涉及一種治療或減輕選自下列的疾病或病癥的嚴重程度的方法敏感癥，哮喘，糖尿病，阿爾茨海默氏病，杭廷頓氏疾病，帕金森氏癥，與AIDS有關的癡呆，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS，Lou Gehrig′s疾病)，多發(fā)性硬化(MS)，由于外傷造成的損傷，精神分裂癥，焦慮癥，雙極神經(jīng)元障礙，tauopothy，脊髓或周圍神經(jīng)損傷，心肌梗塞，心肌細胞肥大，青光眼，注意力缺陷障礙(ADD)，抑郁癥，睡眠障礙，再灌注/局部缺血，中風，血管生成疾病，或禿頂，其中所述方法包括給予需要治療的患者本發(fā)明的化合物或其組合物。
按照另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明涉及一種治療或減輕中風的嚴重程度的方法。
按照另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明涉及一種治療或減輕神經(jīng)變性或神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的嚴重程度的方法。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種在男性患者中降低精子活力的方法，包括給予所述患者本發(fā)明的化合物或其組合物。
在一個替代的實施方案中，利用不含有其它治療劑的組合物的本發(fā)明的方法包括另外分開地給予所述患者其它治療劑的步驟。當分開給予其它治療劑時，可以在給予本發(fā)明的組合物之前、依次或之后給予患者其它治療劑。
具體實施例方式
為了更充分地了解本文中描述的本發(fā)明，給出下面的實施例。
應該理解這些實施例僅僅為了舉例性的目的，并不被看作是以任何方式限制本發(fā)明。
實施例本文中所使用的、指定為“方法A”的HPLC方法如下所示柱C18，3um，2.1×50mm，通過Jones色譜“Lighting”。
梯度從100％水(包含1％乙腈，0.1％TFA)至100％乙腈(含有0.1％TFA)經(jīng)歷4.0分鐘，在100％乙腈保持1.4分鐘，然后回到初始條件。
總運行時間7.0分鐘。
流速0.8毫升/分鐘；本文中使用的術(shù)語“Rt”是指保留時間，以分鐘為單位，由使用所指定的HPLC方法的化合物獲得。列在下列實施例中的化合物編號對應于上文中列在表1中的化合物編號。
實施例16-甲基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮用乙酰乙酸甲酯(0.44mL，4mmol)處理2-三氟甲基-苯甲脒(2.13g，4mmol)與乙醇鈉(0.83g，12mmol)在乙醇(20mL)中的混合物，并加熱24小時。將反應冷卻、濃縮、用水稀釋、再用2N鹽酸酸化。將得到的溶液用乙酸乙酯提取，用硫酸鈉干燥并濃縮。用快速色譜[SiO2，甲醇∶二氯甲烷(3∶97)]純化，形成標題化合物的黃色固體(0.51g，50％產(chǎn)率)；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.7(br s，1H)，7.9(m，1H)，7.8(m，2H)，7.7(m，1H)，6.3(s，1H)，2.21(s，3H)ppm；MS(FIA)255.0(M+H)；Rt(方法A)2.578分鐘。
實施例24-氯-6-甲基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶將6-甲基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮(10.7g，41.9mmol)的氯化氧磷(39mL，419mmol)溶液用三正丙胺(16mL，83.9mmol)處理，并在110-120℃下回流1小時。將溶劑蒸發(fā)，用甲苯共沸三次，而后真空干燥。將殘余物在乙酸乙酯中處理，依次用1N氫氧化鈉、水和鹽水洗滌，然后用硫酸鈉干燥并濃縮。用快速色譜[SiO2，乙酸乙酯∶己烷(1∶9)]純化，形成標題化合物的橙色油(9.61g，84％產(chǎn)率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)δ2.63(3H，s)，7.26(s，1H)，7.61(t，J＝7.6Hz，1H)，7.67(t，J＝7.5Hz，1H)，7.76(d，J＝7.6Hz，1H)，7.82(d，J＝7.8Hz，1H)ppm；MS(FIA)273.0(M+H)；Rt(方法A)3.499分鐘。
實施例3(5-氟-1H-吲唑[6-甲基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]胺(I-2)將4-氯-6-甲基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶(0.10g，0.37mmol)和5-氟-1H-吲唑-3-基胺(0.072g，0.48mmol)的混合物在160-170℃下加熱8小時。將得到的殘余物冷卻至室溫，然后將其溶于N-甲基-吡咯烷酮(2mL)中。將混合物倒入水(20mL)中，加入碳酸氫鈉(5mL)，過濾得到的混合物，再用水洗滌。用制備HPLC純化，得到標題化合物的黃褐色固體(0.081g，產(chǎn)率43％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.8(br s，1H)，10.6(br s，1H)，7.86(d，J＝8.0Hz，1H)，7.77(m，4H)，7.62(br s，1H)，7.50(m，1H)，7.29(m，1H)，2.44(s，3H)ppm；LC-MS388.05(M+H)；Rt(方法A)2.900分鐘。
實施例46-叔丁基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮在回流下加熱2-三氟甲基苯基脒(1.12克，5mmol)、乙醇鈉(1.02克，15mmol)和4，4-二甲基-3-氧代-戊酸甲酯(0.80ml，5mmol)在乙醇(50毫升)中的混合物16小時。將反應冷卻、濃縮、用水稀釋、再用2N鹽酸酸化。用乙酸乙酯提取溶液，用硫酸鈉干燥并濃縮。用快速色譜[SiO2，甲醇∶二氯甲烷(2∶98)]純化，形成標題化合物的黃色固體(0.48g，32％產(chǎn)率)；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.8(br s，1H)，7.89(d，J＝7.5Hz，1H)，7.78(m，2H)，7.71(d，J＝7.4Hz，1H)，6.24(s，1H)，1.20(s，9H)ppm；LC-MS 297.03(M+H)；Rt(方法A)3.30分鐘。
實施例56-叔丁基-6-氯-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶用三正丙胺(0.61毫升，3.17mmol)處理6-叔丁基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮(0.47克，1.59mmol)的氯化氧磷(1.65毫升，15.9mmol)溶液，在110-120℃下加熱1小時。蒸發(fā)除去溶劑，然后用甲苯共沸三次。將殘余物在乙酸乙酯中處理，依次用1N氫氧化鈉、水和鹽水洗滌，然后用硫酸鈉干燥并濃縮。用快速色譜[SiO2，乙酸乙酯∶己烷(1∶9)]純化，形成標題化合物的黃色油(0.33g，66％產(chǎn)率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)δ1.31(9H，s)，7.25(s，1H)，7.51(t，J＝7.6Hz，1H)，7.58(t，J＝7.5Hz，1H)，7.74(t，J＝8.5Hz，2H)ppm；MS(FIA)314.9(M+H)；Rt(方法A)4.156分鐘。
實施例6[6-叔丁基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-3)在160-170℃下加熱4-氯-6-叔丁基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶(0.10克，0.32mmol)和1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基胺(0.064克，0.48mmol)的混合物16小時。將殘余物冷卻，溶于N-甲基-吡咯烷酮(2mL)中，然后傾倒在水(20mL)和碳酸氫鈉(5mL)中，用乙酸乙酯提取兩次。將合并的有機層用水洗滌四次，再用鹽水洗滌一次，然后用硫酸鈉并濃縮。用制備HPLC純化粗產(chǎn)品，形成標題化合物的黃色固體(0.007g，產(chǎn)率4％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(br s，1H)，10.6(br s，1H)，8.49(m，2H)，7.84(d，J＝7.8Hz，2H)，7.76(m，2H)，7.68(m，1H)，7.12(m，1H)，1.32(s，9H)ppm；LC-MS 413.08(M+H)；Rt(方法A)3.112分鐘。
