專利名稱：小檗堿的體內(nèi)抗腫瘤作用的新用途的制作方法
專利說(shuō)明小檗堿的體內(nèi)抗腫瘤作用的新用途 本發(fā)明涉及一種小檗堿的體內(nèi)抗腫瘤作用的新用途。中藥黃連來(lái)源于毛莨科植物黃連Coptis chinensis、三角葉黃連Coptis deltoidea或云連Coptis teeta的干燥根莖，其味苦寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。小檗堿(又稱黃連素，小蘗堿，Berberine，簡(jiǎn)稱Ber)是其主要有效成分，同時(shí)它也是黃柏，三顆針等植物干燥根莖的主要成分。鹽酸小檗堿的分子式為C20H18ClNO4·2H2O。分子量407.85。其純品為黃色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，味極苦。在熱水中溶解，在水或乙醇中微溶。小檗堿(單體)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 小檗堿是一種高效低毒的常用的廣譜抗菌藥物，主要應(yīng)用于菌痢，胃腸炎，癰腫等細(xì)菌性感染，也可用于呼吸道，五官科，外科局部感染的治療。現(xiàn)在還廣泛應(yīng)用于消化性潰瘍，心率失常，糖尿病，抗血小板聚集，高血壓，氨硫脲副反應(yīng)，頑固性菌痢，宮頸糜爛等疾病的治療。特別是在心血管系統(tǒng)方面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均已證實(shí)，Ber具有正性肌力作用和負(fù)性頻率作用，對(duì)心肌缺血及心肌梗塞具有保護(hù)作用，并能降低動(dòng)脈血壓，增加冠脈流量，對(duì)心肌Ca2+內(nèi)流有雙向調(diào)節(jié)作用。同時(shí)Ber具有抗自由基作用。此外，己注意到Ber對(duì)腦缺血的保護(hù)作用以及抗糖尿病作用。近年來(lái)，小檗堿體外抗腫瘤作用亦日漸受到重視。
以往研究表明，Ber能抑制培養(yǎng)細(xì)胞的氧攝取能力，抑制細(xì)胞呼吸鏈中的黃酶，而癌組織中的黃酶含量較低，因此比正常細(xì)胞對(duì)小檗堿更為敏感；抑制癌細(xì)胞對(duì)羧胺的利用，從而抑制嘌呤及核酸的合成。國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道了小檗堿對(duì)艾氏腹水瘤和淋巴瘤NT/LY細(xì)胞均有一定的抑制作用，其中主要通過(guò)抑制腹水瘤細(xì)胞呼吸以及抑制細(xì)胞嘌呤和核酸的生物合成而發(fā)揮作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)小檗堿抗腫瘤作用的研究主要是體外實(shí)驗(yàn)，研究的細(xì)胞株有K562細(xì)胞、HL-60(人急性早幼粒細(xì)胞白血病APL細(xì)胞)和CCRF-CEM(淋巴母細(xì)胞樣白血病)細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞株(低分化粘液腺癌MGC-803，胃腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移SGC-7901)、鼻咽癌上皮樣細(xì)胞株HNE3細(xì)胞、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和大鼠9L腦腫瘤細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、結(jié)腸癌、乳腺癌細(xì)胞、人食管癌細(xì)胞(ECCs)，顯示了小檗堿在體外有著明顯的抗增殖活性。
盡管人們對(duì)小檗堿的體外抗腫瘤作用研究較多，但是有關(guān)小檗堿的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)在國(guó)內(nèi)外的報(bào)導(dǎo)均極少。檢索1966年到2002年共36年間的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，只有4篇報(bào)道與小檗堿的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)有關(guān)。在這4篇文章中真正涉及小鼠體內(nèi)抑瘤作用的僅有1篇文章，實(shí)驗(yàn)只在1個(gè)瘤株、1次實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，結(jié)論認(rèn)為口服小檗堿難以達(dá)到有效抑制腫瘤的作用。其他3篇文章均不是實(shí)際意義上的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，因此到現(xiàn)在為止，對(duì)于小檗堿的體內(nèi)抑瘤作用還沒(méi)有一個(gè)明確的定論。本發(fā)明提供一種小檗堿用于體內(nèi)抗腫瘤作用的應(yīng)用，口服小檗堿可達(dá)有效抑瘤濃度，較好地抑制S180肉瘤在昆明小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，并抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞及人結(jié)腸癌細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。

圖1為Ber對(duì)人鼻咽癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線的影響圖。
圖2為Ber對(duì)人鼻咽癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用圖。
圖3為Ber對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用圖。
