專利名稱：左旋正丁基苯酞的預(yù)防和治療癡呆的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及左旋正丁基苯酞和含有左旋正丁基苯酞的組合物的治療癡呆的用途。
背景技術(shù)：
老年性癡呆或稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以臨床和病理為特征的進(jìn)行性退行性神經(jīng)病。其臨床表現(xiàn)主要為記憶力(特別是近記憶力)減退，認(rèn)知能力低下，思維遲鈍，空間定向障礙等。病理表現(xiàn)為β-淀粉樣肽(Aβ)與其它分子、神經(jīng)元和非神經(jīng)細(xì)胞結(jié)成一起在細(xì)胞外沉積成老年斑以及細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles，NFT)的形成。我國(guó)AD患病率在0.2％～5.98％之間，該病多發(fā)生在60歲以上的人群。隨年齡增加而增多，據(jù)估計(jì)我國(guó)現(xiàn)有AD患者在360萬人以上。在北京地區(qū)調(diào)查癡呆發(fā)病率發(fā)現(xiàn)血管性癡呆(VD)多于AD。(張明園等癡呆和阿爾茨海默病的發(fā)病率。中華精神科雜志1998；31(4)195-196)由于我國(guó)已進(jìn)入老齡化時(shí)期，癡呆患者逐年增多。并且，在老年人群中腦血管病發(fā)生率是很高的，據(jù)估計(jì)卒中后癡呆的發(fā)病卒約為9～30.8％，長(zhǎng)期腦供血不足也是導(dǎo)致血管性癡呆的重要原因?？傊V呆患者不僅對(duì)本人極為痛苦，而且對(duì)家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)很大，因此尋找有效藥物以延緩、控制AD和VD病情的發(fā)展是極為重要的。
阿爾茨海默氏病(AD)是老年人認(rèn)知功能進(jìn)行性減退的最主要原因。其主要病理改變是形成以β-淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)沉積為核心的老年斑和神經(jīng)纖維繞結(jié)。研究表明，腦中膽堿能系統(tǒng)與人的學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)。AD病人腦中ACh水平下降，催化合成ACh的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性低下，其降低程度與認(rèn)知功能減退密切相關(guān)。此外，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與AD的病因也越來越受到重視。Aβ由39-43個(gè)氨基酸組成，是β前體蛋白(APP)的降解產(chǎn)物。Aβ沉積的范圍與神經(jīng)損傷和認(rèn)知功能缺損密切相關(guān)。既往研究證實(shí)持續(xù)地側(cè)腦室灌注(i.c.v.)Aβ(1-40)或Aβ(1-42)能引起大鼠學(xué)習(xí)和記憶損傷(Nitts.et al.β-Amyloid protein-induced Alzheimer’s disease animalmodel.Neurosci.Lett.1994；17063-66)，提示腦中Aβ聚集所造成的記憶損傷可模擬AD病人的癥狀。經(jīng)研究，左旋正丁基苯酞(L-NBP)，能明顯改善線粒體功能，改善腦微循環(huán)和能量代謝，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抗氧化損傷，抑制炎癥反應(yīng)，抗血栓，降低細(xì)胞內(nèi)鈣，抑制谷氨酸的釋放等腦保護(hù)作用。為此，可以選用持續(xù)側(cè)腦室灌注(i.c.v.)Aβ(1-40)作為模型。用Morris水迷宮和生化方法檢測(cè)所試化合物對(duì)動(dòng)物近記憶和空間位置記憶功能和對(duì)氧化損傷的影響。
血管性癡呆(VD)是由于腦血管疾病引起腦功能障礙而產(chǎn)生的癡呆，多數(shù)伴有多發(fā)的較大的腦動(dòng)脈梗塞或腔隙性腦梗塞或腦低灌。腦血流降低程度與癡呆嚴(yán)重性相關(guān)(Roman et al.Vascular dementiadiagnosticcriteria for research studies.Neurology 1993；43250-260)。慢性進(jìn)行性腦供血不足，使其對(duì)氧和葡萄糖以及其他必需的代謝物質(zhì)利用下降，其結(jié)果引起氧化損傷，線粒體功能和神經(jīng)細(xì)胞的生物合成受損，突觸傳遞功能受阻，最后導(dǎo)致神經(jīng)病理學(xué)改變，即發(fā)生神經(jīng)退行性變化(Beal et al.Do defects in mitochondrial metabolism underlie the pathology of neurodegenerativedisease Trends Neurosci.1993；16125-131)。VD病人主要表現(xiàn)為近記憶和空間知覺進(jìn)行性衰退和認(rèn)知功能缺損。血管性癡呆的發(fā)生和發(fā)展與膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞密切相關(guān)，也與神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷相關(guān)，在病理上VD病人皮質(zhì)下白質(zhì)稀疏。大量研究表明，ACh被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)。AD病人的膽堿能通路功能降低，表現(xiàn)為神經(jīng)遞質(zhì)ACh水平下降，這是其記憶功能受損及認(rèn)知缺損的重要原因之一(Toghi et al.Cerebrospinal fluid acetylcholine and choline in vascular dementia ofBinswanger and multiple small infarct types as compared with Alzheimer-type dementia.J.Neural Transm.1996；1031211-1220)。所試化合物對(duì)ChAT活性有提高作用，說明其能使膽堿能神經(jīng)ACh水平增加，有利于改善記憶功能。
近十余年來，很多實(shí)驗(yàn)室用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠近記憶和空間位置的記憶力，可敏銳地反映動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損及其功能變化(Richard Morris.Developments of a water-maze procedure for studying spatiallearning in the rat J.Neurosci Methods.1984；1147-60)，并觀察藥物對(duì)該模型的作用。由于癡呆病人主要表現(xiàn)為認(rèn)知缺損，特別是對(duì)近記憶和空間知覺的進(jìn)行性損傷。因此該模型不失為一個(gè)較理想的觀察藥物對(duì)早老性癡呆病(AD)和VD有否有治療作用的模型。而用大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷(2-VO)模型持續(xù)低灌可模擬臨床上供血不足引起的血管性癡呆，因此用本法可反映藥物治療癡呆的作用(Ni.J.W.et al.Neuronal damage anddecrease of central acetylcholine level following permanent occlusion bilateral commoncarotid arteries in rats.Brain Res.1995；673290-296)。
