專利名稱：皰疹病毒胸苷激酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種新的皰疹病毒胸苷激酶突變體、其編碼序列及其在提高細胞對核苷酸類似物依賴型殺傷的易感性以及制備通過核苷酸類似物依賴型殺傷作用的抗腫瘤基因治療藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皰疹病毒胸苷激酶例如單純皰疹病毒I胸苷激酶(下文簡稱為“HSV1-TK”)，能有效地將丙氧鳥苷(ganciclovir，下文簡稱“GCV”)及無環(huán)鳥苷(acyclovir，下文簡稱“ACV”)等核苷酸類似物磷酸化而形成相應(yīng)的單磷酸化中間體。繼而這些中間體經(jīng)宿主細胞自身的胸苷激酶作用而進一步磷酸化，成為二磷酸化中間體，直至三磷酸化的終體。這類三磷酸終體可在宿主細胞的DNA復(fù)制時，而以胸苷的身份摻入到新合成DNA鏈中，導(dǎo)致DNA鏈合成終止，最終引起細胞死亡[1]。真核生物細胞內(nèi)源性的胸苷激酶不能對GCV及ACV直接磷酸化而產(chǎn)生相應(yīng)的單磷酸化中間體，從而HSVTK-1基因表達與否決定著有關(guān)細胞對GCV等胸苷類似物是否易感。
GCV已廣泛地用治療單純皰疹病毒、巨細胞病毒等感染[2]。除了表達HSVTK-1基因的細胞對GCV為代表的胸苷類似物易感外，這類被HSVTK-1磷酸化的胸苷類似物可有效地通過胞間間隔(GAP JUNCTION)傳導(dǎo)到毗鄰的不表達HSVTK-1基因的細胞而制其于死地。這就是所謂的“旁觀者效應(yīng)”，它可顯著地擴大這一方案的細胞毒效應(yīng)，部分上克服了現(xiàn)有的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的效率偏低的不足[4]。另外，HSVTK-1/GCV方案相關(guān)的旁觀者效應(yīng)與宿主因此而產(chǎn)生的抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)[6]。通過在導(dǎo)入或表達水平上的基因靶向技術(shù)選擇性地使HSVTK-1在腫瘤細胞內(nèi)表達的方案已廣泛地應(yīng)用到腫瘤基因治療中[7，8]。加之，HSVTK-1表達本身對細胞并無任一不良影響，胸苷類似物給藥時間的選擇可決定這一方案產(chǎn)生效應(yīng)的時相。另外用組織專一性啟動子來控制HSVTK-1在個體發(fā)育的中專一性的表達并與GCV的給藥的時間的控制相結(jié)合，能有效地時空專一性地剔除表達該基因的細胞。這一手段已廣泛地用于研究細胞分化以及特定細胞系在器官形成中的以及動物的個體發(fā)生中的作用[9]。
盡管GCV作為抗皰疹病毒及抗腫瘤基因治療的臨床應(yīng)用已為時良久，它的廣泛應(yīng)用明顯地受限于GCV的臨床有效劑量所伴隨著的毒性反應(yīng)。GCV的劑量過高會引起短期的心、肝、腎急性損害及造血系統(tǒng)的改變[10]，還可以抑制機體的免疫反應(yīng)[11]。另外，有些穩(wěn)定表達HSV1-TK的腫瘤細胞對GCV依賴性細胞毒性反應(yīng)有抗性[12，13]。當腫瘤周圍的GCV的含量不足時，這些表達HSV1-TK的腫瘤細胞則得以生存[14，15]。所以，提高HSV1-TK對GCV等胸苷類似物的磷酸化活性，有望降低GCV的臨床劑量，還可以提高TK的旁觀者效應(yīng)。
所以，為了降低GCV的臨床有效劑量，并提高胸苷激酶介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)，本領(lǐng)域中需要有一種對諸如GCV、ACV等核苷酸類似物的磷酸化活性有顯著增強的皰疹病毒胸苷激酶。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種對核苷酸類似物的磷酸化活性顯著增強的皰疹病毒胸苷激酶。
本發(fā)明的另一目的是利用上述皰疹病毒胸苷激酶來提高細胞對核苷酸類似物依賴型殺傷的易感性。
本發(fā)明還有一個目的是用本發(fā)明皰疹病毒胸苷激酶突變體的多核苷酸序列來制備通過核苷酸類似物依賴型殺傷作用的抗腫瘤基因治療藥。
本發(fā)明一方面涉及一種分離的皰疹病毒胸苷激酶突變體，所述皰疹病毒胸苷激酶突變體能較野生型更為高效地使核苷酸類似物磷酸化，其編碼蛋白具有152位氨基酸突變，且當152位突變?yōu)槔i氨酸時，168位和169位氨基酸不是酪氨酸和苯丙氨酸。
在上述方案的一個較佳實例中，所述突變選自Ala152Val，Ala152Gly，Ala152Pro和Ala152Arg。
另外，當152位突變成非纈氨酸的氨基酸時，該皰疹病毒胸苷激酶突變體還可任選地有168位和169位的氨基酸突變。較佳的，所述168位和169位的氨基酸突變?yōu)锳la168Tyr和Leu169Phe。
本發(fā)明所述的皰疹病毒包括皰疹病毒家族中的許多成員，例如單純皰疹病毒1型(McKnight等人，Nuc.Acids Res 85949-5964，1980)，單純皰疹病毒2型(Swain和Galloway，J.Virol.461045-1050，1983)，水痘-帶狀皰疹病毒(Davison和Scott，J.Gen.Virol.671759-1816，1986)，絨猴皰疹病毒(Otsuka和Kit，Virology 135316-330，1984)，貓皰疹病毒1型(Nunberg等人，J.Virol.633240-3249，1989)，假狂犬病病毒(Kit和Kit，美國專利4,514,497，1985)，馬皰疹病毒1型(Robertson和Whalley，Nuc.Acids Res.1611303-11317，1988)，牛皰疹病毒1型(Mittal和Field，J.Virol 702901-2918，1989)，火雞皰疹病毒(Martin等人，J Virol.632847-2852，1989)，Marek′s疾病病毒(Scott等人，J Gen.Virol.703055-3065，1989)，松鼠猴皰疹病毒(herpesvirus saimiri)(Honess等人，J.Gen.Virol.703003-3013，1989)和EB病毒(Baer等人，Nature(London)310207-311，1984)。其中，較佳的病毒是單純皰疹病毒1型。
