專利名稱：調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的部分目的在于提供調(diào)節(jié)多譜系激酶(MLK)家族成員(活性)的方法，提供鑒別可調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白和促進(jìn)細(xì)胞生存或死亡的化合物的方法，提供鑒別可用來治療神經(jīng)退化紊亂和/或炎癥的化合物的方法，以及提供用能抑制多譜系激酶蛋白的化合物來治療神經(jīng)退化紊亂的方法。
背景技術(shù)：
MLK家族包括一組蛋白質(zhì)，該家族成員的激酶區(qū)域的蛋白質(zhì)序列與MAPKKK非常相近，但它們之間的相似更高于與其它MAPKKK的相似。MLK家族成員包括一種非常復(fù)雜的激酶級聯(lián)的蛋白質(zhì)，例如，強(qiáng)信號級聯(lián)，其包括，除其他因素之外，就中，尤其，N末端激酶(JNK)，依次調(diào)節(jié)，除其他因素之外，就中，尤其，轉(zhuǎn)錄因子，包括c-Jun，ATF2和ELK-1。JNK在美國專利號5534426，5593884，5605808，和WO95/03324中有描述，它們中的每一條均以其完整意義在本文中引用。
MLK家族部分包括下列基團(tuán)1)多譜系激酶1(MLK1)；2)多譜系激酶2(MLK2)；3)多譜系激酶3(MLK3)；4)亮氨酸拉鏈支撐激酶(LZK)；5)雙亮氨酸拉鏈支撐激酶(DLK)；和6)多譜系激酶6(MLK6)。MLK1具有與Tyr和Ser/Thr的專一性激酶相似的催化區(qū)域。Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。MLK2也具有與Tyr和Ser/Thr的專一性激酶相似的催化區(qū)域。Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。MLK2也以MST為人所熟知。Katoh等，Oncogene，1995，10，1447-1451。MLK3包含一種蛋白質(zhì)，其除具激酶區(qū)域外，還含2個(gè)與羧基末端堿區(qū)域相鄰近的亮氨酸拉鏈，和1個(gè)脯氨酸富集區(qū)域。Ing等，Oncogene，1994，9，1745-1750。MLK3也稱之為SPRK(Gallo等，J.Biol.Chem.，1994，269，15092-15100)和PTK1(Ezoe等，Oncogene，1994，9，935-938)。.LZK為亮氨酸拉鏈支撐激酶。Sakuma等，J.Biol.Chem.，1997，272，28622-28629。DLK具有1個(gè)激酶區(qū)域和2個(gè)推定的亮氨酸拉鏈基元。Holzman等，J.Biol.Chem.，1994，269，30808-30817。DLK也稱之為ZPK(Reddy等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1994，202，613-620)和MUK(Hirai等，Oncogene，1996，12，641-650)。MLK家族中的成員在下述文件中也有描述，如美國專利號5,676,945，5,554,523，WO93/15201，加拿大專利號2,148,898，Diener等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，9687-9692，DeAizpurua等，J.Biol.Chem.，1997，272，16364-16373，Tung等，Oncogene，1997，14，653-659，Sells等，Trends in Cell Biol.，1997，7，161-167，Mata等，J.Biol.Chem.，1996，271，16888-16896，Hirai等，J.Biol.Chem.，1997，272，15167-15173，F(xiàn)an等，J.Biol.Chem.，1996，271，24788-24793，Blouin等，DNA和Cell Biol.，1996，15，631-642，Pombo等，Nature，1995，377，750-754，Kiefer等，EMBO J.，1996，15，7013-7025，Hu等，Genes & Dev.，1996，10，2251-2264，Su等，EMBOJ.，1997，16，1279-1290，和Dorow等，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500。近來，另一種MLK相關(guān)的激酶已在EST數(shù)據(jù)庫鑒別出來。該克隆的DNA序列，MLK6，由7個(gè)overlapping entires給予描述。其克隆ID號為1007489，1460085，510915，666323，F(xiàn)5555，482188和178522，每一個(gè)序列均以其完整形式在本文中引用為參考文獻(xiàn)。在此以其全文引作參考。
近來，通過集落形成試驗(yàn)的測量，ZPK的穩(wěn)定表達(dá)已表明其可降低NIH 3T3纖維原細(xì)胞的增生能力。Bergeron等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1997，231，153-155。然而Bergeron等未能提供任何數(shù)據(jù)證明ZPK可調(diào)節(jié)ZPK底物的活性或ZPK是否能促進(jìn)細(xì)胞死亡。
編碼Myc-MLK2的構(gòu)建(基因)在Swiss 3T3細(xì)胞中的表達(dá)已證明在注射大約20小時(shí)后可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Nagata等，EMBO J.，1998，17 149-158。
本發(fā)明的申請者已開發(fā)出多種indolo和indeno化合物，和其他的事物(inter alia，)，其可抑制與過增生狀態(tài)(hyperproliferative states)相關(guān)的細(xì)胞的生長，并可抑制多種胚胎培養(yǎng)的死亡，如后根(神經(jīng))節(jié)(dorsal root ganglion)、striatal，superior cervical ganglia和運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞。美國專利號5,475,110，5,591,855，5,594,009，5,461,146，5,621,100，5,621,101，5,705,511，和5,756,494，分別轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人和各在此以其全文引作參考。列舉在美國專利號5,705,511中的具化學(xué)式G的化合物在本發(fā)明申請中具化學(xué)式I。本發(fā)明申請者也已證明運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞的凋亡可為K-252a的衍生物所抑制，其為indolocarbazole，也可調(diào)節(jié)壓力信號級聯(lián)(stress-signaling cascade)。Maroney等，J.Neurosci.，1998，18，104-111，在此以其全文引作參考。
由于篩選可調(diào)節(jié)壓力信號級聯(lián)的成員和促進(jìn)細(xì)胞死亡或生存的化合物的不充分，持續(xù)需要有新的篩選化合物的選擇性方法。此外，持續(xù)需求治療的篩選試驗(yàn)，來用于治療炎癥和神經(jīng)退化紊亂。本發(fā)明目的正在于此，以及其它重要的目標(biāo)。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供鑒別可調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性和促進(jìn)細(xì)胞生存的化合物的方法，其包括包括使包含多譜系激酶蛋白的細(xì)胞和該化合物相接觸的步驟，測定該化合物是否減低多譜系激酶蛋白的活性，是否促進(jìn)細(xì)胞生存。
本發(fā)明也提供鑒別可調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性和促進(jìn)細(xì)胞生存的化合物的方法，其包括包括使包含多譜系激酶蛋白的細(xì)胞和該化合物相接觸的步驟，測定該化合物是否增高多譜系激酶蛋白的活性，是否促進(jìn)細(xì)胞死亡。
本發(fā)明也提供鑒別可用于治療神經(jīng)退化紊亂的化合物的方法，其包括包括使包含多譜系激酶蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞提取物和該化合物相接觸，測定該化合物是否減低多譜系激酶蛋白的活性。
本發(fā)明也提供鑒別可用于治療炎癥的化合物的方法，其包括包括使包含多譜系激酶蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞提取物和該化合物相接觸，測定該化合物是否減低多譜系激酶蛋白的活性。
本發(fā)明也提供了治療有或懷疑有神經(jīng)退化紊亂的哺乳動物方法，其包括給上述哺乳動物服用可抑制或減低多譜系激酶蛋白活性的化合物。
本發(fā)明也提供了治療有炎癥的哺乳動物方法，其包括給上述哺乳動物服用可抑制或減低多譜系激酶蛋白活性的化合物。
本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白的方法，該方法包括將蛋白或包含蛋白的細(xì)胞與具有式II的化合物相接觸(插入化學(xué)式page 4)其中B環(huán)和F環(huán)，獨(dú)立地，且各自和與其相連的碳原子在一起，可供選擇的基團(tuán)包括不飽和的6元碳芳香環(huán)其中的1至3個(gè)碳原子可被氮原子所替換；
不飽和的5元碳芳香環(huán)；及不飽和的5元碳芳香環(huán)，其中1個(gè)碳原子被氧、氮、或硫原子所替換；2個(gè)碳原子被1個(gè)硫原子和1個(gè)氮原子，1個(gè)氧原子和1個(gè)氮原子、或2個(gè)氮原子所替換；或者3個(gè)碳原子被3個(gè)氮原子所替換；R1可供選擇的基團(tuán)包括H、可被取代或不可被取代的1-4個(gè)碳的烷基、可被取代或不可被取代的芳基、可被取代或不可被取代的芳烷基、可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳基、或可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳烷基；-C(＝O)R9，其中R9可供選擇的基團(tuán)包括烷基、芳基和雜環(huán)芳基；-OR10，其中R10可供選擇的基團(tuán)包括H和1-4個(gè)碳的烷基；-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pOR10，-O(CH2)pOR10和-O(CH2)pNR11R12，其中p為1-4；及其中R11和R12可供各自獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H和1-4個(gè)碳的烷基；或R11和R12一起形成化學(xué)式為-(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1可供選擇的基團(tuán)包括-O-，-S-、和-CH2-；R2可供選擇的基團(tuán)包括H，1-4個(gè)碳的烷基，-OH，1-4個(gè)碳的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pNR11R12，-O(CH2)pOR10，可被取代或不可被取代的6-10個(gè)碳的芳香烷基、及可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳香烷基；R3，R4，R5和R6可供各自獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H，芳基，雜環(huán)芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH-，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，--OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pOR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；-CH2OR14，其中R14為其羧基中的羥基移去后的氨基酸殘基；-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pNHR14，或-CH＝NNR2R2A其中R2A與R2相同；-S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9，-CH2S(O)yR14其中y為0、1、或2；1-8個(gè)碳的烷基、2-8個(gè)碳的烯基、2-8個(gè)碳的炔基，其中每一個(gè)烷基、烯基或炔基是不可取代的；或每一個(gè)烷基、烯基或炔基可為1-3個(gè)基團(tuán)所取代的，可供選擇的取代基團(tuán)包括6-10個(gè)碳的芳基、雜環(huán)芳基、芳甲氧基、雜環(huán)烷氧基、羥基烷氧基、alkyloxy-alkoxy，hydroxyalkylthio，alkoxy-alkylthio，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)pNR11R12，-X2(CH2)pC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)yR9，-X2(CH2)pNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-tetrahydropyranyl，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，NR10S(O)2R9，-S(O)yR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，-CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，-OR14，及5-7個(gè)碳的單糖其單糖的每一個(gè)羥基可各自獨(dú)立地不被取代或被H所替換，1-4個(gè)碳的烷基，2-5個(gè)碳的alkylcarbonyloxy，或1-4個(gè)碳的烷氧基；X2為O，S，或NR10；R7和R8可供獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H、1-4個(gè)碳的烷基、1-4個(gè)碳的烷氧基、可替代或不可替代的6-10個(gè)碳的芳烷基、可替代或不可替代的雜環(huán)芳烷基、-(CH2)pOR10，-(CH2)pOC(＝O)NR11R12，和-(CH2)pNR11R12；或R7和R8一起形成化學(xué)式為-CH2-X3-CH2-的連接基團(tuán)，其中X3為X2或鍵；m和n各自獨(dú)立地為0、1、或2；Y可供選擇的基團(tuán)包括-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)-，和-CH2-；Z可供選擇的基團(tuán)包括鍵，-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)-，-N(OR10)-，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)yR9)-，-N(S(O)yNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A與R9相同；R15和R16可供獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，hydroxyalkyl，和-CO2R10；R17可供選擇的基團(tuán)包括H、烷基、芳基、和雜環(huán)芳基；A1和A2可供選擇的基團(tuán)包括H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基團(tuán)其中的A1和A2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；B1和B2可供選擇的基團(tuán)包括H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基團(tuán)其中的B1和B2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；附帶條件是成對的A1和A2，或B1和B2中至少一對形成＝O。
本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性的方法，其包括用具化學(xué)式III的化合物與蛋白或含有蛋白的細(xì)胞接觸(插入化學(xué)式III page 7)其中Z1為H，Z2為H，或Z1和Z2一起形成＝O；R1可選擇的基團(tuán)包括H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3；
(插入化學(xué)式page 8)R2可選擇的基團(tuán)包括H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X可選擇的基團(tuán)包括H，CH2OH，CH2NH-絲氨酸，H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-Serine，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，CO2(CH2)4CH3；(插入化學(xué)式page 9)及R可選擇的基團(tuán)包括OH，和OCH3.