1988年于澍仁報(bào)道的芹菜甲素(3-正丁基苯酞，Ag-1)是合成的消旋體3-正丁基苯酞，它對(duì)馬桑內(nèi)酯造成大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙有改善作用，對(duì)大鼠海馬細(xì)胞有保護(hù)作用(于澍仁等芹菜甲素增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的作用 中國(guó)藥理學(xué)報(bào) 1988，9(5)385-388)。此后，有報(bào)道認(rèn)為芹菜提取液對(duì)中老年小鼠學(xué)習(xí)記憶有改善作用(李靜等 芹菜提取液對(duì)中老年小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 中草藥1996，27(2)104-105；劉洛生等安清益智膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2001，39(6)562-564)，但迄今尚未見到有光學(xué)立體異構(gòu)體一左旋正丁基苯酞(L-NBP)治療老年性癡呆的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了如通式(I)所示 的左旋正丁基苯酞(以下簡(jiǎn)稱L-NBP)作為抗癡呆的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明所用的左旋正丁基苯酞是經(jīng)化學(xué)合成，先得到消旋正丁基苯酞，后經(jīng)化學(xué)拆分成為左旋光學(xué)異構(gòu)體正丁基苯酞，通過核磁、質(zhì)譜和紅外等光譜分析，特別是用Hp5890氣相色譜儀，手性氣相色譜柱(Chiraldex G-TA)進(jìn)行分析，證明本品的光學(xué)純度和化學(xué)純度為單一光學(xué)立體異構(gòu)體一左旋正丁基苯酞(比旋光度＞-66.49°，光學(xué)純度＞98％，化學(xué)純度＞98％)，拆分方法參見中國(guó)專利“制備光學(xué)活性3-正丁基苯酞的方法”，申請(qǐng)?zhí)?9109673.8，公開號(hào)CN1283621。本品的化學(xué)結(jié)構(gòu)式是和食用芹菜及其籽中所含的芹菜甲素結(jié)構(gòu)相同。
本發(fā)明用國(guó)際上公認(rèn)的方法即用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物近記憶和空間定向力。
本發(fā)明通過建立永久性阻斷大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈(2-VO)引起持續(xù)低灌模型，用Morris水迷宮法檢測(cè)L-NBP對(duì)動(dòng)物近記憶和空間位置功能的影響，用生化方法檢測(cè)了L-NBP對(duì)氧化損傷的某些指標(biāo)和對(duì)膽堿能神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)的影響。鑒于腦低灌引起行為改變伴隨著腦膠質(zhì)細(xì)胞激活，白質(zhì)變稀疏。因此本研究用病理學(xué)和免疫組織化學(xué)的方法，用膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白(GFAP)和K-B染色(反映神經(jīng)元髓鞘的病理變化)作為指標(biāo)，觀察了藥物對(duì)其影響。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)于腦供血不足大鼠的近記憶和空間位置功能障礙，本發(fā)明的左旋正丁基苯酞具有明顯的改善作用。水迷宮試驗(yàn)的學(xué)習(xí)和保留實(shí)驗(yàn)經(jīng)常被用于評(píng)價(jià)低灌注大鼠的空間記憶能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，在第一天訓(xùn)練中，各組間潛伏期沒有顯著性差異，說明所有動(dòng)物在笫一天對(duì)該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作并不熟悉。經(jīng)過5天的訓(xùn)練，假手術(shù)組的搜索策略從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期(12.6±3.34秒)明顯縮短，說明動(dòng)物經(jīng)過訓(xùn)練已具有一定的記憶力和空間定向力。而溶劑對(duì)照組的搜索策略沒有明顯的轉(zhuǎn)變，仍為邊緣式和隨機(jī)式，潛伏期(47.6±5.88秒)未明顯縮短，兩組相比差異顯著(P＜0.01)。L-NBP10mg/kg組的搜索策略從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期(26.85±5.98秒)縮短明顯，與溶劑對(duì)照組比較有明顯差異(P＜0.001兩因素方差分析)，而與假手術(shù)組比較無顯著差異，說明該劑量組對(duì)記憶力和空間定向力有明顯改善作用。其它藥物如DL-NBP10mg/kg，DL-NBP30mg/kg和D-NBP30mg/kg的改善作用均不明顯。
在5天的學(xué)習(xí)訓(xùn)練結(jié)束后，進(jìn)行平臺(tái)探索實(shí)驗(yàn)，將安全島撤去以測(cè)試大鼠是否已形成對(duì)安全島的空間記憶。除溶劑對(duì)照組外，所有大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間都大于25％，表明都已經(jīng)形成了對(duì)安全島的相對(duì)位置的記憶。假手術(shù)組的停留時(shí)間為17.73±1.19秒，而溶劑組對(duì)照組的停留時(shí)間(14.40±0.73秒)明顯縮短。通過單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，兩組間有明顯差異(P＜0.05)。L-NBP10mg/kg組在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間較溶劑對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(17.62±1.27秒)，兩組間比較有顯著意義(P＜0.05)。DL-NBP組(10mg/kg和30mg/kg)均無作用。為了排除動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力對(duì)其影響，經(jīng)測(cè)定，各組間游泳速度無差異。以上說明只有左旋正丁基苯酞對(duì)腦供血不足大鼠的近記憶和空間位置功能缺損有明顯作用，而消旋和右旋正丁基苯酞?jiǎng)t無作用。