實施例76-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮(1-環(huán)丙基-乙烯基)-二甲胺在0℃及氮氣氛圍下，向環(huán)丙基甲基酮(19.8mL，200mmol)的戊烷(600mL)溶液中加入二甲胺/四氫呋喃(2M，500mL，1000mmol)，然后以滴加方式加入在戊烷(60mL)中的氯化物鈦(IV)溶液(12.1mL，110mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌0.5小時，而后在室溫下攪拌5小時。將反應混合物通過硅藻土過濾，用戊烷和醚洗滌，在15-20℃浴溫下真空濃縮，然后在-4℃下以橙色油形態(tài)儲存過夜。
2-三氟甲基苯甲?；惽杷狨ピ谑覝丶暗獨夥諊?，將2-三氟甲基苯甲酰胺(34.9克，185mmol)的1，2-二氯乙烷(600毫升)溶液用快速滴加的草酰氯(20.2毫升，230mmol)處理，將反應在70-80℃攪拌過夜。蒸發(fā)除去溶劑，然后殘余物用甲苯共沸兩次。
6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮在0℃及氮氣氛圍下，以滴加方式向(1-環(huán)丙基-乙烯基)-二甲胺的四氫呋喃(400毫升)溶液中加入2-三氟甲基苯甲?；惽杷狨サ乃臍溥秽?50毫升)溶液。將反應混合物攪拌0.5小時，然后加入乙酸銨(78g，1000mmol)和乙酸(400mL)。在回流下將反應混合物加熱3小時以連續(xù)除去四氫呋喃，然后冷卻并傾倒在水(1.2L)中。過濾收集得到的沉淀，用水和醚洗滌，形成6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮(28.79克，56％產(chǎn)率)白色固體，該固體是標題化合物和(2-三氟甲基-苯甲?；?-脲(通過HPLC比例為91∶9)的混合物。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.7(br s，1H)，7.87(d，J＝7.6Hz，1H)，7.79(m，2H)，7.73(d，J＝7.5Hz，1H)，6.32(s，1H)，1.93(m，1H)，0.90(m，4H)，[urea10.8(br s，1H)，7.45(br s，1H)]ppm；LC-MS 280.96(M+H)；Rt(方法A)2.961分鐘(標題化合物)，2.313分鐘(脲雜質(zhì))。
實施例84-氯-6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶將在氯化氧磷(40ml，428mmol)中的6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮(12.0克，42.8mmol)在75-80℃下加熱1小時。蒸發(fā)除去溶劑，用甲苯共沸三次。將殘余物冷卻到0℃，在乙酸乙酯中處理，再用冰碎屑和水處理。將混合物依次用飽和碳酸氫鈉、水和鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮。用快速色譜[SiO2，乙酸乙酯∶己烷(5∶95)]純化，形成標題化合物的無色油(9.71g，76％產(chǎn)率)。
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ1.12(m，2H)，1.30(m，2H).2.02(m，1H)，7.24(s，1H)，7.56(t，J＝7.6Hz，1H)，7.64(t，J＝7.6Hz，1H)，7.79(m，2H)ppm；MS(FIA)299.1/300.9(M+H)；Rt(方法A)3.882分鐘。
實施例9[6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-(1H-吲唑-3-基)-胺(I-4)將4-氯-6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶(0.08克，0.27mmol)和1H-吲唑-3-基胺(0.036克，0.41mmol)的混合物在160-170℃下加熱6小時。將殘余物冷卻，并溶于N-甲基-吡咯烷酮(2mL)中，將其傾倒在水(30mL)和碳酸氫鈉(5mL)中，然后過濾，用水和醚洗滌。將收集的沉淀與洗滌用的醚合并和濃縮。用快速色譜[SiO2，甲醇∶二氯甲烷(2∶98)]純化，形成標題化合物的淺黃色固體(0.017g，15％產(chǎn)率)。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.6(br s，1H)，10.2(br s，1H)，8.00(d，J＝8.1Hz，2H)，7.81(d，J＝7.9Hz，1H)，7.71(m，3H)，7.65(t，J＝7.3Hz，1H)，7.45(d，J＝8.4Hz，1H)，7.36(t，J＝7.5Hz，1H)，7.06(t，J＝7.5Hz，1H)，2.04(m，1H)，1.01(m，2H)，0.96(m，2H)ppm；LC-MS 396.10(M+H)；Rt(方法A)3.122分鐘。
實施例10[6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-(1H-吡唑并[3，4-B]吡啶-3-基)-胺(I-1)將4-氯-6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶(7.00克，23.4mmol，按上述在實施例8中的方法制備)和1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基胺(9.43克，70.3mmol)的N-甲基吡咯烷酮(50毫升)混合物在130℃下加熱12小時。將殘余物冷卻，溶于N-甲基-吡咯烷酮(2mL)中，傾倒在水(500mL)和碳酸氫鈉(15mL)中，過濾后，用水洗滌。用快速色譜[SiO2，乙酸乙酯∶己烷(35∶65)]純化，形成標題化合物的白色固體(5.25g，57％產(chǎn)率)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.1(br s，1H)，10.5(br s，1H)，8.50(m，2H)，7.82(d，J＝7.8Hz，1H)，7.73(m，3H)，7.66(t，J＝7.7Hz，1H)，7.12(m，1H)，2.07(m，1H)，1.02(m，2H)，0.97(m，2H)ppm；LC-MS 397.22(M+H)；Rt(方法A)3.412分鐘。
實施例11[6-環(huán)丙基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺，鹽酸鹽通過在6N鹽酸中溶解化合物I-1(8.42g，21.4mmol)并凍干形成標題化合物的黃色固體(9.242g，99％)來制備HCl鹽。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.3(br s，1H)，10.9(br s，1H)，8.53(dd，J＝4.4，1.4Hz，1H)，8.48(br d，J＝7.4Hz，1H)，7.87(d，J＝7.8Hz，1H)，7.79(m，2H)，7.72(t，J＝6.8Hz，2H)，7.15(m，1H)，2.14(m，1H)，1.07(m，4H)ppm；MS(FIA)397.3(M+H)，395.2(M-H)，431.2(M-H+HCl)；Rt(方法A)2.798分鐘。
實施例126-丁-3-烯基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮除了使用3-氧代-庚-6-烯酸乙酯之外，6-丁-3-烯基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮是按上述實施例1中所述的方法制備的。反應生成了標題化合物的米色固體(2.545g，49％產(chǎn)率)。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.8(s，1H)，7.88(d，1H)，7.79(t，1H)，7.75(t，1H)，7.68(d，1H)，6.22(s，1H)，5.80(m，1H)，5.03(dd，1H)，4.98(dd，1H)，2.56(t，2H)，2.36(m，2H)ppm；MS(FIA)295.1(M+H)；Rt(方法A)3.160分鐘。
實施例134-丁-3-烯基-6-氯-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶除了使用6-丁-3-烯基-2-(2-三氟甲基-苯基)-3H-嘧啶-4-酮之外，按實施例2中所述的方法制備標題化合物，形成黃色油(0.49g，99％產(chǎn)率)。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ7.72(d，1H)，7.67(d，1H)，7.57(t，1H)，7.51(t，1H)，7.13(s，1H)，5.77(m，1H)，4.98(m，2H)，2.84(t，2H)，2.49(m，2H)ppm；MS(FIA)313.0(M+H)；Rt(方法A)4.220分鐘。
實施例14[6-丁-3-烯基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-7)除了使用4-丁-3-烯基-6-氯-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶之外，按如實施例6所述的方法制備標題化合物，形成米色的固體(2.712克，62％產(chǎn)率)。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.1(s，1H)，10.56(s，1H)，8.50(m，1H)，8.47(d，1H)，7.84(d，1H)，7.76(t，1H)，7.69(m，3H)，7.13(m，1H)，5.86(m，1H)，5.06(dd，1H)，4.98(dd，1H)，2.76(t，2H)，2.46(m，2H)ppm；MS(FIA)411.2(M+H)；Rt(方法A)3.019分鐘。
