專利名稱：γ－氨基丁酸轉運蛋白抑制劑在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明述及生物醫(yī)藥領域，具體地講是關于γ-氨基丁酸(GABA)轉運蛋白抑制劑在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質，GABA轉運蛋白的生物學功能是通過攝取神經(jīng)突觸間隙的GABA神經(jīng)遞質來終止其神經(jīng)抑制信息傳遞，進而達到調節(jié)神經(jīng)信號傳遞的強度和時效性，以便實現(xiàn)復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡系統(tǒng)信號之間的協(xié)調性和統(tǒng)一性。具有專一性抑制功能的化合物已有報道，主要是3-哌啶甲酸和四氫煙酸及以這兩種化合物為母核的很多衍生物。除此以外還有很多化合物是GABA轉運蛋白的抑制劑，如高β-脯氨酸、四氫吡啶基異噁唑醇、五氫氮雜基異噁唑醇及其衍生物等等，有關這些化合物的合成及作為抑制劑的研究參見文獻[Andersen K.E.，et al.，J.Med.Chem.，2001，442152-2163；Krogsgaard-Larsen P.，et al.，CurrentPharmaceutical Design，2000，61193-1209]。目前GABA轉運蛋白抑制劑已有報道在臨床上治療癲癇，也提及tiagabine可能用于疼痛治療，并且這種藥副作用小，長期使用也是安全的(Genton p.，et al.，Epilepsia，2001，42(Suppl.3)42-45；Meldrum B.S.，et al.，Epilepsia，1999，40(Suppl.9)S2-S6)。專利WO9415618(1994年)也曾提及一些不正常的情況(如癲癇，肌陣攣，慢性痛)與GABA轉運蛋白的過高表達或過低表達相關。本發(fā)明則找到以γ-氨基丁酸轉運蛋白為靶標的一類化合物具有良好的鎮(zhèn)痛效果。
本發(fā)明找到上述這類具有抑制功能的化合物對鎮(zhèn)痛有良好的效果。這類化合物的作用機理是抑制GABA轉運蛋白的功能，使得突觸間隙GABA濃度升高，最終導致抑制性的GABA能神經(jīng)功能增強，從而達到鎮(zhèn)痛的效果。通過以下實驗可得到證實。γ-氨基丁酸轉運蛋白抑制劑包括所有能降低γ-氨基丁酸轉運蛋白攝取(轉運)功能的化合物，例如上述已知化合物3-哌啶甲酸、四氫煙酸、高β-脯氨酸、四氫吡啶基異噁唑醇、五氫氮雜基異噁唑醇以及它們的衍生物等，例舉化合物結構圖參見

圖1(上述衍生物并不限于這些例舉化合物)。這些化合物可按照前述文獻上報道的方法合成或從市場上購買。本發(fā)明選取其中一種競爭性抑制劑3-哌啶甲酸乙酯(是3-哌啶甲酸的衍生物)和一種非競爭性抑制劑N-(二苯基亞胺基乙醇基)-四氫煙酸(NO-711，是四氫煙酸的衍生物)為例來測定它們的鎮(zhèn)痛效果。分別采用熱致痛(甩尾)實驗、福爾馬林誘導的炎癥疼痛(舔爪)實驗和乙酸誘導的內(nèi)臟痛實驗來測試小鼠對3-哌啶甲酸乙酯和NO-711兩種化合物的反應，以生理鹽水作為對照。結果表明，給藥的小鼠對疼痛的反應顯著降低，說明3-哌啶甲酸乙酯和NO-711兩種化合物具有良好的鎮(zhèn)痛效果。用甩尾實驗測試小鼠經(jīng)過持續(xù)注射3-哌啶甲酸乙酯4天和8天后對急性熱致痛的反應，結果表明，給藥4天和給藥8天小鼠的甩尾反應與第一天無明顯差異，說明此化合物并不造成耐受。用條件型的地點偏好(CPP)模型測試小鼠對3-哌啶甲酸乙酯和NO-711兩種化合物的成癮性，結果表明，小鼠對這兩種化合物并不依賴。上述所有結果表明，無論是競爭性的GABA轉運蛋白抑制劑還是非競爭性的GABA轉運蛋白抑制劑均具有鎮(zhèn)痛作用，并具有不耐受，不成癮的優(yōu)點。