SOD是重要的抗氧化酶，正常對(duì)照組皮層組織中SOD的活性為100.07±3.64(NU/mg protein)海馬組織中的活性為57.90±7.41(U/mgprotein)。大鼠永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，海馬SOD的活性與對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05)，這可能是一種代償性反應(yīng)。經(jīng)L-NBP(10mg/kg)治療后，該酶活性明顯接近正常水平(P＜0.05)。MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志，可反應(yīng)在體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。在此實(shí)驗(yàn)中，模型組皮層MDA的含量升高了19.9％，與正常對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.001)。經(jīng)L-NBP(10mg/kg)治療后，皮層MDA的含量明顯降低了20.7％(P＜0.001)。大鼠永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，皮層ChAT的活性顯著降低，與正常對(duì)照組相比，下降了34.4％(P＜0.05)，表明低灌注可致膽堿能神經(jīng)功能受損。而L-NBP(10mg/kg)連續(xù)給藥16天后，可使皮層組織中ChAT的活性較模型組提高了37.1％，具有顯著性差異(P＜0.05)。由結(jié)果可得出以下結(jié)論L-NBP10mg/kg組能明顯改善2-VO動(dòng)物近記憶和空間位置的記憶障礙，而消旋丁基苯酞和右旋丁基苯酞對(duì)改善記憶功能障礙均無效。本發(fā)明在2-VO后笫10天開始給藥(一直給藥至第35天)，目的在于觀測(cè)藥物對(duì)腦低灌引起的神經(jīng)元退行變的治療作用，以排除對(duì)急性低灌缺血期的影響。
本發(fā)明通過病理學(xué)和免疫組織化學(xué)方面的研究說明L-NBP對(duì)血管性癡呆有明顯的治療作用。永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，模型組可見皮層和海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元明顯減少，細(xì)胞皺縮和神經(jīng)元深染，而L-NBP(10mg/kg)治療后能明顯改善低灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。文獻(xiàn)報(bào)道雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎可以誘導(dǎo)腦中膠質(zhì)細(xì)胞活化，并伴有白質(zhì)稀薄。白質(zhì)稀薄按其嚴(yán)重程度一般分為4級(jí)0級(jí)，正常；1級(jí)，神經(jīng)纖維錯(cuò)排；2級(jí)，明顯空泡形成；3級(jí)，有髓鞘的纖維消失。在我們的實(shí)驗(yàn)中，模型組的視束較正常對(duì)照組顯示明顯的白質(zhì)稀薄，有大量的空泡出現(xiàn)，L-NBP(10mg/kg)長(zhǎng)期給藥后可顯著改善這種情況，視束的空泡明顯減少。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GFAP-陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常對(duì)照組海馬，尾核，胼胝體等部位很少檢測(cè)到，但雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎4周后，許多GFAP-陽性反應(yīng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)。經(jīng)L-NBP(10mg/kg)治療后，GFAP-陽性的膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少(見圖3，4)?？傊?，L-NBP對(duì)ChAT活性有提高作用，說明能使膽堿能神經(jīng)ACh水平增加，有利于改善記憶功能。此外L-NBP能明顯抑制氧化損傷，說明L-NBP能降低神經(jīng)細(xì)胞的損傷。由2-VO引起的腦低灌的病理特征為白質(zhì)稀疏，空泡和膠質(zhì)細(xì)胞增多(Narri.et al.Chronic cerebralhypoperfusion-induced neuropathological changes in rats.Jpn.J.Psychopharmacol.1998；18181-188)，而L-NBP均能改善這些病理改變。以上這些作用機(jī)制對(duì)L-NBP改善2-VO大鼠引起的記憶障礙提供了依據(jù)。根據(jù)以上結(jié)果，L-NBP對(duì)血管性癡呆有明顯的治療作用。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)于β-淀粉樣肽(1-40)引起的大鼠記憶和空間定向力障礙，本發(fā)明的左旋正丁基苯酞具有明顯的改善作用。在大鼠腦室內(nèi)持續(xù)灌流Aβ后的水迷宮實(shí)驗(yàn)中，第一天訓(xùn)練中，各組間潛伏期沒有顯著性差異。經(jīng)過5天的訓(xùn)練，假手術(shù)組的搜索策略從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期(13.02±2.77秒)明顯縮短。而模型組的搜索策略沒有明顯的轉(zhuǎn)變，仍為邊緣式和隨機(jī)式，潛伏期(30.18±4.81秒)未明顯縮短，兩組相比差異顯著(P＜0.01)。經(jīng)L-NBP治療后，大鼠在水迷宮試驗(yàn)中的潛伏期明顯縮短，其中L-NBP10mg/kg組和30mg/kg組的搜索策略從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期分別為27.28±6.42秒和25.88±5.51秒，與模型組比較有明顯差異(P＜0.05兩因素方差分析)，而與假手術(shù)組比較無顯著差異，說明經(jīng)1-NBP治療的大鼠已接近正常水平，見圖4。在工作記憶測(cè)驗(yàn)中，第一次實(shí)驗(yàn)和第2-5次實(shí)驗(yàn)的潛伏期見圖5A，B。雖然在第一次實(shí)驗(yàn)中，各組的潛伏期沒有顯著性差異，但在以后4次實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組的潛伏期為9.15±0.91秒，模型組的潛伏期為14.05±1.88秒，后者潛伏期明顯延長(zhǎng)，二者有顯著性差異(P＜0.01)。L-NBP組可以劑量依賴性的顯著改善工作記憶能力(P＜0.01)。