實施例15[6-(3-嗎啉-4-基-丙基)-2-(2-三氟甲基-苯基)嘧啶-4-基]-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-8)將[6-丁-3-烯基-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(0.10克，0.25mmol)的甲醇(5毫升)和四氫呋喃(5毫升)溶液在-78℃下用臭氧鼓泡5分鐘。向混合物中加入嗎啉(0.05mL，0.56mmol)和三乙酰氧基硼氫化鈉(0.39g，1.85mmol)。將反應在室溫下攪拌24小時，當加入額外的嗎啉(0.10mL，1.28mmol)和三乙酰氧基硼氫化鈉(0.39g，1.85mmol)時，再持續(xù)攪拌另外2小時。將反應用碳酸氫鈉淬滅，并蒸發(fā)。用快速色譜[SiO2，用1∶9的甲醇∶二氯甲烷洗脫]純化，而后利用制備HPLC，形成標題化合物的亮黃色冷凍干燥物(0.068g，38％產(chǎn)率)。484.3(M+H).。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，9.60(br s，1H)，8.52(m，1H)，8.47(d，1H)，7.86(d，1H)，7.77(m，1H)，7.70(m，2H)，7.14(m，1H)，3.97(br m，2H)，3.61(br m，2H)，3.44(br m，2H)，3.18(br m，2H)，3.05(br m，2H)，2.78(t，2H)，2.08(m，2H)ppm。
實施例16利用基本上類似于本文中實施例1-15所描述的方法、常規(guī)反應路線和本領域普通技術(shù)人員已知的方法制備下列化合物。
-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-9)482.2(M+H).1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(S，1H)，9.04(br s，1H)，8.52(m，1H)，8.47(d，1H)，7.85(d，1H)，7.78(m，1H)，7.70(m，2H)，7.14(m，1H)，3.42(m，2H)，3.10(m，2H)，2.85(m，2H)，2.77(t，2H)，2.09(m，2H)，1.79(m，2H)，1.61(m，3H)，1.35(m，1H)ppm. -(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-10)470(M+H).1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，9.07(s，1H)，8.50(m，1H)，7.85(m，1H)，7.78(d，1H)，7.76(m，1H)，7.71(m，2H)，7.14(m，1H)，3.11(m，6H)，2.80(t，2H)，2.05(m，2H)，1.15(t，6H)ppm. -(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-11)497.2(M+H).1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，8.52(m，1H)，8.47(m，2H)，7.85(d，1H)，7.77(m，1H)，7.72(m，3H)，7.14(m，111)，3.0-3.7(br，10H)，2.83(s，3H)，2.77(t，2H)，2.05(m，2H)ppm. -(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-12)483.3(M+H)。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，9.06(br s，2H)，8.52(m，1H)，8.47(d，1H)，7.85(d，1H)，7.77(m，1H)，7.70(m，2H)，7.14(m，1H)，3.34(br m，8H)，3.15(brm，2H)，2.77(t，2H)，2.06(m，2H)ppm。
-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-13)442.1(M+H)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，9.40(br s，1H)，8.52(m，1H)，8.47(d，1H)，7.85(d，1H)，7.78(m，1H)，7.71(m，2H)，7.14(m，1H)，3.12(m，2H)，2.77(m，8H)，2.06(m，2H)ppm。
N，N-二甲基-N′-{3-[6-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基-氨基)-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-丙基}-乙烷-1，2-二胺(I-14)485.3(M+H)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，9.7(br，1H)，8.8(br s，1H)，8.52(m，1H)，8.48(d，1H)，7.85(d，1H)，7.77(m，1H)，7.71(m，2H)7.14(m，1H)，3.32(s，4H)，3.07(br m，2H)，2.84(s，6H)，2.80(m，2H)，2.04(m，2H)ppm。
-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-15)428.1(M+H)。1H-NMR(500MHz，DMSOd6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，8.51(m，1H)，8.48(d，1H)，8.37(br s，2H)，7.85(d，1H)，7.77(m，1H)，7.70(m，2H)，7.14(m，1H)，2.97(m，2H)，2.78(t，2H)，2.55(m，3H)，2.01(m，2H)ppm。
2-{3-[6-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基氨基)-2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-基]丙氨基}-乙醇(I-16)458.2(M+H).IH-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，8.52(m，1H)，8.47(m，2H)，7.85(d，1H)，7.77(m，1H)，7.69(m，2H)，7.14(m，1H)，3.62(t，2H)，2.99(m，4H)，2.78(t，2H)，2.04(m，2H)ppm。
-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-17)527.2(M+H).1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，8.76(br s，2H)，8.52(m，1H)，8.48(d，1H)，7.85(d，1H)，7.78(m，1H)，7.70(m，2H)，7.14(m，1H)，3.81(br s，4H)，3.1-3.3(brm，8H)，3.06(t，2H)，2.80(t，2H)，2.05(t，2H)ppm。
-丙基}-2-(2-三氟甲基-苯基)嘧啶-4-基]-(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)-胺(I-18)541.2(M+H).1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.2(s，1H)，10.7(s，1H)，8.52(m，1H)，8.47(d，1H)，7.85(d，1H)，7.78(m，1H)，7.70(m，2H)，7.14(m，1H)，3.73(br s，4H)，3.39(m，2H)，3.21(m，2H)，2.8-3.3(br m，6H)，2.81(s，3H)，2.78(t，2H)，2.09(m，2H)ppm.
實施例17GSK-3抑制作用的Ki值測定使用標準結(jié)合酶系統(tǒng)來篩選化合物抑制GSK-3β(AA 1-420)活性的能力(Fox等(1998)Protein Sci 7，2249)。反應在含有100mM HEPES(pH值7.5)、10mM MgCl2、25mM NaCl、300μM NADH、1mM DTT和1.5％DMSO的溶液中進行。在測定中最終底物濃度是20μM的ATP(SigmaChemicals，St Louis，MO)和300μM的肽(HSSPHQS(PO3H2)EDEEE，American Peptide，Sunnyvale，CA)。反應在30℃和20nM的GSK-3β中進行。結(jié)合酶系統(tǒng)中的組分的最后濃度是2.5mM的磷酸烯醇丙酮酸、300μM的NADH、30μg/毫升的丙酮酸激酶和10μg/毫升的乳酸脫氫酶。