本文所述的核苷酸類似物選自丙氧鳥苷、無環(huán)鳥苷、泛西洛維、布昔洛維、瓦昔洛維、三氟胸苷、1-2-脫氧、2-氟、δ-D-阿拉伯呋喃糖-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT 1-δ-D-阿拉伯呋喃糖胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脫氧尿苷、5-碘-5’-氨基-2，5’-二脫氧尿苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。其中，較佳的核苷酸類似物是丙氧鳥苷和無環(huán)鳥苷。
在另一較佳的實施方案中，所述皰疹病毒胸苷激酶突變體相對于其野生型只有152位氨基酸突變。
本發(fā)明第二方面涉及一種分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼上述單純皰疹病毒胸苷激酶突變體。
本發(fā)明第三方面涉及一種重組表達載體，該重組表達載體含有上述的編碼上述單純皰疹病毒胸苷激酶突變體的多核苷酸序列以及與所述多核苷酸序列操作性相連的表達調(diào)控序列。
本發(fā)明第四方面涉及一種提高細胞對核苷酸類似物依賴型殺傷的易感性的方法，其包括用上述重組表達載體轉(zhuǎn)染所述細胞。
在一個較佳的實施方案中，所述轉(zhuǎn)染方案采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔和病毒性載體介導(dǎo)的方法。
本發(fā)明的第五方面涉及上述皰疹病毒胸苷激酶突變體、皰疹病毒胸苷激酶突變體多核苷酸序列或其重組表達載體在制備通過核苷酸類似物依賴型殺傷作用的抗腫瘤基因治療藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了數(shù)種高生物活性的HSV1-TK突變株，它在GCV依賴性細胞內(nèi)殺傷實驗中對GCV所需要的有效劑量低于野生型的所需的5倍之多。使用這些高效HSV-1TK突變株顯著地減輕了GCV使用的臨床劑量所帶來的臨床毒性以及患者在治療費用上的負效應(yīng)，而且還提高了胸苷激酶的旁觀者效應(yīng)。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將在下文的詳細描述中有進一步揭示。
附圖簡述

圖1顯示了HA2質(zhì)粒圖譜及其多克隆位點附近的序列，其中Ampicillin和Neomycin分別表示氨芐青霉素和新霉素標記基因；HA tag是HA多肽序列。
圖2顯示了含有HSV1-TK基因的HA2質(zhì)粒的圖譜。
圖3是構(gòu)建突變株時所采用的雙輪PCR搭橋法流程示意圖。
圖4是構(gòu)建突變株時所采用的定點突變方法示意圖。
圖5顯示了野生型TK和突變體mTk1的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)果。
圖6顯示了U-2 0S細胞磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染效率的測定結(jié)果。
圖7顯示了HSV1-TK蛋白在U-2 0S細胞表達水平的Western印跡檢測。
圖8顯示了野生型HSV1-TK以及各突變型HSV1-TK在瞬時轉(zhuǎn)染試驗GCV依賴型殺傷試驗中的結(jié)果比較。
圖9顯示了野生型HSV1-TK以及HSV1-TK突變型1在瞬時轉(zhuǎn)染試驗GCV依賴型殺傷試驗中的結(jié)果比較。
圖10顯示了野生型HSV1-TK以及各突變型HSV1-TK在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染試驗GCV依賴型殺傷試驗中的結(jié)果比較。
圖11顯示了野生型HSV1-TK以及HSV1-TK的各種152氨基酸點突變型在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染試驗GCV依賴型殺傷試驗中的結(jié)果比較。
具體實施方案有關(guān)通過點突變來提高野生型HSV1-TK生物活性的方法已有報道(具體見下文)，這些點突變方案均是圍繞著HSV1-TK的活性中心(155-172位氨基酸)開展的。但本發(fā)明者通過研究發(fā)現(xiàn)，僅僅通過改變HSV1-TK的152位氨基酸，就可使胸苷激酶的生物活性顯著高于野生型，從而完成了本發(fā)明。
在這里，術(shù)語“胸苷激酶的生物活性”是指胸苷激酶將丙氧鳥苷等核苷酸類似物(如胸苷類似物)磷酸化，并在細胞及活體內(nèi)的系統(tǒng)中，表達該蛋白的細胞對核苷酸類似物依賴性殺傷有易感性。
本發(fā)明提供了一種分離的皰疹病毒胸苷激酶突變體，所述皰疹病毒胸苷激酶突變體能較野生型更為高效地使核苷酸類似物磷酸化，其編碼蛋白具有152位氨基酸突變，且當152位突變?yōu)槔i氨酸時，168位和169位氨基酸不是酪氨酸和苯丙氨酸。在上述方案的一個較佳實例中，所述突變選自Ala152Val，Ala152Gly，Ala152Pro和Ala152Arg。另外，當152位突變成非纈氨酸的氨基酸時，該皰疹病毒胸苷激酶突變體還可任選地有168位和169位的氨基酸突變。較佳的，所述168位和169位的氨基酸突變?yōu)锳la168Tyr和Leu169Phe。