圖4為Ber對(duì)人結(jié)腸瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線的影響圖。下列實(shí)驗(yàn)研究了小檗堿對(duì)小鼠S180肉瘤、人鼻咽癌裸鼠移植瘤和人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用。藥品為鹽酸小檗堿片。1.Ber對(duì)昆明小鼠S180肉瘤的抑瘤實(shí)驗(yàn)抽取小鼠腹腔接種6-8天的S180肉瘤腹水型細(xì)胞懸液，生理鹽水稀釋成1×106細(xì)胞懸液，作右腋下注射，0.2mL/只。24h后進(jìn)行隨機(jī)分組，設(shè)陰性對(duì)照組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(CTX，5mg/kg)、Ber低劑量組(10mg/kg)、Ber中劑量組(30mg/kg)和Ber高劑量組(50mg/kg)。每組10只小鼠，每天灌胃給藥1次，連續(xù)用藥10天。停藥后24h殺鼠取腫瘤稱重。用公式(1)計(jì)算抑瘤率。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)處理，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。 式中T為給藥組平均瘤重，C為對(duì)照組平均瘤重。
結(jié)果第一次實(shí)驗(yàn)Ber在劑量為10mg/kg和30mg/kg時(shí)對(duì)小鼠S180肉瘤均有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為31.9％(P＜0.05)和42.2％(P＜0.01)。用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠體重沒(méi)有明顯差異，未見(jiàn)小鼠外觀、活動(dòng)狀態(tài)等方面的異常。
第二次實(shí)驗(yàn)Ber在劑量為10mg/kg、30mg/kg和50mg/kg時(shí)對(duì)小鼠S180肉瘤均有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為36.4％、46.9％和54.5％，P值均＜0.01。CTX陽(yáng)性對(duì)照組(5mg/kg)的抑瘤率為63.6％，P值＜0.01。用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠體重沒(méi)有明顯差異，未見(jiàn)小鼠外觀、活動(dòng)狀態(tài)等方面的異常。
第三次實(shí)驗(yàn)Ber在劑量為10mg/kg、30mg/kg和50mg/kg時(shí)對(duì)小鼠S180肉瘤均有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為31.7％、43.3％和48.3％，P值均＜0.01。CTX組(5mg/kg)的抑瘤率為65.0％，P值＜0.01。用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠體重沒(méi)有明顯差異，未見(jiàn)小鼠外觀、活動(dòng)狀態(tài)等方面的異常。結(jié)果見(jiàn)表1。2.Ber對(duì)人鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤的抑瘤實(shí)驗(yàn)選擇腫瘤生長(zhǎng)旺盛且無(wú)潰破、健康情況良好的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，固定于手術(shù)板上，用酒精消毒動(dòng)物皮膚，無(wú)菌條件下在超凈臺(tái)上剝離腫瘤組織，所用器械全部經(jīng)高壓消毒。腫瘤組織用加了雙抗的平衡鹽溶液沖洗，剪去其中壞死的部分，再將其剪成直徑0.2cm左右的小塊，接種到裸鼠右側(cè)背部皮下。一周后根據(jù)腫瘤體積將其隨機(jī)分組，設(shè)陰性對(duì)照組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(CTX，10mg/kg)、Ber低劑量組(10mg/kg)、Ber中劑量組(30mg/kg)和Ber高劑量組(50mg/kg)。24h后開(kāi)始用藥。每天灌胃給藥1次，連續(xù)用藥10天。每3天用游標(biāo)尺測(cè)量腫瘤大小及稱體重，按公式(2)計(jì)算腫瘤體積，繪制生長(zhǎng)曲線。腫瘤接種后，第30天處死小鼠，取其腫瘤組織，用公式(3)計(jì)算腫瘤體積抑制率。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)處理，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。 式中a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為腫瘤短徑。 式中T為給藥組腫瘤平均體積，C為對(duì)照組腫瘤平均體積。
結(jié)果Ber在劑量為10mg/kg、30mg/kg和50mg/kg時(shí)對(duì)人鼻咽癌裸鼠移植瘤均有明顯的抑制作用，腫瘤體積抑制率分別為50.3％、58.8％和53.3％，P值均＜0.01。CTX組(10mg/kg)的腫瘤體積抑制率為65.8％，P值＜0.01。用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠體重沒(méi)有明顯差異，未見(jiàn)小鼠外觀、活動(dòng)狀態(tài)等方面的異常。見(jiàn)表2，圖1和圖2。3.Ber對(duì)人結(jié)腸癌LoVo裸鼠移植瘤的抑瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤接種步驟同2。因LoVo生長(zhǎng)較快，接種4天后根據(jù)腫瘤體積將其隨機(jī)分組，設(shè)陰性對(duì)照組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(CTX，10mg/kg)、Ber低劑量組(10mg/kg)、Ber中劑量組(30mg/kg)和Ber高劑量組(50mg/kg)。24h后開(kāi)始用藥。每天灌胃給藥1次，連續(xù)用藥10天。每2天用游標(biāo)尺測(cè)量腫瘤大小及稱體重，按公式(2)計(jì)算腫瘤體積，繪制生長(zhǎng)曲線。腫瘤接種后，第16天處死小鼠，取其腫瘤組織，用公式(3)計(jì)算腫瘤體積抑制率。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)處理，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。