制備含有除ATP和目標試驗化合物外的上列所有試劑的測定用緩沖原溶液。在裝有5μl最后濃度為0.002μM到30μM的待測試驗化合物的96孔平皿中，將測定緩沖原溶液(175μl)在30℃下孵育10分鐘。典型地，通過在子系平皿中制備試驗化合物的DMSO系列稀釋液(由10mM化合物原液稀釋)進行12-點滴定。通過加入20μl的腺苷三磷酸(最后濃度為20μM)引起反應。在30℃使用MolecularDevices Spectramax平皿讀數(shù)器(Sunnyvale，CA)于10分鐘內(nèi)獲得反應速率。用隨抑制劑濃度而變的速度數(shù)據(jù)確定Ki值。
使用上述測定方法發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物具有小于100nM的Ki值。
實施例18神經(jīng)保護百分數(shù)的測定本文中所使用的術(shù)語“保護作用百分數(shù)”代表受到保護避免缺血性損傷(OGD)的神經(jīng)細胞的百分數(shù)，且計算如下％保護作用＝(試驗-OGD)/(正常-OGD)*100本方案描述了通過在所培養(yǎng)的海馬趾神經(jīng)元細胞中的缺氧癥復氧作用來誘導實驗性局部缺血所使用的步驟。評估了試驗化合物對于缺血性誘發(fā)神經(jīng)元細胞的損傷和細胞死亡的神經(jīng)保護作用。
在測定日之前進行下列步驟將LoG-Neurobasal[LoG-Neurobasal含有NoG Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen Corp，客戶自訂)加0.5mM葡萄糖、0.5mM L-谷氨酰胺和0.25x青霉素/鏈霉素]在含氧量低的箱中過夜預平衡。
將LoG-Neurobasal在標準培養(yǎng)箱(5％CO2)中過夜預平衡。
在標準培養(yǎng)箱中(5％CO2)，將Neurobasal/B27AO[Neurobasal/B27AO含有Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen Corp目錄號21103-049)、用2x B27 minus AO補充(Invitrogen Corp目錄號10889-038)、0.5mM L-谷氨酰胺和0.25x青酶素/鏈霉素]過夜預平衡。
在測定當天進行下列步驟由含氧量低的箱中取出LoG-Neurobasal培養(yǎng)基，并用100％N2給培養(yǎng)基輕輕鼓泡30分鐘，至去氧完全。
使用附裝有無菌玻璃吸量管的真空泵從每個12-孔平皿中的細胞中吸出Neurobasal/B27m培養(yǎng)基[Neurobasal/B27m含有具有2x B27補充液和0.5mM L-谷酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen Corp目錄號_17504-044)]。
將平皿用由以下制備的2毫升不含葡萄糖的-BSS0(pH值7.4)洗滌143.6mM NaCl，5.4mM KCl，1.8mM CaCl2，0.8mM MgSO4，1mM NaH2PO4，26.2mM NaHCO3，10mg/l酚紅，和0.25x P/S。
將神經(jīng)元(從初始培養(yǎng)起10-11天)用LoG-Neurobasal(對于12-孔平皿的每個孔每孔1毫升)重新補足。神經(jīng)元細胞按照以下文獻制備Park LC，Calingasan NY，Uchida K，Zhang H，Gibson GE(2000)“Metabolic impairment elicits brain cell type-selectivechanges in oxidative stress and cell death in culture.”JNeurochem 74(1)114-124。
直接向每個孔加入試驗化合物(3種濃度的化合物加陽性對照，每個樣品一式三份)。將化合物溶于100％DMSO，其中DMSO的濃度從不超過0.5％，然后將平皿在含氧量低的箱中放置5小時，使平皿蓋半開著。
對于氧正常對照組，將預平衡過的含氧量正常的LoG-Neurobasal培養(yǎng)基加入到每個孔中，并將放回到標準培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。
在缺氧4小時后，小心地吸出現(xiàn)有的介質(zhì)，并向每個孔中加入2ml新的充氧的(預平衡過的)Neurobasal/B27AO。再充氧介質(zhì)是通過在使用之前將介質(zhì)在培養(yǎng)箱(5％CO2/95％O2)中放置過夜實現(xiàn)的。
將相同濃度的相同試驗化合物加回到相應的孔中，并將平皿放入細胞培養(yǎng)箱中(5％CO2/95％O2)，再充氧20-24小時。再充氧20-24小時后，使用如下所述的細胞跟蹤器綠色熒光法對活神經(jīng)元數(shù)目計數(shù)。
從12孔平皿的每個孔中吸出存在的培養(yǎng)基，將神經(jīng)元用預溫熱至30-37℃的2毫升HBSS(pH值7.4，Invitrogen Corp，目錄號14170-112)洗滌一次。
向平皿的每個孔中加入1毫升2.5μM細胞跟蹤器綠((MolecularProbes，目錄號2925)，并將5μM Hoechst 33342熒光染料溶于HBSS中。然后將平皿在室溫下在黑暗中放置15分鐘，然后將神經(jīng)元用2ml HBSS洗滌一次。向每個孔中加入1毫升HBSS，并使用Cellomics自動成像系統(tǒng)對活的和死的熒光細胞數(shù)目進行計數(shù)。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物的％保護作用值≥30％。
實施例19大腦中動脈閉塞模型(MCAO)在此研究中使用的動物是重量在270和333克之間的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River，NC)。使大鼠在12-小時光/黑暗晝夜循環(huán)中對動物設施適應至少一星期。它們可自由獲取食物和水。
用于阻擋大腦中動脈(MCA)來源的管腔內(nèi)動脈限光器由切至25mm長片段的4-0尼龍單絲縫線制成。通過接觸熱源將縫線的線頭弄圓。為提高限光器阻擋動脈腔管的效果，將它們涂上1％聚L-賴氨酸懸浮液，并在設置為60℃的烘箱內(nèi)干燥1小時?？p線購買于Ethelon，Somerville，NJ。使用如下的化學試劑1.2，3，5-三苯基四唑氯化物，或TTC，目錄號8877，Lot #50K1435，和PEG400，目錄號P-3265，購買自Sigma Chemical Co，St Louis，Missouri。
2.磷酸鹽緩沖液福爾馬林，目錄號245-685，購買自FisherScientific Co，Mddletown，VA。
3.蒸餾水是自行生產(chǎn)的。
4.乙醇，目錄號E702-3，購買自Aldridge，Milwaukee，WI。
基本上使用Longa等在Stroke，2084-91(1989)中描述的病灶腦缺血的管腔內(nèi)縫線模型。在左側(cè)外頸靜脈插入導管用于給予賦形劑或化合物。
為幫助大鼠在研究期間維持水化作用，在MCAO后10，24，和48小時時在肋部的每邊皮下注射5％葡萄糖水溶液和乳酸鹽林格氏溶液(各5毫升)。
將滿足初始包含標準(神經(jīng)學分數(shù)為2且體溫＞38.5℃)的大鼠進行隨機地按順序分配給賦形劑或化合物試驗組。每天將初始每天分配的大鼠交換到一個特定的組。
MCAO后6小時通過靜脈內(nèi)快速注射來開始用化合物或賦形劑處理，并通過使用Infu Disk泵繼續(xù)持續(xù)輸液18小時。將大鼠略麻醉，并通過背側(cè)的頸切口露出頸靜脈的導管。將推注劑量的化合物或賦形劑快速濃注給大鼠施用，5分鐘后啟動灌流泵。通過一個夾套將灌流泵附于大鼠的背后。
使用以體積比5∶4∶1的水∶PEG400∶乙醇的載體每天制備新鮮的化合物溶液。在此模型中各組和所用劑量在下面的表2中列出。
表2.用于t-MCAO模型的化合物給藥劑量

*推注劑量0.49毫升體積**0.21ml/hr的輸液速度和18小時的輸液時間。
使用改進的Bederson等(1986)描述的方法，通過7份連續(xù)的2，3，5-三苯基四唑氯化物(TTC)染色劑的圖像分析來測定梗塞的體積。MCAO三天后，通過二氧化碳窒息將大鼠殺死并切去頭。將腦迅速地從顱蓋中取出，并放置在冰浴上的含有PBS的專用燒杯中30分鐘。使用腦基質(zhì)切片機獲得2mm厚度的花冠腦切片。在37℃下，將腦切片放置在做了標記的、含有在PBS中的2％TTC的陪氏培養(yǎng)皿中20分鐘。TTC將活腦組織染成紅色，余下白色缺血性部位。然后在4℃下將腦切片浸于10％中性緩沖液福爾馬林中至少24小時。在死亡的3天之內(nèi)將所有切片成像。
使用Adobe Photoshop程序和數(shù)字式攝像機，數(shù)字化捕獲經(jīng)福爾馬林穩(wěn)定的TTC染色的腦切片(7個連續(xù)切片)。將圖像導入IPLab圖像分析程序。勾勒出并測定皮層梗塞的部位(白色部位)。使用下面的公式計算梗塞體積梗塞體積＝∑梗塞面積×2(在每個切片之間的距離)可類似地測定總的同側(cè)和對側(cè)的半球形的體積。從同側(cè)半球形體積減去對側(cè)半球形體積可計算出浮腫的體積。讓對大鼠的處理不知情的科學家進行分析。
使用Bederson等(1986b)描述的打分系統(tǒng)，在MCAO后2、24、48和72小時評定大鼠的神經(jīng)學功能。分數(shù)范圍從0-3，用0作為正常，3表明嚴重缺陷。
