鹽酸芐絲肼一種新的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及鹽酸芐絲肼對于動(dòng)脈粥樣硬化疾病的防治作用。
【背景技術(shù)】
[0002]鹽酸芐絲肼收載于中國藥典2010年版(ChP 2010)，歐洲藥典7.0版(EP7.0)和日本藥典16版(JP16)。鹽酸芐絲肼為白色或類白色結(jié)晶粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮，其性質(zhì)極不穩(wěn)定，對溶劑PH、光線、溫度及濕度的變化極為敏感。鹽酸芐絲肼是外周脫羧酶抑制劑，主要用于治療帕金森氏癥(原發(fā)性震顫麻痹)，腦炎后或合并有腦動(dòng)脈硬化的癥狀性帕金森氏綜合征(非藥源性震顫麻痹綜合癥)。
[0003]近年來，隨著人們生活水平的提高，人們的生活方式及飲食習(xí)慣發(fā)生了巨大改變，高脂食物的大量攝入，日常運(yùn)動(dòng)的日益減少，加上老齡化人口的不斷增多，心腦血管疾病的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，并在在許多國家和地區(qū)的死亡譜中居于首位。
[0004]動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是中老年人的常見疾病和好發(fā)疾病，是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，它是一種以細(xì)胞增殖和變性為主要病變的疾病，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與高血脂、平滑肌細(xì)胞增生及損傷、巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞等粘附聚集具有密切關(guān)系。動(dòng)脈粥樣硬化的危害性極大，可導(dǎo)致患者發(fā)生心絞痛、心肌梗死、心源性猝死、外周動(dòng)脈疾病等，動(dòng)脈粥樣硬化已成為全球死亡的首因，對患者的生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。正是由于動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重危害性，所以近年來，動(dòng)脈粥樣硬化受到了社會(huì)及人們的廣泛關(guān)注，對于動(dòng)脈粥樣硬化的藥物治療研宄成為了一個(gè)研宄熱點(diǎn)。挖掘出一個(gè)具有良好的動(dòng)脈粥樣硬化防治效果的藥物對保障患者的生命健康具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明采用不同濃度的鹽酸芐絲肼治療高脂動(dòng)脈粥樣硬化造模的ApoE-/-小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量鹽酸芐絲肼(25mg/kg/d)能夠顯著減少ApoE-/-高脂動(dòng)脈粥樣硬化造模小鼠的血管壁動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積及血管壁巨噬細(xì)胞沉積，且效果優(yōu)于中劑量鹽酸芐絲肼(50mg/kg/d)及高劑量鹽酸節(jié)絲肼(100mg/kg/d)。
[0006]下面是藥理學(xué)部分試驗(yàn)及結(jié)果:
[0007]一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
[0008]空白對照組(野生型C57小鼠10只)、模型對照組(ApoE-/-小鼠10只)、鹽酸芐絲肼低劑量組(ApoE-/-小鼠10只、25mg/kg/d)、鹽酸芐絲肼中劑量組(ApoE-/-小鼠10只、50mg/kg/d)、鹽酸節(jié)絲肼高劑量組(ApoE-/-小鼠10只、100mg/kg/d)。
[0009]二、建立動(dòng)脈粥樣硬化模型及給藥處理
