專利名稱：多肽－脂質體與人血管內皮生長因子基因重組質粒復合物及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體說是涉及一種非病毒載體介導的基因轉導系統(tǒng)，更具體地說是涉及一種多肽-脂質體與人血管內皮生長因子基因重組質粒復合物及用途。
血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前所知最明確能特異地促進血管生成的主要因子。其基因定位于6號染色體短臂，該家族有6個成員，分別為VEGF-A、B、C、D、E、和胎盤生長因子。其中，由于mRNA的不同剪接形式，VEGF-A又可產生不同的VEGF亞型，主要的有VEGF165、VEGF121、VEGF145、VEGF189、和VEGF206。在臨床試驗中，VEGF的血管生成作用最初應用于治療外周動脈狹窄導致的局部缺血性疾病(Isner，et al.)。早期實驗結果證實VEGF在促進血管生成方面有著明顯效果，包括病人疼痛緩解、局部缺血癥狀減輕、潰瘍愈合，一致病人的肢體得以保留。深入研究證實，這些臨床效應是VEGF促進新血管生成的結果。
基于這一早期臨床實驗的結果，人們開始了VEGF用于CAD治療的研究(Losordo，et al.)。目前，美國已有46項FDA和RAC批準的有關促進血管生成的臨床基因治療研究，研究用于治療各種形式的局部缺血癥狀，包括外周動脈狹窄導致的局部疾病和CAD。絕大多數(shù)臨床研究采用了VEGF和FGF基因導入的手段，其中兩項用VEGF基因導入治療CAD的臨床研究已進展到臨床II期研究(Berlex Lab和GenVec Inc.)。迄今的臨床研究報導均證實了VEGF基因導入治療的有效性，即能明顯改善局部缺血癥狀。例如，對30個CAD病人用脂質體包裹DNA(編碼VEGF165)導入進行臨床治療研究，結果有29個病人的心絞痛有明顯的減輕；對20個病人進行為期六個月的治療觀察，結果有12個病人的心絞痛全部消除。另10個病人在12個月觀察治療期，有7個病人的心絞痛全部消除(Symes，et al.)。其他的應用VEGF121和FGF4基因治療CAD的研究也報導了類似的臨床療效(Rosengart，et al.，Grimes and Vale，et al.)。在所有的臨床治療過程中沒有發(fā)現(xiàn)嚴重的副作用。因此用VEGF基因導入治療CAD是安全和有效的的。由于這些臨床結果展現(xiàn)出良好前景，吸引了更多的公司和大學參與進一步的臨床研究。
與癌癥的基因治療不同，促血管生成的基因治療大部分采用了非病毒基因導入方法(39％采用裸DNA，8％采用脂質體)。其原因之一是用于血管生成的基因(如VEGF和FGF基因)所表達的血管生成生長因子都是分泌性的蛋白質，正是基于其分泌性，只要能保證導入的基因可以表達足夠量的生長因子，在相對低的基因導入率下也可以達到有效的治療結果。另外一個原因是非病毒基因導入方法的相對安全性，使用非病毒基因導入方法也避免了由于人體對病毒抗體的存在或產生，而引起的基因導入效率降低的不利因素，從而可以采用多次給藥來達到臨床治療效果。
過去幾年大量的研究工作證實，與裸DNA相比，脂質體基因導入方法能提高局部基因導入率(Lasic，et al.)。隨著不同脂質體的開發(fā)和對脂質體DNA復合物的形成機制的研究，其基因導入率得到了進一步的提高(Templeton，et al.)。這其中包括有針對于特定細胞的脂質體，隱秘脂質體和多肽-脂質體的開發(fā)。盡管如此，距特異高效介導基因轉移這一目標仍有很大差距。
目前限制脂質體在基因治療領域更廣泛應用的一個主要原因是基因導入效率低和特異性差。多肽的開發(fā)，利用多肽的引導作用，則有可能大幅度提高基因導入的特異性和效率。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種多肽-脂質體與人血管內皮生長因子基因重組質粒復合物，該復合物是由人血管內皮生長因子基因重組質粒及包裹于其外部的多肽及脂質體復合而成。