使用局部缺血2小時的神經(jīng)學分數(shù)作為研究中的包含標準。如果大鼠沒有至少2分的神經(jīng)學分數(shù)，或如果具有3分的分數(shù)，則將其從研究中淘汰。讓對大鼠的試驗組不知情的研究員進行神經(jīng)學評價。
在快速注射后的5分鐘和在4、22、46和70小時從大鼠獲得血樣(約0.5毫升)用于藥物動力學分析。將大鼠用異氟烷稍微麻醉。使用23-規(guī)格的蝶形輸液裝置，從側(cè)面的尾部靜脈將血液收集在肝素化的血液接收管(0.6mL容積)中。在微型離心機中將血樣旋轉(zhuǎn)4分鐘(設定10)。除去血漿，放入做了標記的小瓶中，并在-20℃冷凍存儲。
MCAO后七十二小時，將大鼠用CO2吸入劑深麻醉，并通過心臟穿刺盡可能多地獲得血液。將血液輸入肝素化的血液接收管中(6毫升容積)。通過在4000rpm下離心5分鐘從血液中分離出血漿(AllegraR6，)。收集血漿，放入做了標記的塑料管中，并在-20℃冷凍存儲。
通過雙尾Student′s t檢驗來進行賦形劑和試驗組之間的梗塞面積、血漿葡萄糖、體溫和體重的統(tǒng)計分析。利用非變量分析來進行神經(jīng)學分數(shù)的統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。
在MCAO后6小時用式I的化合物處理能非常有效地減少暫時聚焦性中風模型的梗塞體積(圖1)。與賦形劑對照組(418±31mm3，p＜0.0001)相比，化合物處理組(88±31mm3)中的大鼠在總的梗塞體積上具有相當顯著的79％的減少。與賦形劑對照組(272±22mm3，p＜0.0001)對比，在化合物處理組(32±20mm3)中皮層缺血性損傷也有88％的顯著減少。與賦形劑對照組(146±13mm3，p＜0.0001)相比較，用式I的化合物處理(55±12mm3)能夠顯著地減少62％的紋狀體的缺血性損傷。最后，與賦形劑對照組(97±10mm3，p＜0.0001)相比較，用式I的化合物處理(21±10mm3)能減少79％浮腫形成量。
在實驗進程中，用式I的化合物處理的大鼠在神經(jīng)學功能方面顯示了明顯的改進(圖2)。開始給藥后18小時，與賦形劑對照組相比，能夠觀察到化合物處理組在神經(jīng)學功能方面的顯著改進(分別為1.3±0.3和2±0單位，p＜0.01)。用化合物處理的大鼠的神經(jīng)學分數(shù)繼續(xù)改進，以致于MCAO后72小時，大鼠的功能有很少或沒有可注意到的缺陷。相比之下，在實驗的進程中，賦形劑處理的大鼠在神經(jīng)學功能方面沒有顯示出改進。
實施例20抗抑郁劑的動物模型通過基本上類似于Porsolt R.D.，等，1977；229327-336BourinM.Fundam Clin Phannacol 1990；449-64描述的方法，在大鼠身上測定本發(fā)明的化合物的抗抑郁活性。
大鼠的游泳試驗(抑郁試驗)將大鼠放置在一個可透明的裝滿水的圓筒中。將不動持續(xù)時間(＝不動-時間)定義為大鼠為了保持其頭在水面上而做最小的身體活動的時間，人工記錄這個時間。在第二個試驗中，在第4天將大鼠再次放置在圓筒中，這次放置5分鐘。人工記錄整個試驗的不動-時間。
試驗I(初次試驗)在第1天將雄性Wistar大鼠(RA239系；160-180g)放置在一個圓筒中15分鐘。不動持續(xù)時間(＝不動-時間)，定義為大鼠為了保持其頭在水面上而做最小的身體活動的時間，人工記錄這個時間。為了測試動物在一天之內(nèi)合理的數(shù)目，將記錄限制在下列15分鐘內(nèi)的三個子周期中。試驗0-2.5分鐘(即在試驗開始時)，6.25-8.75分鐘(正好在試驗當中)和12.5-15分鐘(試驗全部結(jié)束)。以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這個方法可代表動物在整個試驗中表現(xiàn)的行為。
試驗II(第二次試驗)在第4天將大鼠再次放置在圓筒中，這次放置5分鐘。人工記錄整個試驗的不動-時間。將化合物處理劑懸浮在0.5％的甲基纖維素(甲基纖維素)中，并口服給予(5ml/kg)。在第1天(試驗I的當天)的晚上(約16:00)、在第2和第3天的早上(約08:00)和晚上和正好在試驗II(在第4天)之前1小時給予藥物。對于二次試驗的兩個大鼠的處理是相似的或不同的，取決于在試驗I中的行為的隨機性。用甲基纖維素或15mg p.o.地昔帕明(DMI)處理的大鼠組分別作為對照組和陽性標準。
在上述模型中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物顯示出抗抑郁活性。
實施例21精神分裂癥的動物模型驚嚇的悸動前抑制作用(PPI)與注意力和識別力的失調(diào)相聯(lián)系的感覺運動控制的損傷在精神分裂癥患者中是常見的。在精神分裂癥患者中削弱了驚嚇的悸動前抑制作用(PPI)。當先于強聲刺激的弱音抑制驚嚇反射時，出現(xiàn)悸動前抑制作用。PPI被認為是一種對于精神分裂癥具有良好預見性、表面和內(nèi)在驗證的試驗。
陽性對照，氯氮平，是可商業(yè)上獲得的非典型的抗精神病藥物(Clozaril)。氯氮平對于D4多巴胺和5-HT2受體具有高親合性，并能在動物模型中有效地增強PPI響應值。
以下面的方式，通過基本上類似于Spooren等在Anxiolytic-likeeffects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5antagonist 2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine in rodents.JPharrnacol Exp Ther.2951267-1275(2000)中描述的方法進行PPI的測定。
在實驗之前至少3天，把四組雄性C57BL/6(20-30g)放入macrolon籠(42×26×15cm)中。該套設施對溫度和濕度進行了控制，并裝有人工照明(6:00AM-6:00PM，開燈)。動物可以使用水和食物，不限量。所有的動物是試驗性的當?shù)貏游铩?br> 將用于試驗的動物用測試化合物(30，60，100mg/kg)、氯氮平(30mg/kg)、陽性對照或賦形劑(0.5％甲基纖維素)預先處理。45分鐘后，將小鼠分別放入具有70dB白噪聲背景的箱中，使小鼠10分鐘不受干擾。然后在15分鐘期間進行56個試驗。驚嚇刺激物是40ms-120db-白噪聲聲音，悸動前是20ms-72、74和78dB的白噪聲聲音，然后驚嚇100ms。
進行八種類型的試驗悸動前加驚嚇(每個悸動前強度7個試驗)，單獨的悸動前(每個悸動前強度7個試驗)，單獨的驚嚇(7個試驗)，和沒有刺激作用(7個試驗)?？勺兊脑囼為g間隔平均為15s(在10和20s之間)。在沒有-刺激作用的試驗中，測定基線。在驚嚇單獨試驗中，測定基礎聽覺驚嚇振幅(g)，并在悸動前加驚嚇試驗中，測定正常驚嚇抑制作用的量并表示為基礎驚嚇的百分數(shù)。在悸動前單獨試驗中，作為對照組來測定對微弱噪音的正常響應。按照下式計算悸動前的抑制作用，％PPI＝100-100×[(PA2 PPP)/PA2]。
我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物能夠提高在小鼠身上的聲學驚嚇反射的PPI。
實施例22抗焦慮劑的動物模型以下面的方式，通過基本上類似于Spooren等在Anxiolytic-likeeffects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5antagonist 2-261(1990)pyridine in rodents.J Pharrnacol ExpTher.2951267-1275(2000)和Lecci A，Borsini F，Voltera G和Meli A，Pharmacological validation of a novel animal model ofanticipatory anxiety in mice.Psychophannacology 101255-261(1990)中描述的方法進行抗焦慮藥的測定。
I.緊張引起的高熱癥采用Lecci等(1990)原始描述的緊張引起的高熱癥的試驗步驟，稍有改進。手持小鼠接近尾根的部分，將溫度計(ELLAB instruments，Copenhagen，Denmark)通過潤滑的熱敏探頭(直徑2mm)插入直腸內(nèi)20mm來測定直腸溫度，近似至0.1℃。將探頭放在適當?shù)奈恢?，直到獲得穩(wěn)定的讀數(shù)(在15s之內(nèi))。
將十五個動物放置在一個macrolon籠中(42×26×15cm)。實驗之前至少24小時，在動物的毛皮上用顏色給一個籠中的動物做出標記，以便隨后進行鑒別。測定直腸溫度之前六十分鐘，用測試化合物(劑量1.3，10或30mg/kg，p.o.；注射體積10ml/kg)、陽性對照物利眠寧-HCl(10mg/kg，p.o.；Research BiochemicalsInternational)或賦形劑(0.5％甲基纖維素；硬樹脂)以1分鐘間隔連續(xù)處理一個籠內(nèi)的所有個體。正好30分鐘后，從籠中連續(xù)取出小鼠(再次以1分鐘間隔)，測定直腸溫度并記錄。一旦已經(jīng)記錄溫度后，將動物放置在一個不同的(相鄰的)籠內(nèi)。因變量，即緊張引起的高熱癥，被定義為一個籠內(nèi)的最初取出的六只小鼠的直腸溫度中間值和最后取出的六只小鼠的直腸溫度中間值的增量δ。根據(jù)具體試驗組計算六至八籠的δ，使用六至八籠的平均值來代表最終值。此外，利用最初的動物的直腸溫度來評定化合物本身對基礎體溫的潛在影響。