本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性的方法，其包括用具化學(xué)式IV的化合物與蛋白或含有蛋白的細(xì)胞接觸
(插入化學(xué)式page 9)IV其中Z1為H，Z2為H或Z1和Z2一起形成＝O；R1為H或Br；R2為H；R3為H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，(插入化學(xué)式)或及R4為H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
附圖簡述為了圖示本發(fā)明中具體實(shí)例，在附圖中顯示了某些特征。然而，必須認(rèn)識到，本發(fā)明不限于所示的精確的具體實(shí)例。


圖1為示意圖，顯示橋連茚并吡咯并咔唑的一般制備過程。
圖2為示意圖，顯示橋連茚并吡咯并咔唑的一般制備過程。
圖3為示意圖，顯示樹脂結(jié)合的茚并吡咯并咔唑的制備過程。
圖4為示意圖，顯示被保護(hù)的、可溶解的茚并吡咯并咔唑的制備過程。
圖5為示意圖，顯示中間產(chǎn)物V的制備過程。
圖6為示意圖，顯示用方法A制備橋連茚并吡咯并咔唑的過程。
圖7為示意圖，顯示用方法B制備橋連茚并吡咯并咔唑的過程。
圖8為示意圖，顯示B環(huán)取代的橋連茚并吡咯并咔唑的制備過程。
圖9為示意圖，顯示橋連茚并吡咯并咔唑的E環(huán)的衍生過程。
圖10顯示兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，描述在缺乏NGF時(shí)培養(yǎng)5天后存活的神經(jīng)分化PC-12細(xì)胞的保留數(shù)量。結(jié)果以每組內(nèi)NGF對照的百分比顯示(缺乏NGF組內(nèi)的載體對照，n＝12；所有其它組內(nèi)，n＝3)。載體對照和細(xì)胞穩(wěn)定池中的差異顯示在缺乏NGF圖11A描述在缺乏NGF時(shí)培養(yǎng)5天后存活的神經(jīng)分化PC-12細(xì)胞的保留數(shù)量。結(jié)果以每組內(nèi)NGF對照的百分比顯示(缺乏NGF組內(nèi)的載體對照，n＝12；所有其它組內(nèi)，n＝3)。
圖11B描述在缺乏NGF時(shí)培養(yǎng)5天后存活的神經(jīng)分化PC-12細(xì)胞的保留數(shù)量。結(jié)果以每組內(nèi)NGF對照的百分比顯示(缺乏NGF組內(nèi)的載體對照，n＝12；所有其它組內(nèi)，n＝3)。
圖12描述在缺乏NGF時(shí)培養(yǎng)5天后存活的神經(jīng)分化PC-12細(xì)胞的保留數(shù)量。結(jié)果以每組內(nèi)NGF對照的百分比顯示(缺乏NGF組內(nèi)的載體對照，n＝12；所有其它組內(nèi)，n＝3)。
圖13描述在缺乏NGF時(shí)培養(yǎng)5天后存活的神經(jīng)分化PC-12細(xì)胞的保留數(shù)量。結(jié)果以每組內(nèi)NGF對照的百分比顯示(缺乏NGF組內(nèi)的載體對照，n＝12；所有其它組內(nèi)，n＝3)。
圖14描述在缺乏NGF時(shí)培養(yǎng)5天后存活的神經(jīng)分化PC-12細(xì)胞的保留數(shù)量。結(jié)果以每組內(nèi)NGF對照的百分比顯示(缺乏NGF組內(nèi)的載體對照，n＝12；所有其它組內(nèi)，n＝3)。
圖15A描述在缺乏NGF時(shí)培養(yǎng)5天后存活的神經(jīng)分化PC-12細(xì)胞的保留數(shù)量。結(jié)果以每組內(nèi)NGF對照的百分比顯示(缺乏NGF組內(nèi)的載體對照，n＝12；所有其它組內(nèi)，n＝3)。
圖15B表示在從圖15A所述樣品中的免疫沉淀/激酶反應(yīng)中剩余的百分活性的定量圖。柱代表一式兩份樣品的平均值，其中誤差棒表示平均值的范圍。
圖15C表示僅過表達(dá)HA-JNK1的細(xì)胞的免疫沉淀/激酶反應(yīng)中的32P-標(biāo)記c-jun的量，或采用如所示的MEKK1各種量的cDNA，并用0.025％DMSO(對照)或500nM的化合物III-3(參見，表3)處理。柱表示一式兩份樣品的平均值，其中誤差棒表示平均值的范圍。
圖16表示化合物III-3以濃度依賴方式促進(jìn)神經(jīng)元存活。將分離的神經(jīng)元從交感神經(jīng)節(jié)(SG)(A)、后根神經(jīng)節(jié)(DRG)(B)、睫狀神經(jīng)節(jié)(CG)(C)和運(yùn)動神經(jīng)元(MN)(D)中培養(yǎng)，在所示營養(yǎng)因子的存在或缺乏下。在鋪板48小時(shí)之后對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，如材料和方法中所述。數(shù)據(jù)表示重復(fù)三次和四次測定的平均值±SD。所示為三次實(shí)驗(yàn)中的一次。
圖17表示下列物質(zhì)培養(yǎng)的反相微型圖，E12 DRG(A、E)、E9交感神經(jīng)元(B、F)、E8睫狀神經(jīng)元(C、G)和E5.5運(yùn)動神經(jīng)元(D、H)，在所示營養(yǎng)因子(對于交感神經(jīng)元20ng/ml NGF以及對于睫狀神經(jīng)元10ng/ml，對于運(yùn)動神經(jīng)元(A-D)30ug/ml肌肉抽提物(MEX)的存在或缺乏下或在1uM化合物III-3(E-H)存在下，培養(yǎng)48小時(shí)之后(對睫狀神經(jīng)元24小時(shí)之后)。誤差棒＝200um。
圖18表示下列物質(zhì)培養(yǎng)的反相微型圖，E12 DRG(A、E)、E9交感神經(jīng)元(B、F)、E8睫狀神經(jīng)元(C、G)和E5.5運(yùn)動神經(jīng)元(D、H)，在所示營養(yǎng)因子(對于培養(yǎng)48小時(shí)之后(對睫狀神經(jīng)元24小時(shí)之后)。(A)對照DMSO；(B)20ng/ml NGF；(C)250nM化合物III-3。48小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，并將移植物用4％甲醛的磷酸緩沖液固定。
圖19表示眾多雞運(yùn)動神經(jīng)元，在用特異性劑量的化合物III-3每天處理(E5-9)后的在E10的存活。所示數(shù)據(jù)是5-6只動物/處理組的平均值±S.D.。所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。數(shù)據(jù)來自一次代表性的實(shí)驗(yàn)，并表示柱的一邊。*p＜0.01，**p＜0.001，在化合物III-3和對照組之間的學(xué)生氏測定，采用Bonferroni校正。
圖20表示許多運(yùn)動神經(jīng)元，在雌性大鼠脊柱核(SNB)，第PN10或PN60天，在用化合物III-3或?qū)φ彰浇槲?5％SolutolTM)每日處理(PN1-5)之后。在第PN10(A，B)或PN 60(B)，將大鼠處死，并將含有SNB的脊柱切開，為組織學(xué)加工；在系列切片中計(jì)數(shù)蘭染色的運(yùn)功神經(jīng)元，如前所述(Wingfield等，Steroids，1975，26，311-327)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.從4-8動物/處理組。
圖21ChAT免疫反應(yīng)的喪失，在成年大鼠的舌下神經(jīng)外科術(shù)之后，用化合物III-3處理。舌下核的光微照片用對照媒介物(A)(5％SolutolTM)每日處理之后，以及(B)200ug的化合物III-3在切片位點(diǎn)施用。(C)在第PN10(A，B)或PN60(B)，將大鼠處死，并將含有SNB的脊柱切開，為組織學(xué)加工；在系列切片中計(jì)數(shù)蘭染色的運(yùn)功神經(jīng)元，結(jié)果表示為ChAT-免疫反應(yīng)運(yùn)功神經(jīng)元的百分比，100％定義為ChAT免疫反應(yīng)運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)。
圖22顯示MLK-3途徑的抑制，其表明體內(nèi)磷酸化作用的功效和阻斷。圖22A表示黑質(zhì)酪氨酸酶免疫神經(jīng)元的增加，在用全身施用化合物III-3的MPTP損傷后。圖22B是代表性的免疫印跡，表示MPTP誘導(dǎo)的增加，在磷酸化MKK4水平上。圖22C描述了代表性免疫印跡和ELISA，顯示MPTP的衰減誘導(dǎo)磷酸化的MKK4，在化合物III-3存在下。
圖23顯示IL-2在Jurkat細(xì)胞中的感應(yīng)。圖23A顯示IL-2感應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程。圖23B顯示化合物III-3對IL-2感應(yīng)的抑制。圖23C顯示化合物III-3和化合物I-4對IL-2感應(yīng)的抑制。
本發(fā)明優(yōu)選具體實(shí)例的描述如上述所用并貫穿于全部公開文件，除非另有指明，下列術(shù)語應(yīng)該理解為具如下意思。
“細(xì)胞編程性死亡”指細(xì)胞死亡的特殊形態(tài)類型，其特征在于細(xì)胞片段化，細(xì)胞核成為膜連顆粒。細(xì)胞凋亡的引發(fā)可能是，例如，用可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的化合物來治療，這些化合物有etoposide，staurosporine，腫瘤壞死因子α，神經(jīng)酰胺，以及類似物，或由于如X放射環(huán)境。
術(shù)語“細(xì)胞死亡”指又細(xì)胞凋亡、壞死、或其它為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員廣為知道的方式引起的細(xì)胞的死亡?！凹?xì)胞死亡”的特征在于，例如，與未處理的對照細(xì)胞群相比，細(xì)胞的總數(shù)下降或細(xì)胞的生存能力下降。與對照細(xì)胞群相比，“促進(jìn)細(xì)胞死亡”的化合物導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目的下降或細(xì)胞生存能力下降。與之相反，“促進(jìn)細(xì)胞生存”的化合物導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞生存能力增強(qiáng)，或減慢或減低細(xì)胞的死亡率。
術(shù)語“選擇性反應(yīng)”或“特殊鍵連”描述化合物與MLK蛋白有直接地物理或化學(xué)相互作用。相反，沒有“選擇性反應(yīng)”或“特殊鍵連”的化合物可影響MLK蛋白下游或上游的蛋白，進(jìn)而影響MLK蛋白的活性，但不與MLK蛋白有直接地物理或化學(xué)的相互作用。
術(shù)語“調(diào)節(jié)”指增高或減低特殊蛋白質(zhì)或其底物的活性。
本發(fā)明的部分目的也在于提供鑒別化合物的方法，該化合物可調(diào)節(jié)MLK蛋白活性和促進(jìn)細(xì)胞的生存或死亡。導(dǎo)致MLK蛋白活性增加的化合物可促進(jìn)細(xì)胞死亡，而導(dǎo)致MLK蛋白活性下降的化合物可細(xì)胞生存。
MLK蛋白可能是鑒別屬于MLK蛋白組群中的任何一種。優(yōu)選的MLK蛋白選自下列組群，包括MLK1，MLK2，MLK3(SPRK，PTK1)，LZK，DZK(ZPK，MUK)，和MLK6，其已在上文描述。在本發(fā)明的優(yōu)化的具體實(shí)例中，鑒別化合物與MLK蛋白直接相互作用或結(jié)合的方法是結(jié)合試驗(yàn)、激酶試驗(yàn)、或其它等價(jià)試驗(yàn)。
為了鑒別可MLK蛋白活性和促進(jìn)細(xì)胞生存或死亡的化合物，要用試驗(yàn)的化合物接觸包含MLK蛋白的細(xì)胞。這種接觸在為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的緩沖液或培養(yǎng)基中進(jìn)行?；蛘?，此接觸發(fā)生在動物體內(nèi)，例如，老鼠或?yàn)楸绢I(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的其它適合的動物。接觸通過使用制藥上的合成物來實(shí)現(xiàn)，該合成物包含試驗(yàn)的化合物和制藥上可接受的鹽、載體、或稀釋液。此外，要使用不同數(shù)量的細(xì)胞和不同濃度的試驗(yàn)化合物。測定試驗(yàn)的化合物是否增強(qiáng)或降低MLK蛋白的活性。此外，也測定試驗(yàn)的化合物是否促進(jìn)細(xì)胞的生存或死亡。
用試驗(yàn)化合物接觸的細(xì)胞可以是任何一種哺乳動物細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞是陷于神經(jīng)退化疾病的神經(jīng)細(xì)胞。為了本發(fā)明的目的，“神經(jīng)退化疾病”、“神經(jīng)退化紊亂”、和“神經(jīng)退化狀態(tài)”是可互換的并用于描述關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞或包含在神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞的任何疾病或紊亂，包括，但不限于，老年癡呆癥、運(yùn)動神經(jīng)疾病、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、帕金森氏癥、腦血管疾病、缺血性狀態(tài)、AIDS性癡呆、癲癇癥、亨廷頓癥、和大腦或脊髓的震蕩性或穿透性損傷。阿爾次海默氏病、運(yùn)功的神經(jīng)元病、amyotrophic脊側(cè)索硬化、帕金森氏病、腦血管病、局部缺血癥、AIDS dementia，epilepsy，亨廷頓癥和concussive or penetrating對大腦或脊柱的傷害。
有多種技術(shù)可以測定MLK蛋白的活性。例如，可通過檢測MLK蛋白底物的活性來測定MLK的活性。這類底物為本領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知和容易地識別。優(yōu)選的底物是活化蛋白激酶的激酶家族的分裂素中的一種或是活化蛋白激酶家族的分裂素或是進(jìn)一步下游途徑的底物，其包括，但不限于，選自下列組群的蛋白，包括JNK1，JNK2，JNK3，ERK1，ERK2，p38α，p38β，p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEK1)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELK1，和AEX-3的哺乳動物同族體，也可是Ser/Thr蛋白激酶的一般底物，如髓磷脂堿性蛋白(MBP)。測定底物活性的試劑和方法為本領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知。
MLK的存在也可通過檢測MLK蛋白的量或編碼MLK蛋白的mRNA的量來測定。所用試劑包括抗體和寡核苷酸探針，以及檢測DNA或蛋白量的方法，Northern和Western雜交，其為本領(lǐng)域的專業(yè)人士所熟知。MLK蛋白活性也可通過體內(nèi)激酶試驗(yàn)來測定，體內(nèi)激酶試驗(yàn)也為本領(lǐng)域的專業(yè)人士所熟知。其它為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人士所熟知的檢測蛋白活性的技術(shù)也可包括在本發(fā)明中。因而，本領(lǐng)域的專業(yè)人士可以測定試驗(yàn)的化合物是否可調(diào)節(jié)，即增強(qiáng)或減低，MLK蛋白的活性。
可通過多種方法測定試驗(yàn)的化合物是否促進(jìn)細(xì)胞的生存或死亡。優(yōu)選地，對細(xì)胞生存或死亡的促進(jìn)，可通過用有死亡危險(xiǎn)的細(xì)胞來測定，比較用試驗(yàn)的化合物接觸細(xì)胞后仍然保持存活的數(shù)量和不用試驗(yàn)的化合物接觸細(xì)胞后仍然保持存活的數(shù)量。優(yōu)選的細(xì)胞為前編程序性死亡的初始胚胎運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞。初始胚胎運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞的描述見于Maroney等，J.Neurosci.，1998，18，104-111。在此以其全文引作參考。除非用試驗(yàn)的化合物援救，否則初始胚胎運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞將會死亡。因此，在用試驗(yàn)化合物處理的運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞群中比在未用試驗(yàn)化合物處理的運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞群中有更多數(shù)目的存活運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞顯示試驗(yàn)的化合物可促進(jìn)細(xì)胞生存。相反，在用試驗(yàn)化合物處理的運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞群中比在未用試驗(yàn)化合物處理的運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞群中有更少數(shù)目的存活運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞顯示試驗(yàn)的化合物可促進(jìn)細(xì)胞死亡。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，正常細(xì)胞、或野生型細(xì)胞通過MLK蛋白的過表達(dá)而轉(zhuǎn)換成有死亡危險(xiǎn)的細(xì)胞，如下述的實(shí)施例所描述，然后用試驗(yàn)的化合物與之接觸。除非用試驗(yàn)化合物援救，否則MLK蛋白過表達(dá)的細(xì)胞可能死亡。MLK蛋白的過表達(dá)可由能夠表達(dá)特殊蛋白的載體在細(xì)胞中完成。所用表達(dá)載體為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人士所熟知。此外，制備表達(dá)載體的方法也為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人士所熟知。表達(dá)任何一種MLK蛋白的表達(dá)載體的制備與實(shí)施例中所描述的相似。在用試驗(yàn)化合物處理的過表達(dá)細(xì)胞群中比在未用試驗(yàn)化合物處理的過表達(dá)細(xì)胞群中有更多數(shù)目的存活細(xì)胞顯示試驗(yàn)的化合物可促進(jìn)細(xì)胞生存。相反，在用試驗(yàn)化合物處理的過表達(dá)細(xì)胞群中比在未用試驗(yàn)化合物處理的過表達(dá)細(xì)胞群中有更少數(shù)目的存活細(xì)胞顯示試驗(yàn)的化合物可促進(jìn)細(xì)胞死亡。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)例中，對細(xì)胞生存的促進(jìn)，可通過觀察和檢測細(xì)胞凋亡的降低來測定。細(xì)胞質(zhì)收縮和細(xì)胞核濃縮與細(xì)胞凋亡相聯(lián)系。因此本領(lǐng)域的專業(yè)人士可通過檢測或觀察細(xì)胞質(zhì)收縮和/或細(xì)胞核濃縮來測定細(xì)胞凋亡的降低。此外，本領(lǐng)域的專業(yè)人士可用常規(guī)的染色技術(shù)測定細(xì)胞凋亡。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)例中，正常的、野生型神經(jīng)細(xì)胞可被用來鑒別化合物是否促進(jìn)細(xì)胞死亡。若未被試驗(yàn)化合物誘導(dǎo)至死亡，正常神經(jīng)細(xì)胞將存活。在用試驗(yàn)化合物處理的正常細(xì)胞群中比在未用試驗(yàn)化合物處理的正常細(xì)胞群中有更少數(shù)目的存活細(xì)胞顯示試驗(yàn)的化合物可促進(jìn)細(xì)胞死亡。相反，在用試驗(yàn)化合物處理的正常細(xì)胞群中比在未用試驗(yàn)化合物處理的正常細(xì)胞群中有更多或相等數(shù)目的存活細(xì)胞不能顯示試驗(yàn)的化合物可促進(jìn)細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的部分目的也在于提供調(diào)節(jié)MLK蛋白活性的方法，其包括用具有下列化學(xué)式G的化合物(本文表示為化學(xué)式I)接觸蛋白或含有該蛋白的細(xì)胞，該化合列在美國專利號為5,705,511的專利中，其轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人并以其全文在此引作參考。