所述人血管內皮生長因子基因重組質粒為pVAX-VEGF165。
所述多肽為可有效誘導基因重組質?；駾NA跨越哺乳動物細胞膜和核膜性結構的人工合成的富含疏水氨基酸的肽段，其氨基酸殘基序列和一級結構為GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYPKKKRKV.其中，GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY序列來自heterogeneousnuclear ribonucleoprotein(hnRNP)A1蛋白質NLS序列；PKKKRKV序列來自SV40病毒T抗體NLS序列。
在富含疏水氨基酸的多肽序列后附加其他的帶正電荷的短肽，可形成復合多肽。
多肽的性質氨基酸序列中不存在半胱氨酸，是簡單線形多肽。多肽中含有許多中性疏水的氨基酸(G，F(xiàn)，和Y)。自SV40病毒T抗體NLS序列，帶正電荷。
所述脂質體是可以包裹基因重組質?；駾NA，并有助重組質粒或DNA跨越哺乳動物細胞膜性結構的人工合成的脂性物質。
多肽以非共價鍵形式與人血管內皮生長因子基因重組質粒及脂質體相結合，序列中帶正電的氨基酸(K)和帶負電的質粒DNA相互作用，從而使質粒DNA進一步凝聚。這種凝聚作用有利于質粒DNA傳輸過細胞膜，細胞液和細胞核膜。存在于細胞核孔復合物(nuclear pore complex，NPC)上的importinβ蛋白質和多肽作用，在GTPase的幫助下把凝聚的質粒DNA傳輸?shù)郊毎藘冗M而實現(xiàn)DNA的轉錄和轉譯。多肽中的疏水氨基酸以疏水鍵與脂質體上的脂結合。這樣，多肽起著同時與質粒DNA和脂質體雙重作用的功能。由此而形成十分密封的質粒DNA，多肽和脂質體復合物，進而達到最高的基因傳導率。
本發(fā)明還提供了該復合物的醫(yī)藥用途，該復合物可用于制備缺血性外周血管病及缺血性冠心病的基因治療藥物。
本發(fā)明的貢獻在于，它有效解決了基因導入效率低和特異性差的問題，本發(fā)明通過篩選某些生物來源的多肽，利用其與人特定細胞膜的親和力及核定位信號作用，介導基因轉移，提高特異性的同時，提高轉染效率。這些多肽與脂質體和DNA結合，使多肽呈現(xiàn)在形成的包有目的DNA的脂質體囊泡表面。通過多肽介導，囊泡與目的細胞高親和力結合，進入胞內，并在多肽的協(xié)作下，DNA釋放入胞漿，隨后在多肽的核定位作用引導下，DNA進入核內，達到提高基因轉導效率的目的。在此基礎上，本發(fā)明對多肽-脂質體介導的VEGF165基因導法用于缺血性組織的血管新生研究也取得了明顯效果。
圖2是單純脂質體介導質粒DNA pEGFP-N3在牛主動脈內皮細胞表達的熒光顯微圖。
圖3是多肽-脂質體介導質粒DNA pEGFP-N3在牛主動脈內皮細胞表達的熒光顯微圖。
圖4是本發(fā)明的體內促血管生長試驗血管造影圖。
實施例1該多肽-脂質體與人血管內皮生長因子基因復合物的結構見

圖1，圖中1為人血管內皮生長因子基因重組質粒pVAX-VEGF165，2為脂質體，3為多肽，復合物的平均直徑為100nm。具有該結構的復合物按下列技術路線進行制備1、VEGF165cDNA的獲得常規(guī)方法裂解培養(yǎng)的SMMC-7721細胞，提取總
RNA，方法參照RNA提取試劑盒說明書。以poly T作為引物，將其中的mRNA反轉錄成cDNA。
2、EGF165編碼基因的獲得于VEGF165基因的上下游各設計一條PCR引物，引入酶切位點(參照質粒pVAX1的多克隆位點)。PCR反應后，將目的DNA克隆到特定的測序載體pUC19中，做序列分析。保留正確的克隆。
3、建VEGF165重組質粒將克隆載體中的正確序列，克隆到真核表達質粒pVAX1中(該質粒將提供T7啟動子和下游的poly A)。陽性克隆做PCR和酶切鑒定，獲得重組表達質粒pVAX-VEGF165.