本文所用的術(shù)語“皰疹病毒胸苷激酶”可以是具有天然野生型序列的皰疹病毒胸苷激酶，也可以是其具有突變序列的衍生型或重組型，前提條件是該突變型或重組型中不包括152位氨基酸突變。野生型皰疹病毒胸苷激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO17所示。
本文中所用的術(shù)語“Ala152Val”即表示152位氨基酸由丙氨酸(Ala)變?yōu)槔i氨酸(Val)?！癆la152Gly”、“Ala152Pro”、“Ala152Arg”、“Ala168Tyr”和“Leu169Phe”可以此類推。
本文所用的術(shù)語“分離的”在用于核酸或蛋白質(zhì)時，表示核酸或蛋白質(zhì)基本上不含其它在天然狀態(tài)下相關(guān)的細胞成分，其最好呈均質(zhì)狀態(tài)，但也可以是干的或水溶液。純度和均一性通常可用分析化學(xué)方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。
本發(fā)明所述的皰疹病毒包括皰疹病毒家族中的許多成員，例如單純皰疹病毒1型(McKnight等人，Nuc.Acids Res 85949-5964，1980)，單純皰疹病毒2型(Swain和Galloway，J.Virol.461045-1050，1983)，水痘-帶狀皰疹病毒(Davison和Scott，J.Gen.Virol.671759-1816，1986)，絨猴皰疹病毒(Otsuka和Kit，Virology 135316-330，1984)，貓皰疹病毒1型(Nunberg等人，J.Virol.633240-3249，1989)，假狂犬病病毒(Kit和Kit，美國專利4,514,497，1985)，馬皰疹病毒1型(Robertson和Whalley，Nuc.Acids Res.1611303-11317，1988)，牛皰疹病毒1型(Mittal和Field，J.Virol 702901-2918，1989)，火雞皰疹病毒(Martin等人，J Virol.632847-2852，1989)，Marek′s疾病病毒(Scott等人，J Gen.Virol.703055-3065，1989)，松鼠猴皰疹病毒(Honess等人，J.Gen.Virol.703003-3013，1989)和EB病毒(Baer等人，Nature(London)310207-311，1984)。其中，較佳的病毒是單純皰疹病毒1型。由于皰疹病毒家族中上述這些成員的胸苷激酶的酶活性中心氨基酸序列有高度的同源性，因此預(yù)計該家族中其它成員的相應(yīng)突變株也有同樣高的價值和應(yīng)用前景。
本文所述的核苷酸類似物可選自丙氧鳥苷、無環(huán)鳥苷、泛西洛維、布昔洛維、瓦昔洛維、三氟胸苷、1-2-脫氧、2-氟、δ-D-阿拉伯呋喃糖-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT 1-δ-D-阿拉伯呋喃糖胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脫氧尿苷、5-碘-5’-氨基-2，5’-二脫氧尿苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。其中，較佳的核苷酸類似物是丙氧鳥苷和無環(huán)鳥苷。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，本發(fā)明并不局限于這些核苷酸類似物。
本發(fā)明還提供了編碼上述單純皰疹病毒胸苷激酶突變體的多核苷酸序列。所述多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈或是雙鏈形式，可以是編碼鏈或非編碼鏈。由于遺傳密碼的簡并性，因此能夠編碼單純皰疹病毒胸苷激酶突變體的所有多核苷酸序列均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明的編碼上述單純皰疹病毒胸苷激酶突變體的多核苷酸序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA重組、PCR等各種技術(shù)來獲得，例如包括，但不局限于本發(fā)明較佳實施方案中采用的雙輪PCR搭橋法以及Stratagene的quick change中描述的定點突變方法。
將上述突變的多核苷酸序列經(jīng)適當酶切插入合適的表達載體中并與表達調(diào)控序列操作性相連，就得到了本發(fā)明的重組表達載體。在這里，術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、病毒或其他載體。在本發(fā)明較佳實施方案中使用的載體是以pcDNA3.1+(Invitrogen，CA，USA)為基本骨架/在其多克隆位點區(qū)中的EcoRI和XhoI之間插入了三個流感病毒血凝素抗原決定簇(HA)多肽序列構(gòu)建而成的真核細胞壁表達載體。然而，本發(fā)明范圍并局限于該載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。這里所用的術(shù)語“表達調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達的序列。表達調(diào)控序列包括與目標核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。典型的啟動子例如有CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、以及其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子?！安僮餍韵噙B”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。在上述重組表達載體中也可根據(jù)需要加入選擇性標記基因。