本發(fā)明的部分目的也在于提供調(diào)節(jié)MLK蛋白活性的方法，其包括用具有下列化學(xué)式III的化合物接觸蛋白或含有該蛋白的細(xì)胞III式中Z1為H，Z2為H，或Z1和Z2一起形成＝O；R1可供選擇的基團(tuán)包括H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O，n-丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
及R2可供選擇的基團(tuán)包括H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X可供選擇的基團(tuán)包括H，CH2OH，CH2NH-絲氨酸H，CO2CH3，CONHC6H52，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-氨基乙酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-絲氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2n-己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下列化學(xué)式之一以及R可供選擇的基團(tuán)包括OH，和OCH3。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)例中，Z1和Z2為H，X為CO2CH3，R1為NHCONHC2H5，R2為CH2CH2(2-吡啶基)，以及R為OH。在本發(fā)明其它的優(yōu)選情形中，Z1和Z2為H，X為CO2CH3；R1和R2為CH2OCH2OCH2CH3，而R為OH；或Z1和Z2為H，X為CO2CH3，R1和R2為CH2SCH2CH3，而R為OH；或Z1，Z2，R1，和R2均為H，X為CO2CH3；而R為OH；或Z1，Z2，R1，和R2均為H，X為CO2(CH2)4CH3，而R為OH；或Z1，Z2，和R1為H，R2為CH2OH，X為CO2CH3，而R為OH；或Z1，和Z2為H，R1和R2為H2S[3-(1，2，4-三嗪)]，X為CO2CH3，而R為OH；或Z1，和Z2為H，R1為Br，R2為I，X為CO2CH3；而R為OH；或Z1，Z2為H，R1和R2為CH2CH2SCH3，X為CO2CH3，而R為OH；或Z1，Z2，R1，和R2為H，X為CO2CH3，而R為OCH3；或Z1和Z2一起形成＝O，R1和R2為Br，X為CO2CH3，而R為OH。
本發(fā)明的部分目的也在于提供調(diào)節(jié)MLK蛋白活性的方法，其包括用具有下列化學(xué)式II的化合物接觸蛋白或含有該蛋白的細(xì)胞II式中B環(huán)和F環(huán)，獨(dú)立地，各自與其相連的碳原子在一起，選自下列基團(tuán)，包括
a)不飽和的6元碳芳香環(huán)，其中1至3個(gè)碳原子可被氮原子代替；b)不飽和的5元碳芳香環(huán)；和c)不飽和的5元碳芳香環(huán)，其中1個(gè)碳原子被氧、氮、或硫原子所代替；2個(gè)碳原子被1個(gè)硫原子和1個(gè)氮原子，1個(gè)氧原子和1個(gè)氮原子，或2個(gè)氮原子所代替；或3個(gè)碳原子被3個(gè)氮原子所代替；R1可供選擇的基團(tuán)包括a)H、可被取代或不可被取代的1-4個(gè)碳的烷基、可被取代或不可被取代的芳基、可被取代或不可被取代的芳烷基、可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳基、或可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳烷基；b)-C(＝O)R9，其中R9可供選擇的基團(tuán)包括烷基、芳基和雜環(huán)芳基；c)-OR10，其中R10可供選擇的基團(tuán)包括H和1-4個(gè)碳的烷基；d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pOR10，-O(CH2)pOR10和-O(CH2)pNR11R12，其中p為1-4；及其中R11和R12可供各自獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H和1-4個(gè)碳的烷基；或R11和R12一起形成化學(xué)式為-(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1可供選擇的基團(tuán)包括-O-，-S-、和-CH2-；R2可供選擇的基團(tuán)包括H，1-4個(gè)碳的烷基，-OH，1-4個(gè)碳的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pNR11R12，-O(CH2)pOR10，可被取代或不可被取代的6-10個(gè)碳的芳香烷基、及可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳香烷基；R3，R4，R5和R6可供各自獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H，芳基，雜環(huán)芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH-，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，--OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pOR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；
-CH2OR14，其中R14為其羧基中的羥基移去后的氨基酸殘基；-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pNHR14，或-CH＝NNR2R2A其中R2A與R2相同；-S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9，-CH2S(O)yR14其中y為0、1、或2；1-8個(gè)碳的烷基、2-8個(gè)碳的烯基、2-8個(gè)碳的炔基，其中每一個(gè)烷基、烯基或炔基是不可取代的；或每一個(gè)烷基、烯基或炔基可為1-3個(gè)基團(tuán)所取代的，可供選擇的取代基團(tuán)包括6-10個(gè)碳的芳基、雜環(huán)芳基、芳甲氧基、雜環(huán)烷氧基，羥基烷氧基，alkyloxy-alkoxy，hydroxyalkylthio，alkoxy-alkylthio，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)pNR11R12，-X2(CH2)pC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)yR9，-X2(CH2)pNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-tetrahydropyranyl，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，NR10S(O)2R9，-S(O)yR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，-CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，-OR14，及5-7個(gè)碳的單糖其單糖的每一個(gè)羥基可各自獨(dú)立地不被取代或被H所替換，1-4個(gè)碳的烷基，2-5個(gè)碳的alkylcarbonyloxy，或1-4個(gè)碳的烷氧基；X2為O，S，或NR10；R7和R8可供獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H、1-4個(gè)碳的烷基、1-4個(gè)碳的烷氧基、可替代或不可替代的6-10個(gè)碳的芳烷基、可替代或不可替代的雜環(huán)芳烷基、-(CH2)pOR10，-(CH2)pOC(＝O)NR11R12，和-(CH2)pNR11R12；或R7和R8一起形成化學(xué)式為-CH2-X3-CH2-的連接基團(tuán)，其中X3為X2或鍵；m和n各自獨(dú)立地為0、1、或2；Y可供選擇的基團(tuán)包括-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)-，和-CH2-；Z可供選擇的基團(tuán)包括鍵，-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)-，-N(OR10)-，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)yR9)-，-N(S(O)yNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A與R9相同；R15和R16可供獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羥基烷基，和-CO2R10；R17可供選擇的基團(tuán)包括H、烷基、芳基、和雜環(huán)芳基；A1和A2可供選擇的基團(tuán)包括H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基團(tuán)其中的A1和A2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；B1和B2可供選擇的基團(tuán)包括H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基團(tuán)其中的B1和B2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；附帶條件是成對的A1和A2，或B1和B2中至少一對形成＝O。
本發(fā)明的部分目的也在于提供調(diào)節(jié)MLK蛋白活性的方法，其包括用具有下列化學(xué)式IV的化合物接觸蛋白或含有該蛋白的細(xì)胞page 22IV式中Z1為H，Z2為H或Z1和Z2一起形成＝O；R1為H或Br；R2為H；R3為H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，(插入化學(xué)式page 22)或及R4為H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)例中，R1，R2，R4，Z1，和Z2為H，而R3為CH2CH＝CH2。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)例中，R1為Br，而R2，R3，R4，Z1和Z2均為H；或R1，R2，Z1和Z2均為H，而R3和R4為CH2CH＝CH2；或R1，R2，R3，Z1，和Z2均為H，而a R4為CH2CH＝CH2；或R1，R2，Z1，和Z2均為H，而R3和R4為CH2CH2CH2OH；或R1，R2，R4，Z1，和Z2為H，而R3為(插入化學(xué)式page 22)本發(fā)明也提供了鑒別可用于治療神經(jīng)退化紊亂的化合物的方法，其包括用化合物接觸包含多譜系激酶蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并測定該化合物減低多譜系激酶蛋白活性的(狀況)。所用的細(xì)胞或提取物，包括上文所描述過的。用本發(fā)明的方法所發(fā)現(xiàn)的化合物(即，可抑制或減低多譜系激酶蛋白活性的化合物)可用于治療神經(jīng)退化紊亂。優(yōu)選的蛋白選自以下組群，包括多譜系激酶1、多譜系激酶2、多譜系激酶3、亮氨酸拉鏈支撐激酶、雙亮氨酸拉鏈支撐激酶和多譜系激酶6。細(xì)胞可在體外或體內(nèi)接觸。優(yōu)選的蛋白活性的測定方法是通過測定活性或所用蛋白底物的磷酸化作用的狀態(tài)。優(yōu)選的底物選自以下組群，包括JNK1，JNK2，JNK3，ERK1，ERK2，p38α，p38β，p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEK1)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELK1，和AEX-3的哺乳動物同族體，以及通用的Ser/Thr底物，例如，髓磷脂堿性蛋白(MBP)。蛋白的活性測定也可通過測定蛋白底物的活性、蛋白底物的量、或編碼蛋白底物的mRNA來實(shí)現(xiàn)。蛋白的活性測定也可通過體外激酶試驗(yàn)或結(jié)合試驗(yàn)來進(jìn)行。優(yōu)選的細(xì)胞為初始胚胎運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞，多譜系激酶蛋白過度表達(dá)的細(xì)胞，或神經(jīng)細(xì)胞，但也可以是任一細(xì)胞或其提取物。優(yōu)選地，與多譜系激酶蛋白直接結(jié)合的化合物的鑒別如上文所描述。
本發(fā)明也提供了鑒別可用于治療炎癥的化合物的方法，其包括用化合物接觸包含多譜系激酶蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并測定該化合物減低多譜系激酶蛋白活性的(狀況)。所用的細(xì)胞或提取物，包括上文所描述過的。用本發(fā)明的方法所發(fā)現(xiàn)的化合物(即，可抑制或減低多譜系激酶蛋白活性的化合物)可用于治療炎癥。優(yōu)選的蛋白選自以下組群，包括多譜系激酶1、多譜系激酶2、多譜系激酶3、亮氨酸拉鏈支撐激酶、雙亮氨酸拉鏈支撐激酶和多譜系激酶6。細(xì)胞可在體外或體內(nèi)接觸。優(yōu)選的蛋白活性的測定方法是通過測定活性或所用蛋白底物的磷酸化作用的狀態(tài)。優(yōu)選的底物選自以下組群，包括JNK1，JNK2，JNK3，ERK1，ERK2，p38α，p38β，p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEK1)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELK1，和AEX-3的哺乳動物同族體，以及通用的Ser/Thr底物，例如，髓磷脂堿性蛋白(MBP)。蛋白的活性測定也可通過測定蛋白底物的活性、蛋白底物的量、或編碼蛋白底物的mRNA來實(shí)現(xiàn)。蛋白的活性測定也可通過體外激酶試驗(yàn)或結(jié)合試驗(yàn)來進(jìn)行。
優(yōu)選的細(xì)胞為初始胚胎運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞，多譜系激酶蛋白過度表達(dá)的細(xì)胞，或神經(jīng)細(xì)胞，但也可以是任一細(xì)胞或其提取物。所用的細(xì)胞包括，但不限于，陷于炎癥的細(xì)胞，諸如為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它白血細(xì)胞。優(yōu)選地，與多譜系激酶蛋白直接結(jié)合的化合物的鑒別如上文所描述。
本發(fā)明也提供了治療有或懷疑有神經(jīng)退化紊亂的哺乳動物方法，其包括給上述哺乳動物服用可抑制或減低多譜系激酶蛋白活性的化合物?？梢种苹驕p低多譜系激酶蛋白活性的化合物包括，但不限于，具化學(xué)式I、II、III、和IV的化合物。優(yōu)選的化合物包括上文所描述的那些化合物，及關(guān)于篩選可調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白和促進(jìn)細(xì)胞存活或死亡的化合物的方法。優(yōu)選的哺乳動物為人類。如果個(gè)體具有特別的神經(jīng)退化疾病癥狀，其被懷疑患有神經(jīng)退化疾病，并處于高度危險(xiǎn)人群中，或具有神經(jīng)退化疾病家族史。
本發(fā)明也提供了治療患有炎癥的哺乳動物方法，其包括給上述哺乳動物服用可抑制或減低多譜系激酶蛋白活性的化合物。可抑制或減低多譜系激酶蛋白活性的化合物包括，但不限于，具化學(xué)式I、II、III、和IV的化合物。優(yōu)選的化合物包括上文所描述的那些化合物，及關(guān)于篩選可調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白和促進(jìn)細(xì)胞存活或死亡的化合物的方法。優(yōu)選的哺乳動物為人類。