4、VEGF165的表達鑒定將構建好的pVAX-VEGF165以脂質體的方法轉染培養(yǎng)的不表達VEGF165的細胞系，篩選后經，以western-blot檢測VEGF165的表達。保留具有高表達能力的pVAX-VEGF165表達質粒。
5、種子工程菌和工作工程菌建立將重組質粒pVAX-VEGF165轉染大腸桿菌DH5α，通過發(fā)酵，建立工程菌。通過傳代試驗確定重組質粒pVAX-VEGF165；應用質粒含量確定該質粒的拷貝數(shù)。純化質粒，采用紫外分光光度計測量質粒DNA的純度，DNA凝膠電泳法測量超螺旋DNA的比例。
6、高親和力多肽獲得應用心肌細胞特異膜蛋白的胞外區(qū)作為固定相，利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術篩選多肽庫，經多輪富集后，獲得與心肌細胞高親和力多肽，做基因序列測定和推導氨基酸序列分析。
7、酵母雙雜交篩選應用心肌細胞特異膜蛋白的胞外區(qū)作為誘餌，做酵母雙雜交系統(tǒng)篩選，對首輪篩選陽性的序列經再次驗證后，分析其DNA序列和相應的氨基酸序列。
8、親和力測定體外表達心肌細胞特異膜蛋白的胞外區(qū)，人工合成篩選獲得的多肽，以生物傳感器進行二者結合親和力測定，選擇高親和力的多肽用于多肽-脂質體復合物制備。
9、多肽-脂質體復合物的制備按照篩選獲得的氨基酸序列，加上核定位信號序列，采用人工合成方法生產多肽，與質粒pVAX-VEGF165混合，通過非共價鍵結合，形成多肽-質粒復合物。
10、VEGF165基因的包裝制備將上述構建的制備的多肽-質粒復合物與脂質體2000混合，室溫下自然混合。使之形成本項目產品SBN-2基因搭橋素(Gene Bypassin)。見成品結構示意圖。
11、質量控制成品控制指標為混合后的顆粒直徑和ζ電位，可分別用激光顆粒尺寸儀和ζ電位以測量。
12、基因轉移復合物的轉導效率試驗購買含有報告基因β-gal質粒，用如9制備的多肽-脂質體復合物作為轉導介質，轉導培養(yǎng)的血管內皮細胞，以單用脂質體做對照，比較轉導效率。
實施例2本發(fā)明的體外轉導實驗如下1、細胞培養(yǎng)和轉導方法牛主動脈內皮細胞(BAEC)(Cell SystemsCorporation，Kirkland，WA)生長鋪滿，傳代至24孔培養(yǎng)板繼續(xù)生長2天，達到細胞密度為＞100,000/cm2，然后用脂質體或多肽脂質體進行轉導實驗。細胞生長介質為DMEM，含10％熱滅活的胎牛血清。
2、轉導方法按脂質體(lipofectamine-2000)與質粒DNA pEGFP-N3(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)的重量比為6∶1混合，即3μl脂質體(2mg/ml)或者3μl脂質體肽復合物與1μg質粒DNA混合，加96μl無血清培養(yǎng)介質(OPTIMEM Reduced Serum Medium，Gibco-BRL)，37℃溫育45min。pEGFP-N3含CMV promoter，可表達EGFP。合成的肽(P9)30μg加到1μgpEGFP-N3脂質體混合物中，37℃溫育15min。繼而，加入150μl OPTIMEM無血清培養(yǎng)介質，完全浸泡細胞(250μl per2cm2well)，5％CO2、37℃溫育2hrs，補加10％的血清，繼續(xù)孵育2天。最后，用熒光顯微鏡照相觀察結果。