L-NBP還能增加GSH-Px活性和降低MDA的含量。GSH-Px是重要的抗氧化酶，在我們的實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組皮層組織中GSH-PX的活性為15.86±0.91(U/mg protein)；海馬組織中的活性為16.19±1.19(U/mg protein)。大鼠Aβ(1-40)持續(xù)灌流后，GSH-Px的活性與假手術(shù)組相比在皮層和海馬分別降低了29.5％和42.4％，具有顯著性差異(P＜0.01和P＜0.001)。經(jīng)L-NBP治療后，30mg/kg組對(duì)該酶活性明顯升高(P＜0.01)，L-NBP(10mg/kg)也有升高該酶的活性作用，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志，反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。在此實(shí)驗(yàn)中，大鼠Aβ(1-40)持續(xù)灌流后皮層和海馬MDA的含量分別升高了25.7％和23.6％，與假手術(shù)組相比具有顯著性差異(P＜0.05和P＜0.01)。經(jīng)L-NBP治療后，皮層和海馬MDA的含量明顯降低，10mg/kg組分別降低了28.4％和24.3％(P＜0.05和P＜0.01)，30mg/kg的作用弱于10mg/kg組，但與Aβ(1-40)模型組相比，仍具有顯著性差異(P＜0.05)。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)可以得出如下結(jié)論大鼠持續(xù)側(cè)腦室灌流Aβ(1-40)引起的記憶障礙是公認(rèn)的觀測(cè)藥物對(duì)AD治療作用的模型。由以上結(jié)果可見，L-NBP不僅對(duì)2-VO導(dǎo)致供血不足引起血管性癡呆的模型有明顯作用，而且對(duì)大鼠持續(xù)側(cè)腦室灌流Aβ(1-40)引起的近記憶和空間位置的記憶障礙也有明顯改善作用。這說明L-NBP對(duì)不同原因引起的近記憶和空間位置記憶障礙均有明顯改善作用。此外，L-NBP有阻斷氧化損傷的作用(提高GSH-Px活性和降低MDA含量)，結(jié)合其明顯的腦保護(hù)作用，提示L-NBP有治療老年性癡呆的作用。
總而言之，本發(fā)明用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠近記憶和空間位置的記憶力，用大鼠2-VO模型持續(xù)低灌以模擬臨床上供血不足引起的血管性癡呆，因此本法完全可以反映藥物治療癡呆的作用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L-NBP10mg/kg組能明顯改善2-VO動(dòng)物近記憶和空間位置的記憶障礙，而消旋丁基苯酞和右旋丁基苯酞對(duì)改善記憶功能障礙均無效。ACh被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)。AD病人的膽堿能通路功能降低，表現(xiàn)為神經(jīng)遞質(zhì)ACh水平下降，這是其記憶功能受損及認(rèn)知缺損的重要原因之一。而L-NBP對(duì)ChAT活性有提高作用，說明能使膽堿能神經(jīng)ACh水平增加，有利于改善記憶功能。L-NBP能明顯抑制氧化損傷，說明L-NBP能降低神經(jīng)細(xì)胞的損傷。由2-VO引起的腦低灌的病理特征為白質(zhì)稀疏，空泡和膠質(zhì)細(xì)胞增多，而L-NBP均能改善這些病理改變。因此，本發(fā)明的如通式(I)所示的化合物左旋正丁基苯酞對(duì)血管性癡呆的有預(yù)防和治療作用。
持續(xù)地側(cè)腦室灌注Aβ(1-40)引起大鼠學(xué)習(xí)和記憶損傷可以模擬早老性癡呆病人的癥狀。用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠近記憶和空間位置的記憶功能。L-NBP對(duì)近記憶和空間位置記憶障礙均有明顯改善作用，而D-NBP和DL-NBP則無作用。GSH-Px是重要的抗氧化酶；MDA是反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應(yīng)出腦細(xì)胞損傷的程度。L-NBP能提高GSH-Px活性和降低MDA含量的作用，說明L-NBP能阻斷氧化損傷，有保護(hù)腦損傷作用，而D-NBP和DL-NBP則無作用。因此，本發(fā)明的如通式(I)所示的化合物左旋正丁基苯酞對(duì)早老性癡呆的有預(yù)防和治療作用?？傊?，左旋正丁基苯酞有預(yù)防和治療老年性癡呆作用，而消旋丁基苯酞和右旋丁基苯酞均無作用。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明化合物和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-95重量％的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。
本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴位注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維索等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如，將本發(fā)明化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍優(yōu)選為0.1-100mg/kg體重，更優(yōu)選為0.1-100mg/天/人。上述劑量可以單-劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。
每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。
術(shù)語L-NBP左旋正丁基苯酞2-VO模型永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎


圖1.水迷宮實(shí)驗(yàn)，1A第五天大鼠的搜索路線；1B第五天平臺(tái)探索實(shí)驗(yàn)中大鼠的搜索路線。
圖2.永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后口服L-NBP對(duì)大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的空間記憶障礙的影響。圖2A表示在訓(xùn)練階段潛伏期的改變；圖2B表示移去平臺(tái)后的平臺(tái)探索實(shí)驗(yàn)，大鼠自由游泳60秒鐘，其在平臺(tái)所在象限(Q4)停留的時(shí)間。所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。每組12-14只大鼠；#P＜0.05與假手術(shù)(sham)組比較。P＜0.05與溶劑對(duì)照組(vehicle)比較。
圖3.雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎5周后大鼠海馬CA1區(qū)(A，B，C)和皮層(D，E，F(xiàn))的H-E染色的顯微鏡下圖象改變(40倍)。假手術(shù)組(A，D)；溶劑對(duì)照組(B，E)；L-NBP(10mg/kg)治療組(C，F(xiàn))圖4..雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎5周后大鼠視束K-B染色(A，B，C放大40倍)和尾核GFAP免疫組化染色(D，E，F(xiàn)放大20倍)的顯微鏡下圖象變化。假手術(shù)組(A，D)；溶劑對(duì)照組(B，E)；L-NBP(10mg/kg)治療組(C，F(xiàn))圖5.L-NBP對(duì)大鼠持續(xù)側(cè)腦室灌流Aβ(1-40)后在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的記憶障礙的影響。圖示為訓(xùn)練階段逃避潛伏期的改變；所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。每組10只大鼠。