與具有化學(xué)式I-IV的化合物的接觸可發(fā)生在緩沖液或培養(yǎng)基中，其為本領(lǐng)的專業(yè)人員所熟知?；蛘撸摻佑|發(fā)生于使用制藥合成物，其包含試驗(yàn)的化合物和制藥上可接受的鹽、載體、或適合于動物或哺乳動物的稀釋液，這些動物如老鼠或其它為本領(lǐng)專業(yè)人員所熟知的合適動物。另外，需要使用各種數(shù)量的細(xì)胞和各種濃度的化合物。被試驗(yàn)的化合物所接觸的細(xì)胞可以是任何一種哺乳動物細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞要陷于神經(jīng)退化疾病，例如，老年癡呆癥、運(yùn)動神經(jīng)疾病、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、帕金森氏癥、腦血管疾病、缺血性狀態(tài)、AIDS性癡呆、癲癇癥、亨廷頓癥、和大腦或脊髓的震蕩性或穿透性損傷。具有化學(xué)式I的化合物，及制備該化合物的方法，描述于美國專利號為5,705,511的專利中，本文按其完整意義引之為參考文獻(xiàn)。具有化學(xué)式III的化合物，及制備該化合物的方法，描述于美國專利號為5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，及WO97/46567的專利中，每一個(gè)專利，本文均按其完整意義引之為參考文獻(xiàn)。具有化學(xué)式IV的化合物，及制備該化合物的方法，描述于美國專利號為5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，及WO97/46567的專利中，每一個(gè)專利，本文均按其完整意義引之為參考文獻(xiàn)。
具有化學(xué)式II的化合物，包括diasteriomers和enantiomers在碳原子周圍，取代基R2，R7，和R8與之相連。
優(yōu)選的橋連茚并吡咯并咔唑?yàn)榛瘜W(xué)式II所代表(插入化學(xué)式page 25)在一些優(yōu)選的，具化學(xué)式II的化合物的具體實(shí)例中，R1為H。在更進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)例中，R2為H，羥基，或不可取代的烷基。
在其它優(yōu)選的具體實(shí)例中，R3，R4，R5，和R6，各自獨(dú)立的為H、可取代的或不可取代的烷基、鹵素、可取代或不可取代的烷氧基、可取代或不可取代的氨基、或可取代或不可取代的芳基。在更進(jìn)一步優(yōu)化的具體實(shí)例中，R7和R8各自獨(dú)立的為H，或可取代的或不可取代的烷基。
在一些優(yōu)選的具體實(shí)例中，Y為O。在更進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)例中，Z為a鍵，O，S，或可取代的或不可取代的N。在再進(jìn)一步優(yōu)化的具體實(shí)例中，m和n各自獨(dú)立為1或2。在一些特別優(yōu)化的具體實(shí)例中，Y為O，Z為鍵或O，而m和n各自獨(dú)立為1或2。
在進(jìn)一步優(yōu)化的具體實(shí)例中，A1A2和B1B2為＝O或H，H。
在一些特別優(yōu)化的具體實(shí)例中，R1，R4，R6，和R7均為H，Y為＝O，n為1，A1A2和B1B2為＝O或H，H，R2為H，OH或低級烷基，R3為H或取代的烷基，R5和R8均為H或烷氧基，并以甲氧基為優(yōu)化，Z為鍵或O，而m為1或2。
具有化學(xué)式II的化合物的一些特別優(yōu)化的具體實(shí)例為化合物II-1，II-2，II-3，II-4a，II-4b，II-5，II-6，II-7a，II-7b，II-8，II-9，II-10，II-11，和II-12，列于下文的表1中。
化學(xué)式II所代表的化合物在下文中稱為化合物(II)。
如本文所用，術(shù)語“碳環(huán)的”指環(huán)形基團(tuán)其中的環(huán)部分只有碳原子組成。術(shù)語“雜環(huán)”和“雜環(huán)的”指環(huán)形基團(tuán)其中的環(huán)部分包括至少一種雜環(huán)原子，如O，N或S。
如本文所用，術(shù)語“烷基”意指直鏈的、環(huán)鏈的、或分支的烷基團(tuán)，其又有1至8個(gè)碳原子，如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、順-丁基、反-丁基、戊基、異戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、辛基、環(huán)丙基、和環(huán)戊基。含甲基基團(tuán)如、烷氧基、烷氧羰基、和烷基胺羰基基團(tuán)中的甲基部分與上述定義的甲基有相同的意思。優(yōu)選的較少碳原子的烷基基團(tuán)，是上述定義的含1至4個(gè)碳原子的基團(tuán)。術(shù)語“烯基”是指包含直鏈或分支的碳?xì)滏溨兄辽儆幸粋€(gè)碳-碳雙鍵。烯基基團(tuán)的例子包括乙烯基和丙烯基。如本文所用，術(shù)語“炔基”是指包含直鏈或分支的碳?xì)滏溨兄辽儆幸粋€(gè)碳-碳三鍵。炔基基團(tuán)的例子包括乙炔基和丙炔基。
含?；幕鶊F(tuán)如酰氧基的?；糠质侵赴?至6個(gè)碳原子的直鏈或分支的烷酰基，如甲酸基、乙酸基、丙?；?、丁酰基、戊?；蚣乎；?。
如本文所用術(shù)語“芳基”意指含6-12個(gè)碳原子的基團(tuán)，如苯基、二苯基和萘基。優(yōu)選的芳香基團(tuán)包括可取代的或不可取代的苯基和萘基。本文所用的術(shù)語“雜環(huán)芳基”是指在芳基基團(tuán)的環(huán)上的一個(gè)或多個(gè)碳原子被雜原子(即非碳原子)如O、N或S所取代。優(yōu)選的雜環(huán)芳基包括吡啶基、嘧啶基、pyrrolyl，furyl，thienyl，imidazolyl，triazolyl，terzolyl，quinolyl，isoquiolyl，benzoimidazolyl，thiazolyl，pyrazolyl和benzothiazolyl。
術(shù)語“芳烷基”(或“arylalkyl”)是指有7-15個(gè)碳原子的基團(tuán)，其包含一個(gè)烷基基團(tuán)支撐一個(gè)芳基基團(tuán)。芳烷基基團(tuán)的例子包括苯甲基、苯乙基、二苯甲基和萘甲基。
烷基基團(tuán)和包含在取代基團(tuán)如和酰氧基中的烷基部分可被取代或不被取代。被取代的烷基基團(tuán)有1-3個(gè)可供選擇的獨(dú)立的取代基團(tuán)，優(yōu)選的為羥基、低級烷氧基、低級alkoxy-alkoxy，可取代的或不可取代的arylalkoxy-lower alkoxy，可取代的或不可取代的雜芳烷氧基-低級烷氧基，可取代的或不可取代的芳烷氧基、取代或未取代的雜環(huán)烷氧基、鹵素、羧基、低級烷氧羧基、硝基、氨基、單或雙低級烷氨基、二氧雜環(huán)乙烷、dithiolane，dithione，呋喃、內(nèi)酯、或內(nèi)酰胺。
取代的芳基、取代的雜芳基和取代的芳烷基每1個(gè)有1-3個(gè)可獨(dú)立選擇的取代基，其優(yōu)選的為低級烷基、羥基、低級烷氧基、羧基、低級烷氧羰基、硝基、氨基、mono-or di-低級alkylamino、和鹵素。
1個(gè)氮原子形成的雜環(huán)基團(tuán)包括和三氮雜茂。1個(gè)氧原子形成的雜環(huán)基團(tuán)包括呋喃、四氫呋喃、吡喃、和四氫吡喃。
“羥烷基”基團(tuán)是指在烷基上另外加上1個(gè)羥基基團(tuán)。
鹵素包括氟、氯、溴和碘。
如本文所用，術(shù)語“雜環(huán)芳烷基”是指包含雜環(huán)原子的芳烷基。術(shù)語“含氧”指存在氧原子。因而，“烷氧基”基團(tuán)是指通過氧原子連著的烷基基團(tuán)，而“羰基氧”是指通過氧原子連接的羰基基團(tuán)。
術(shù)語“雜環(huán)烷氧基”是指具有與其烷基部分相連的雜環(huán)基團(tuán)的烷氧基基團(tuán)，而術(shù)語“芳香烷氧基”是指具有與其烷基部分相連的芳基基團(tuán)的烷氧基基團(tuán)。術(shù)語“烷羰基氧”是指具化學(xué)式-O-C(＝O)-烷基的基團(tuán)。
如本文所用，術(shù)語“alkyloxy-烷氧基”是指包含與其烷基部分相連的alkyloxy替代的烷氧基基團(tuán)。術(shù)語“烷氧基-alkylthio”是指包含與其烷基部分相連的烷氧基替代的alkylthio基團(tuán)(即，具化學(xué)式-S-烷基的基團(tuán))。術(shù)語“羥基-alkylthio”是指包含與其烷基部分相連的羥基替代的的alkylthio基團(tuán)(即，具化學(xué)式-S-烷基的基團(tuán))。
如本文所用，術(shù)語“單糖”具有其通常的意思即簡單的糖。
如本文所用，術(shù)語“氨基酸”是指既含有氨基又含有羧基的分子。氨基酸的具體實(shí)例包括α-氨基酸；即具有一般化學(xué)式HOOC-CH(NH2)-(側(cè)鏈)的羧基。
氨基酸的側(cè)鏈包括天然存在和非天然存在的部分。非天然存在的(即，非天然的)氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)侵刚紦?jù)天然氨基酸側(cè)鏈所在部位的部分，例如，氨基酸類似物。參見Lehninger，Biochemistry，Second Edition，Worth Publishers，Inc.，1975，73-75頁，本文引用為參考文獻(xiàn)。
優(yōu)選的α-氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、和賴氨酸，其具有D構(gòu)型、L構(gòu)型、或外消旋物。
更多的代表性α-氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)居谙率龅谋?中。
表1CH3- HS-CH2-HO-CH2- HO2C-CH(NH2)-CH2-S-S-CH2-C6H5-CH2-CH3-CH2-HO-C6H4-CH2- CH3-S-CH2-CH2-CH3-CH2-S-CH2-CH2-HO-CH2-CH2-CH3-CH(OH)-HO2C-CH2-NHC(＝O)-CH2-(插入化學(xué)式page 29)HO2C-CH2-CH2-NH2C(＝O)-CH2-CH2-(CH3)2-CH-(CH3)2-CH-CH2-CH3-CH2-CH2-H2N-CH2-CH2-CH2-H2N-C(＝NH)-NH-CH2-CH2-CH2-H2N-C(＝O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH3-CH2-CH(CH3)-CH3-CH2-CH2-CH2-H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-在一些優(yōu)選的具體實(shí)例中，具化學(xué)式II的化合物的取代基團(tuán)包括移去羧基中的羥基部分后的氨基酸殘基；如，具有化學(xué)式-C(＝O)-CH(NH2)-(側(cè)鏈)的基團(tuán)。
存在于化學(xué)式II中的功能基團(tuán)可能包含保護(hù)基團(tuán)。例如，化學(xué)式II的化合物的氨基酸側(cè)鏈取代可被保護(hù)基團(tuán)如benzyloxycarbonyl或t-butoxycarbonyl基團(tuán)所取代。保護(hù)基團(tuán)本質(zhì)上為化學(xué)功能基團(tuán)，其可選擇性地加上和移去。如，羥基基團(tuán)和羧基基團(tuán)。這些基團(tuán)存在于化學(xué)化合物中，可致使功能惰性達(dá)到化學(xué)反應(yīng)條件，而化合物暴露于此。各類保護(hù)基團(tuán)中的任一種均可用于本發(fā)明。這類保護(hù)基團(tuán)中1個(gè)是benzyloxycarbonyl(Cbz；Z)基團(tuán)。本發(fā)明中其它的優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)可在Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.，“Protective Groups in OrganicSynthesis”2d.Ed.，Wiley & Sons，1991中找到。
BI化合物已顯示在多個(gè)方面有重要藥學(xué)功能活性，包括研究和治療兩個(gè)領(lǐng)域。這些衍生物可用作治療試劑。這些化合物的活性對營養(yǎng)因子響應(yīng)細(xì)胞的功能和/或生存具有正效應(yīng)。對營養(yǎng)因子響應(yīng)細(xì)胞，例如神經(jīng)元譜系細(xì)胞，的功能和/或生存的效應(yīng)可通過下列任一實(shí)驗(yàn)來證實(shí)(1)培養(yǎng)脊髓乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(“ChAT”)試驗(yàn)；或(2)培養(yǎng)基前腦神經(jīng)細(xì)胞ChAT活性試驗(yàn)。
如本文所用，術(shù)語“效應(yīng)”當(dāng)其用于修飾術(shù)語“功能”和“生存”時(shí)意為正的或負(fù)的變更或改變。本文的正效應(yīng)指“增加”或“增強(qiáng)的”而負(fù)效應(yīng)指“抑制”或“抑制的”。
如本文所用，術(shù)語“增加”或“增強(qiáng)的”當(dāng)其用于修飾術(shù)語“功能”或“生存”時(shí)意為與細(xì)胞無該化合物相比，細(xì)胞存在BI化合物對營養(yǎng)因子響應(yīng)細(xì)胞的功能和/或生存產(chǎn)生正效應(yīng)。例如，但不限于此例，關(guān)于如膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的生存，該化合物經(jīng)證明能使有死亡危險(xiǎn)(如由于損傷、疾病情形、退化情形或自然進(jìn)程)的膽堿能細(xì)胞群與無該化合物時(shí)相比生存力增強(qiáng)。處理過的群系較未處理的群系有相對更長的功能期。
如本文所用，“抑制”和“抑制狀態(tài)”意指指定材料(如，酶的活性)的特殊反應(yīng)在有BI化合物存在時(shí)相對減低。
如本文所用，術(shù)語“trk”指高度親合的神經(jīng)營養(yǎng)素受體家族，目前包括trkA、trkB、和trkC，以及其它神經(jīng)營養(yǎng)素可結(jié)合的膜連蛋白。
如本文所用，VEGFR的抑制意指用于，如，血管發(fā)生起重要作用的疾病，比如實(shí)性腫瘤癌、子宮內(nèi)膜異位、糖尿病型視網(wǎng)膜病、牛皮癬、成血管細(xì)胞瘤，以及其它眼的疾病和癌癥。
Trk的抑制意指用于，例如，前列腺疾病如前列腺癌和量性的前列腺增生，和炎癥性疼痛的治療。
血小板衍生的生長因子受體(PDGFR)的抑制意指用于，例如，各種形式的瘤形成，比如P31P4等。
如本文所用，術(shù)語“癌”和“癌的”指哺乳動物的任何一種細(xì)胞的惡性增生。具體例子包括P31P5，和其它可識別的癌。
如本文所用，術(shù)語“神經(jīng)元”、“神經(jīng)譜系細(xì)胞”和“神經(jīng)細(xì)胞”包括，但不限于，具有單個(gè)或多個(gè)傳感器和/或單個(gè)或多個(gè)功能的異源神經(jīng)類型群系；優(yōu)選的為膽堿能和感覺神經(jīng)細(xì)胞。如本文所用，詞組“膽堿能神經(jīng)細(xì)胞”意指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的神經(jīng)細(xì)胞，其神經(jīng)傳感器是乙酰膽堿；具體例子如基前腦、纖維、和脊髓神經(jīng)細(xì)胞。如本文所用，詞組“感覺神經(jīng)細(xì)胞”包括對來自如皮膚、肌肉和關(guān)節(jié)的環(huán)境暗示(如，溫度，運(yùn)動)產(chǎn)生反應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞，具體例子是背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞。
如本文所定義，“營養(yǎng)因子響應(yīng)細(xì)胞”是包括營養(yǎng)因子可與之特殊結(jié)合的受體的細(xì)胞；具體例子包括神經(jīng)細(xì)胞(如膽堿能神經(jīng)細(xì)胞和感覺神經(jīng)細(xì)胞)和非神經(jīng)細(xì)胞(如單核細(xì)胞和瘤細(xì)胞)。
本文所描述的BI化合物已發(fā)現(xiàn)可用于研究和治療領(lǐng)域，例如，酶活性的抑制。比如，在研究領(lǐng)域，該化合物可用于試驗(yàn)和模型的開發(fā)以便進(jìn)一步增進(jìn)理解其對絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸蛋白激酶(如，PKC、trk酪氨酸激酶)的抑制作用，其可在相關(guān)紊亂和疾病的機(jī)械方面起作用。在治療領(lǐng)域，該化合物抑制一些酶的活性，可用于抑制與癌一類的紊亂的有關(guān)這些酶的有害后果。
如下列實(shí)施例所示，可通過下列所列舉的試驗(yàn)來測定用BI化合物對酶活性的抑制trkA酪氨酸激酶活性抑制試驗(yàn)完整細(xì)胞標(biāo)本中NGF-stimulated trk的磷酸化抑制；血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)激酶抑制試驗(yàn)；PKC活性抑制試驗(yàn)；PDGFR抑制試驗(yàn)。
公開的BI化合物可用于增強(qiáng)哺乳動物，如人類，的神經(jīng)元譜系細(xì)胞的功能和/或生存。在上下文中，該化合可單獨(dú)使用，或和其它保險(xiǎn)的吡咯并咔唑和/或吲哚并咔唑，或與其它有益的分子一起使用，這些有益分子也能夠影響指定的細(xì)胞的功能和/或生存。
各種神經(jīng)錯亂的特征在于神經(jīng)細(xì)胞，其正在死亡、損傷、功能損害、經(jīng)歷軸突惡化、有死亡危險(xiǎn)等。這些錯亂包括，但不限于此老年癡呆癥；運(yùn)動神經(jīng)紊亂(如，肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化)；帕金森氏癥(震顫性麻痹)；腦血管紊亂(如，中風(fēng)、局部缺血)；亨廷頓氏癥；艾滋病癡呆；癲癇癥；多發(fā)性硬化；外周神經(jīng)病(如，在化療外周神經(jīng)病時(shí)影響DRG神經(jīng)細(xì)胞的疾病)，包括糖尿病性神經(jīng)病和AIDS外周神經(jīng)??；由興奮氨基酸誘導(dǎo)的紊亂；及與大腦或脊髓的震蕩或穿透相關(guān)的紊亂。
ChAT催化神經(jīng)傳感器乙酰膽堿的合成，其可被認(rèn)為是功能性膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的酶標(biāo)記。功能性神經(jīng)細(xì)胞也能生存。神經(jīng)細(xì)胞的生存可通過存活的神經(jīng)細(xì)胞專一吸收的量和染料的酶轉(zhuǎn)化來檢測。
因其用途多樣，本文所描述的化合物，包括那些通過本文所描述的方法鑒別的化合物，可應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。這些化合物可用于神經(jīng)細(xì)胞生存、功能、鑒定的體外模型的開發(fā)，或應(yīng)用于篩選其它合成化合物其與本文所描述的化合物具有相似的活性，或應(yīng)用于本文所描述的方法所鑒別的化合物。本文所描述的化合物，以及用本文所描述的方法所鑒別的化合物，可用于研究領(lǐng)域以調(diào)查、定義和測定與功能性響應(yīng)相關(guān)的分子標(biāo)靶。例如，通過放射標(biāo)記一個(gè)BI化合物，或一個(gè)由本文所描述的方法所鑒別的化合物，其與專一的細(xì)胞功能(如有絲分裂發(fā)生)相聯(lián)系，衍生物結(jié)合的標(biāo)靶實(shí)體可被鑒別、分離和純化以便研究其特征。