結(jié)果Ber在劑量為30mg/kg和50mg/kg時(shí)對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤均有明顯的抑制作用，腫瘤體積抑制率分別為33.1％(P＜0.05)和45.4％(P＜0.01)。Ber在劑量為10mg/kg時(shí)的腫瘤體積抑制率為29.2％(P＞0.05)。CTX組(10mg/kg)的腫瘤體積抑制率為32.3％(P＜0.05)。用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠體重沒(méi)有明顯差異，未見(jiàn)小鼠外觀、活動(dòng)狀態(tài)等方面的異常。見(jiàn)表3，圖3和圖4。
根據(jù)抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則，我們可以認(rèn)為小檗堿具有明確的體內(nèi)抑瘤作用，口服可以達(dá)到有效抑瘤的血藥濃度。
小檗堿作為一種抗菌藥應(yīng)用為時(shí)已久，其治療量相當(dāng)安全。一次口服2.0g對(duì)人未見(jiàn)任何副作用，長(zhǎng)期服用亦無(wú)明顯毒性。在小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)中，灌胃的LD50為329mg/kg?，F(xiàn)在小檗堿應(yīng)用于治療心血管疾病的臨床用量是0.3-0.5g/次，每天3-4次。而在本實(shí)驗(yàn)中，在小鼠中的最高劑量(50mg/kg)折算到人體的用量是0.388g/次，低于現(xiàn)有的臨床用量，可以安全使用。
小檗堿作為臨床常用藥物，理化特性清楚、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、使用安全。我們的工作首次證明小檗堿口服可達(dá)有效抑瘤濃度，較好地抑制S180肉瘤在昆明小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，并抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞及人結(jié)腸癌細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。
下面為本發(fā)明相關(guān)實(shí)驗(yàn)之圖表表1Ber對(duì)昆明小鼠S180肉瘤的體內(nèi)抗腫瘤作用劑量 小鼠數(shù)量 體重變化 平均瘤重 抑瘤率組別P值(mg/kg) 開(kāi)始 結(jié)束(g) (x±s，g)(IR)％對(duì)照組 - 1010 +8.2 1.80±1.29 - -Ber用藥組 10 8 8 +11.41.23±0.6131.9 ＜0.0530 1010 +11.91.04±0.6342.2 ＜0.01*灌胃給藥，1次/1天×10天劑量小鼠數(shù)量 體重變化 平均瘤重抑瘤率組別 P值(mg/kg) 開(kāi)始 結(jié)束 (g) (x±s，g)(IR)％對(duì)照組 - 1010+7.81.43±0.27- -CTX組 5 1010+8.80.52±0.1163.6 ＜0.01Ber用藥組 101010+7.10.91±0.2236.4 ＜0.01301010+6.70.76±0.1946.9 ＜0.01501010+5.70.65±0.1854.5 ＜0.01*灌胃給藥，1次/1天×10天劑量小鼠數(shù)量 體重變化 平均瘤重 抑瘤率組別P值(mg/kg) 開(kāi)始 結(jié)束 (g) (x±s，g)(IR)％對(duì)照組- 1010+6.71.20±0.22 --CTX組 5 1010+5.70.42±0.2465.0 ＜0.01Ber用藥組 101010+5.30.82±0.1331.7 ＜0.01301010+2.00.68±0.1843.3 ＜0.01501010+4.10.62±0.1148.3 ＜0.01*灌胃給藥，1次/1天×10天表2 Ber對(duì)人鼻咽癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用劑量 小鼠數(shù)量 體重變化 平均瘤體積 抑瘤率組別 P值(mg/kg) 開(kāi)始 結(jié)束 (g) (x±s，cm3) ％對(duì)照組 - 1010+1.72.47±0.71- -CTX組 109 9 +1.30.85±0.2165.8＜0.01Ber用藥組 109 9 +0.81.23±0.3950.3＜0.01301010+1.41.02±0.2758.8＜0.01501010+1.11.16±0.2253.3＜0.01*灌胃給藥，1次/1天×10天表3 Ber對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用劑量小鼠數(shù)量 體重變化 平均瘤體積 抑瘤率組別P值(mg/kg) 開(kāi)始 結(jié)束 (g) (x±s，cm3) ％對(duì)照組 - 1010+6.66.11±1.92 - -CTX組 101010+4.34.14±0.9832.3 ＜0.05Ber用藥組 101010+5.14.33±2.4129.2 ＞0.05301010+4.04.09±1.7533.1 ＜0.05501010+3.03.34±1.3045.4 ＜0.01*灌胃給藥，1次/1天×10天
權(quán)利要求
1.一種小檗堿的體內(nèi)抗腫瘤作用的新用途，其特征為小檗堿用于體內(nèi)抗腫瘤作用的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種小檗堿的體內(nèi)抗腫瘤作用的新用途。其特征為小檗堿的體內(nèi)抗腫瘤作用的新用途?？诜￠迚A可達(dá)有效抑瘤濃度，較好地抑制S180肉瘤在昆明小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，并抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞及人結(jié)腸癌細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1421203SQ0213469
公開(kāi)日2003年6月4日 申請(qǐng)日期2002年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月7日
發(fā)明者冼勵(lì)堅(jiān), 蔡于琛 申請(qǐng)人:中山大學(xué)腫瘤防治中心