γ-氨基丁酸轉運蛋白抑制劑的鎮(zhèn)痛應用，可給予疼痛患者有效藥量的GABA轉運蛋白抑制劑藥物達到治療疼痛的目的。這些疼痛包括由各種原因例如熱刺激、炎癥、內(nèi)臟受損、癌癥等引起的疼痛疾病。臨床使用給藥方式可以是口服或注射?？诜幇闯Ｒ?guī)可制成片劑、膠囊、粉末、溶液等劑型，注射可以是肌肉注射、皮下注射或靜脈注射等。
使用γ-氨基丁酸轉運蛋白抑制劑在治療疼痛時，藥物的量取決于疾病的性質和程度以及病人已接受治療的情況。最終由處方醫(yī)生決定給予病人多少劑量，臨床使用的劑量為每公斤體重每日可使用0.1-2mg的GABA轉運蛋白抑制劑。
在制備γ-氨基丁酸轉運蛋白抑制劑鎮(zhèn)痛藥物過程中，藥物除含有GABA轉運蛋白抑制劑外，還可包括藥理學上可被接受的載體、溶劑、填充物、緩沖劑和穩(wěn)定劑等物質。所謂“藥理學上可接受的”是指不影響GABA轉運蛋白抑制劑生物活性的無毒物質。載體和其它物質的選擇取決于不同的給藥途徑。
本發(fā)明揭示了GABA轉運蛋白抑制劑具有鎮(zhèn)痛作用，為GABA轉運蛋白抑制劑開拓了一個新的應用領域。該抑制劑包括所有能抑制GABA轉運蛋白具有鎮(zhèn)痛作用的化合物。這類化合物除了具有良好的鎮(zhèn)痛作用以外，還具有顯著的優(yōu)點實驗證實，它們是非阿片類的小分子，不具有耐受性，可避免使用的劑量遞增，不具有成癮性，可避免用藥后的后繼戒斷治療。因此，這類化合物對治療疼痛具有臨床應用價值，γ-氨基丁酸轉運蛋白抑制劑可用于制備鎮(zhèn)痛藥物。
圖2顯示3-哌啶甲酸乙酯對熱致痛的鎮(zhèn)痛作用。結果表明3-哌啶甲酸乙酯(30mg/kg和60mg/kg)能鎮(zhèn)痛，并且是劑量依賴的(n＝8-10，**表示p＜0.01，3-哌啶甲酸乙酯對生理鹽水，one-way ANOVA評價顯著性)。
圖3顯示NO-711對熱致痛的鎮(zhèn)痛作用。結果表明NO-711(10mg/kg)能鎮(zhèn)痛，其鎮(zhèn)痛作用時間比3-哌啶甲酸乙酯長(n＝8-10，**表示p＜0.01，NO-711對生理鹽水，one-way ANOVA評價顯著性)。
圖4顯示3-哌啶甲酸乙酯和NO-711對福爾馬林誘導的足部炎癥疼痛的鎮(zhèn)痛作用。結果表明3-哌啶甲酸乙酯(60mg/kg)和NO-711(10mg/kg)能對炎癥痛起鎮(zhèn)痛作用，NO-711的鎮(zhèn)痛作用時間長，鎮(zhèn)痛效果比3-哌啶甲酸乙酯好(n＝8，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，3-哌啶甲酸乙酯和NO-711對生理鹽水； 表示p＜0.01，NO-711對3-哌啶甲酸乙酯，one-way ANOVA評價顯著性)。
圖5顯示3-哌啶甲酸乙酯對乙酸誘導的內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛作用，結果表明，3-哌啶甲酸乙酯(30mg/kg，60mg/kg)具有良好的內(nèi)臟痛鎮(zhèn)痛效果，高劑量的3-哌啶甲酸乙酯比低劑量的3-哌啶甲酸乙酯鎮(zhèn)痛效果好(n-8-9，**表示p＜0.01，3-哌啶甲酸乙酯對生理鹽水，one-way ANOVA評價顯著性)。