本文描述的化合物，以及用本文描述的方法鑒別的化合物，和其他的事物，不僅可用于增強(qiáng)營養(yǎng)響應(yīng)細(xì)胞的營養(yǎng)因子誘導(dǎo)的活性，如膽堿能神經(jīng)細(xì)胞，也可作為其它神經(jīng)細(xì)胞類型的生存促進(jìn)劑，如，多巴胺能的或glutamatergic。生長因子可通過向小的GTP結(jié)合蛋白下游信號的級聯(lián)傳送來調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生存，這些蛋白包括，但不限于，ras，rac，和cdc42(Denhardt，Biochem.J.，1996，318，729)，特別地，ras的活化導(dǎo)致磷酸化作用和細(xì)胞外受體活化激酶(ERK)的活化，其與生物生長和分化過程相連。刺激rac/cdc42導(dǎo)致JNK和p38活化的增強(qiáng)，其反應(yīng)是與之相連的壓力、凋亡和炎癥。雖然生長因子的反應(yīng)主要通過EPK途徑，影響這些后續(xù)過程可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞生存的另一可選擇的機(jī)制，同效生長因子增強(qiáng)生存特征(Xia et al.，Science，1995，270，1326)。這類化合物也可通過與之相關(guān)的機(jī)制用作神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的生存促進(jìn)劑，但也不同于生長因子調(diào)節(jié)生存，例如，抑制JNK和p38途徑，其可通過抑制程序型細(xì)胞死亡過程導(dǎo)致生存。
本發(fā)明提供的化合物可用于治療與降低ChAT活性相關(guān)的紊亂或死亡、脊髓運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞的傷害，也可用于治療，如，與中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的程序性細(xì)胞死亡相關(guān)的疾病，及炎癥型疾病。
本文所描述的化合物也可用于治療疾病狀態(tài)包括惡性細(xì)胞增生，如多種癌癥。
藥學(xué)上可接受的本文所描述的化合物的鹽，以及由本發(fā)明方法鑒別的化合物，包括，藥學(xué)上可接受的酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機(jī)銨加成鹽、和氨基酸加成鹽。酸加成鹽的例子是無機(jī)酸加成鹽，如鹽酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽；有機(jī)酸加成鹽如醋酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽和乳酸鹽；金屬鹽的例子是堿金屬鹽如鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽如鎂鹽和鈣鹽，鋁鹽，和鋅鹽；銨鹽的例子為銨鹽和四甲基銨鹽；有機(jī)銨加成鹽的例子為具嗎啉和哌啶的鹽；氨基酸加成鹽的例子為苷氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和賴氨酸形成的鹽。
本文提供的化合物，包括由本發(fā)明方法鑒別的化合物，可作為藥物成分，其通過與藥學(xué)上可接受的無毒賦形劑和載體混合。這些成分可制備成適用于腸胃外投藥，特別是制成液體溶液或懸浮液形式；或口服藥，特別是制成片劑或膠囊；或鼻腔內(nèi)投藥，特別是制成粉劑、滴鼻劑、或氣霧劑；或皮膚投藥，如通過，經(jīng)皮貼片。
藥用成分可方便地制成單位劑量形式，可通過制藥領(lǐng)域所熟知的方法中的任何一種來制備，例如，按Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)所描述的方法制備。腸胃外投藥的配制可包含常見的賦形劑、無菌水或鹽水，聚(亞烷基)二醇類如聚乙二醇、油脂和植物油，氫化萘及類似物。特別地，生物適合的、生物可降解的丙交酯聚合體，丙交酯/乙交酯聯(lián)合聚合體，或聚氧乙烯-聚氧丙烯聯(lián)合聚合體可用作賦形劑以控制活性化合物的釋放。其它適用于這類化合物的潛在腸胃外傳送系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯聯(lián)合聚合體顆粒、滲透泵、可移植的浸制系統(tǒng)、和脂質(zhì)體。吸入給藥的配制包括作為賦形劑，例如，乳糖，或包含其的水溶液，例如聚甲醛-9-月桂醇酯，甘膽酸鹽和去氧膽(酸)鹽，或以滴鼻劑給藥的油溶液，或適合于鼻內(nèi)使用的凝膠。腸胃外投藥的配制也可包括口腔給藥的甘膽酸鹽，直腸給藥的水楊酸鹽，或陰道給藥的檸檬酸。經(jīng)皮貼片投藥的配制優(yōu)選親脂性的乳劑。
本發(fā)明中化合物作為藥物成分中的唯一活性物質(zhì)?；蛘撸膳c其它活性成分聯(lián)合使用，如，其它生長因子，其可促進(jìn)疾病或紊亂的神經(jīng)細(xì)胞生存或軸突再生。
本發(fā)明的化合物和包含該化合物的藥學(xué)上可接受的鹽類可用于口腔或非口腔給藥，例如，作為藥膏或注射用藥。本發(fā)明的化合物在治療成分中的濃度可以變化。其濃度依照如下因子而變化，所給藥物的總劑量，所用化合物的化學(xué)特征(如，疏水性)，給藥的方式，病人的年齡、體重和癥狀等。本發(fā)明的化合物的典型用法是以含該化合物大約0.1至10％w/v的水溶性生理緩沖液的形式腸胃外給藥。典型的劑量范圍是每天約1μg/kg至約1g/kg體重；優(yōu)選的劑量范圍為每天約0.01mg/kg至100mg/kg體重，而優(yōu)選的每天1至4次給藥的每次劑量為約0.1至20mg/kg體重。優(yōu)選的使用藥物的劑量依賴下列因素而變化，諸如疾病或紊亂的類型和發(fā)展程度，特殊病人的總體健康狀況，所選擇化合物的相對生物活性，化合物賦形劑的配制，以及給藥的方式。
本發(fā)明的化合物，包括試驗(yàn)用化合物和由本發(fā)明的方法鑒別的化合物，以及制藥上可接受的包含其的鹽類，可以單獨(dú)使用，或根據(jù)藥學(xué)活性和給藥的目的以各種制藥成分的形式。根據(jù)本發(fā)明的制藥成分可制備成均一的混合物，其包含作為活性成分的有效量的該化合物或其制藥上可接受的鹽類，及制藥上可接受的載體。根據(jù)適合于給藥的藥物成分的形式，載體的形式范圍較寬。期望這類藥物成分制備成單位劑量形式以適合于口服或非口服給藥。非口服給藥的方式包括藥膏和注射。
片劑的制備要使用賦形劑，諸如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素，裂解劑諸如淀粉、藻酸鈉、羧甲基纖維素和結(jié)晶纖維素，滑潤劑諸如硬脂酸鎂和滑石，粘合劑諸如白明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啉、羥丙基纖維素和甲基纖維素，表面活性劑諸如蔗躺脂肪酸酯和山梨(糖)醇脂肪酸酯，以及常規(guī)制藥上用的類似物。優(yōu)選的劑量是每個(gè)片劑中含15-300mg的活性成分。
顆粒劑的制備要使用賦形劑，諸如乳糖和蔗糖，裂解劑諸如淀粉，粘合劑諸如白明膠，以及常規(guī)制藥上用的類似物。粉劑的制備要使用賦形劑，諸如乳糖和甘露醇，以及常規(guī)制藥上用的類似物。膠囊的制備要使用白明膠、水、蔗糖、阿拉伯樹膠、山梨糖醇、甘油、結(jié)晶纖維素、硬脂酸鎂、滑石，以及常規(guī)制藥上用的類似物。優(yōu)選的劑量是每個(gè)膠囊中含15-300mg的活性成分。
糖漿制劑的制備使用糖諸如蔗糖，水，乙醇，以及常規(guī)制藥上用的類似物。
藥膏的制備使用膏基諸如凡士林、液體石蠟、羊毛脂和macrogol，乳化劑諸如月桂醇乳酸鈉、殺藻胺、山梨醇單脂肪酸酯、羧甲基纖維素鈉和阿拉伯樹膠，以及常規(guī)制藥上用的類似物。
注射劑的制備使用溶劑諸如水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇，加溶劑諸如安息香酸鈉、水楊酸鹽鈉和氨基甲酸脂，等滲劑諸如氯化鈉和葡萄糖，防腐劑諸如苯酚、甲酚、對-羥基安息香酸酯和氯代丁醇，抗氧化劑諸如抗壞血酸維生素C和焦亞硫酸鈉，以及常規(guī)制藥上用的類似物。
本發(fā)明通過下列實(shí)施例得到進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例旨在闡明本發(fā)明。這些實(shí)施例不說明、也不能理解為限制發(fā)明公開的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1合成過程的概括描述和實(shí)施例用于制備本發(fā)明中具有化學(xué)式II的橋連茚并吡咯并咔唑的一般合成途徑示于圖1和圖2。合成茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)的一般程序可按美國專利號5,705,511所描述的執(zhí)行，其所公開的內(nèi)容本文完整地引用為參考文獻(xiàn)。當(dāng)R1為H時(shí)，茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)中內(nèi)酰胺氮為合適的保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)而生成(IV)/(IX)。用合適的堿在無水的有機(jī)溶劑中處理被保護(hù)的化合物，將產(chǎn)生暗紅色的溶液，其被認(rèn)為是負(fù)碳離子。負(fù)碳離子與雙功能試劑(V)反應(yīng)導(dǎo)致(V)中的C＝Y(jié)鍵親電子加成產(chǎn)生初始的中間產(chǎn)物(VI)/(X)。用磺酸或路易斯酸，如三氟化硼酯鹽，處理中間產(chǎn)物(VI)(X)和/或(VII)/(XI)，產(chǎn)生橋連茚并吡咯并咔唑(I)/(II)。
內(nèi)酰胺氮的保護(hù)策略(示于圖3和圖4)可通過酸或堿催化過程來實(shí)施。酸催化反應(yīng)可用樹脂粘合試劑不使茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)移動而形成聚合支撐，如聚苯乙烯為基礎(chǔ)的，Rink酸樹脂(XII)(圖3)，生成(XIII)。另一個(gè)選擇為，執(zhí)行可溶試劑的酸催化反應(yīng)產(chǎn)生化合物(XIV)(圖4)。在堿催化條件下產(chǎn)生甲硅烷基保護(hù)的化合物(XV)(圖4)。
圖5描述制各中間產(chǎn)物(V)的幾種方法。程序(a)描述各種乙縮醛(XVI)至(XVII，Z＝粘合劑)的轉(zhuǎn)化。例如，酯-乙縮醛/縮酮(XVI，D＝COOR)完全還原為乙醇并氧化為醛-乙縮醛/縮酮(XVII，R8＝H)。另一個(gè)選擇是，酯-乙縮醛/縮酮(XVI，D＝COOR)用DIBAL部分還原而直接提供醛(XVII，R8＝H)。與之相似，腈-醛(XVI，D＝CN)用DIBAL還原生成醛(XVII，R8＝H)。酮-乙縮醛/縮酮的制備是在Weinreb氨基-乙縮醛/縮酮(XVI，D＝CON(OMe)Me)中加入格氏試劑。
中間產(chǎn)物(XVII，Z＝鍵)也可通過程序(b)中所描繪的兩步程序獲得。將有機(jī)金屬試劑(XIX)加至乙縮醛/縮酮(XVIII)中產(chǎn)生烯烴(XX)，其通過臭氧分解及隨后的還原整理提供酮-乙縮醛/縮酮(XVII)。中間產(chǎn)物(XVII，Z＝雜環(huán)原子)的兩步制備程序在程序(c)中描繪。耦合乙縮醛(XXII)與烯烴(XXI)經(jīng)由產(chǎn)生的烯烴的臭氧分解(伴隨一個(gè)還原整理)產(chǎn)生酮-乙縮醛/縮酮(XVII)。可供選擇的方法是，程序(d)中描繪的中間產(chǎn)物(XVII，Z＝雜環(huán)原子)的兩步制備程序?；衔?XXIV)與乙縮醛/縮酮(XVIII)反應(yīng)產(chǎn)生(XXV)，其可通過程序(a)所描述的方法轉(zhuǎn)化成酮-乙縮醛/縮酮(XVII)。酮-乙縮醛/縮酮(XVII)經(jīng)用羥胺、肼、N-烷基-N-烷氧基胺、和胺的濃縮產(chǎn)生中間產(chǎn)物(XXVI)，其具有功能上親電子的C＝N。
樹脂粘合的茚并吡咯并咔唑(XIII)(圖6，方法A)用過量的作為堿的格氏試劑處理，將產(chǎn)生暗紅色的負(fù)碳離子溶液。隨后與試劑(V)反應(yīng)導(dǎo)致(V)中的C＝Y(jié)基團(tuán)親電子加成產(chǎn)生的產(chǎn)物。用磺酸或路易斯酸，如三氟化硼酯鹽，處理中間產(chǎn)物(XXVII)和/或(XVIII)，產(chǎn)生橋連茚并吡咯并咔唑(II)。
相似的策略應(yīng)用于可溶的內(nèi)酰胺保護(hù)的中間產(chǎn)物，如(XV)(圖7，方法B)。然而，在此情形下。中間產(chǎn)物(XV)在嘧啶作為堿代替格氏試劑，用Triton B處理。中間產(chǎn)物(XXIX)和/或(XXX)可用內(nèi)酰胺保護(hù)基團(tuán)完整來分離，其可進(jìn)一步通過色譜純化。如方法A所示，(圖6)，用Lewis酸(如三氟化硼etherate)處理可產(chǎn)生IB(II)，其中R1＝H。
基團(tuán)R3，R4，R5和R6的引入可按美國專利號5,705,511和4,923,986所描述的來執(zhí)行，其公開的文件以其完整形式引用為參考文獻(xiàn)。R3取代基團(tuán)的引入則在BI構(gòu)建之后，如圖8所示。B環(huán)的3號位用NBS溴化生成化合物(XXXI)。含碳片段隨后通過鈀催化的Stille，Suzuki，Heck，Kumada或Castro-Stephens反應(yīng)導(dǎo)入以生成(XXXII)，(XXXIII)等型的化合物。此外，化合物(XXXI)可提供接近化合物，其中溴基團(tuán)用雜原子取代，例如基于胺的基團(tuán)采用Buchwald鈀催化的氨基化化學(xué)。
通過氧化過程，氧連的基團(tuán)可被導(dǎo)入E環(huán)的茚碳中，如圖9的化合物(XXXIV)所示。這一化學(xué)過程也導(dǎo)致內(nèi)酰胺(A環(huán))的亞甲基基團(tuán)的氧化并形成如圖所示的酰亞胺衍生物。實(shí)施例2Rink樹脂粘合中間產(chǎn)物(XIII-A)、(XIII-B)和(XIII-C)的制備，(圖3)實(shí)施例2-A頂端帶有機(jī)械攪拌器和迪安和斯塔克水閘的三頸圓底燒瓶中裝入Rink酸樹脂XII(10.00g，0.64mmol/g)，1-甲基-2-pyrolidinone(80mL)，苯(350mL)，VIII-A(3.00g)和對-甲苯磺酸(1.00g)。反應(yīng)混合物保溫回流20小時(shí)，然后過濾。用THF(5×175mL)洗滌樹脂，留用濾出液。然后，依次用DMSO(4×100mL)，2％NaHCO3水溶液(4×100mL)，水(4×100mL)，DMSO(2×200mL)，THF(4×100mL)和乙酸乙酯(4×100mL)洗滌樹脂。樹脂經(jīng)真空干燥(24小時(shí))，獲得11.70(0.47mmol/g)的樹脂粘合VIII-A(XIII-A)。
最初的THF濾出液經(jīng)蒸發(fā)，剩余物用水(750mL)稀釋，沉淀物經(jīng)過濾并依次用水，2％NaHCO3水溶液(4×100mL)，和水(4×100mL)洗滌。真空干燥后，可回收VIII-A(1.28g)。實(shí)施例2-B用相似的方式，VIII-B()(0.5g)與Rink酸樹脂XII(1.52g)結(jié)合，獲得1.58g樹脂粘合的VIII-B，(XIII-B)。實(shí)施例2-C
用相似的方式，VIII-C()(1.02g)與Rink酸樹脂XII(3.12g)結(jié)合，獲得3.70(0.46mmol/g)樹脂粘合的VIII-C，(XIII-C)，及回收的VIII-C(0.44g)。實(shí)施例3化合物(II-1)、(II-2)、(II-3)、(II-4a)、(II-4b)、(II-6)(II-8)的制備(方法A，圖6)實(shí)施例3-A在(XIII-A)(1.25g)的THF(24mL)懸浮液中加入1.0M的EtMgBr(6.25mL溶于THF)溶液，該反應(yīng)在加入HMPA(5.0mL)前攪動1小時(shí)。攪動10分鐘后，加入diethoxybutyraldehyde(3.0g)(其制備按照文獻(xiàn)程序進(jìn)行Paquette等，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，9662-71)，反應(yīng)攪動20小時(shí)。用10％NH4Cl(5mL)水溶液終止反應(yīng)并過濾。樹脂依次用10％NH4Cl(3×10mL)水溶液、水(3×10mL)、THF(3×10mL)、DMF(3×10mL)、水(3×10mL)和and醚(3×10mL)洗滌。樹脂經(jīng)真空干燥，用methylene chloride(15mL)吸收，并用三氟乙酸(0.15mL)處理。反應(yīng)1小時(shí)后，過濾，濾液經(jīng)蒸發(fā)。所得殘留物用methylene chloride(20mL)吸收并用pyridinium tosylate(50mg)處理，所得溶液攪動4小時(shí)。此時(shí)，用飽和的NaHCO3水溶液和鹽水洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，并用MgSO4干燥。
經(jīng)過過濾和溶劑蒸發(fā)后，殘留物用制備HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，采用60％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸洗脫)純化。合適的餾分用NaHCO3中和，抽提到methylene chloride(3×50mL)中，并用MgSO4干燥。經(jīng)過過濾和溶劑蒸發(fā)后，可獲得70.2mg的化合物II-1，其為白色粉末并具下列特征13C NMR(DMSO-d6)δ171.8，143.3，142.4，141.4，140.1，140.0，136.6，129.2，127.9，127.4，127.1，126.8，124.1(2C)，122.7，121.6，121.5，118.3，112.1，88.1，79.2，56.6，45.6，33.4，24.8；1HNMR(DMSO-d6)d 9.21(d，J＝7.5，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.86(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.3，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.41(dd，J＝7.5，7.4，1H)7.36-7.27(m，2H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.91(s，2H)，4.53(d，J＝3.3，1H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值379，實(shí)測值379.