圖6.L-NBP對(duì)大鼠持續(xù)側(cè)腦室灌流Aβ(1-40)造成的記憶障礙的影響。工作記憶測(cè)驗(yàn)(每天5次)在Aβ(1-40)灌流后第14-16天進(jìn)行。圖5A表示在第一次實(shí)驗(yàn)中潛伏期的改變；圖5B表示后4次實(shí)驗(yàn)中潛伏期的改變。所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。每組10只大鼠。##P＜0.01與假手術(shù)組相比；*P＜0.05與Aβ(1-40)模型組相比。
圖7.實(shí)施例1小鼠從手術(shù)后第10天開始灌服藥物或溶劑。水迷宮實(shí)驗(yàn)在術(shù)后第29-33天進(jìn)行，避暗實(shí)驗(yàn)在34-35天進(jìn)行。動(dòng)物在第36天處死，進(jìn)行生化測(cè)定或病理學(xué)檢查。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，均在實(shí)驗(yàn)前40分鐘給藥。
圖8.實(shí)施例2小鼠從手術(shù)后第2天開始灌服藥物和溶劑。水迷宮訓(xùn)練試驗(yàn)在術(shù)后第9-13天進(jìn)行，第13天進(jìn)行平臺(tái)探索試驗(yàn)，第14-16天進(jìn)行工作記憶測(cè)驗(yàn)。動(dòng)物在第17天處死，斷頭取腦進(jìn)行生化測(cè)定。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，均在實(shí)驗(yàn)前40分鐘給藥。
具體實(shí)施例方式
1.實(shí)施例1 左旋正丁基苯酞對(duì)老年性癡呆之一種，血管性癡呆的治療作用材料和方法試劑和藥品L-，D-，DL-NBP由本所合成室提供，光學(xué)和化學(xué)純度＞98％，旋光度依次為-66.49，+66.88和0度。用植物油配制。
儀器Morris水迷宮自動(dòng)監(jiān)控儀，避暗箱由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所儀電室研制2-VO模型建立雄性Wistar大鼠，10周齡，體重280克左右，每5只放置1籠中，室溫保持在23℃，自由進(jìn)食和引水。大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈暴露，仔細(xì)分離頸總動(dòng)脈的包膜和迷走神經(jīng)。低灌注模型組使用5-0絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外接受相同的手術(shù)。術(shù)后在傷口上撒少許滅菌結(jié)晶磺胺粉，縫合皮膚。手術(shù)一個(gè)月后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)及避暗實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)大鼠隨機(jī)分成8組，每組10只。1)假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其余操作均與低灌注組相同；2)溶劑對(duì)照組僅口服植物油；3)DL-NBP10mg/kg組；4)DL-NBP30mg/kg組；5)L-NBP10mg/kg組；6)L-NBP30mg/kg組；7)D-NBP30mg/kg組；從手術(shù)后第10天開始灌服藥物或溶劑。水迷宮實(shí)驗(yàn)在術(shù)后第29-33天進(jìn)行，避暗實(shí)驗(yàn)在34-35天進(jìn)行。動(dòng)物在第36天處死，進(jìn)行生化測(cè)定或病理學(xué)檢查。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，均在實(shí)驗(yàn)前40分鐘給藥。
水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮主要由一金屬圓柱形水池(池高60cm，直徑120cm)和自動(dòng)顯示、監(jiān)測(cè)、記錄裝置及安全島(直徑10cm的平臺(tái))組成。預(yù)先在水池中注入清水，然后加入溶有1000g的新鮮奶粉的水溶液，使池水成為不透明的乳白色，水面高出平臺(tái)15mm。這樣動(dòng)物不能通過聽、視和嗅覺到達(dá)平臺(tái)，以便檢測(cè)動(dòng)物對(duì)空間位置的敏銳性。水溫保持23±1℃，水池分為4個(gè)象限(東、南、西、北)，平臺(tái)置于西南象限的中心。每只大鼠的游泳活動(dòng)通過電視儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直接連于計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理分析。水迷宮實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5天。每只大鼠1天接受2次訓(xùn)練尋找平臺(tái)，兩次分別從東北象限和西北象限的中點(diǎn)，頭朝向池壁入水，兩次訓(xùn)練間隔10分鐘。記錄找到平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)，并將2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行平均。如果大鼠在60秒內(nèi)未找到平臺(tái)，則潛伏期以60秒計(jì)算。無論在60秒內(nèi)找到平臺(tái)與否，大鼠都在平臺(tái)上停留10秒。第一次實(shí)驗(yàn)開始前將大鼠放到平臺(tái)上10秒適應(yīng)。隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組大鼠尋找安全島的潛伏期縮短。最后一次訓(xùn)練后進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)。移去平臺(tái)，大鼠自由游泳60秒尋找平臺(tái)，記錄大鼠在每個(gè)象限花費(fèi)的時(shí)間。大鼠在原來平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間長(zhǎng)，提示大鼠已經(jīng)對(duì)這個(gè)空間目標(biāo)存在記憶。
我們將搜索策略分為4類(1)邊緣式，大鼠沿水池邊緣運(yùn)動(dòng)，無尋找動(dòng)機(jī)；(2)隨機(jī)式，大鼠搜索時(shí)無明確方向；(3)趨向式，大鼠已記得安全島的大概位置，在發(fā)現(xiàn)安全島前轉(zhuǎn)彎少于4次；(4)直線式，大鼠已明確記得安全島的位置，直接游向安全島。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以大鼠找到安全島的時(shí)間即潛伏期和搜索策略表示對(duì)膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶、抗氧化酶和MDA的檢測(cè)將大鼠斷頭取腦，在冰浴上剝離出皮層和海馬組織，稱重后迅速置于液氮中冷凍待用。樣品加入預(yù)冷的pH7.0磷酸鉀緩沖液0.05mol L-1(內(nèi)含0.5mol L-1EDTA和7％甘油)，冰浴制成10％的組織勻漿，蛋白定量以Lowry比色法測(cè)定。