由于本發(fā)明的皰疹病毒胸苷激酶突變體具有顯著高于野生型的對胸苷類似物的磷酸化活性，因此本發(fā)明還提供了一種提高細胞對核苷酸類似物依賴性殺傷易感性的方法，該方法包括用上述的具有皰疹病毒胸苷激酶突變體編碼序列的重組表達載體轉(zhuǎn)染所述目標細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的的。由于本發(fā)明中涉及的目標細胞通常為真核細胞，因此通常采用的DNA轉(zhuǎn)染方法例如有磷酸鈣沉淀法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和病毒載體介導(dǎo)等方法。在一個較佳的實施方案中，所述轉(zhuǎn)染方案采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染。
所以，本發(fā)明在抗腫瘤基因治療方面也有廣泛的應(yīng)用前景。
本發(fā)明還涉及上述皰疹病毒胸苷激酶突變體、其多核苷酸編碼序列或含該多核苷酸編碼序列的重組表達載體在制備通過核苷酸類似物依賴型殺傷作用的抗腫瘤基因治療藥中的應(yīng)用。在一個較佳的實施方案中，所述抗腫瘤基因治療藥可以采用單基因、聯(lián)合基因(胸苷激酶和一個或幾個其抗腫瘤機制不同的治療蛋白的基因)或融合基因(胸苷激酶和胞嘧啶脫氨酶或任一其它種類蛋白的融合基因)的形式。
另外，利用本發(fā)明的高生物活性的HSV1-TK突變株來代替野生型HSV1-TK基因，能提高整體動物中進行組織剔除的選擇性。
下面結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，這些實施例僅用于描述本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 HSV1-TK突變株的構(gòu)建在本試驗中采用的試劑如下pfu購自Stratagene，CA，USA；限制性內(nèi)切酶購自Takara寶生物工程(大連)有限公司；T4 DNA連接酶購自Promega，WI，USA；膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。主要生化試劑為Sigma，MO，US的產(chǎn)品或國內(nèi)RA級產(chǎn)品。HA抗體為Santa Crutz，CA，USA公司產(chǎn)品(F-7，小鼠單克隆抗體)。
本試驗中所有的常規(guī)的分子遺傳學(xué)操作均按照《分子克隆實驗指南》[16]上的相關(guān)程序進行，除非另有特別描述。
首先構(gòu)建HA3標記的野生型-HSV1-TK真核細胞壁表達載體。
流感病毒血凝素抗原決定簇(HA)載體是以pcDNA3.1+(invitrogen，CA，USA)為基本骨架，在其多克隆位點區(qū)中的EcoRI和XhoI之間插入了三個HA多肽序列構(gòu)建而成的。圖1中顯示了pHA2質(zhì)粒圖譜及其多克隆位點附近的序列。HA野生型HA標記的TK基因是通過PCR方法，將HSV1-TK基因插入到XhoI/BglII切過的HA2載體中，其中本實驗所用的HSV1-TK經(jīng)Blastn和Blastp(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查新及同源搜索確認與基因庫中登陸號為BAA8399的HSV1-TK基因在蛋白質(zhì)水平上只多了一個4位上的甘氨酸。由于該甘氨酸遠離HSV1-TK的活性中心(氨基酸155到172)，這一個差別沒有顯著化影響HSV1-TK的酶活性。圖2中顯示了含有HSV1-TK基因的HA2質(zhì)粒的圖譜。
由于某些突變株涉及到多個氨基酸的改變，而且這些氨基酸的分布域很寬，因此采用雙輪PCR搭橋法構(gòu)建mTK-1，mTK-2和mTK-3。關(guān)于雙輪PCR搭橋法可參見圖3，其流程大致如下首先用引物a和引物d、引物b和引物c分別進行PCR，然后用pfu進行聚合酶連反應(yīng)。使膠回收產(chǎn)物在95℃變性，再40℃退火，然后用pfu在75℃延伸，進行3個循環(huán)。然后用引物a和d再進行PCR，做22個循環(huán)。
所需引物具體如下1)mTK-1(152位丙氨酸→纈氨酸)和mTK-2(152位丙氨酸→纈氨酸，168位丙氨酸→纈氨酸，169位亮氨酸→苯丙氨酸)所用的引物引物aTKaAAACTC GAGATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAG CAC(SEQ ID NO1)，其中下劃線的是Bgl II的識別順序引物bTKbAAA AGA TCT TTA GCC TCC CCC ATC TCC CGG GCA AAC(SEQ ID NO2)，其中下劃線的是Xba I的識別順序引物cmt-LACC ATC CTC GCC GAC CGC CAT CCC ATC GCC TAC TTCCTG TGC(SEQ ID NO3)引物dmt-RGGC GAG GAT GGT GAG GGC CGG GGG CGG GAC ATG(SEQ ID NO4)2)mTK-3(將亮氨酸插入到161位苯丙氨酸后，168位亮氨酸→苯丙氨酸，169亮氨酸→甲硫氨酸)所用的引物引物aZ-TKaAAA CTC GAC ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA(SEQID NO5)引物bZ-TKbAAA AGA TCT TCA GTT AGC CTC CCC CAT CTC CCG GGC(SEQ ID NO6)引物c2m-LGAC CGC CAT CCC ATC GCC TTC ATG CTG TGC TAC(SEQID NO7)引物d2m-RGGC GAT GGG ATG GCG GTC TAA GAA GAT GGT GAG(SEQID