該反應(yīng)產(chǎn)物的混合物也可通過制備HPLC分離得到化合物II-2(0.5mg)，其具有下列特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.17(d，J＝8.1，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.0，1H)，7.85(d，J＝6.8，1H)，7.57(d，J＝6.8，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.44-7.26(m，3H)，6.81(d，J＝6.0，1H)，5.43-5.33(m，1H)，4.43(s，2H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，1.45-1.55(m，2H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)，0.29(t，J＝7.0，3H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值407，實(shí)測值407.實(shí)施例3-B用與在上述化合物II-1中所描述得相似的方法，樹脂(XIII-A)(70.3mg)用1，1-diethoxy-2-pentanone(0.75mL))(根據(jù)文獻(xiàn)Sworin，et al.，J.Org.Chem.，1988，53，4984-6制備)處理，獲得化合物II-3(3.5mg)，其可用制備TLC(silica gel，eluted with 50％EtOAc/toluene)分離，并具有如下特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.42(d，J＝8.2，1H)，8.58(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.79(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.1)，7.50-7.20(m，4H)，6.81(d，J＝5.9，1H)，4.90(s，2H)，4.46(s，1H)，2.35-2.20(m，1H)，1.98(s，3H)，1.75-1.60(m，1H)，1.25-1.00(m，1H)，0.35-0.15(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值393，實(shí)測值393.實(shí)施例3-C通過相似的方式，(XIII-A)(74.3mg)用h1，1-diethoxy-2-hexanone(根據(jù)文獻(xiàn)Brenner，J.Org.Chem.，1961，26，22-7制備)(0.75mL)處理，獲得化合物II-4a(2.10mg)和化合物II4b(1.06mg)，它們各自用制備HPLC(Zorbax RX-8，4×15cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離?；衔颕I-4a具有如下特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.30(d，J＝8.3，1H)，8.55(s，1H)，7.97(d，J＝7.2，1H)，7.65(d，J＝8.5，1H)，7.59(d，J＝7.5)，7.48(dd，J＝7.8，7.2，1H)，7.39-7.15(m，3H)，6.31(dd，J＝5.9，5.5，1H)，5.02(s，1H)，4.88(s，2H)，0.88(s，3H)其它脂肪族的信號在溶劑峰中消失；MS m/z(M+H)計(jì)算值407，實(shí)測值407?；衔颕I-4b具有如下特征1H NMR(DMSO-d6)d 9.43(d，J＝8.1，1H)，8.59(s，1H)，7.99(d，J＝7.3，1H)，7.75-7.65(m，2H)，7.49(dd，J＝7.0，6.4，1H)，7.43(dd，J＝8.2，8.1，1H)，7.36-7.25(m，2H)，6.75(s，1H)，4.91(s，2H)，4.50(s，1H)，1.95(s，3H)其它脂肪族的信號在溶劑峰中消失；MS m/z(M+H)計(jì)算值407，實(shí)測值407。實(shí)施例3-D通過相似的方法，(XIII-C)(1.00g)用diethoxybutyraldehyde(3.65g)處理，獲得化合物II-6(87.8mg)，其用制備HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離，該化合物具有如下特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝8.6，1H)，8.60(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.84(d，J＝8.3，1H)，7.47(dd，J＝7.2，7.0，1H)，7.35(s，1H)，7.29(dd，J＝7.0，7.0，1H)，6.98(dd，J＝8.6，1.9，1H)，6.83(d，J＝6.0，1H)，5.65-5.55(m，1H)，4.88(s，2H)，4.48(d，J＝3.9，1H)，3.82(s，3H)，2.25-2.10(m，1H)，2.08-1.85(m，1H)，0.96-0.75(m，1H)，0.65-0.50(m，1H)；MS m/z(M+Na)計(jì)算值431，實(shí)測值431.實(shí)施例3-E通過相似的方法，樹脂(XIII-B)(153.2mg)用diethoxybutyraldehyde(1.5mL)處理，獲得化合物II-8(3.6mg)，其用制備HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離，該化合物具有如下特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝7.9，1H)，8.81(s，1H)，7.81-7.73(m，3H)，7.48-7.35(m，3H)，7.24(dd，J＝7.6，7.5，1H)，6.85(d，J＝6.2，1H)，5.63-5.59(m，1H)，4.86(s，2H)，4.61(d，J＝3.6，1H)，3.82(s，3H)，2.21-2.13(m，1H)，1.96-1.90(m，1H)，0.87-0.79(m，1H)，0.61-0.56(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值379，實(shí)測值379.實(shí)施例4化合物II-7A和II-7b的制備(方法A，圖6)實(shí)施例4-A(1，1-diethoxyethoxy)丙酮的制備在冷的(0℃)NaH(2.68g，60％)的THF(150mL)懸浮液中加入1，1-diethoxyethanol(根據(jù)文獻(xiàn)Zirkle等，J.Org.Chem.，1961，26，395-407的程序制備)(9.00g)的THF(20mL)溶液，反應(yīng)混合物在室溫下攪動1小時(shí)，然后加入甲代烯丙基氯(methally chloride)(8.0mL)。反應(yīng)混合物加熱回流過夜，冷卻并用plug of celite過濾。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移去溶劑。殘留物用柱色譜(硅土，20％乙酸乙酯/己烷)純化，以生成1，1-diethoxyethyl methallyl ether(11.5，90％)。這種過冷的(-30℃)乙酸乙酯(80mL)中醚溶液進(jìn)行臭氧分解知道用TLC(1小時(shí))檢測不到材料。此時(shí)，用氧清洗該反應(yīng)，再用Pd(OH)2(159mg)處理，并在氫氣中攪動過夜。過濾掉催化劑，濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來濃縮。所得的殘留物用柱色譜(硅土，20％乙酸乙酯/己烷)，獲得標(biāo)題中的化合物(4.53g，82％)。實(shí)施例4-B按照方法A(圖6)，樹脂(XIII-A)(230.2mg)用EtMgBr(1.25mL)處理，然后用(1，1-diethoxyethoxy)丙酮處理(實(shí)施例3-A)(1.2mL)。在從樹脂工作和切割之后，反應(yīng)粗產(chǎn)物混合物(10.5mg)中的蛋白用二氯甲烷(20mL)吸收，并用BF3 etherate(20uL)處理。攪動2.5小時(shí)后，用飽和的NaHCO3水溶液和鹽水洗滌該溶液，然后用MgSO4干燥。經(jīng)過濾并移去溶劑后，所得的殘留物用預(yù)備好的HPLC(ZorbaxRX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化，獲得化合物II-7a(2.34mg)和化合物II-7b(1.34mg)?；衔?II-7a)具有如下特征1H NMR(CDCl3)δ9.35-9.20(m，1H)，7.87(d，J＝7.6，1H)，7.62(d，J＝7.0，1H)，7.60-7.45(m，1H)，7.49(dd，J＝7.7，7.5，1H)，7.40(d，J＝8.1，1H)，7.37-7.26(m，3H)，6.22(s，1H)，5.20-4.85(m，1H)，4.47(s，1H)，3.67(d，J＝12.7，1H)，3.52(d，J＝11.8，1H)，3.40(d，J＝12.7，1H)，3.38(d，J＝11.8，1H)，1.91(s，3H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值409，實(shí)測值409?；衔颕I-7b具有如下特征1H NMR(CDCl3)δ9.58-9.22(m，1H)，7.82(d，J＝7.4，1H)，7.60-7.40(m，3H)，7.37-7.27(m，3H)，7.21(d，J＝8.1，1H)，5.81(s，1H)，5.21(s，1H)，5.10-4.80(m，1H)，4.59(d，J＝13.5，1H)，4.38(dd，J＝13.5，5.3，1H)，4.21(d，J＝13.1，1H)，3.82(d，J＝13.2，1H)，1.13(s，3H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值409，實(shí)測值409。實(shí)施例5化合物II-5的制備(圖8)在化合物II-1(8.1mg)的THF(2mL)溶液中加入NBS(4.6mg)，攪動反應(yīng)過夜。補(bǔ)加NBS(4.5mg)，攪動反應(yīng)2.5小時(shí)。過濾掉不能溶解的材料，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液。所得的殘留物用柱色譜(C-18，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。合適的餾分用NaHCO3中和，并用二氯甲烷(3×20mL)提取，經(jīng)MgSO4干燥。過濾和溶劑蒸發(fā)后，獲得化合物II-5(5.1mg)，其為白色粉末，并具有以下特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.4，1H)，8.67(s，1H)，8.14(s，1H)，7.86(d，J＝8.7，1H)，7.72(d，J＝7.0，1H)，7.63(d，J＝7.8，1H)，7.42(dd，J＝7.5，7.3，1H)，7.35(dd，J＝7.3，7.2，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.94(s，2H)，4.54(d，J＝3.1，1H)，2.30-2.14(m，1H)，2.00-1.82(m，1H)，0.96-.088(m，1H)，0.62-0.50(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值457/9(1∶1)，實(shí)測值457/9(1∶1)。實(shí)施例6中間產(chǎn)物XV的制備(圖4)在VIII-A[A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝R6＝H](1.05g)的DMF(25mL)溶液中加三乙胺(0.75mL)和t-butyldimethylsilylchloride(TBS-Cl)(0.65g)。攪動3小時(shí)，反應(yīng)用飽和的NaHCO3水溶液終止，并用乙酸乙酯提取。有機(jī)層用水和鹽水洗滌，用MgSO4干燥。過濾和溶劑蒸發(fā)后，所得的殘留物用乙醚研磨，生成化合物XV(848mg)。洗出液蒸發(fā)后所得的殘留物用柱色譜(silica，1％EtOAc/CH2Cl2)純化，獲得額外的產(chǎn)物(502mg，組合產(chǎn)率94％)，該化合物具有下列光譜特征1H NMR(DMSO-d6)δ11.94(s，1H)，9.32(d，J＝7.6，1H)，8.03(d，J＝7.7，1H)，7.64(d，J＝7.2，1H)，7.58(d，J＝8.1，1H)，7.44(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.39(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.32(d，J＝7.3，1H)，7.25(dd，J＝7.6，7.3，1H)，5.00(s，2H)，4.14(s，2H)，0.99(s，9H)，0.46(s，6H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值425，實(shí)測值425。實(shí)施例7通過方法B制備化合物II-1(圖7)Triton B的嘧啶(0.45M)溶液通過將40％Triton B溶液溶解在甲醇(10mL)和嘧啶(10mL)中來制備。在減壓(20mmHg)蒸去溶劑至終體積為8mL。將殘留物用嘧啶稀釋至50mL，過濾并保存在氮中。XV(20.3mg)的嘧啶(2.0mL)溶液用氬氣沖洗，并用300μL的Triton B(0.45M于嘧啶中)溶液和diethoxybutyraldehyde(50μL)處理。攪動2小時(shí)，用乙酸乙酯抽提，用1N HCl水溶液、鹽水洗滌，并用MgSO4.干燥。經(jīng)過濾和溶劑蒸發(fā)后，用CH2Cl2(10mL)吸收加合物，并用BF3 etherate(10μL)處理。攪動2小時(shí)，所得溶液用飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌，然后經(jīng)MgSO4干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移去溶劑，所得得殘留物用預(yù)備好得HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。合適的餾分用NaHCO3中和，并用二氯甲烷(3×20mL)抽提及MgSO4干燥。經(jīng)過和溶劑蒸發(fā)，獲得II-1(11.8mg，65％產(chǎn)率)，其1H NMR和MS光譜和HPLC保留時(shí)間與實(shí)施例3-A中描述的通過方法A制備和分離的材料一致。實(shí)施例8化合物II-9的制備(圖8)在鎮(zhèn)靜劑化合物II-5(6.2mg)的1-propanol(4.0mL)懸浮液中加入3-aminophenylboric acid(3.8mg)。攪動0.25小時(shí)后，依次加入Pd(OAc)2(2.0mg)、Ph3P(4.8mg)、Na2CO3(2.8mg)、和水(2.0mL)。將混合物加熱回流0.75小時(shí)，冷卻，用CH2Cl2抽提，并用水和鹽水洗滌。有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，所獲得的殘留物用預(yù)備好的HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，50％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。合適的餾分用NaHCO3中和并用二氯甲烷抽提(3×20mL)，及MgSO4干燥。過濾和溶劑蒸發(fā)后，獲得化合物II-9(3.1mg，49％yield)，其具有如下光譜特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.5，1H)，8.66(s，1H)，8.00-7.25(m，8H)，7.12(dd，J＝7.1，7.0，1H)，6.95-6.80(m，3H)，6.53(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.99(s，2H)，4.55(s，1H)，2.25-2.10(m，1H)，1.95-1.90(m，1H)，0.98-0.88(m，1H)，0.65-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值470，實(shí)測值470。實(shí)施例9化合物II-10的制備(圖9)在化合物II-1(5.0mg)的DMSO(1mL)溶液中加入NaCN(4.3mg)，混合物于145℃保溫1小時(shí)。冷卻，用EtOAc提取，用水(3×20mL)和鹽水洗滌。有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥，過濾及蒸發(fā)獲得的殘留物經(jīng)預(yù)備好的HPLC(Zorbax RX-8，2.5×2.5cm，55％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。合適的餾分用NaHCO3中和，二氯甲烷提取，經(jīng)MgSO4干燥。經(jīng)過濾和溶劑蒸發(fā)，獲得化合物II-10(2.7mg，50％yield)，其具有如下光譜特征1H NMR(DMSO-d6)δ11.4(s，1H)，8.86(d，J＝7.9，1H)，8.79(d，J＝7.6，1H)，7.90(d，J＝8.3，1H)，7.62-7.55(m，2H)，7.49(dd，J＝7.6，7.4，3H)，7.40(dd，J＝7.4，7.3，1H)，7.35(dd，J＝7.5，7.4，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，6.03(s，1H)，5.40-5.30(m，1H)，2.25-2.14(m，1H)，2.03-1.90(m，1H)，1.10-0.98(m，1H)，0.82-0.77(m，1H)。實(shí)施例10化合物II-11的制備(方法A，圖6)按照方法A，樹脂(XIIIa)(150.2mg)與EtMgBr(1.0mL)反應(yīng)，然后，加入ethyl 2，5-dioxopentanoate(Schmidt等，Synthesis，1993，809)(1.5mL)。After workup and cleavage from the resin，用二氯甲烷(20mL)吸收反應(yīng)的粗產(chǎn)物混合物，并用BF3 etherate(20μL)處理。攪動2.5小時(shí)后，所得溶液用飽和得NaHCO3水溶液和鹽水洗滌，然后，經(jīng)MgSO4干燥。經(jīng)過濾和去除溶劑后，所獲得的殘留物用預(yù)備好的HPLC(ZorbaxRX-8，4×25cm，55％-75％gradient MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化，獲得化合物II-11(6.4mg)，其具有如下特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.36(d，J＝7.7，1H)，8.68(s，1H)，8.00(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.3，1H)，7.58-7.15(m，5H)，6.97(d，J＝5.9，1H)，4.93(s，2H)，4.82(s，1H)，4.48(q，J＝7.1，2H)，2.42-1.91(m，2H)，1.37(t，3H，J＝7.1)，1.25-0.63(m，2H)。實(shí)施例11化合物II-12的制備化合物II-11(3.4mg)的THF(2mL)溶液用2M LiBH4(1.0mLin THF)溶液處理，反應(yīng)攪動1.5h小時(shí)。通過加入1N HCl水溶液(4mL)來終止反應(yīng)。攪動20分鐘后，加入10％NaOH水溶液(15mL)，所得混合物用二氯甲烷(3×10mL)提取。經(jīng)MgSO4后，混合物經(jīng)過過濾和溶劑蒸發(fā)，獲得化合物II-12(0.32mg)，其具有如下特征1H NMR(DMSO-d6)δ9.35(d，J＝7.7，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.2，1H)，7.75(d，J＝8.2，1H)，7.50-7.25(m，4H)，6.84(d，J＝7.7，1H)，6.11(s，1H)，4.91(s，2H)，4.71(s，1H)，4.50-4.40(m，1H)，4.30-4.20(m，1H)，2.42-1.91(m，2H)，1.25-0.63(m，2H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值409，實(shí)測值409。實(shí)施例12脊髓ChAT活性的增強(qiáng)ChAT是功能性膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的專一性生化標(biāo)記。膽堿能神經(jīng)細(xì)胞代表主要的海馬趾形成、嗅覺神經(jīng)細(xì)胞、interpeduncular nucleus，皮層、扁桃體、和部分丘腦的膽堿能輸入。在脊髓中，運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞為包括ChAT的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞(Phelps等，J.Comp.Neurol.，1988，273，459-472)。ChAT活性已被用于研究神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)素(如NGF或NT-3)在膽堿能細(xì)胞的存活和/或功能方面的效果。ChAT試驗(yàn)也可用作膽堿能神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ChAT水平的調(diào)節(jié)的指示。