1.膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)的測(cè)定反應(yīng)體系中加入磷酸鈉緩沖液0.5mol L-1，乙酰輔酶A0.0062mol L-1，氯化膽堿1.0mol L-1，甲基硫酸新斯的明76μmol L-1，NaCL3mol L-1及EDTA0.011mol L-1，鹽酸肌酸酐0.5mol·L-1各40μl，最后各管加入蒸餾水至0.8ml。置37℃溫浴5min后，各管加入200μl組織勻漿液，然后將各管加入沸水2min，之后加入2.5mmol L-1砷酸鈉0.8ml，室溫下15000×g離心3min，取2.0ml上清加入40μ13mmol L-14-PDS，置25℃溫浴15min后，測(cè)定OD值(λ＝324nm)，計(jì)算ChAT活性，以nmolCoA SH/mgprotein/hr表示。
2.超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，的測(cè)定參照南京建成試劑公司試劑盒說明書進(jìn)行。
病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)每組隨機(jī)選取4-6只動(dòng)物，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，戊巴比妥麻醉(100mg/kgip)，依次剪開皮膚，胸腔，充分暴露心臟，剪開左側(cè)心尖部，以灌注針朝主動(dòng)脈方向插入，止血鉗夾閉，輸注生理鹽水，于右心耳下部剪開右心房，生理鹽水灌注15-20min(200-300ml)，流出液變清，換以4％多聚甲醛PBS液繼續(xù)灌注15-20min(150-200ml)，動(dòng)物全身僵硬，肝臟發(fā)白為止，然后斷頭取腦，用刀片切去前部端腦和后部小腦，放入4％多聚甲醛繼續(xù)固定48h(石蠟切片)或20％的蔗糖多聚甲醛溶液固定48h(冰凍切片)。
石蠟切片經(jīng)固定、包埋，切片后應(yīng)用Hematoxylin-Eosin(HE)染色，K-B(Klüver-Barrera Luxol fast blue)染色進(jìn)行病理檢測(cè)，免疫組化的方法檢測(cè)GFAP在腦組織中含量的變化。
統(tǒng)計(jì)分析所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá)。水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組的潛伏期差異比較采用重復(fù)測(cè)定的兩因素方差分析。組間差異采用post hoc LSD或Turkey檢驗(yàn)。水迷宮平臺(tái)探索實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析。避暗實(shí)驗(yàn)采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)。生化測(cè)定采用單因素方差的分析。P＜0.05為有顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果L-NBP對(duì)大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶的影響在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，學(xué)習(xí)和保留實(shí)驗(yàn)經(jīng)常被用于評(píng)價(jià)低灌注大鼠的空間記憶能力。在第一天訓(xùn)練中，各組間沒有顯著性差異。經(jīng)過5天的訓(xùn)練，假手術(shù)組的的搜索策略從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期(12.6±3.34秒)明顯縮短。而溶劑對(duì)照組的搜索策略沒有明顯的轉(zhuǎn)變，仍為邊緣式和隨機(jī)式，潛伏期(47.6±5.88秒)未明顯縮短，兩組相比差異顯著(P＜0.01)。L-NBP10mg/kg組的搜索策略從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期(26.85±5.98秒)縮短明顯，與溶劑對(duì)照組比較有明顯差異(P＜0.001兩因素方差分析)，而與假手術(shù)組比較無顯著差異。其它藥物如DL-NBP10mg/kg，DL-NBP30mg/kg和D-NBP30mg/kg的改善作用均不明顯，見圖1A，B和圖2。在5天的學(xué)習(xí)訓(xùn)練結(jié)束后，進(jìn)行平臺(tái)探索實(shí)驗(yàn)，將安全島撤去以測(cè)試大鼠是否已形成對(duì)安全島的空間記憶。除溶劑對(duì)照組外，所有大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間都大于25％，表明都已經(jīng)形成了對(duì)安全島的相對(duì)位置的記憶。假手術(shù)組的停留時(shí)間(17.73±1.19秒)明顯長(zhǎng)于溶劑對(duì)照組(14.40±0.73秒)，通過單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，有明顯差異(P＜0.05)見圖3。L-NBP10mg/kg組在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間較溶劑對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(17.62±1.27秒，P＜0.05)。DL-NBP組(10mg/kg和30mg/kg)均無作用。為了排除動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力對(duì)其影響，經(jīng)測(cè)定，各組間游泳速度無差異。以上說明只有左旋正丁基苯酞對(duì)腦供血不足大鼠的近記憶和空間位置功能缺損有明顯作用，而消旋和右旋正丁基苯酞?jiǎng)t無作用。
對(duì)SOD、ChAT活性和MDA含量的影響 SOD是重要的抗氧化酶，正常對(duì)照組皮層組織中SOD的活性為100.07±3.64(NU/mg protein)；海馬組織中的活性為57.90±7.41(U/mg protein)。大鼠永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，海馬SOD的活性與對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05)，這可能是一種代償性反應(yīng)。經(jīng)L-NBP(10mg/kg)治療后，該酶活性接近正常水平(P＜0.05)，MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志，可反應(yīng)在體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。在此實(shí)驗(yàn)中，模型組皮層MDA的含量升高了19.9％，與正常對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.001)。經(jīng)L-NBP(10mg/kg)治療后，皮層MDA的含量明顯降低了20.7％(P＜0.001)。大鼠永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，皮層ChAT的活性顯著降低，與正常對(duì)照組相比，下降了34.4％(P＜0.05)，表明低灌注可致膽堿能神經(jīng)功能受損。L-NBP(10mg/kg)連續(xù)給藥16天后，可使皮層組織中ChAT的活性較模型組提高了37.1％，具有顯著性差異(P＜0.05)。(見表1表1.L-NBP對(duì)低灌注大鼠皮層和海馬的SOD和ChAT活性和MDA含量的影響(n＝7-9)組別 SOD活性 MDA含量 ChAT活性(NU/mg蛋白) (nmol/mg蛋白)(％of假手術(shù))腦區(qū)皮層 海馬皮層海馬皮層 海馬假手術(shù)組100.07±3.64 57.90±7.41 3.13±0.10 3.03±0.12 100.0±13.3 100.0±7.2溶劑對(duì)照組 114.42±7.82 81.16±6.84#3.91±0.22###3.63±0.45 65.6±15.1#102.6±15.1