圖6顯示NO-711對乙酸誘導的內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛作用，結果表明，NO-711(5mg/kg，10mg/kg)具有良好的內(nèi)臟痛鎮(zhèn)痛效果，高劑量的NO-711比低劑量的NO-711鎮(zhèn)痛效果好。(n＝8-9，**表示p＜0.01，NO-711對生理鹽水，one-way ANOVA評價顯著性)。
圖7顯示3-哌啶甲酸乙酯(90mg/kg)持續(xù)注射4天和8天后不具有耐受性(a)。而嗎啡(8mg/kg)持續(xù)注射4天和8天后具有顯著的耐受性(b)。d1-第一天，d4-第四天，d8-第八天(n＝8，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，第4天和第8天對第1天，one-way ANOVA評價顯著性)。
圖8顯示3-哌啶甲酸乙酯(60mg/kg)和NO-711(10mg/kg)不具有成癮性，而嗎啡(8mg/kg)則具有顯著的成癮性(n＝8-10，*表示p＜0.05，給藥后對給藥前，one-wav ANOVA評價顯著性)。
實施例中的注射液配制及注射3-哌啶甲酸乙酯和NO-711兩種藥物各別均勻溶解于生理鹽水，3-哌啶甲酸乙酸配成濃度分別為1.5mg/ml，3mg/ml，4.5mg/ml和6mg/ml的溶液，NO-711配成濃度分別為0.5mg/ml和1mg/ml的溶液，腹腔注射用量為每克小鼠體重20μl相應濃度的藥物，皮下注射用量為每克小鼠體重10μl相應濃度的藥物。
實施例1
3-哌啶甲酸乙酯和NO-711對熱致痛的鎮(zhèn)痛效果測定每組小鼠為8-10只。甩尾實驗采用51.0℃熱水浸尾，實驗操作如下(1)將小鼠用軟布包裹起來，尾巴外露，(2)將3/4長度尾巴浸入熱水中，記錄從尾巴浸入熱水到甩尾的時間間隔，(3)小鼠通過腹腔注射分別給藥3-哌啶甲酸乙酯30mg/kg，60mg/kg，NO-711 10mg/kg或相同體積的生理鹽水，(4)藥物注射后分別在5、15、30、45、60、75、90、105、120分鐘時間點測試甩尾的延遲時間，即重復步驟(1)和(2)。為避免尾組織損傷，最長浸入熱水時間為12秒。鎮(zhèn)痛效果通過如下公式計算％MPE＝(給藥后的延遲時間-給藥前的延遲時間)/(12-給藥前的延遲時間)。用one-way ANOVA評價顯著性。
測定結果 3-哌啶甲酸乙酯和NO-711兩種藥物均具有對熱致痛的鎮(zhèn)痛作用(圖2，圖3；**表示p＜0.01)，不同劑量的3-哌啶甲酸乙酯產(chǎn)生不同的鎮(zhèn)痛效果(高劑量的鎮(zhèn)痛效果較低劑量的好)，3-哌啶甲酸乙酯鎮(zhèn)痛效果快，NO-711鎮(zhèn)痛效果較3-哌啶甲酸乙酯長。
實施例23-哌啶甲酸乙酯和NO-711對福爾馬林誘導的足部炎癥疼痛的鎮(zhèn)痛效果測定實驗操作如下(1)將小鼠單只放置，記錄小鼠舔或咬左爪的時間，每5分鐘間隔記錄一次，記錄三個時間段，(2)在小鼠左爪背部的皮下注射10μl5％的福爾馬林，立即記錄小鼠舔或咬注射部位的時間長短，每5分鐘間隔記錄一次，(3)在記錄完第二個時間間隔，即10分鐘后立即腹腔注射60mg/kg 3-哌啶甲酸乙酯、10mg/kg NO-711或相同體積的生理鹽水，(4)接著記錄小鼠舔爪或咬爪的時間，每5分鐘記錄一次，直至福爾馬林注射后55分鐘終止。用one-way ANOVA評價顯著性。每組小鼠為8只。
測定結果 三組小鼠在福爾馬林注射后的階段I(0-10分鐘)中痛覺反應無顯著差異，而階段II(10-55分鐘)即3-哌啶甲酸乙酯、NO-711或生理鹽水注射后，注射3-哌啶甲酸乙酯和NO-711的兩組動物比注射生理鹽水的動物對福爾馬林誘導的炎癥疼痛反應明顯降低，且NO-711的鎮(zhèn)痛效果較3-哌啶甲酸乙酯好(圖4中(a)及(b)；*表示p＜0.05，**表示p＜0.01， 表示p＜0.01)。
