專利名稱：用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物藥物，具體地說是用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在人們交往日益頻繁，細(xì)菌、病毒等引起的疾病也乘機(jī)活動(dòng)，尤其人們免疫功能低下時(shí)，易受侵犯而致病，影響了身體健康，特別是兒童及老年人由于免疫功能較為軟弱更易受致病菌的侵害。
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病之一，目前，它已成為人類的最大殺手；從現(xiàn)階段的治療手段來看，主要有化療和放療兩種方法，其中的化療藥物對(duì)正常細(xì)胞有較大的毒副作用，嚴(yán)重影響機(jī)體地免疫功能。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)理的研究，人們認(rèn)識(shí)到潛在的腫瘤細(xì)胞在正常機(jī)體內(nèi)是經(jīng)常產(chǎn)生的，由于這些潛在的腫瘤細(xì)胞不斷被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別并殺滅，因此大多數(shù)動(dòng)物和人體不會(huì)表現(xiàn)出腫瘤，而當(dāng)機(jī)體的這一功能不足時(shí)，就會(huì)發(fā)展成為腫瘤；因此提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，就越來越受到重視并發(fā)展成為腫瘤的預(yù)防和治療手段，即腫瘤的殺傷作用，通過各種免疫調(diào)節(jié)劑來激活機(jī)體免疫系統(tǒng)以殺滅腫瘤細(xì)胞，現(xiàn)在已越來越受到人們的重視；從目前提高機(jī)體免疫功能的制劑來看，屬于生物口服制劑且藥效顯著的制劑還比較少，經(jīng)常使用的為一些中藥品種，如云芝多糖，香菇多糖等；生物制品多為一些注射劑如升白能、ok-432等，使用起來極為不便。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服目前口服生物制劑品種的缺乏，本發(fā)明的目的在于提供一種服用方便的用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的提高機(jī)體免疫功能口服制劑是以金黃色葡萄球菌濾液制劑為主要原料，其中含有(腸毒素)SEA、SEB、SEC、SED及TSST-1作為提高機(jī)體免疫功能的活性成份，濾液中腸毒素的含量為5～10ng/ml；所述的金黃色葡萄球菌的濾液主要是從金黃色葡萄球菌發(fā)酵液中分離制得；其中所述濾液通過如下步驟制得金黃色葡萄球菌發(fā)酵液(腸毒素的含量約為5～30μg/ml)經(jīng)濃縮，用陽離子柱層析分離，用5～400mmol/L的PB緩沖液梯度洗脫，收集28000～33000D分子量段，調(diào)配，滅菌，即可得到；其中還可以加入適量的藥物輔料，經(jīng)常采用的藥物輔料為甜菊糖、阿斯巴甜等；所需產(chǎn)品的具體制備過程為首先培養(yǎng)金黃色葡萄球菌于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(例如豬心培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)液)中進(jìn)行培養(yǎng)，然后分離純化出含有SEA、SEB、SEC、SED及TSST-1的培養(yǎng)液；所述的培養(yǎng)液為L(zhǎng)B培養(yǎng)液，其PH值為6.5～7.5。
口服金黃色葡萄球菌濾液制劑可升高人體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量，也可提高人體內(nèi)白小板數(shù)量，其進(jìn)一步可用于作為提高人體內(nèi)白小板數(shù)量的制劑。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.療效確切。本發(fā)明產(chǎn)品為一種從金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液中提取的一類物質(zhì)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)口服給藥后，能顯著提高小鼠免疫細(xì)胞的活性和小鼠的淋轉(zhuǎn)率，可顯著提高機(jī)體的免疫功能。
2.克服了目前口服生物制劑過少不足，毒副作用小。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例所采用的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)已經(jīng)保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO.0165(詳見中國(guó)專利91106067.7)。
菌株情況從一病人的尿中分離得到的菌株。
菌株CGMCC NO.0165的特征1.形態(tài)特征為典型的球體，直徑0.2～1.2μm，各個(gè)菌體的大小排列也較整齊，細(xì)菌繁殖時(shí)呈多平面不規(guī)則分裂，堆積成葡萄串狀排列，無鞭毛，不形成夾膜，不產(chǎn)生芽孢。
2.培養(yǎng)特征為厭氧菌，在普通LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，最適PH76.2～7.4，最適培養(yǎng)增值溫度為37℃，耐鹽性強(qiáng)，普通瓊脂培養(yǎng)18～24小時(shí)，形成凸起、光滑、不透明、金黃色、邊緣整齊的菌落。
3.染色特征革蘭氏陽性染色。
4.生理生化特征能分解葡萄糖、產(chǎn)酸，表達(dá)金黃色葡萄球菌腸毒素。
實(shí)施例1接0165菌種于1ml的LB斜面上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到含100ml的LB培養(yǎng)液的三角瓶中，于恒溫?fù)u床30℃培養(yǎng)8小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按5％(按體積百分含量計(jì))接種量，接種于發(fā)酵罐中，再于35℃培養(yǎng)20小時(shí)，離心除去菌體后所得到發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，得到的樣品經(jīng)離子層析柱(本實(shí)施例中采用羧甲基纖維素)純化；分別用5mmol/L PB緩沖液(PH5.5)、20mmol/L PB緩沖液(PH6.8)分別洗脫，收集所需組分，調(diào)配，加入阿斯巴甜，滅菌，分裝即得。
實(shí)施例2接0165菌種于1ml的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)后，轉(zhuǎn)接到含30ml的LB培養(yǎng)液的三角瓶中，于恒溫?fù)u床30℃培養(yǎng)8小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按5％(按體積百分含量計(jì))接種量，接種于發(fā)效罐中，再于30℃培養(yǎng)20小時(shí)；離心除去菌體后所得到濾液進(jìn)行透析、濃縮，得到的樣品經(jīng)離子層析柱(本實(shí)施例中采用羧甲基纖維素)純化；分別用8mmol/L PB緩沖液(PH5.0)、10mmol/L PB緩沖液(PH6.8)、45mmol/L PB緩沖液(PH6.5)分步洗脫，收集所需組分，調(diào)配，加入阿斯巴甜，滅菌，分裝即得。
實(shí)驗(yàn)例本實(shí)驗(yàn)采用Laca小鼠，雄性，體重18～20g，實(shí)驗(yàn)組先全部采用環(huán)磷酰胺——處理，然后給以高(360ng/Kg)、中(180ng/Kg)、低(90ng/Kg)劑量(本發(fā)明藥劑)，和給以云芝多糖，采用灌胃給藥，每天一次，每次給藥體積為0.5ml/20g，連續(xù)給藥10天，停藥后24小時(shí)處死動(dòng)物并進(jìn)行各項(xiàng)檢查，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1。
表1.各組小鼠脾臟重量和指數(shù)變化比較n＝10