L-NBP98.84±5.5357.60±3.86*3.10±0.09***3.42±0.12104.3±8.2*110.0±13.5(10mg/kg)#P＜0.05，###P＜0.001與假手術(shù)組相比；*P＜0.05，***P＜0.001與溶劑對(duì)照組相比。
對(duì)病理學(xué)和組織化學(xué)的影響永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，模型組可見皮層和海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元明顯減少，細(xì)胞皺縮和神經(jīng)元深染，而L-NBP(10mg/kg)治療后能明顯改善低灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。文獻(xiàn)報(bào)道雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎可以誘導(dǎo)腦膠質(zhì)細(xì)胞活化，并伴有白質(zhì)稀薄。白質(zhì)稀薄按其嚴(yán)重程度一般分為4級(jí)0級(jí)，正常；1級(jí)，神經(jīng)纖維錯(cuò)排；2級(jí)，明顯空泡形成；3級(jí)，有髓鞘的纖維消失。在我們的實(shí)驗(yàn)中，模型組的視束較正常對(duì)照組顯示明顯的白質(zhì)稀薄，有大量的空泡出現(xiàn)，L-NBP(10mg/kg)長(zhǎng)期給藥后可顯著改善這種情況，視束的空泡明顯減少。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GFAP-陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常對(duì)照組海馬，尾核，胼胝體等部位很少檢測(cè)到，但雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎4周后，許多GFAP-陽性反應(yīng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)。經(jīng)L-NBP(10mg/kg)治療后，GFAP-陽性的膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少(見圖3，4)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論由結(jié)果可得出以下結(jié)論L-NBP10mg/kg組能明顯改善2-VO動(dòng)物近記憶和空間位置的記憶障礙，而消旋丁基苯酞和右旋丁基苯酞對(duì)改善記憶功能障礙均無效。本研究在2-VO后笫10天開始給藥(一直給藥至第35天)，目的在于觀測(cè)藥物對(duì)腦低灌引起的神經(jīng)元退行變的治療作用，以排除對(duì)急性低灌缺血期的影響。
L-NBP對(duì)ChAT活性有提高作用，說明能使膽堿能神經(jīng)ACh水平增加，有利于改善記憶功能。此外L-NBP能明顯抑制氧化損傷，說明L-NBP能降低神經(jīng)細(xì)胞的損傷。由2-VO引起的腦低灌的病理特征為白質(zhì)稀疏，空泡和膠質(zhì)細(xì)胞增多(Narri.et al.Chronic cerebralhypoperfusion-induced neuropathological changes in rats.Jpn.J.Psychopharmacol.1998；18181-188)，而L-NBP均能改善這些病理改變。以上這些作用機(jī)制對(duì)L-NBP改善2-VO大鼠引起的記憶障礙提供了依據(jù)。根據(jù)以上結(jié)果，提示L-NBP對(duì)血管性癡呆有明顯治療和預(yù)防作用的可能。
實(shí)施例2左旋正丁基苯酞能明顯改善β-淀粉樣肽(1-40)引起的老年性癡呆癥狀材料和方法試劑和藥品L-NBP由本所合成室提供，用植物油配制。Aβ(1-40)購(gòu)自Sigma公司。Alzet腦微滲透泵灌流裝置購(gòu)自美國(guó)DURECT公司。儀器Morris水迷宮自動(dòng)監(jiān)控儀及實(shí)驗(yàn)方法，參見以上腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑿坌訵istar大鼠，10周齡，體重280克左右，每籠放置1只動(dòng)物，室溫保持在23℃，自由進(jìn)食和引水。大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，腹臥位固定于立體定位儀上，剪開頭部的皮膚，將用于灌流Aβ(1-40)的套管植入右側(cè)腦室，根據(jù)Paxions和Watson的大鼠腦立體定位圖譜，植入部位在前囟后0.3mm，右1.1mm，深4.0mm。套管與一個(gè)微量滲透泵相連接。微量滲透泵置于大鼠的背部。Aβ(1-40)溶于35％乙腈/0.1三氟乙酸，以300pmol/天持續(xù)腦室灌流(i.c.v)，對(duì)照組僅灌流溶劑35％乙腈/0.1％三氟乙酸。既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)在此流速下，溶劑不會(huì)引起大鼠行為和神經(jīng)化學(xué)的改變。
實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。1)假手術(shù)組大鼠腦室僅灌流35％乙腈/0.1三氟乙酸+溶劑；2)模型組Aβ(1-40)+溶劑；3)Aβ(1-40)+L-NBP10mg/kg組；4)Aβ(1-40)+L-NBP30mg/kg組。從手術(shù)后第2天開始灌服藥物和溶劑。水迷宮訓(xùn)練試驗(yàn)在術(shù)后第9-13天進(jìn)行，第13天進(jìn)行平臺(tái)探索試驗(yàn)，第14-16天進(jìn)行工作記憶測(cè)驗(yàn)。動(dòng)物在第17天處死，斷頭取腦進(jìn)行生化測(cè)定。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，均在實(shí)驗(yàn)前40分鐘給藥。(見圖8)水迷宮實(shí)驗(yàn)自icv Aβ(1-40)后第9-13天進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練試驗(yàn)，第13天進(jìn)行平臺(tái)探索試驗(yàn)。在icv Aβ(1-40)后第14-16天進(jìn)行工作記憶測(cè)驗(yàn)(見上圖)，該測(cè)驗(yàn)是在訓(xùn)練試驗(yàn)和平臺(tái)探索試驗(yàn)后動(dòng)物已獲得一定的記憶基礎(chǔ)上，觀察改變平臺(tái)和象限后動(dòng)物的快速學(xué)習(xí)空間記憶能力。除了平臺(tái)每天改變位置，實(shí)驗(yàn)過程與標(biāo)準(zhǔn)的水迷宮訓(xùn)練試驗(yàn)相似。每天5次實(shí)驗(yàn)，大鼠分別從5個(gè)入水點(diǎn)開始進(jìn)行游泳。每天的第一次實(shí)驗(yàn)稱為示范試驗(yàn)，大鼠被允許游到處于新位置的平臺(tái)上，并停留10秒鐘，其后的四次試驗(yàn)，平臺(tái)位置保持不變，只是入水點(diǎn)的象限不同。工作記憶能力的潛伏期取第2到第5次試驗(yàn)的平均值，每只大鼠的工作記憶能力通過3天的實(shí)驗(yàn)平均值進(jìn)行計(jì)算。