II.大鼠的社交探索性試驗使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠(＝“常駐”大鼠；350-400克)和幼年的Lister Hooded大鼠(＝“闖入者”大鼠；100-120克)。測試之前，將闖入者大鼠成對放置在macrolon籠(42×26×15cm)內(nèi)，常駐大鼠單個放置在macrolon籠(42×26×15cm)內(nèi)，放置2星期。所有的動物都被放在同一個房間。該套設施對溫度和濕度進行了控制，并裝有人工照明(6:00AM-6:00PM，開燈)。動物可以使用水和食物，不限量。所有的大鼠是試驗性的當?shù)卮笫蟆?br> 讓動物接受測試化合物(劑量0.3，3，10或30毫克/千克)、利眠寧-HCl(5毫克/千克，p.o；cdz，Research BiochemicalsInternational，Natick，MA)，LiCl(10，30毫克/千克)作為參考/陽性化合物或賦形劑(0.5％甲基纖維素)。注射體積是2毫升/千克。只給闖入者大鼠口服給藥，測試在給予化合物后1小時進行。在光照期間(8:00AM-1:00PM)，在常駐大鼠的籠中進行所有觀測(參見上面)。將籠底板用木屑覆蓋。將由一只闖入者大鼠和一只常駐大鼠組成的一對大鼠隨機地分配到實驗或?qū)φ战M中的一組中。人工評分闖入者大鼠對常駐大鼠的主動接近行為(嗅，肛門與生殖器的探究，用鼻子拱，梳毛，舔，游戲)的時間(＝花在社交活動上的時間)，并在5分鐘內(nèi)累積報告。
III.高架十字迷宮模型(Elevated Plus Maze Test)實驗之前至少3天，將雄性成年Sprague-Dawley大鼠(180-220g)以四個一群放入macrolon籠內(nèi)(42×26×15cm)。該套設施對溫度和濕度進行了控制，并裝有人工照明(6:00AM-6:00PM，開燈)。動物可以使用水和食物，不限量。所有的動物是試驗性的當?shù)貏游铩?br> 高架十字迷宮由兩個開放式的懸臂(40×12cm)和兩個密封的懸臂(40×12×20cm)組成，所有的懸臂從一個普通的中心平臺上(12×12cm)伸出。這種構(gòu)型形成了加號的形狀，相似的懸臂彼此相對，并將裝置升高至超過中央基座的底板60cm。迷宮由灰色有機玻璃制成。圍繞懸臂周長的小卷邊(0.25cm)有助于抓住開放懸臂。
以下面的方式，通過基本上類似于Handley，S.L.和Mithani，S在Naunyn-Schtvziedeberg′s Arch Pharmacol 3271-5(1984)中的Effects of α-adrenoceptor agonists and antagonists in a mazeexploration model of″fear″-motivated behaviour所描述的方法來進行本方法。將大鼠隨機地分配給各種處理組中的一組。至少在測試之前1小時將動物從放置房間運送到實驗室?？诜o予化合物后，將大鼠分別放在macrolon籠(22×16×14cm)中，60分鐘后將其放置在面對密封懸臂的中心平臺上。進行8分鐘的試驗，徹底清理受試者之間迷宮。由位置接近于迷宮的觀測者直接做記錄，使用以下常規(guī)的參數(shù)進入開放的和密封的懸臂的次數(shù)(將進入懸臂解釋為所有的四只爪子都進入懸臂)和處于開放懸臂中的時間(不包括中心平臺)。對來自不同試驗組的動物進行交替測試，試驗在8:30AM和12:30PM之間進行，即在光照階段的前半段之內(nèi)進行。記錄了以下焦慮反射參數(shù)在開放臂中的時間比例(開放式/總時間)，離開第一個懸臂的等待時間，進入的懸臂總數(shù)。
在上述動物模型中，本發(fā)明的化合物顯示了抗焦慮類藥的效果。
實施例23對于阿爾莰海默氏病神經(jīng)元存活的細胞測定利用基本上類似于Kienlen-Campard等在J Biol Chem 27715666(2002)中所描述的方法來進行以下測定。由E18大鼠胚胎來制備海馬趾神經(jīng)元的原始培養(yǎng)物(Park等，J Neurochem，74114，2000)。將細胞放在6或96孔培養(yǎng)皿(4×105個細胞/cm2)中或玻璃蓋片(1.25×105個細胞/cm2)上，用聚(D-賴氨酸)預處理，并在補充有2％B-27和0.5mM L-谷氨酰胺的NEUROBASALTM培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)6天，然后用重組腺病毒感染。在這樣的條件下，神經(jīng)元培養(yǎng)物(高達98％的神經(jīng)元)表現(xiàn)了高分化和高存活率。
制作了重組腺病毒和神經(jīng)元感染-進行了編碼APP695形式的突變株的腺病毒的產(chǎn)生、繁殖和純化。體外6天后，將神經(jīng)元培養(yǎng)物在最小體積的培養(yǎng)基中以4小時重復100次的感染次數(shù)進行感染。然后用新鮮的培養(yǎng)基替代感染培養(yǎng)基3-5天。在這樣的條件下，至少75％神經(jīng)元能表達重組腺病毒編碼的蛋白質(zhì)。
細胞存活-神經(jīng)元存活是通過比色MTT測定法或利用CellTracker熒光細胞存活度測定法使用Cellomics自動成像系統(tǒng)測定的。為了核染色，將細胞固定在(0.37％甲醛/0.2％戊二醛的磷酸鹽緩沖鹽水溶液)中，并在Hoechst 33342染料(1μg/ml)中孵育30分鐘。
Aβ產(chǎn)物的定量分析--收集培養(yǎng)基，用蛋白酶抑制劑(1μg/ml抑胃肽，10μg/ml亮肽素，1mM苯甲基磺酰氟)處理，離心(16,000×g，5min，4℃)清洗。使用如下所述的ELISA方法，用100μl的上清液來進行β淀粉樣的定量分析。
實施例24β淀粉樣(1-40)產(chǎn)物的抑制作用阿爾茨海默氏病的特征是，在腦部存在細胞外動脈粥樣斑和細胞間神經(jīng)纖維纏結(jié)。這些動脈粥樣斑的主要蛋白組分是從淀粉樣前體蛋白(“APP”)斷裂的β淀粉樣(“Aβ”)肽。
細胞系和化合物的處理通過用既表達含有Swedish突變(K595N，M596L)的APP695又表達作為選擇標示物的YFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行轉(zhuǎn)導，在人H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中構(gòu)建了能分泌Aβ的穩(wěn)定的細胞株。表達APP695的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導子是通過將表達高水平Y(jié)FP的細胞分類來選擇的。
將細胞以80,000個細胞/孔的量置于96孔平皿中，其中裝有補充以10％胎牛血清(PBS)和青霉素/鏈霉素的Dulbecco′s改進的Eagle培養(yǎng)基。24小時后，將培養(yǎng)基用新鮮的、含有目標化合物的培養(yǎng)基替換，其中以七-點滴定法一式兩份測定從20μM至10nM的化合物濃度范圍。在37℃下，與測試化合物孵育18-24小時后，使用hAβ40ELISA確定上清液中的hAβ(1-40)濃度。
分泌出的Aβ的ELISA測定用Biosource International，Inc，Inc.Signal SelectTMHumanβ Amyloid(hAβ40)ELISA(目錄號KHB3482)來進行樣品培養(yǎng)上清液中hAβ40的體外定量測定。將對hAβ的NH2末端特異性的單克隆抗體涂布在微量滴定板的孔中。將包括已知hAβ含量的標準的樣品吸取到這些孔中，而后加入對hAβ的1-40序列特異性的兔抗體。然后利用辣根過氧化酶標記的抗兔抗體來檢測結(jié)合的兔抗體。除去過量的抗兔抗體后，加入底物溶液，其被結(jié)合的酶切斷而產(chǎn)生顏色。所產(chǎn)生的顏色強度與存在于樣品中的hAβ(1-40)的濃度直接成正比。
ELISA測定以如下方式進行將樣品和含有已知濃度hAβ(1-40)肽的標準物在標準物/樣品稀釋劑(Biosource試劑)中稀釋。將蛋白酶抑制劑AEBSF、抑肽酶、貝他定、E-64、亮肽素和抑胃肽A(Calbiochem，Protease InhibitorCocktail Setm，catalog # 539134)加入到所有的樣品中，以防止Aβ肽的水解。將100μl的樣品和標準物加入到96孔ELISA平皿的孔中，并在室溫下培養(yǎng)2小時，或在4℃下過夜。用100μl洗滌緩沖液(Biosource試劑)將孔洗滌4次，然后加入100μl的檢測抗體，并將平皿在室溫下孵育2小時。檢測抗體能夠識別hAβ(1-40)序列。
將孔用100μl的洗滌緩沖液洗滌4次，然后加入辣根過氧化酶(HRP)標記的抗兔二代抗體。將平皿在室溫下孵育2小時。然后用100μl的洗滌緩沖液將孔洗滌5次，而后加入100μl的穩(wěn)定化的色原。將平皿在室溫下、在暗處孵育30分鐘。穩(wěn)定化的色原是一種底物溶液，其被結(jié)合的HRP切斷后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，并因此可以在標準微量滴定板讀數(shù)器上監(jiān)控。然后加入100μl的停止溶液，使用Molecular DevicesSpectraMAX 340平皿讀數(shù)器在450nM處測定孔中的顏色強度。典型地，以一式兩份在7-點劑量響應中進行化合物濃度范圍從20μM至10nM的化合物的分析。由含有已知Aβ肽濃度的標準物制出的標準曲線來計算樣品中Aβ(1-40)的濃度。
