專利名稱:海嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的實驗研究的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明為抗癌新藥的實驗方法研究,從分子水平探討了海嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。
細胞凋亡是一個非常復(fù)雜的生理和病理過程,是細胞主動參與的細胞死亡形式之一。近年來研究表明,許多抗腫瘤藥物均可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,并且抗腫瘤作用強弱平行于它們誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的活性。細胞凋亡現(xiàn)象為腫瘤的藥物研究和治療提供了一個新方向。這一研究結(jié)果,不僅為新型抗癌制劑海嘧啶的研制提供了較為堅實系統(tǒng)的實驗基礎(chǔ),而且為祖國醫(yī)藥資源的進一步開發(fā)與利用開辟了新的途徑。
本發(fā)明的目的,在于從整體、細胞、分子以及基因水平觀察和研究海嘧啶對腫瘤細胞凋亡的影響,旨在為海嘧啶抗腫瘤作用提供新的實驗依據(jù),找出藥理學(xué)特點,并深入地闡明其作用機制。
本發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容是,海嘧啶的藥物組成是,海藻、昆布、半夏、郁金、黃芪、苦參、5-氟脲嘧啶(5-Fu),制成水針注射劑海嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的實驗研究如下(一)腫瘤細胞的培養(yǎng)及藥物處理采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基對人胃癌BGC-823細胞進行培養(yǎng),細胞密度至70%時,更換培養(yǎng)基加藥,同時設(shè)中藥復(fù)方對照組、陽性藥對照組、生理鹽水對照組、普通對照組。
(二)海嘧啶處理后HL-60細胞凋亡的PI和Hoechst 33342雙熒光染色顯示HL-60細胞核,將DNA熒光染料Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)用PBS配成2mmol/L母液,以10μmol/L終濃度染色15分鐘(37℃)無血清培養(yǎng)液洗3次,重新懸浮于含血清培養(yǎng)液中,滴片后紫外光激發(fā)觀察細胞核DNA熒光。
(三)流式細胞儀測定凋亡腫瘤細胞收集不同藥物濃度處理后的BGC-823細胞和HL-60細胞,用PBS洗滌2次,離心,以70%乙醇(PBS配制)固定24小時(4℃)。加入100μl PBS,再加入RNAase(50μg/ml)37℃反應(yīng)1小時。PI(65μg/ml)4℃染色1小時,避光操作。在FACS420流式細胞儀上進行細胞期分析,低于G1期DNA含量的細胞為凋亡細胞。
(四)HL-60細胞、BGC-823細胞DNA提取及凝膠電泳實驗?zāi)[瘤細胞總DNA提取采用Blin和Stafford的方法進行。收集細胞約5×106細胞,5-10倍PBS重新懸浮,再次離心,重新懸浮,每毫升細胞懸浮液加入10ml抽提緩沖液、37℃培養(yǎng)1小時。加入蛋白酶K使終濃度為150μg/ml,懸浮于50℃水浴中3小時,放冷后加入等體積的飽和酚,充分混勻,5000g離心(20℃),使兩相分開,重復(fù)抽提兩次(抽提液10mmol/L、Tris.Cl(pH8.0)、0.1mol/L EDTA(pH8.0)、20μg/ml胰RNAase、0.5%SDS)將全部水相移至另一離心管中,加入0.2倍體積的10M乙酸銨和2倍體積的無水乙醇,充分混勻,放置20分鐘(-20℃)。10000rpm離心收集之。70%乙醇洗滌沉淀2次,空氣涼干,沉淀加入1mlTE在搖床上緩慢搖動過夜直至全部溶解。測定DNA樣品在260nm、280nm處光吸收。(A260/A280>1.8)本發(fā)明的技術(shù)效果在于,利用了分子手段詳細研究了海嘧啶對腫瘤細胞凋亡的影響。實驗結(jié)果表明海嘧啶對腫瘤細胞惡性增殖細胞周期進程的抑制作用,海嘧啶具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用。
實現(xiàn)本發(fā)明的實施例如下所述海藻30g、昆布30g、郁金20g、黃芪20g、苦參15g、5-Fu 0.25g,水針劑,10ml/支,制成海嘧啶注射劑,分別做以下實驗,海嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的實驗研究,來研究海嘧啶是否對腫瘤細胞的凋亡具有誘導(dǎo)作用。
權(quán)利要求
1.海嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的實驗研究其特征是,通過流式細胞儀測定凋亡腫瘤細胞來研究海嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的實驗研究。
2.海嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的實驗研究其特征是,通過HL-60細胞、BGC-823細胞DNA提取及凝膠電泳實驗來研究海嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的實驗研究。
全文摘要
本發(fā)明為抗癌新藥的實驗方法研究,通過流式細胞儀測定凋亡腫瘤細胞,通過HL-60細胞、BGC-823細胞DNA提取及凝膠電泳實驗,觀察和研究海嘧啶對腫瘤細胞凋亡的影響。實驗結(jié)果表明海嘧啶抑制腫瘤細胞的作用機制是在于通過阻斷細胞周期的進程抑制腫瘤細胞的惡性增殖,同時激發(fā)了腫瘤細胞的凋亡。海嘧啶對腫瘤細胞具有廣泛的影響,通過對腫瘤細胞的誘導(dǎo)分化作用,對腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)作用發(fā)揮良好的抗腫瘤效果。
文檔編號A61P35/00GK1504749SQ0215306
公開日2004年6月16日 申請日期2002年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月2日
發(fā)明者季宇彬 申請人:季宇彬