生化實(shí)驗(yàn)丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的測(cè)定同以上實(shí)驗(yàn)。
統(tǒng)計(jì)分析所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá)。水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組的潛伏期差異比較采用重復(fù)測(cè)定的兩因素方差分析。組間差異采用post hocLSD或Turkey檢驗(yàn)。水迷宮平臺(tái)探索試驗(yàn)，工作記憶測(cè)驗(yàn)，生化測(cè)定采用單因素方差分析。P＜0.05為有顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果L-NBP對(duì)大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶的影響在第一天訓(xùn)練中，各組間沒有顯著性差異。經(jīng)過5天的訓(xùn)練，假手術(shù)組的搜索策略從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期(13.02±2.77秒)明顯縮短。而模型組的搜索策略沒有明顯的轉(zhuǎn)變，仍為邊緣式和隨機(jī)式，潛伏期(30.18±4.81秒)未明顯縮短，兩組相比差異顯著(P＜0.01)。經(jīng)L-NBP治療后，大鼠在水迷宮試驗(yàn)中的潛伏期明顯縮短，其中L-NBP10mg/kg組和30mg/kg組的搜索策略從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期分別為27.28±6.42秒和25.88±5.51秒，與模型組比較有明顯差異(P＜0.05兩因素方差分析)，而與假手術(shù)組比較無顯著差異，說明經(jīng)L-NBP治療的大鼠已接近正常水平，見圖4。在工作記憶測(cè)驗(yàn)中，第一次實(shí)驗(yàn)和第2-5次實(shí)驗(yàn)的潛伏期見圖5A，B。雖然在第一次示范實(shí)驗(yàn)中，各組的潛伏期沒有顯著性差異，但在以后4次實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組的潛伏期為9.15±0.91秒，模型組的潛伏期為14.05±1.88秒，后者潛伏期明顯延長(zhǎng)，二者有顯著性差異(P＜0.01)。L-NBP組可以劑量依賴性的顯著改善工作記憶能力(P＜0.01)。L-NBP增加GSH-Px活性和降低MDA的含量GSH-Px是重要的抗氧化酶，在我們的實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組皮層組織中GSH-PX的活性為15.86±0.91(U/mg protein)；海馬組織中的活性為16.19±1.19(U/mg protein)。大鼠Aβ(1-40)持續(xù)灌流后，GSH-Px的活性與假手術(shù)組相比在皮層和海馬分別降低了29.5％和42.4％，具有顯著性差異(P＜0.01和P＜0.001)。經(jīng)L-NBP治療后，30mg/kg組對(duì)該酶活性明顯升高(P＜0.01)，L-NBP(10mg/kg)也有升高該酶的活性作用，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志，反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。在此實(shí)驗(yàn)中，大鼠Aβ(1-40)持續(xù)灌流后皮層和海馬MDA的含量分別升高了25.7％和23.6％，與假手術(shù)組相比具有顯著性差異(P＜0.05和P＜0.01)。經(jīng)L-NBP治療后，皮層和海馬MDA的含量明顯降低，10mg/kg組分別降低了28.4％和24.3％(P＜0.05和P＜0.01)，30mg/kg的作用弱于10mg/kg組，但與Aβ(1-40)模型組相比，仍具有顯著性差異(P＜0.05)，見表2。
表2.L-NBP對(duì)大鼠持續(xù)灌流Aβ(1-40)后皮層和海馬SOD活性和MDA含量的影響(n＝7)組 GSH-PX MDA(U/mg protein) (nmol/mg protein)皮層 海馬 皮層 海馬假手術(shù)組 15.86±0.91 16.19±1.191.10±0.09 1.13±0.06模型組 11.18±1.32##9.32±1.01###1.48±0.14#1.48±0.12##Aβ(1-40)L-NBP 11.73±0.53 12.73±1.341.06±0.05*1.12±0.07**(10mg/kg)L-NBP 15.40±1.03**18.91±1.16**1.06±0.10*1.15±0.07*(30mg/kg)#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001與假手術(shù)組比較；*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較。
實(shí)驗(yàn)討論大鼠持續(xù)側(cè)腦室灌流Aβ(1-40)引起的記憶障礙是公認(rèn)的觀測(cè)藥物對(duì)AD治療作用的模型。由以上結(jié)果可見，L-NBP不僅對(duì)2-VO導(dǎo)致供血不足引起血管性癡呆的模型有明顯作用，而且對(duì)大鼠持續(xù)側(cè)腦室灌流Aβ(1-40)引起的近記憶和空間位置的記憶障礙也有明顯改善作用。這說明L-NBP對(duì)不同原因引起的近記憶和空間位置記憶障礙均有明顯改善作用。此外，L-NBP有阻斷氧化損傷的作用(提高GSH-Px活性和降低MDA含量)，結(jié)合其明顯的腦保護(hù)作用，提示L-NBP有治療和預(yù)防老年性癡呆的作用。
權(quán)利要求
1.如通式(I)所示左旋正丁基苯酞的在制備預(yù)防或治療癡呆的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的癡呆是阿爾茨海默病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的癡呆是血管性癡呆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于該化合物的有效治療劑量為0.1～100mg/kg/天。
5.一種藥物組合物，其特征在于，含有治療有效劑量的如通式(I)所示左旋正丁基苯酞及藥用載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了如通式(I)所示左旋正丁基苯酞制備預(yù)防和治療癡呆，尤其是阿爾茨海默病、血管性癡呆的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K31/34GK1565441SQ0313745
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月20日
發(fā)明者馮亦璞, 王曉良, 彭英, 楊靖華 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所, 中奇制藥技術(shù)(石家莊)有限公司