[0010]所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房內(nèi)，并采取自由采食及飲水的飼養(yǎng)方式。對上述五組小鼠采用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后，給空白對照組小鼠喂食基礎(chǔ)飼料，給模型對照組、鹽酸芐絲肼給藥的三組小鼠均喂食高脂飼料，高脂飼養(yǎng)的同時(shí)給予鹽酸芐絲肼低劑量組小鼠腹腔注射鹽酸芐絲肼25mg/kg/d，鹽酸芐絲肼中劑量組小鼠腹腔注射鹽酸芐絲肼50mg/kg/d，鹽酸芐絲肼高劑量組小鼠腹腔注射鹽酸芐絲肼100mg/kg/d，空白對照組及模型對照組小鼠則腹腔注射相應(yīng)體積的生理鹽水。連續(xù)給藥處理8周后，處死小鼠，取小鼠主動(dòng)脈標(biāo)本，進(jìn)行HE染色及巨噬細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)。
[0011]三、病理切片HE染色檢測
[0012]取小鼠主動(dòng)脈根0.5cm置于10%福爾馬林固定24h，常規(guī)脫水，標(biāo)本以石蠟包埋、連續(xù)切片，片厚4 μ m，對切片進(jìn)行HE染色并鏡檢。
[0013]光鏡下可見空白對照組小鼠主動(dòng)脈壁由內(nèi)膜，中膜及外膜組成，分界清楚，厚度均一。內(nèi)膜表被單層扁平上皮，內(nèi)膜下為內(nèi)彈性膜。中膜主要由彈性膜組成，外膜為疏松結(jié)締組織，可見脂肪，如圖1。模型對照組小鼠主動(dòng)脈光鏡下局部內(nèi)膜隆起，出現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，斑塊主要由吞噬脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞組成，泡沫細(xì)胞表面可見少量膠原纖維、平滑肌細(xì)胞，如圖2。鹽酸芐絲肼低劑量組小鼠主動(dòng)脈光鏡下，僅見少量泡沫細(xì)胞沉積，未形成明顯的斑塊，如圖3。鹽酸芐絲肼中劑量組及高劑量組小鼠主動(dòng)脈光鏡下，內(nèi)膜增厚明顯減輕，斑塊數(shù)目明顯減少，但效果不如鹽酸芐絲肼低劑量組，如圖4、圖5。
[0014]四巨噬細(xì)胞免疫組化檢測
[0015]取小鼠主動(dòng)脈根0.5cm置于10%福爾馬林固定24h，常規(guī)脫水，標(biāo)本以石蠟包埋、連續(xù)切片，片厚4 μ m，對切片進(jìn)行巨噬細(xì)胞免疫組化檢測。
[0016]光鏡下可見空白對照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁無棕黃色斑塊沉積，也未見巨噬細(xì)胞，如圖6。模型對照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁有明顯斑塊沉積，且斑塊內(nèi)有大量的巨噬細(xì)胞，如圖7。鹽酸芐絲肼低劑量組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁無明顯斑塊沉積，僅見少量巨噬細(xì)胞粘附，如圖8。鹽酸芐絲肼中劑量組及高劑量組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁，可見明顯斑塊，斑塊內(nèi)富含巨噬細(xì)胞，較模型組減少，但效果不如鹽酸芐絲肼低劑量組，如圖9、圖10。
【附圖說明】
[0017]圖1是空白對照組小鼠主動(dòng)脈根HE染色鏡檢圖。
[0018]圖2是模型對照組小鼠主動(dòng)脈根HE染色鏡檢圖。
[0019]圖3是鹽酸芐絲肼低劑量組小鼠主動(dòng)脈根HE染色鏡檢圖。
[0020]圖4是鹽酸芐絲肼中劑量組小鼠主動(dòng)脈根HE染色鏡檢圖。
[0021]圖5是鹽酸芐絲肼高劑量組小鼠主動(dòng)脈根HE染色鏡檢圖。
[0022]圖6是空白對照組小鼠主動(dòng)脈根巨噬細(xì)胞免疫組化鏡檢圖。
[0023]圖7是模型對照組小鼠主動(dòng)脈根巨噬細(xì)胞免疫組化鏡檢圖。
[0024]圖8是鹽酸芐絲肼低劑量組小鼠主動(dòng)脈根巨噬細(xì)胞免疫組化鏡檢圖。
[0025]圖9是鹽酸芐絲肼中劑量組小鼠主動(dòng)脈根巨噬細(xì)胞免疫組化鏡檢圖。
[0026]圖10是鹽酸芐絲肼高劑量組小鼠主動(dòng)脈根巨噬細(xì)胞免疫組化鏡檢圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例一