NO8)3)mTK-4(159位亮氨酸→絲氨酸，160位異亮氨酸→苯丙氨酸，161位苯丙氨酸→亮氨酸，168位丙氨酸→苯丙氨酸，169位亮氨酸→甲硫氨酸)所用的引物Z-TKa、Z-TKb如2)所述；引物c SR39-AGCC CCC GGC CCT CAC TAG TTT CTT AGA CCG CCA TC(SEQ ID NO9)引物d SR39-BGAT GGC GGT CTA AGA AAC TAG TGA GGG CCG GGG GC(SEQ ID NO10)4)mTK-5(152位丙氨酸→脯氨酸)PLGGG AGG CTG GGA GTT CAC ATC CAC CGC CCC CGG CCC(SEQ ID NO11)PRGGG CCG GGG GCG GTG GAT GTG AAC TCC CAG CCT CCC(SEQ IDNO12)5)mTK-6(152位丙氨酸→甘氨酸)
GLGGG AGG CTG GGA GTT CAC ATG GAC CGC CCC CGG CCC(SEQ IDNO13)GRGGG CCG GGG GCG GTC CAT GTG AAC TCC CAG CCT CCC(SEQ IDNO14)6)mTK-7(152位丙氨酸→精氨酸)RLGGG AGG CTG GGA GTT CAC ATA GAC CGC CCC CGG CCC(SEQ IDNO15)RRGGG CCG GGG GCG GTC TAT GTG AAC TCC CAG CCT CCC(SEQ ID NO16)如圖3所示，第一輪PCR反應(yīng)以野生型HSV1-TK為模板，分別以引物ab和cd為引物，得到二個片段；第二輪PCR先將經(jīng)膠回收的兩個片段退火，經(jīng)搭橋形成模板，進行三輪PCR循環(huán)后，再加ad引物，經(jīng)25輪PCR循環(huán)得到全長突變型TK(mTK-1，mTK-2和mTK-3)。
全長TK和載體HA用XhoI、BglII酶切，電泳，膠回收，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒HA-mTK。經(jīng)上?；倒緶y序鑒定，序列正確。
進而采用Stratagene的quick change(參照Stratagene網(wǎng)站，產(chǎn)品號#200519)中描述的定點突變方法(圖4)，在mTK-3的基礎(chǔ)上產(chǎn)生mTK-4；在mTK-1的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了152P(mTK-5)，152G(mTK-6)和152R(mTK-7)的突變體。下表1中列出了HSV1-TK突變株的各突變位點。
表1 HSV1-TK突變株的位點

實施例2 HSV1-TK突變株的鑒定1)HSV1-TK突變體的完整性的鑒定用T7噬菌體轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)對上述實施例1獲得的各突變株進行試管外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯分析。用35S標記的甲硫氨酸作為標記底物，轉(zhuǎn)錄翻譯后的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳干膠后，放射自顯影檢測。從圖5的結(jié)果可以看出，HSVI-TK突變體1(mTK-1)與野生型HA HSV1-TK一樣，能產(chǎn)生預(yù)期大小的蛋白質(zhì)。
2)HSV1-TK及其點突變體的功能檢驗瞬時轉(zhuǎn)染試驗用磷酸鈣沉淀法分別將野生型及突變型HSV1-TK的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到U-2 0S細胞(購自中國細胞庫，上海生化細胞所)中，因此有必要對所用的U-2 0S細胞轉(zhuǎn)染效率進行測定。
(A)用含增強性綠色螢光蛋白基因的真核細胞表達性質(zhì)粒EGFP DNA轉(zhuǎn)染U-20S細胞，并用碘化丙啶(PI)染色。轉(zhuǎn)染了EGFP DNA的細胞發(fā)出綠色熒光。細胞核均被碘化丙啶染色發(fā)出紅色熒光，可用來計算細胞總數(shù)。隨機取二個視野，計數(shù)綠色熒光細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比，作為轉(zhuǎn)染效率。根據(jù)圖6所示結(jié)果，測得轉(zhuǎn)染效率10％。
(B)用Western印跡來核定野生型HSV1-TK及其突變株在轉(zhuǎn)染細胞中的蛋白水平上表達的測定。如圖7所示，與增殖胞核抗原PCNA(proliferation cell nuclearantigen)(一種真核細胞普遍表達的一種核蛋白，常常被用來作為上樣量的內(nèi)參照)帶的強度相比，mTK的表達量并不比野生型TK的表達量大(抗HA抗體)。所以據(jù)信下文所述的mTK-1和mTK-2的GCV依賴性殺傷能力的提高是由于所述氨基酸突變引起的。
C)HSV1-TK及其點突變株的功能檢驗瞬時轉(zhuǎn)染試驗、GCV依賴性的殺傷實驗及統(tǒng)計分析采用磷酸鈣沉淀法分別將野生型及突變型HSV1-TK的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到U-2 0S細胞中，隔天后將受轉(zhuǎn)染的細胞以1×104/孔的量分板接種到96孔板中。待細胞貼壁后，加入如下表2所示濃度的GCV。處理三天后，采用MTS(Promega)對細胞對GCV存在的反應(yīng)進行結(jié)果分析。每個樣品重復(fù)五次，每組GCV濃度不同的樣品的均值及方差(SD)按有關(guān)數(shù)量方法處理后，用GCV濃度不同組的均值/GCV濃度為零的MTT值的比值對GCV濃度作圖，方差放入。