3、結果單純脂質體(lipofectamine-2000)介導質粒DNA pEGFP-N3進入BAEC，熒光顯微鏡下所見細胞內熒光斑點(GFP的表達)稀少(見圖2)，證明轉導效率較差。圖3顯示多肽脂質體介導質粒DNA pEGFP-N3進入BAEC，熒光顯微鏡下所見細胞內熒光斑點明顯增多增強，轉導效率提高約10倍。
實施例3本發(fā)明的體內促血管生長試驗如下通過外科手術，將新西蘭兔下肢股動脈從髂外側至窩處切除，造成下肢嚴重缺血。術后，使動物恢復10天，并使側枝循環(huán)初步建立。檢查動物各項生理指標正常后，開始做基因治療。
取多肽脂質體-pVEG165復合物制品500μg/2.5ml，向缺血的三塊肌肉組織二端分5個點注射，每點100μg/0.5ml。注意不要注入太深或使注射液漏出。在注射前后，以血管造影和在顯微鏡下，觀察缺血部位的血管及毛細血再生情況，包括血管及毛細血管再生的數(shù)量、密度、面積、長度和組織血液灌流狀態(tài)等，以判斷治療效果。結果如圖4所示，其中圖4A為對照1，術后第一天；圖4B為對照2，術后30天后?？梢娦g后30天后，缺血組織的血管具有代賞性增粗，但無明顯自主性血管再生；圖4C顯示用pVEGF165注射兔缺血肢體30天后，血管的新生情況。由圖可見血管明顯再生。
權利要求
1.一種多肽-脂質體與人血管內皮生長因子基因重組質粒復合物，其特征在于，它是由人血管內皮生長因子基因重組質粒及包裹于其外部的多肽及脂質體復合而成。
2.如權利要求1所述的復合物，其特征在于，所述人血管內皮生長因子基因重組質粒為pVAX-VEGF165。
3.如權利要求1所述的復合物，其特征在于，其中的多肽為可有效誘導基因重組質?；駾NA跨越哺乳動物細胞膜和核膜性結構的人工合成的富含疏水氨基酸的肽段，其氨基酸殘基序列和一級結構為GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYPKKKRKV.其中，GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY序列來自heterogeneousnuclear ribonucleoprotein(hnRNP)A1蛋白質NLS序列；PKKKRKV序列來自SV40病毒T抗體NLS序列。
4.如權利要求3所述的復合物，其特征在于，在富含疏水氨基酸的多肽序列后附加其他的帶正電荷的短肽，可形成復合多肽。
5.如權利要求1所述的復合物，其特征在于，所述脂質體是可以包裹基因重組質?；駾NA，并有助重組質?；駾NA跨越哺乳動物細胞膜性結構的人工合成的脂性物質。
6.如權利要求1所述的復合物，其特征在于，多肽以非共價鍵形式與人血管內皮生長因子基因重組質粒及脂質體相結合。
7.如權利要求1至6中任一條所述的復合物，其特征在于，該復合物可用于制備缺血性外周血管病及缺血性冠心病的基因治療藥物。
全文摘要
一種多肽－脂質體與人血管內皮生長因子基因重組質粒復合物及用途,該復合物是由人血管內皮生長因子基因重組質粒及包裹于其外部的多肽及脂質體復合而成,其中人血管內皮生長因子基因重組質粒為pVAX－VEGF
文檔編號A61K48/00GK1389269SQ0213432
公開日2003年1月8日 申請日期2002年7月4日 優(yōu)先權日2002年7月4日
發(fā)明者朱靜亞, 彭朝暉, 張曉志 申請人:朱靜亞, 彭朝暉, 張曉志