[0028]I)高脂飼料配方
[0029]15%豬油，2%膽固醇，1.5%全脂奶粉，1.5%蛋黃粉，0.2%膽酸鈉+79.8%普通飼料。
[0030]2) HE 染色
[0031](I)石蠟切片常規(guī)脫蠟:二甲苯(I)15min — 二甲苯(II)(應(yīng)完全透明)1min ；
(2)逐級下行梯度乙醇浸泡水化:100%乙醇(I)2min — 100%乙醇(II) 2min — 95%乙醇2min —80%乙醇2min —自來水沖洗片刻；(3)染色:蒸餾水洗片刻一蘇木素液染核5min —自來水沖洗片刻一I %鹽酸乙醇分化30s (提插數(shù)下)一流水沖洗片刻一弱氨水水溶液反藍(lán)數(shù)秒一流水沖洗1min —置0.5%伊紅水溶液中復(fù)染1min ； (4)逐級上行梯度乙醇脫水:自來水沖洗片刻(分化伊紅)一95%乙醇(I)2min —95%乙醇(II) 2min — 100%乙醇(I) 2min — 100% 乙醇(II) 2min ； (5)透明:二甲苯(I) 5min — 二甲苯(II) 5min ； (6)固定、封片:蓋玻片下中性樹脂固定、封片。
[0032]3)免疫組化染色
[0033]1.石蠟切片完成以后，先放于鐵架上烘箱60°C烘片lh，結(jié)束后可抽查下切片石蠟是否融化。
[0034]2.然后依次二甲苯I 15min，二甲苯II 15min，無水乙醇5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，H20 5min，PBS 5min。注意:液面都要浸過切片上的組織。
[0035]3.在燒杯中中加入足量的檸檬酸緩沖液，先讓液體沸騰(要求沸騰不要太劇烈)，然后加入切片，20min后燒杯停止加熱，讓其自然冷卻，然后PBS洗，3*3min。
[0036]4.切片甩干，然后橫放于濕盒，滴加3% H202，蓋上蓋子室溫孵育lOmin。
[0037]5.?83洗，3*311^11。切片甩干，然后用3% BSA封閉切片組織，濕盒室溫孵育30min。
[0038]6.切片去封閉液，然后滴加第一抗體，濕盒4°C過夜。
[0039]7.第二天取出濕盒，并放于室內(nèi)30min，讓其復(fù)溫。
[0040]8.PBS洗，3*3min。切片甩去PBS，然后切片滴加第二抗體濕盒室溫孵育20min。
[0041]9.PBS洗，3*3min。切片甩去PBS，然后切片滴加第三抗體濕盒室溫孵育20min。
[0042]10.PBS洗，3*3min。切片甩去PBS，然后切片滴加新鮮配制的DAB顯色液，3_5min后用水沖洗掉DAB液體。蘇木素復(fù)染，l_3min后用水洗掉蘇木素。注意:具體染色時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況來定。
[0043]11.切片脫水干燥。程序如下:H20 3min，75%乙醇3min，85%乙醇3min，95%乙醇3min，無水乙醇3min，二甲苯I 15min，二甲苯II 15min。
[0044]12.待二甲苯揮干，中性樹膠封片。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.鹽酸芐絲肼用于動(dòng)脈粥樣硬化疾病防治的藥物用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了鹽酸芐絲肼在動(dòng)脈粥樣硬化防治方面的效果。本發(fā)明通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了鹽酸芐絲肼的對于動(dòng)脈粥樣硬化疾病的防治作用，此研究符合我國藥物現(xiàn)代化的發(fā)展方向，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和應(yīng)用研究領(lǐng)域內(nèi)具有重要的社會(huì)意義和潛在的經(jīng)濟(jì)效益。
【IPC分類】A61K31/165, A61P9/10
【公開號】CN104940180
【申請?zhí)枴緾N201510407527
【發(fā)明人】何書英, 余新超, 吳杰, 方婷歡, 季璇馨
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月9日