方法解離胎鼠脊髓細(xì)胞，按文獻(xiàn)所描述的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(Smith等，J.Cell Biology，1985，101，1608-1621；Glicksman等，J.Neuroche.，1993，61，210-221)。通過標(biāo)準(zhǔn)的胰島素解離技術(shù)(standard trypsin dissociatedtechniques)(Smith等，supra)從解剖的老鼠(14-15天的胚胎)的脊髓中獲得解離的細(xì)胞。細(xì)胞以6×105細(xì)胞/cm2放置在聚-1-鳥氨酸包被的塑料組織培養(yǎng)孔，不含血清N2培養(yǎng)基，補(bǔ)充有0.05％牛血清蛋白(BSA)(Bottenstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1979，76，514-517)。在5％CO2/95％空氣的潮濕大氣中37℃保溫培養(yǎng)48小時(shí)。體外2天后，用改進(jìn)的Fonnum方法(Fonnum，Neurochem.，1975，24，407-409)測定ChAT活性。依照McManaman等，和Glicksman等的文獻(xiàn)(McManaman等，Develop.Biol.，1988，125，311-320；Glicksman等，J.Neurochem.，supra.)。
在實(shí)施例中描述的具有化學(xué)式II的化合物列在表2中。R1，R4，R6，和R7為H；Y為O；而n為1。
表2
實(shí)施例13pCDNA3-EE-MLK3，pcDNA3-EE-MLK3(K144R)按文獻(xiàn)描述克隆MLK3(Lee等，Oncogene，1993，8，3403-3410；Ezoe等，Oncogene，1994，9，935-938)。cDNA的制備來自200ng的polyadenylated黑素細(xì)胞mRNA，反應(yīng)的5％用作擴(kuò)增全部PTKcDNAs的摸板，用2個(gè)或4個(gè)高度degenerate寡核苷酸引物，其來自于已知的PTKs的保守的Vib和IX亞區(qū)的保守序列PTK1，5’-CGGATCCACMGIGAYYT-3’(SEQ ID NO1)；PTK2，5’-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3’(SEQ ID NO2)；PTK3，5’-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3’(SEQ ID NO3)；PTK4，5’-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3’(SEQ IDNO4)。用Taq DNA聚合酶(AmpliTaq；Perkin-Elmer/Cetus)和自動DNA熱循環(huán)儀進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR。每個(gè)循環(huán)包括94℃，40s，37℃，2min和63℃，3min。8個(gè)PCRs的產(chǎn)物收集在一起，用DNA聚合酶(Klenow)處理，用內(nèi)切酶BamH1加上EcoR1進(jìn)行酶切，并經(jīng)5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙啶染色鑒定主要為200-230bp的酶切的帶，洗脫并克隆進(jìn)入M13mp18。在1次實(shí)驗(yàn)中，部分PCR擴(kuò)增的cDNA未被酶切，代之以Smal酶切克隆blunt進(jìn)入M13mp18。用鏈終止測序法測定核苷酸序列。
1種被鑒定為PTK1的cDNA，可用作篩選人類黑素瘤和黑素細(xì)胞cDNA文庫的探針。指定為PTK1-3.2的克隆，包括完整的2541nt的開放閱讀框架，編碼847個(gè)氨基酸的蛋白。該cDNA用Nco1酶切，經(jīng)DNA聚合酶(Klenow)補(bǔ)平，再用EcoR1酶切，連于載體pCDNA3-EE，其用BamH1酶切、補(bǔ)平、然后用EcoR1酶切。載體pCDNA3-EE的構(gòu)建是在HindIII/BamH1酶位點(diǎn)插入1個(gè)編碼為EE抗原決定部位跟隨的起始密碼的寡核苷酸MEEEEYMPME(SEQ IDNO5)(Grussenmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，7952-7954)。利用PCR通過制備突變K144R來制備MLK3的激酶失活的版本，使用以前出版的技術(shù)(Chen等，Biotechniques，1994，17，657-659)。第一個(gè)突變的寡核苷酸為5’-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3’(SEQ ID NO6)，第二個(gè)寡核苷酸為5’-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3’(SEQ ID NO7)。使用MLK3作為摸板，在PCR中用這些寡核苷酸來擴(kuò)增806bp的片段，在第二個(gè)PCR反應(yīng)中，T7引物作為另一個(gè)擴(kuò)增引物，以MLK3作為摸板擴(kuò)增1285bp的片段，所得片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分開、分離后，克隆進(jìn)入pGEM-5(Promega)并測序。片段用HindIII和HpaI酶切，插進(jìn)pCDNA3-EE-MLK3，其用HindIII和HpaI酶切。在核苷酸1342位檢測到額外的點(diǎn)突變。為證實(shí)之，pf1M1片段(nt 1093-1418)從野生型MLK3切得，并用來替換in the K144R mutated MLK3中的一致的片段。實(shí)施例14pFB-FLAG-MLK3為獲得MLK3蛋白，將cDNA克隆進(jìn)入陰莖骨病毒(baculoviral)表達(dá)載體pFB-FLAG。MLK3由PTK1-3.2用Nco1酶切得來，用DNA聚合酶(Klenow)補(bǔ)平，再用Not1酶切并連入pFB-FLAG，其用Stu1和Not1酶解。pFB-FLAG來自pFB(LifeTechnologies)，具有FLAG抗原決定部位(Hopp等，Biotechnology，1988，6，1205-1210)的編碼序列，其具有1個(gè)起始密碼，MDYKDDDDK(SEQ ID NO8)，將polylinker加入BamH1的位點(diǎn)。實(shí)施例15pFB-GST-MLK3(KD)MLK3的激酶區(qū)域的Baculoviral表達(dá)通過用EcoR1和Xho1從pGEXKG-MLK3(KD)酶切MLK3片段而完成，將其連入用EcoR1和Xho1酶切的pFB載體，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的克隆序列已克隆進(jìn)入上游區(qū)。其完成是通過獲得GST編碼序列和多接頭來自pGEXKG載體，通過PCR利用該載體作為模板(Guan等，Anal.Bioch.，1991，192，262-267)。PCR用的5’端寡核甘酸在片段的5’端產(chǎn)生Bg12限制位點(diǎn)。該分離的片段隨后用Bg12和HinD3酶解，并連入用BamH1和HinD3酶解的pFB。實(shí)施例16pGEXKG-MLK3(KD)包含MLK3激酶區(qū)域和亮氨酸拉鏈部分的cNDA片段可通過用PTK1 cDNA的PCR獲得。所分離的片段用限制性內(nèi)切酶EcoR1和Xho1消解，酶切位點(diǎn)在PCR的寡核苷酸中，將其克隆進(jìn)入已用EcoR1和Xho1消解的pGEX-KG中。該pGEX-KG中的片段通過PCR截短成只包含激酶區(qū)域(nt 736-1638)。實(shí)施例17pKH3-MLK2(KA)用degenerate PCR(Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710；Dorow等，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500)克隆MLK2。編碼蛋白激酶的催化亞區(qū)的cDNAs片段在外周腫瘤細(xì)胞系Colo 16中表達(dá)，其通過反轉(zhuǎn)錄PCR從RNA擴(kuò)增。Degenerate PCR引物基于表皮生長因子受體家族激酶催化區(qū)域的Vib核VIII亞區(qū)的編碼保守基元的序列。 引物序列如下正向引物，5’-CGGATCCGTG(A)CACC(A)GT(CG)G(A)ACC(T)-3’(SEQ ID NO9)，反轉(zhuǎn)引物，5’-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3’(SEQ ID NO10)。幾種PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)入M13并用T7 Super-Base測序試劑盒(Bresatec)進(jìn)行測序。1個(gè)216-bp PCR的產(chǎn)物用于作為篩選人克隆λgt11 cDNA文庫(Clontech，catalog#HL 10346)的探針。片段用隨機(jī)引物標(biāo)記，在65℃進(jìn)行雜交，過濾液洗滌到0.2X NaCl/檸檬酸鹽的嚴(yán)格性(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)和0.5％SDS在65℃下。過濾液放射自顯影16小時(shí)在-70℃下用Kodak XAR-5膠卷。分離出4個(gè)克隆，最長的為1.2kb，作為探針再用相同的條件篩選相同的文庫。又挑選出4個(gè)克隆，其中1個(gè)代表MLK2的1034bp的片段。該克隆作為探針篩選人腦λgt10文庫，篩選出近500,000克隆，其中1個(gè)3454bp的克隆被分離出來，其代表MLK2的完整的編碼區(qū)域。
從ATG到polyA尾部，將MLK2克隆進(jìn)入載體pKH3，位于BamH1和EcoR1的酶切位點(diǎn)之間，這需要2步來完成，因?yàn)橛?個(gè)BamH1酶切位點(diǎn)再M(fèi)LK2序列的中間。載體pKH3的構(gòu)建是通過插入3個(gè)拷貝的HA表位標(biāo)記進(jìn)入到pRK7多接頭的位于Xba1和EcoR1酶切位點(diǎn)之間的BamH1的酶切位點(diǎn)之后。為獲得突變體K125A，將MLK2的5’短BamH1片段克隆進(jìn)入Promega palter載體，按制造商推薦的方法進(jìn)行突變。將獲得的片段回復(fù)克隆進(jìn)入MLK2 pKH3載體。實(shí)施例18pcDNA3-HA-JNK1JNK1 cDNA的獲取如文獻(xiàn)所描述(Coso等，Cell，1995，81，1137-1146)。用人骨骼肌cDNA(Invitrogen)作為摸板通過PCR方法獲得cDNA，并將其克隆進(jìn)入pcDNA3-HA的Bg12/Sall位點(diǎn)，這是一個(gè)改進(jìn)過的編碼Haepitope(Wilson等，Cell，1984，37，767-778)pcDNA3表達(dá)質(zhì)粒。然后從pcDNA3酶切，包括HA抗原決定部位，并連接到pGEX-4T3(Pharmacia)。將JNK1 cDNA從pGEX-4T3構(gòu)建體中切開，作為Bg12/Sall片段并連接到pcDNA3-HA中，載體具有HA表位，添加在pcDNA3的HindIII/BamHI位點(diǎn)上。實(shí)施例19pFLAG-DLK按文獻(xiàn)描述將DLK克隆進(jìn)入含F(xiàn)LAG抗原決定部位的表達(dá)載體pcDNA3(Holzman等，J.Biol.Chem.，1994，269，30808-30817)。DLK的cDNA中的片段用degenerate oligonucleotide-based PCR克隆來分離。總RNA從embryonic day 13.5 kindeys(32 organs)和andembryonic day 17.5 kindeys(16 organs)中提取，使用commerciallyprepared phenol/guanidine isothiocyanate reagent方法，按照制造商的說明(TRIzol Reagent，Life Technologies，Inc.)進(jìn)行提取。用不含Rnase的Dnase消解后，用Rnase H-反轉(zhuǎn)錄酶(Superscript，Life Technologies，Inc.)將總RNA反轉(zhuǎn)錄，從寡(dT)合成的寡核苷酸引物到單鏈cDNA。與蛋白的的酪氨酸激酶催化亞區(qū)Vib和IX相關(guān)的簡并寡核苷酸引物最先由Wilks設(shè)計(jì)(Wilks，Proc Natl Acad Sci USA.，1989，86，1603-1607)，改進(jìn)為5’EcoRI和HindIII位點(diǎn)，分別是(5’-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3’(SEQ ID NO11)，5’-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3’(SEQ ID NO12)。進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，條件為1.5minat 94℃，2min at 37℃，和3min at 63℃。加入新鮮試劑進(jìn)行又1個(gè)40循環(huán)的PCR，結(jié)束前，在72℃增加10-min的延伸。所得的200-210-bp的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠分離，亞克隆進(jìn)入準(zhǔn)備好的pGEM7zf(+)質(zhì)粒(Promega)，轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入大腸桿菌(Escherichia coli)。微量制備的質(zhì)粒DNA來自轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)菌及用EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶消解的部分。對包含插入的克隆進(jìn)行測序。
從degenerate PCR獲得的195-bp DLK cDNA片段經(jīng)放射標(biāo)記用來篩選近1×106Uni-ZAP II的重組體(Stratagene，La Jolla，CA)，寡(dT)-primed成年老鼠cDNA文庫(Holzman等，Mol Cell Biol，1990，10，5830-5838)。Filters were hybridixed in a buffer consisting of 50％formamide，5×SSC，3×Denhardt’s solution，0.25％SDS，1mg/mlpolyadenylic acid，and 200mg/ml salmon sperm DNA at 42℃.filters werewashed once at room temperature in 2×SSC，0.2％SDS and twice for 30min at 65℃.twenty five unique clones were identified；10 clones werepurified to homogeneity，in vivo excised according to the protocol of themanufacturer and restriction mapped。2個(gè)最長的克隆(分別為，3401和3397bp，僅在5’末端有差異)沿兩條鏈測其全長序列。
全長的NotI-XhoI DLK cDNA片段(3401 bp)亞克隆進(jìn)入thecytomegalovires promoter based真核生物表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)(construct designated pcDNA3-DLK)。Next，a NH4-MetFLAG epitope(DYKDDDDK)(SEQ ID NO13)tagged construct(pFLAG-DLK)was made.The PCR was used to amplify cDNA fragmentswhich encoded a 5’HindIII site，DLK’s Kozak’s consensus sequenceincluding the initiation ATG，the FLAG epitope，and DLK cDNA openreading frame sequence extending from nucleotide 88 to an internal EcoRIsite at nucleotide 758(HPLC純化合成寡核苷酸體積克分子濃度相等的量5’-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGAC TACAAGGA CGA CGATGACAA GGCCTGCCTCCATGAAACCCGAACA-3’(SEQ ID NO14)forthe FLAG construct sense primer，和5’-GACAGGGCGGCCGGCTCT-3’(SEQ ID NO15)反義引物)。凝膠純化的HindIII和EcoRI消解的擴(kuò)增引物片段進(jìn)入HindIII-EcoR1準(zhǔn)備的pcDNA3-DLK質(zhì)粒。構(gòu)建體沿雙鏈測序確保Taq聚合酶的保真性和維護(hù)閱讀框架。實(shí)施例20pcDNA3-MLK1MLK1的5’部分從EST數(shù)據(jù)庫(注冊號#AA160611)。該克隆是MLK1和另一個(gè)未鑒定的cDNA的融合。它包括以前未出版的MLK1的5’端序列，其沿著以前出版的MLK1的激酶區(qū)域(Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。取自EST克隆的MLK1 cDNA的序列如下GAATTCGGCACGAGAGGACTCGCAGGTGTCCGGCGACGAGGGCTGGTGGACCGGGCAGCTGAACCAGCGGGTGGGCATCTTCCCCAGCAACTACGTGACCCCGCGCAGGGCCTTCTCCAGCCGCTGCCAGCCCGGCGGCGAGGACCCCAGTTGCTACCCGCCCATTCAGTTGTTAGAAATTGATTTTGCGGAGCTCACCTTGGAAGAGATTATTGGCATCGGGGGCTTTGGGAAGGTCTATCGTGCTTTCTGGATAGGGGATGAGGTTGCTGTGAAAGCAGCTCGCCACGACCCTGATGAGGACATCAGCCAGACCATAGAGAATGTTCGCCAAGAGGCCAAGCTCTTCGCCATGCTGAAGCACCCCAACATCATTGCCCTAAGAGGGGTATGTCTGAAGGAGCCCAACCTCTGCTTGGTCATGGAGTTTGCTCGTGGAGGACCTTTGAATAGAGTGTTATCTGGGAAAAGGATTCCCCCAGACATCCTGGTGAATTGGGCTGTGCAGATTGCCAGAGGGATGAACTACTTACATGATGAGGCAATTGTTCCCATCATCCACCGCGACCTTAAGTCCAGCAAC(SEQ ID NO16)。翻譯成NSAREDSQVS GDEGWWTGQLNQRVGIFPSN YVTPRSAFSS RCQPGGEDPS CYPPIQLLEIDFAELTLEEI IGIGGFGKVY RAFWIGDEVA VKAARHDPDEDISQTIENVR QEAKLFAMLK HPNIIA；RGV CLKEPNLCLVMEFARGGPLN RVLSGKRIPP DILVNWAVQI ARGMNYLHDEAIVPIIHRDL KSSN(SEQ ID NO17)。