表2GCV的 野生型 TK mTK-1 mTK-2 mTK-3 mTK-4HA3載體劑量生存 生存 生存 生存 生存率 生存率((M)率％SD 率％ SD 率％ SD 率％ SD (％)SD (％)SD0 100 2.8100 2.5 100 3.3 100 1.3 100 5.7 100 2.60.3 100 2.361.4 1.8 70.7 0.3 83.0 5.5 97.41.9 105.9 2.91.25107.9 10.1 55.9 1.6 66.7 1.0 88.3 2.3 91.81.5 96.45.55 102.5 3.252.1 3.1 65.7 1.7 85.3 2.0 92.82.4 87.86.020 80.86.251.6 1.6 59.0 1.2 84.4 3.0 92.60.5 94.14.180 75.46.747.9 2.0 58.5 2.4 86.5 2.4 91.32.1 95.94.5將HSV1-TK野生型和突變體進一步相比較可以更清楚地看到這兩者之間的差別(圖8和圖9)。
在相同條件下，重復(fù)實驗三次，結(jié)果類似。用寇氏法計算TK的IC50(即半數(shù)細胞死亡時GCV的用量)。突變型HSV-1 TK的IC50為12.07uM(95％可信限9.22uM～15.81uM)遠小于野生型HSV-1 TK的IC5089.26uM(95％可信限72.85uM～109.37uM)，P值小于0.001，有顯著統(tǒng)計意義。
同時對其表達量進行研究。Western印跡和體外轉(zhuǎn)錄翻譯試驗都表明(圖7)，突變后并沒有表達量的增加。這進一步說明，152位氨基酸的突變(由丙氨酸突變成纈氨酸)提高了對腫瘤細胞的殺傷能力。
用SPSS軟件作多因素方差分析。結(jié)果顯示mTK-1和mTK-2的殺傷效果與野生型和其它TK的突變體有明顯區(qū)別，統(tǒng)計學(xué)檢驗有顯著性差異(P＜0.05)，因此可以認為mTK-1和mTK-2突變體比其野生型以及其它TK突變體(mTK-3和mTK-4)殺傷效果要好。而mTK-3和mTK-4的殺傷效果則比野生型TK差。
鑒于HSV1-mTK1表現(xiàn)出遠較野生型HSV1-TK為高的酶活性，下面進一步對用定點突變法對152氨基酸進行下列三個點突變的突變株進行酶活性比較分析152位精氨酸(mTK-5)、152位脯氨酸(mTK-6)和152位甘氨酸(mTK-7)(表1)。
為了在實驗動物體內(nèi)比較HSV1-TK突變株與其野生型的活性，用大鼠C63神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株作為受體細胞來建立穩(wěn)定細胞株。利用HA載體上所帶有G418抗性為選擇性標記，篩選出抗G418的C63細胞的混合群體(其中只有部分C6細胞表達HSV1-TK蛋白)，然后對這些細胞群體開展GCV依賴性的細胞試驗。
從圖10和圖11可清楚地看出，凡是涉及到152氨基酸突變(除了152脯氨酸以外)的突變體(mTK-1、mTK-2、mTK-6和們mTK-7)均較野生型HSV1-TK的活性為高。
很早就有人對HSV1-TK在自然界中多態(tài)性以及對其人為突變體開展酶學(xué)方面的研究。他們的初衷是研究某些皰疹病毒對已胸苷激酶為對象而設(shè)計的抗皰疹藥物的耐藥性機制。某些HSV1-TK的點突變體可導(dǎo)致皰疹病毒對GCV等胸苷類似物性的臨床藥物產(chǎn)生的耐藥性[17，18]。后來的研究者是通過點突變來探討HSV-1 TK和底物或抑制劑結(jié)合區(qū)的關(guān)鍵氨基酸的功能，來揭示TK的酶活性的生化機制[19]?，F(xiàn)在，學(xué)者們對TK突變體的研究是為了找到一個在基因治療實踐中更為有效的治療基因。[20-22]Kokoris[20]等人構(gòu)建的mutant 30含有6個氨基酸突變152位的A變成V，159位L變成I，160為I變成L，161位F變成A，168位A變成Y，169位L變成F。據(jù)報道該突變體30的胸苷激酶活性比野生型高出10倍，根據(jù)HSV1-TK蛋白質(zhì)/GCV復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)的分析，168位和169位氨基酸的改變是mutant 30生物活性提高的關(guān)鍵。另外，Black等人[21]還在159位、160位、161位及168位、169位進行了多位點突變，他們認為這幾個位點位于162-164位和170-172位的保守區(qū)的旁邊，是TK活性改變的關(guān)鍵位點。他們構(gòu)建的SR39突變體具有5個位點氨基酸改變159位的亮氨酸(L)變成異亮氨酸(I)，160位的異亮氨酸(I)變成苯丙氨酸(F)，161位的苯丙氨酸(F)變成亮氨酸(L)，168位的丙氨酸(A)變成苯丙氨酸(F)，169位的亮氨酸(L)變成甲硫氨酸(M)。據(jù)稱，SR39突變株的IC50是野生型TK的294倍。
與他們報道的極為不同的是，在本發(fā)明的GCV依賴性細胞毒性實驗系統(tǒng)中，mTK-3和mTK-4的活性比野生型弱。mTK-3僅比SR39在160F后多了一個F。而mTK-4與SR39相比，僅在159位改F位S。其中尤以突變株3為差，其活性近全無(圖9-11)。
本發(fā)明構(gòu)建了HSV-1 TK的7個突變體，并將其克隆到真核表達載體HA上，瞬時轉(zhuǎn)染U-2 OS細胞，用Western印跡測定它們的表達，并通過GCV殺傷實驗篩選到數(shù)個高活性的都與152氨基酸突變有關(guān)的TK突變株。另外，另外，mTK-1和mTK-2的活性接近，這也說明mTK-2的活性顯著提高并不與活性中心(155位-172位氨基酸)中的168位和169位氨基酸突變明顯相關(guān)，而是與152位氨基酸極為相關(guān)。