表2.各組實(shí)驗(yàn)小鼠HC50(半數(shù)溶血值)反應(yīng)的變化比較n＝10

表3.本品對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性和ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增值能力影響n＝12

與環(huán)磷酰胺組比較aP＜0.01；bP＜0.05。
表4.口服本品對(duì)小鼠IL-2和TNF含量的影響n＝10


與環(huán)磷酰胺組比較aP＜0.01。
從表1～4可知，金黃色葡萄球菌濾液經(jīng)口服給藥后，可顯著提高機(jī)體的免疫功能。
1992年4月至1993年10月，沈陽市抗癌協(xié)會(huì)腫瘤康復(fù)醫(yī)院、深圳邊檢中醫(yī)腫瘤康復(fù)中心等單位應(yīng)用金黃色葡萄球菌濾液對(duì)125例各種不同類型的病人進(jìn)行了臨床觀察，總結(jié)如下本實(shí)驗(yàn)組共125例，男性58例，女性67例，11～79歲，平均年齡為57.96歲；一般疾病胃潰瘍18例，結(jié)腸炎2例，腎炎1例，神經(jīng)衰弱6例，脾亢2例，粒細(xì)胞減少癥7例苯中毒2例，支氣管炎2例，貧血4例；腫瘤食道癌16例，胃癌28例，肝癌1例，結(jié)腸癌16例，乳腺癌4例，肺癌10例，宮頸癌2例，腦膜瘤2例，慢粒2例；每日早晚各服一支，30天為一療程，一般疾病1個(gè)療程，腫瘤患者3個(gè)療程；結(jié)果如表5所示。
表5.療效觀察指標(biāo)和結(jié)果

自覺癥狀如疼痛、失眠、食欲不振等均有明顯改善；腫瘤病人KAPNOFSKY健康狀況，總評(píng)分從45分增加到60分；無任何毒副反應(yīng)。
可升高人體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量服藥前白細(xì)胞的數(shù)量為4.2±0.49(*109)個(gè)/L，服藥前白細(xì)胞的數(shù)量為6.5±1.32(*109)個(gè)/L。
權(quán)利要求
1.用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑，其特征在于以腸毒素SEA、SEB、SEC、SED及TSST-1作為活性成份，經(jīng)口服給藥。
2.按照權(quán)利要求1所述用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑，其特征在于濾液中腸毒素的含量為5～10ng/ml。
3.按照權(quán)利要求1所述用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑，其特征在于其中所述濾液通過如下步驟制得金黃色葡萄球菌發(fā)酵經(jīng)濃縮，用陽離子柱層析分離，用5～400mmol/L的PB緩沖液梯度洗脫，收集28000～33000D分子量段，調(diào)配，滅菌，即可得到。
4.按照權(quán)利要求1所述用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑，其特征在于金黃色葡萄球菌濾液是從金黃色葡萄球菌CGMCCNO.0165發(fā)酵液中分離得到。
5.按照權(quán)利要求1所述用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑，其特征在于所述用于提高機(jī)體免疫功能是指用于升高人體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量。
6.口服金黃色葡萄球菌濾液在提高人體內(nèi)白小板數(shù)量制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物藥物，具體地說是用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑，其以腸毒素SEA、SEB、SEC、SED及TSST－1作為活性成份，經(jīng)口服給藥；濾液中腸毒素的含量為5～10ng/ml?？诜瘘S色葡萄球菌濾液制劑可升高人體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量，也可提高人體內(nèi)白小板數(shù)量；本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)療效確切；克服了目前口服生物制劑過少不足，毒副作用小。
文檔編號(hào)A61P37/04GK1509725SQ0215692
公開日2004年7月7日 申請(qǐng)日期2002年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月24日
發(fā)明者陳巨余 申請(qǐng)人:沈陽協(xié)合集團(tuán)有限公司