用3天的時間測試本發(fā)明的化合物。每天，均包括作為對照物的Calbiochem γ分泌酶“抑制劑X”。這是一種可滲透細胞的羥基乙烯二肽等排體(目錄號565771)，據(jù)報道IC50值為50nM。
實施例25阿爾茨海默氏病(AD)的轉(zhuǎn)基因動物實驗I.AD轉(zhuǎn)基因動物過表達人類阿爾茨海默氏β-淀粉樣(Aβ)前體蛋白(其含有Lys670-->天冬酰胺、Met671-->Leu突變)的695-氨基酸異構(gòu)體的轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg2576小鼠，從Taconic N.Y商購)，在空間參照物中具有正常的學習和記憶、以及在3月齡時的可改變?nèi)蝿展δ?，但顯示其在9至10個月齡時這種功能受到削弱。Aβ(1-40)增加五倍和Aβ(1-42/43)增加14倍會伴隨著這些行為缺陷的出現(xiàn)。在Aβ數(shù)量提高的小鼠皮層和邊緣組織中存在大量的用剛果紅染料染色的Aβ動脈粥樣斑。在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中出現(xiàn)暗示阿爾茨海默氏病的相關行為的、生化的和病理的反常，預示著探索這些疾病的病理生理學和神經(jīng)生物學的新的時機。參見Correlative memory deficits，Aβ elevation，andamyloid plaques in transgenic mice(在轉(zhuǎn)基因小鼠中相關的記憶缺陷、Aβ提高和淀粉狀動脈粥樣斑)，Science 1996年10月4日；274(5284)99-102。
盡管在本文描述的模型中具體應用了Tg2576小鼠，但可以理解，可商業(yè)和私人提供的其它轉(zhuǎn)基因小鼠，也可用于所述模型。
II.β-淀粉狀ELISA方案在阿爾茨海默氏病的Tg2576小鼠模型中Aβ和記憶之間的關系。Journal of Neuroscience，3月1日，2002，22(5)1858-1867。
將冷凍的半腦用兩步提取法依次提取[超聲處理，在(1)2％SDS和(2)70％甲酸(FA)中]。將后一部分稱為Abnsol。超聲處理后，將樣品在4℃下以100,000xg離心1小時，回收上清液，將沉淀用下一個溶液進行超聲處理。通過夾入先前描述的ELISA來測定腦提取物(Suzuki等，1994；Gravina等，1995)。使用以下系統(tǒng)(1)BAN-50捕獲和BA-27或BC-05檢測或(2)3160捕獲和BA-27或BC-05檢測，以上兩種方法均分別檢測Aβ1-40和Aβ1-42。將由所有年齡組的小鼠獲得的Tg2576腦直接比較，表明用3160捕獲ELISAs檢測的Aβ40和Aβ42的量基本上與用BAN-50捕獲時的量相同。將2％的SDS提取物以至少1∶40的比例稀釋，以使測定可以在0.05％SDS中進行。對于SDS可使用更大量的稀釋劑，以使其也可在0.05％SDS中測定。通過以1∶20的稀釋比例加入到1M Tris磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中來中和FA提取物。使用Softmax程序，通過比較樣品的吸光度與已知濃度的合成的Aβ-40和Aβ-42(其在與樣品相同的溶液中)的吸光度，來計算每毫升毫微微摩爾值，并用原始組織均漿的濕重來校正這些值，最終以皮摩爾每克濕重來表示。在所有這些情況下，將非轉(zhuǎn)基因組織與轉(zhuǎn)基因組織并行同等地處置。
III.轉(zhuǎn)基因小鼠的行為實驗Morris水迷宮使B6/SJL族背景的Tg2576小鼠以能夠使我們檢測和判別記憶喪失的整個階段的方式適應水迷宮。此方案提供了所需要的敏感性、特異性和動態(tài)范圍，以測定生命早期敏感的和生命晚期遲鈍的變化。在訓練期間插入探頭提供敏感性。采用行為缺陷的排除標準排舉出特異性。廣泛地訓練提供了動態(tài)范圍。平均探頭分數(shù)的指定(MPSs)，即小鼠在三次探頭試驗期間在目標象限內(nèi)所花時間的平均百分數(shù)，改進了與分子標示物相關的個體小鼠的認知行為的定量分析，并提供了具有廣泛的動態(tài)范圍的單一測定方法。用于其它族背景的Tg2576的方案，在學習速率和行為缺陷方面可能需要按族特異性的差別進行調(diào)整。參見The Relationship between Aβ and Memory in the Tg2576 MouseModel of阿爾茨海默氏病Disease(在阿爾茨海默氏病的Tg2576小鼠模型中Aβ和記憶之間的關系)。The Journal of Neuroscience，三月1日，2002年，22(5)1858-1867。
水迷宮是一個環(huán)形的1或1.2m的池子，裝滿25-27℃的水，并通過加入無毒的白色涂料使其不透明。池子位于在由醒目圖案的幕布和放有差別明顯的物品的架子組成的固定空間記號中間。將小鼠放置在一個量杯中，并輕輕地將其面對池壁降入到水里。首先將小鼠進行3個連續(xù)日(每日八次試驗)的可視平臺訓練，使其游泳至一個用黑色和白色條紋標桿標明的高臺處(正方形表面12×12cm2)。將可視平臺訓練天數(shù)分成兩個訓練板塊，每個板塊進行四個試驗用于統(tǒng)計分析。在可視平臺訓練期間，平臺位置(NE，SE，SW或NW)和開始位置(N，NE，E，SE，S，SW，W或NW，不包括與平臺緊密相鄰的位置)在每個試驗中是偽隨機改變的。偽隨機化可保證所有的位置在所指定的位置重復之前都被抽樣過。用9個連續(xù)日(每日四個試驗)進行隱藏平臺訓練，其中使小鼠搜索淹沒在水表面之下1.5厘米的平臺。將在60秒之內(nèi)沒能達到平臺的小鼠引向具有金屬逃逸口的平臺。在隱藏平臺試驗期間，平臺位置保持恒定(NE，SE，SW，或NW)，并且小鼠在七個偽隨機化選擇的位置(N，NE，E，SE，S，SW，W或NW，不包括與平臺緊密鄰接的位置)進入池子。每個隱藏平臺試驗結(jié)束后，將小鼠在平臺上保留30秒鐘，從平臺取出，并使其回到它們的具有逃逸口的家籠中。小鼠迅速地學會將出口與從池子逃逸出來相關聯(lián)，并不斷地以出口為目標或在出口出現(xiàn)時跟蹤出口。小鼠取向或跟蹤逃逸口的能力代表視覺和注意力的獨立測定。在隱藏平臺訓練的第4、7和10天的開始時，進行探頭試驗，其中從池中取出平臺，并使小鼠搜索平臺60秒鐘。用一架直接安裝在池子上面的相機監(jiān)控所有的試驗，并使用計算機處理跟蹤系統(tǒng)進行報告和分析。
計算每個小鼠的MPS，并用其評價在Morris水迷宮中的空間信息的記憶力。通過整合由插入探頭得來的信息，MPS表示與先前描述的學習指數(shù)在概念上相似的學習量度(Gallagher等，1993)，其中抽樣檢驗了在不同學習階段的記憶。發(fā)現(xiàn)用MPS、學習指數(shù)和學習分數(shù)(在探頭試驗期間在目標象限耗費的時間百分數(shù)的加權(quán)總數(shù))具有相似的統(tǒng)計結(jié)果，我們選擇使用MPS表示我們的數(shù)據(jù)是由于其表示方法簡單。
測試后，將每個小鼠組的子組進行安樂死，并將右半腦在液氮中冷凍，以用于Aβ測量。將所有的腦以編碼方式進行分析。
IV.轉(zhuǎn)基因小鼠的行為實驗探索活動，焦慮，和運動協(xié)調(diào)參見Transgenic mice expressing the βAPP695SWE mutationeffects on exploratory activity，anxiety，and motorcoordination。Brain Res 2003年7月；977(1)38-45。
在由白色丙烯酸制成的T-迷宮中測試自發(fā)交替。迷宮由一個每個邊的側(cè)面帶有兩個懸臂(長度30cm)的中心柄(長度30cm)組成。迷宮寬度是9cm，每個壁高20cm。在試驗的初始階段，將小鼠放置在T-迷宮柄中，利用塑料阻片阻斷右懸臂(強迫選擇)。進入可獲取后的懸臂后，利用封閉它們后面的阻片將小鼠關在里面60秒鐘。然后將小鼠取回，除去阻片后，立即將其放回在柄中做自由選擇試驗，其中小鼠可以探索相對的懸臂或同一個懸臂(四個爪的標準)。在以下的9天中，除了將在第一個試驗中被阻斷的懸臂在奇數(shù)天從右邊轉(zhuǎn)換過來、在偶數(shù)天保持在右邊之外，重復相同的兩個試驗步驟。測定在選擇試驗期間的交替數(shù)目和響應之前的潛伏數(shù)目，每個試驗具有1分鐘的截止周期。如果小鼠在1分鐘之內(nèi)沒有響應，并遠離選擇點，可從它們后面略略進行刺針，通常不超過一次，以報告每個試驗的響應值。
在開放領域測定機動活性，開放領域由具有50×50cm表面積和38cm高的側(cè)壁的白色丙烯酸制成。通過高架的圖像攝像機來報告并分析在中央和周圍區(qū)的活動。中央帶是正方形形狀，并從距每個壁25厘米的距離處開始。將小鼠放置在開放領域的角落里，放置三天，每天5-分鐘時間。在每個區(qū)域中測定移動距離，并測定休息(＜2cm/s)、遲緩移動(2-5cm/s)或迅速移動(＞5cm/s)所耗費的時間，以及在裝置周圍和中心所花費的時間。
高臺十字迷宮由四個以十字形的懸臂(長度70cm，寬度10cm，由底板開始的高度40cm)和一個中心區(qū)(10cm2)組成。將兩個懸臂的三個側(cè)面用隔板(高度10cm)圍起來，而其它兩個懸臂開放，但帶有用于避免下落的邊緣(高度0.5cm)。兩個圍起來或開放的懸臂彼此面對。將小鼠放置在中心區(qū)，并測定進入次數(shù)和在封閉的和開放的懸臂中的時間，測定兩天，每天5分鐘，用預先測試中使用的相同的電視軌道裝置來測定。然后計算進入和停留開放/全部懸臂比例。在極少的時候，當小鼠從開放懸臂掉下時，停止報告時間并將小鼠放回到其掉下處的精確位置。每個自發(fā)交替時段、開放領域和十字迷宮測驗后，將裝置用濕潤布擦干凈并在下一個試驗開始之前進行干燥，以降低可能產(chǎn)生的氣味線索影響。