實施例33-哌啶甲酸乙酯和NO-711對乙酸誘導的內(nèi)臟疼痛的鎮(zhèn)痛效果測定實驗操作如下給小鼠皮下注射30mg/kg 3-哌啶甲酸乙酯、60mg/kg 3-哌啶甲酸乙酯、5mg/kg NO-711、10mg/kg NO-711或相同體積的生理鹽水(對照組)，立即放回小鼠籠中；(2)5分鐘之后取出小鼠，在小鼠腹腔內(nèi)注射0.6％乙酸(10μl/g)，立即放回小鼠籠中；(3)5分鐘之后開始記錄小鼠扭體的次數(shù)，持續(xù)記錄15分鐘，用one-way ANOVA評價顯著性，每組小鼠8-9只。
測定結果 注射3哌啶甲酸乙酯或NO-711的小鼠扭體次數(shù)比對照組小鼠扭體次數(shù)明顯減少，而且經(jīng)高劑量3-哌啶甲酸乙酯或NO-711預處理后的小鼠對內(nèi)臟痛的反應比低劑量3-哌啶甲酸乙酯或NO-711預處理的小鼠對內(nèi)臟痛的反應要弱，(參見圖5和圖6，**表示p＜0.01)。這些結果表明3-哌啶甲酸乙酯和NO-711對內(nèi)臟痛均具有良好的鎮(zhèn)痛效果，而且鎮(zhèn)痛的效果是劑量依賴的。
實施例43-哌啶甲酸乙酯和NO-711的耐受性與成癮性評價實驗。
藥品和動物來源同實施例1。
a.耐受性 分別給小鼠每天一次皮下注射90mg/kg 3-哌啶甲酸乙酯或8mg/kg嗎啡，持續(xù)8天，在第1，4，8天分別測試3-哌啶甲酸乙酯和嗎啡的鎮(zhèn)痛效果。方法采用甩尾實驗，操作同上。
b.成癮性 本實驗應用條件型的地點偏好(CPP)模型來測試3-哌啶甲酸乙酯和NO-711的成癮性。CPP模型由左右兩個顏色，粗糙度和氣味均不相同的小室及中間隔離的小室組成。左右兩邊隨機選定一室給藥，另一室喂生理鹽水。實驗操作如下(1)測試小鼠(給藥前)對左右兩間小室的偏好，即將小鼠放入中間小室，記錄小鼠在規(guī)定時間(18分鐘)內(nèi)分別在左右兩小室中停留的時間，(2)進行條件訓練(給藥)，即在第1，3，5天給小鼠皮下注射60mg/kg 3-哌啶甲酸乙酯或10mg/kg NO-711，立即將小鼠放入選定的喂藥小室，將其隔離于室內(nèi)20分鐘，在第2，4，6天注射相同體積的生理鹽水，將其放入選定喂生理鹽水的小室，同樣隔離20分鐘，(3)測試小鼠(給藥后)對喂藥小室和喂生理鹽水小室的偏好，即在第7天將小鼠置于中間小室內(nèi)，記錄小鼠在規(guī)定時間(18分鐘)內(nèi)分別在左右兩小室中停留的時間。計算小鼠喂藥小室停留時間相對于其兩者的百分率。用one-way ANOVA評價顯著性。每組小鼠為8-10只。對照實驗(生理鹽水和嗎啡)的操作同上。
實驗結果a.耐受性 持續(xù)注射3-哌啶甲酸乙酯4天和8天，3-哌啶甲酸乙酯對小鼠的鎮(zhèn)痛作用與第1天相比無顯著差異，表明持續(xù)給藥并不造成3-哌啶甲酸乙酯鎮(zhèn)痛藥效的減弱，即不具有耐受性。而持續(xù)注射嗎啡4天和8天，嗎啡對小鼠的鎮(zhèn)痛作用與第1天相比有顯著差異，表明持續(xù)嗎啡使用后，嗎啡的藥效大大降低，具有耐受性。(圖5中(a)及(b)；*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)。
b.成癮性 小鼠在訓練后對給3-哌啶甲酸乙酯和NO-711小室的偏好與訓練前相比并無顯著變化，與注射生理鹽水的小鼠相似，表明3-哌啶甲酸乙酯和NO-711兩種藥品對小鼠不造成依賴性，也無厭惡反應。而嗎啡組小鼠對給嗎啡的小室具有顯著的偏好(圖6；*表示p＜0.05)。