下面列出了在本發(fā)明中提及的所有參考文獻，所有這些文獻均納入本文作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種變化或修改，這些變化或修改均包括在本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
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序列表<110> 上海新世界基因技術(shù)開發(fā)有限公司<120> 皰疹病毒胸苷激酶突變體及其應(yīng)用<130> 023027<160> 17<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 1aaactcgaga tggcttcgta ccccggccat cagcac 36<210> 2<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 2aaaagatctt tagcctcccc catctcccgg gcaaac 36<210> 3<211> 42<212> DNA<213> 引物<400> 3accatcctcg ccgaccgcca tcccatcgcc tacttcctgt gc 42<210> 4<211> 33<212> DNA<213> 引物<400> 4ggcgaggatg gtgagggccg ggggcgggac atg 33<210> 5<211> 33<212> DNA<213> 引物<400> 5aaactcgaca tggcttcgta ccccggccat caa33<210> 6<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 6aaaagatctt cagttagcct cccccatctc ccgggc 36<210> 7<211> 33<212> DNA<213> 引物<400> 7gaccgccatc ccatcgcctt catgctgtgc tac33<210> 8<211> 33<212> DNA<213> 引物<400> 8ggcgatggga tggcggtcta agaagatggt gag33<210> 9<211> 35<212> DNA<213> 引物<400> 9gcccccggcc ctcactagtt tcttagaccg ccatc 35<210> 10<211> 35<212> DNA<213> 引物<400> 10gatggcggtc taagaaacta gtgagggccg ggggc 35<210> 11<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 11gggaggctgg gagttcacat ccaccgcccc cggccc 36<210> 12<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 12gggccggggg cggtggatgt gaactcccag cctccc 36<210> 13<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 13gggaggctgg gagttcacat ggaccgcccc cggccc 36<210> 14<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 14gggccggggg cggtccatgt gaactcccag cctccc 36<210> 15<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 15gggaggctgg gagttcacat agaccgcccc cggccc 36<210> 16<211> 36<212> DNA<213> 引物<400> 16gggccggggg cggtctatgt gaactcccag cctccc 36<210> 17<211> 376<212> PRT<213> 單純皰疹病毒(herpes simplex virus)<400> 17Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala1 5 10 15Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg20 25 30Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr35 40 45Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr50 55 60Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr65 70 75 80Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr85 90 95Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile100 105 110Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met115 120 125Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly130 135 140Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile145150 155 160Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg165 170 175Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala180 