固定的橫梁由直徑2.5厘米和長度110cm的塑料建造成。將橫梁用一層白色膠紙帶包上，以確保穩(wěn)固地控制，并通過繪線型圖分成11個部分。將橫梁放置在距有保護層的底板高45cm處，該底板是用來緩沖下落并由此防止對小鼠造成損傷。將一個硬紙板隔板插入橫梁的末端以防止小鼠從中逃逸。通過將小鼠放置在中部而開始試驗。在單一四個試驗期間，測定交叉部分數(shù)目(四個爪的標準)、下落前潛伏時間和下落次數(shù)。截止周期是每個試驗1分鐘，試驗間的間隔為15分鐘。
加速旋轉(zhuǎn)棒(Model7650，Stoelting，Wood Dale，IL，USA)是由有棱紋的塑料(直徑3厘米)制成的。將橫梁放置在距地平面13.5cm的高度上，并用塑料隔板分成五個部分(寬度5.5cm)。面對遠離實驗者的視野，將小鼠放置在與其活動方向正相反的已旋轉(zhuǎn)的棒(4rpm)的上端，以使其下落時可以避免向前運動。將旋轉(zhuǎn)棒在每個5分鐘試驗期間從4至40rpm逐漸且平穩(wěn)地加速。測定下落之前等待時間，在四個試驗期間每天測定三次，試驗期間間隔15分鐘。只要小鼠在沒有移動的情況下抓住棒(被動式旋轉(zhuǎn))連續(xù)兩個整轉(zhuǎn)，可認為小鼠已經(jīng)下落。由于沒有小鼠出現(xiàn)故意跳躍的行為，可以得到運動技能的有效評價。訓練后，評定出現(xiàn)的各種正常的和病理的反射。
V.利用免疫組織化學測定腦β淀粉狀的累積參見“在共表達突變的人類早老素基因1和淀粉狀前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠中的加速動脈粥樣斑累積，相伴隨的學習缺陷，和α7煙堿性受體蛋白的上調(diào)”(Accelerated plaque accumulation，associative learning deficits，and upregulation of α7nicotinic receptor protein in transgenic mice co-expressingmutant human presenilin 1 and amyloid precursor proteins)。J Biol Chem 2002年六月21日；277(25)22768-80用磷酸鹽緩沖鹽水(10mM NaHPO4，150mM NaCl，pH7.2)給小鼠進行心臟灌注并用4％多聚甲醛固定。使用恒冷切片機將冷凍腦部分切成12μm厚的花冠狀切片，放在ProbeOn Plus載玻片(FisherScientific)上，并空氣干燥。用丙酮將腦切片固定，然后立即染色。在0.3％H2O2和0.3％正常山羊血清中將組織切片孵育30分鐘，在磷酸緩沖鹽水中洗滌，并在1.5％的正常山羊血清的磷酸緩沖鹽水溶液中孵育30分鐘。然后將腦切片用生物素化的抗小鼠IgG(1∶200，VectorLaboratories)染色的抗-Aβ抗體6E10(1∶1000，Senetik)一起孵育，并用Vectastain ABC試劑(1∶100，Vector Laboratories)進行免疫檢測。對各切片用蘇木素進行負染。
盡管上面已經(jīng)描述了許多本發(fā)明的實施方案，但很明顯可以改變我們的基礎實施例，利用本發(fā)明的化合物和方法提供其它實施方案。因此，應理解本發(fā)明的范圍是通過附加的權(quán)利要求而不是通過已經(jīng)通過實施例表示的具體實施方案來定義的。
權(quán)利要求
1.式I的化合物 或其藥學可接受的鹽，其中W是氮或CH；R1選自氫或氟；和Ry是C1-4脂族基，任選被N(R2)2或具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫的雜原子的5-6元飽和環(huán)所取代，其中每個R2獨立地選自氫或任選被OH、N(R3)2、或具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫的雜原子的5-6元飽和環(huán)所取代的C1-3脂族基；并且其中每個R3獨立地選自氫或C1-3脂族基；條件是當R1是氫并且W是CH時，則Ry不是甲基。
2.按照權(quán)利要求1的化合物，其中Ry是C1-4脂族基。
3.按照權(quán)利要求2的化合物，其中Ry選自甲基，乙基，環(huán)丙基，叔丁基或異丙基。
4.按照權(quán)利要求3的化合物，其中Ry選自甲基，環(huán)丙基或叔丁基。
5.按照權(quán)利要求1的化合物，其中W是氮。
6.按照權(quán)利要求1的化合物，其中W是CH。
7.按照權(quán)利要求1的化合物，其中R1是氫。
8.按照權(quán)利要求1的化合物，其中R1是氟。
9.按照權(quán)利要求1的化合物，其中Ry是被具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫的雜原子的6元飽和環(huán)取代的C1-4脂族基。
10.按照權(quán)利要求9的化合物，其中Ry是被嗎啉環(huán)、哌啶環(huán)或哌嗪環(huán)取代的C1-4脂族基。
11.按照權(quán)利要求1的化合物，其中Ry是被N(R2)2取代的C1-4脂族基。
12.選自下列的化合物
13.一種藥學可接受的組合物，包括按照權(quán)利要求1的化合物和藥學可接受的載體、輔料或賦形劑。
14.按照權(quán)利要求13的組合物，另外包括選自下列的其它治療劑用于治療阿爾茨海默氏病(AD)的試劑、用于治療帕金森氏癥的試劑，用于治療多發(fā)性硬化(MS)的試劑、用于治療哮喘的試劑，抗炎劑，免疫調(diào)控劑或免疫抑制劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子，用于治療中風的試劑，用于治療心血管疾病的試劑，抗抑郁藥，抗精神病試劑，或用于治療糖尿病的試劑。
15.一種抑制生物樣品中的GSK3激酶活性的方法，包括將所述生物樣品與下述物質(zhì)接觸的步驟a)按照權(quán)利要求13的組合物；或b)按照權(quán)利要求1的化合物。
16.一種抑制患者的GSK3激酶活性的方法，包括給予所述患者下述物質(zhì)的步驟a)按照權(quán)利要求13的組合物；或b)按照權(quán)利要求1的化合物。
17.一種對需要治療的患者治療自身免疫性疾病、炎性疾病、代謝紊亂、精神錯亂、糖尿病、血管生成疾病、tauopothy、神經(jīng)學或神經(jīng)變性障礙、脊髓損傷、青光眼、禿頂、或心血管疾病的方法，包括給予所述患者按照權(quán)利要求13的組合物。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中所述疾病、障礙或病癥選自變態(tài)反應，哮喘，糖尿病，阿爾茨海默氏病，杭廷頓氏舞蹈病，帕金森氏癥，AIDS-有關的癡呆，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS，盧格里克氏疾病)，多發(fā)性硬化(MS)，由于頭外傷引起的損傷，精神分裂癥，焦慮，雙極障礙，tauopothy，脊髓或周圍神經(jīng)損傷，心肌梗塞，心肌肥大，青光眼，注意力缺陷障礙(ADD)，抑郁癥，睡眠障礙，再灌注/局部缺血，中風，血管生成疾病，或禿頂。
19.按照權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病、障礙或病癥是中風。
20.按照權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病、障礙或病癥是阿爾茨海默氏病。
21.按照權(quán)利要求17的方法，其中所述障礙是神經(jīng)學或神經(jīng)變性障礙。
22.減少男性患者精子活力的方法，包括給予所述患者按照權(quán)利要求13的組合物。
23.按照權(quán)利要求17的方法，包括另外給予所述患者選自下列的其它治療劑的步驟用于治療阿爾茨海默氏病(AD)、用于治療帕金森氏癥的試劑，用于治療多發(fā)性硬化(MS)、用于治療哮喘的試劑，抗炎劑，免疫調(diào)控劑或免疫抑制劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子，用于治療中風的試劑，用于治療心血管疾病的試劑，抗抑郁藥，抗精神病試劑，或用于治療糖尿病的試劑，其中所述其它治療劑對于所要治療的疾病是適合的；且所述其它治療劑是與所述組合物以單一劑量形式一起給予的、或作為多重劑量形式的一部分與所述組合物分開給予的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種式(I)的化合物或其藥學可接受的衍生物。這些化合物是蛋白質(zhì)激酶的抑制劑，特別是GSK3哺乳動物蛋白激酶的抑制劑。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的化合物的藥學可接受的組合物，和利用這些化合物和組合物治療多種蛋白激酶介導的病癥的方法。
文檔編號A61P25/16GK1681815SQ03821985
公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月2日
發(fā)明者C·J·福斯特, L·C·帕克, M·W·沃納梅克, Y－M·姚 申請人:沃泰克斯藥物股份有限公司