實施例5 鎮(zhèn)痛注射液的制備將3-哌啶甲酸乙酯1.5克、2.5克、5克各別溶解于1升水中，混合均勻后分裝成3mg/2ml/支、5mg/2ml/支、10mg/2ml/支濃度的注射液于安瓿瓶中密封，消毒殺菌，制成產(chǎn)品，避光保藏。
實施例6 鎮(zhèn)痛注射液的制備將NO-711 1.5克、2.5克、5克各別溶解于1升水中，混合均勻后分裝成3mg/2ml/支、5mg/2ml/支、10mg/2ml/支濃度的注射液于安瓿瓶中密封，消毒殺菌，制成產(chǎn)品，避光保藏。
實施例7 鎮(zhèn)痛片劑的制備按公知的制片技術，取NO-711 20克，糊精130克，淀粉100克，羧甲基淀粉50克，一起放入粉碎機內(nèi)充分混合25-30分鐘，粉碎至約80-120目，再加入硬脂酸鎂3克，均勻混合，經(jīng)制片機制成1000片片劑，每片重量約0.3克，每片含NO-711 20mg。
權利要求
1.一種γ-氨基丁酸轉運蛋白抑制劑(tiagabine除外)在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征是包括3-哌啶甲酸，四氫煙酸，高β-脯氨酸、四氫吡啶基異噁唑醇、五氫氮雜基異噁唑醇以及它們的衍生物(tiagabine除外)為抑制劑在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征是包括但并不限于下列這些化合物3-哌啶甲酸，四氫煙酸，3-哌啶甲酸乙酯，N-(二苯基亞胺基乙醇基)-四氫煙酸，雙(三氟甲基苯基)甲氧基乙基四氫煙酸，N-(二苯基-3-丁烯基)四氫煙酸，(二苯基甲氧乙基)-3-哌啶甲酸，二苯甲叉基乙氧基胺哌啶甲酸，二苯乙烯氧基乙基哌啶甲酸，二苯氨基乙氧基乙基哌啶甲酸，二苯丙氧基乙基哌啶甲酸，4，4-二對甲苯基-3-丁烯基哌啶甲酸，6-(3，3-二苯丙基)四氫煙酸，2-(3，3-二苯丙氧基)乙基哌啶甲酸，(10，11-二氫-二苯氮雜基)乙氧基乙基哌啶甲酸，2-(9-對甲氧基苯基)芴基乙氧基哌啶甲酸，三對甲氧基苯基甲氧基乙基哌啶甲酸，高β-脯氨酸，四氫吡啶基異噁唑醇，五氫氮雜基異噁唑醇，四氫吡啶基硫代異噁唑醇，五氫-4-胺基苯并異噁唑醇，五氫-4-甲胺基苯并異噁唑醇，4，4-二苯基-3-丁烯基四氫吡啶異噁唑醇，二苯基-3-丁烯基五氫氮雜異噁唑醇，3-氮雜芴基-4-鄰甲氧基苯基-吡啶醇，為抑制劑在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
全文摘要
一種γ－氨基丁酸(GABA)轉運蛋白抑制劑在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。該抑制劑包括所有能抑制GABA轉運蛋白具有鎮(zhèn)痛作用的化合物,例如3－哌啶甲酸,四氫煙酸,高β－脯氨酸、四氫吡啶基異噁唑醇(THPO)、五氫氮雜基異噁唑醇(THAO)以及它們的衍生物等。實驗結果表明,這類抑制GABA轉運蛋白的化合物具有鎮(zhèn)痛作用,并具有不耐受,不成癮的優(yōu)點。因此這類化合物對鎮(zhèn)痛治療具有臨床應用價值,可用于制備鎮(zhèn)痛藥物。
文檔編號A61K31/00GK1382441SQ0211177
公開日2002年12月4日 申請日期2002年5月21日 優(yōu)先權日2002年5月21日
發(fā)明者郭禮和, 胡佳華, 楊納, 馬映華, 費儉 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 上海賽達生物技術研究中心有限公司