185 190Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu195 200 205Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly210 215 220Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly225 230 235 240Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg245 250 255Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala260 265 270Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu275 280 285Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu290 295 300Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg305 3l0 3l5 320Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys325 330 335Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val340 345 350Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe355 360 365Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn370 37權(quán)利要求
1.一種分離的皰疹病毒胸苷激酶突變體，其特征在于，所述皰疹病毒胸苷激酶突變體能較野生型更為高效地使核苷酸類似物磷酸化，其編碼蛋白具有152位氨基酸突變，且當152位突變?yōu)槔i氨酸時，168位和169位氨基酸不是酪氨酸和苯丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皰疹病毒胸苷激酶突變體，其特征在于，所述突變選自Ala152Val，Ala152Gly，Ala152Pro和Ala152Arg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皰疹病毒胸苷激酶突變體，其特征在于，當152位突變成非纈氨酸的氨基酸時，它還可具有168位和169位氨基酸突變Ala168Tyr和Leu169Phe。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皰疹病毒胸苷激酶突變體，其特征在于，所述皰疹病毒選自單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、水痘-帶狀皰疹病毒、絨猴皰疹病毒、貓皰疹病毒1型、假狂犬病病毒、馬皰疹病毒1型、牛皰疹病毒1型、火雞皰疹病毒、Marek′s疾病病毒、松鼠猴皰疹病毒和EB病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皰疹病毒胸苷激酶突變體，其特征在于，所述核苷酸類似物丙氧鳥苷、無環(huán)鳥苷、泛西洛維、布昔洛維、瓦昔洛維、三氟胸苷、1-2-脫氧、2-氟、δ-D-阿拉伯呋喃糖-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT 1-δ-D-阿拉伯呋喃糖胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脫氧尿苷、5-碘-5’-氨基-2，5’-二脫氧尿苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皰疹病毒胸苷激酶突變體，其特征在于，所述皰疹病毒胸苷激酶突變體只有152位氨基酸突變。
7.一種分離的多核苷酸序列，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的單純皰疹病毒胸苷激酶突變體。
8.一種重組表達載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求7所述的多核苷酸序列和所述多核苷酸序列操作性相連的表達調(diào)控序列。
9.一種提高細胞對核苷酸類似物依賴型殺傷的易感性的方法，其特征在于，該方法包括用權(quán)利要求8所述的重組表達載體轉(zhuǎn)染所述細胞。
10.權(quán)利要求1所述的皰疹病毒胸苷激酶突變體、權(quán)利要求7所述的分離的多核苷酸序列或權(quán)利要求8所述的重組表達載體在制備通過核苷酸類似物依賴型殺傷作用來起作用的抗腫瘤基因治療藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的皰疹病毒胸苷激酶突變體，所述皰疹病毒胸苷激酶突變體能較野生型更為高效地使核苷酸類似物磷酸化，其編碼蛋白具有152位氨基酸突變，且當152位突變?yōu)槔i氨酸時，168位和169位氨基酸不是酪氨酸和苯丙氨酸。本發(fā)明還提供了該突變體的編碼序列、重組載體以及其提高細胞對核苷酸類似物依賴型殺傷的易感性和其在包括制備基因治療在內(nèi)的臨床應(yīng)用中的應(yīng)用。上述突變體顯著減輕GCV的臨床用量，降低臨床毒性，而且還提高了胸苷激酶的旁觀者效應(yīng)。
文檔編號A61K38/45GK1464051SQ0211195
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月5日
發(fā)明者朱景德, 王曉梅 申請人:上海新世界基因技術(shù)開發(fā)有限公司