MLK1的3’部分最初由簡并PCR克隆，見已出版的文獻(xiàn)(Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。MLK1的3’部分的克隆方法與上文描述的MLK2的相似，但有以下例外。在用1.2kb的克隆從文庫中重新篩選獲得4個(gè)克隆時(shí)，其中的3個(gè)代表MLK1。沒有克隆包含可用PCR獲得的完整的激酶區(qū)域。
噬菌體從1(1等分試樣的放大的庫(正常人結(jié)腸的上皮和人T84結(jié)腸的癌電解槽系列互補(bǔ)脫氧核糖核酸在(Uni-ZAPXR(Stratagene，cat#937204)通過懸浮在20um水和咬住冷凍。5ul的樣品的該細(xì)胞溶解噬菌體用作PCR模板分為兩部分反應(yīng)各庫。雷管表示該矢量是減少核苷酸序列沿直向切割礦柱該研制兼容產(chǎn)品位置。就該T84結(jié)腸的電解槽系列庫而言，該T3和T7順序雷管(Promega)是使用。在各反應(yīng)，一個(gè)雷管來自于該3-5多股絞線的該MLK1基因，大約100bp從該5轉(zhuǎn)換端該已知序列。第二底物是一個(gè)的該兩個(gè)矢量底物。PCR反應(yīng)含有1x預(yù)防循環(huán)轉(zhuǎn)發(fā)緩沖的，2.5mM氯化鎂，1U Taq聚合酶(全部從Bresatec)，0.2毫米dNTP和0.4毫米各底物在總共50uL。反應(yīng)條件是60s在95℃，90s在52℃，90s在72℃為30循環(huán)與A 15最小的延長比賽時(shí)間生新開始該期末考試循環(huán)。預(yù)防循環(huán)轉(zhuǎn)發(fā)產(chǎn)品是無性系和順序?yàn)樯厦婷枋龅?。長的無性系從該庫篩和PCR碎片那些包括附加的MLK1順序是連接一起到創(chuàng)造1.08kb MLK1 cDAN在pUC18。
源自EST數(shù)據(jù)庫的MLK1克隆由載體pBluescript(Stratagene)提供。來自克隆文庫的MLK1 cDNA連接到EST克隆，其通過用EcoRI消解前者，用Klenow補(bǔ)平，然后用AflII酶切。將分離的片段克隆進(jìn)入源自EST數(shù)據(jù)庫的MLK1 cDNA，其用XhoI酶切，用Klenow補(bǔ)平，用AflII酶切。這一由用Not1和Apal酶切自pBluescipt的新構(gòu)建體連接進(jìn)入同樣用Not1和Apal酶切的pcDNA3-EE。所有的克隆交叉點(diǎn)通過測序確證。實(shí)施例21GST-MLK3KD的E.coli表達(dá)PGEXKG-MLK3(KD)用電擊法轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入E.coli BL21株。含有質(zhì)粒的細(xì)菌接種于15升的Applikon發(fā)酵罐中，其裝有10升體積的如下豐富培養(yǎng)基1.95g/L K2HPO4，0.9g/L KH2PO4，0.1g/L ampicillin，0.3g/L(NH4)2SO4，0.92g/L MgSO4 7 H2O，42.7mg/L檸檬酸鈉，21.8mg/L FeSO4 7 H2O，0.5mL Pichia微量金屬(Higgins等，MethodsMolecular Biology，1998，103，149-177)，20g/L casamino acids，40g/L甘油，25.5mg/L CaCl2。細(xì)菌在800rpm/68％溶解氧/30℃條件下培養(yǎng)過夜，直到培養(yǎng)濃度達(dá)到OD600＝4.4。加入1mM isopropyl-β-D-thiogalactoside誘導(dǎo)重組蛋白產(chǎn)生，在25℃下繼續(xù)發(fā)酵至6hr.細(xì)菌通過離心回收，將細(xì)胞糊在-20℃冷凍保存，直至純化。實(shí)施例22細(xì)菌中GST-MLK3KD的純化部分純化的GST-MLK3KD的制備通過在100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM dithiothreitol(DTT)，pH 7.5(buffer A)中用(超)聲波降解100mg的細(xì)菌細(xì)胞糊。用Triton X-100配制成1％的溶液，在冰上攪動1hr。在20,000xg離心45分鐘所得的上清液用10mL平衡于緩沖液A中的glutathione Sepharose 4B樹脂(Pharmacia)在冰上混合1小時(shí)。粒化的樹脂用12.5×體積的緩沖液A洗2次，然后用20mL 100mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM DTT(緩沖液B)，含20mM谷胱甘肽，pH7.5洗提。蛋白經(jīng)透析過夜去除緩沖液并保存于aliquots at-80℃。實(shí)施例23FLAG-MLK3 and GST-MLK3KD的陰莖骨病毒表達(dá)能表達(dá)FLAG-MLK3和GST-MLK3KD的陰莖骨病毒分別用轉(zhuǎn)導(dǎo)載體pFB-FLAG-MLK3和pFB-GST-MLK3KD用BAC-TO-BAC系統(tǒng)(Life Technologies)按照說明手冊來制備。懸浮培養(yǎng)的Sf21細(xì)胞(Vaughn等，，In Vitro，1977，13，213-217)生長在27℃/120rpm的補(bǔ)充Grace’s培養(yǎng)基上(Hink，Nature，1970，266，466-467)，其中補(bǔ)充10％熱滅活的小牛血清(FBS)。為制備重組的FLAG-MLK3，Sf21cells at a density of 1.5×106cells/mL supplemented Grace’s mediumcontaining 5％FB S were infected with a multiplicity of infection(MOI)of3.1 and harvested at 39 hr after infection.To produce recombiant GST-MLK3KD，Sf21 cells at a density 1.5×106cells/mL supplementedGrace’s medium containing 5％FB S were infected with an MOI of 2 andharvested at 41 hr after infection。在兩種情況下，球化細(xì)胞均用緩沖液重新懸浮，緩沖液含有10mM HEPES，50mM Pefabloc SC，5μMpepstain，10μg/mL aprotinin，10μg/mL leupeptin，pH 7.4。在147,000xg離心1小時(shí)后的上清液用3M Tris堿重新調(diào)節(jié)至pH7.4，然后保存于-70℃直至純化。實(shí)施例24baculoviral GST-MLK3KD的純化部分純化的baculoviral GST-MLK3KD用谷光苷肽親和色譜來制備。在10mL的細(xì)胞提取物(26.6mg總蛋白)中，加入1mL谷光苷肽Sepharose 4B樹脂(Pharmacia)，其平衡于10mM HEPES，150mMNaCl，pH7.4(緩沖液C)中，在4℃讓蛋白結(jié)合45分鐘。用30倍柱體積的緩沖液洗滌裝于柱中的樹脂，然后用5倍的含有20mM谷光苷肽的緩沖液C洗提。收集的最終產(chǎn)物經(jīng)透析過夜去除緩沖液C并保存于aliquots at-70℃。實(shí)施例25baculoviral FLAG-MLK3的純化部分純化的FLAG-MLK3的用抗體親和色譜來制備。15mL提取物中的蛋白(19.5mg總蛋白)加入0.1M NaCl重復(fù)加樣到0.25mL的M2單克隆FLAG肽抗體結(jié)合瓊脂糖樹脂(Sigma)的柱中(總共3次)。在進(jìn)行色譜分離前，樹脂用5倍柱體積的50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4(TBS)平衡洗滌，3倍柱體積的0.1M glycine，pH3.5洗滌，繼之以另一個(gè)5倍柱體積的TBS洗滌。重組的蛋白主要通過5倍柱體積的0.2mM FLAG肽(N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C)(SEQ ID NO18)的TBS溶液洗提。在試驗(yàn)前蛋白保存于aliquots at-80℃。實(shí)施例26顯性的負(fù)突變在移去生長因子后分化的PC12細(xì)胞中阻止死亡的MLK家族的顯性負(fù)突變PC-12細(xì)胞系來自老鼠pheochromocvtoma腫瘤，廣泛用作檢測導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的分子事件的神經(jīng)細(xì)胞模型(綜述，參見Troy等，Adv.Neurology，1997，103-111)。神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞分化成交感神經(jīng)表型(Greene，Cell Biol.，1978，78，747-755)。NGF分化的PC-12細(xì)胞依賴NGF生存，在從培養(yǎng)基中去掉NGF時(shí)，將經(jīng)歷形態(tài)學(xué)上描述的細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞系統(tǒng)是顯影劑到確定該隨角異色效應(yīng)的環(huán)中原子數(shù)混合的血統(tǒng)激酶家族在PC-12細(xì)胞死亡跟隨NGF退縮。PC-12細(xì)胞感染cDNA譯碼為占優(yōu)勢的否定(DN)突變體的MLK-3使用Pfx脂質(zhì)傳輸系統(tǒng)被該廠家(Invitrogen，Carlsbad CA)推薦。穩(wěn)定的集資的轉(zhuǎn)染子壓榨DN-MLK-3中選使用G418硫酸鹽(Mediatech Inc.，Herndon，VA)。大約30％的細(xì)胞在這些集資的里以確定由免疫組織化學(xué)形式表示DN MLK3。集資的細(xì)胞穩(wěn)定地壓榨該突變體激酶是片在polyornithine/laminin(10(g/ml各在磷酸鹽緩沖鹽水)涂層組織培養(yǎng)96-最佳格式片絕對大氣壓密度的2字母×104細(xì)胞/孔和用處理100ng/ml的神經(jīng)生長因子為7天。介質(zhì)含有NGF子是除去，該細(xì)胞單層用洗磷酸鹽緩沖鹽水和介質(zhì)含有中和神經(jīng)生長因子抗體(商品目錄#n6655；Sigma，St.Louis，MO)絕對大氣壓期末考試稀釋的1∶1000是重做的為1-5天。細(xì)胞耐久性被A細(xì)胞耐久性試驗(yàn)使用轉(zhuǎn)化的該四唑鹽定量，MTS，到A有三苯基甲脂哪個(gè)是讀者在吸光率的570納米在CytoFluor 2350(Millipore Bedford，MA)被制造業(yè)者(Promega，Madison，WI)。穩(wěn)定的集資的壓榨DN-MLK-3部分地被使免于失敗細(xì)胞死亡由NGF退縮引起(圖10)。實(shí)施例27重組MLK蛋白的酶活性試驗(yàn)為了證明該MLK蛋白質(zhì)用表示該桿狀病毒或細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)是酶催活性，若干試驗(yàn)甲酸可以使用的。該MLK蛋白質(zhì)可以全長的構(gòu)造或A激酶領(lǐng)域用表達(dá)桿狀病毒或細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)。該試驗(yàn)可以抗體-向基底的比如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，時(shí)間分辨熒光(TRF)，否則熒光偏振(FP)。該抗體可以單克隆或多元性繁殖系的與反應(yīng)性向磷酸絲氨酸，磷蘇氨酸，或磷酸特定底物。另外地，非抗體-向基底的方法可以使用比如放射性凝膠-向基底的試驗(yàn)(參見圖11)，多屏幕三氯乙酸(TCA)沉淀試驗(yàn)(圖13)，閃爍鄰近試驗(yàn)(SPA)，閃板(flashplate)方法，否則磷酸纖維素過濾試驗(yàn)開本(圖13)。該試驗(yàn)可以用來監(jiān)測直接磷酸化的基材或聯(lián)結(jié)試驗(yàn)系統(tǒng)利用該下游地激酶在該信號途徑。該基材可以特異的基質(zhì)比如SEK-1或相對非特效藥基材如髓磷脂堿性蛋白(MBP)。實(shí)施例28激酶試驗(yàn)放射性凝膠激酶試驗(yàn)(Radioactive Gel-Based kinase assay)該激酶活性的MLK-3通過監(jiān)測該包含的磷的32P從[γ-32P]-ATP進(jìn)入基質(zhì)的MLK(例如激酶-死的SEK-1；髓磷脂堿性蛋白)。該50ul的試驗(yàn)合劑含有緩沖的A(20mM MOPS，pH7.2，25毫米(-磷酸甘油，5mM EGTA，1mM原釩酸鈉，1mM二硫蘇糖醇)，15毫米mgcl2，100(M ATP，10uCi[γ-32P]-ATP，并且0.1(g激酶-死的SEK-1基質(zhì)(Stressgen，Inc；粘結(jié)劑谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-SEK-1(GST-SEK-1)是豁免谷胱甘肽-瓊脂糖珠粒與10mM谷胱甘肽，pH8.0)或25ug MBP(Sigma Chemical Co.)。反應(yīng)起源于添加MLK蛋白質(zhì)(激酶領(lǐng)域或制備含有既全長的又激酶領(lǐng)域)或控制蛋白質(zhì)。混合物是培養(yǎng)為30最小的在30℃該反應(yīng)每日擠奶二次減少樣品緩沖的是添加的末尾?；旌衔锸侵笃鳛?最小的，填充量在上A 12％SDS-PAGE凝膠(使用MBP作為基質(zhì))或8％凝膠(SEK-1作為基質(zhì))。在電泳以后，凝膠是干燥的。定量的磷酸酯并入基質(zhì)，SEK-1，是履行在MolecularDynamics Phosphorimager(Sunnyvale，CA)。合成的試驗(yàn)設(shè)計(jì)到顯示該酶的活性的桿狀病毒-壓榨MLK-3(FLAG-緊隨全長的或GST-緊隨激酶領(lǐng)域)使用激酶-死的GST-SEK-1或MBP作為基質(zhì)是顯示在圖11A和11B中。雜交分析(Western blot analysis)該激酶活性的桿狀病毒-表達(dá)MLK-3被immunoblot分析檢查。該20-ul試驗(yàn)混合物含有緩沖的A，15mM MgCl2，100uM ATP，并且0.1ug激酶-死的SEK-1基質(zhì)。該反應(yīng)是考慮到生產(chǎn)為30分鐘在30℃，然后用…解渴10ul 4x減少樣品緩沖的。蛋白質(zhì)是分開的在8％三-大豆屬凝膠和親電轉(zhuǎn)學(xué)到止動劑PVDF薄膜。該薄膜是培養(yǎng)與磷酸特異的SEK-1(Thr223)抗體(New England，Biolabs，Inc.)后面有辣根過氧化酶-標(biāo)簽山羊抗兔子免IgG(Bio-Rad)。發(fā)現(xiàn)的該免疫活性的帶材是履行VIA增強(qiáng)化合光(Amersham)。該磷酸化的激酶-死的GST-SEK-1由FLAG-MLK-3蛋白質(zhì)(桿狀病毒制備含有既全長的又激酶領(lǐng)域)是說明在圖12。多屏幕三氯乙酰子囊(TCA)沉淀試驗(yàn)該激酶活性的細(xì)菌表達(dá)GST-MLK-3激酶領(lǐng)域估定使用該多屏幕三氯乙酰子囊(TCA)在＝片試驗(yàn)被皮特等人，描述J.Biomol.Screening，1996，1，47-51)。分析是履行在96-井多屏幕Durapore片(微孔)。各50-ul試驗(yàn)混合物含有20mM Hepes，pH7.4，20mMMgCl2，20mM MnCl2，2mM DTT，0.1mM Na3VO4，1(CI[(-p32]-ATP和30ug MBP底物。該反應(yīng)起源于添加MLK蛋白質(zhì)和考慮到收益為15分鐘在37℃。該反應(yīng)是停止與25ul的50％TCA。該片是考慮到平衡的為30分鐘在4℃，然后用.洗冰冷的25％TCA。閃爍雞尾酒被增加給該片，并且該放射活性決意使用Wallac MicroBeta 145PLUS閃爍計(jì)數(shù)器。該蛋白質(zhì)劑量反應(yīng)對32P巖層的磷的放射性同位素-標(biāo)簽MBP是如圖13所示。磷酸纖維素過濾試驗(yàn)該激酶試驗(yàn)是履行在A 50-ul反應(yīng)混合物含有20mm Hepes(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸)，pH7.4，20mM MgCl2，20mM MnCl2，2mM二硫蘇糖醇，0.1mM Na3VO4，1uCI[(-p32]-ATP和30ugMBP。該反應(yīng)起源于添加MLK蛋白質(zhì)和考慮到收益為15分鐘在37℃。該反應(yīng)是停止與75ul的75mM磷酸。在該磷酸纖維素膜(Pierce)一等分試樣的該淬滅溶液是就填充量。另外地，該96-井多屏幕Durapore(微孔)可以使用。該膜是用洗75mM H3PO4。該粘結(jié)劑磷的放射性同位素-標(biāo)簽磷酸化MBP是洗提在接收管由添加1M氫氧化鈉。該放射性決意由Cerenkov把算在內(nèi)Beckman閃爍計(jì)數(shù)器(Somerset，NJ)。該巖層的磷酸化MBP與提高濃度的細(xì)菌表達(dá)壓榨GST-MLK-3激酶領(lǐng)域是如圖13所示。實(shí)施例29測定化合物與重組MLK家族結(jié)合的試驗(yàn)k-252a(化合物III-3；看，表4)，一吲哚并咔唑代謝物的諾卡氏菌屬種類，與結(jié)合起來許多品種的絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶(天使，等人，類似生物化學(xué)，1996，263，49-55；騎士，等人，類似生物化學(xué)，1997，247，376-381)。氚化了的K-252a ligang習(xí)慣于估定與結(jié)合起來人重組體總長MLK-3從A粗制備的桿狀病毒受感染細(xì)胞。[[3H]K-252a特定地標(biāo)記的與氚在3和9的在位置穿過與簽訂合同網(wǎng)路設(shè)備號碼研究產(chǎn)品(Billerica MA)和具有比放射性的40Ci/mmol。粘結(jié)反應(yīng)是履行在1ml在96-井片。反應(yīng)混合物含有50mMMOPS緩沖的，pH7，150mM NaCl，5mM MnCl2，1mg/ml牛血清清蛋白，1％二甲亞砜和0.25納米[3H]K-252a。樣品是進(jìn)行一式三份與A濃度的5μg/ml的粗桿狀病毒派生MLK-3。非特異的粘結(jié)劑規(guī)定裝訂于出席的無標(biāo)號的1.2μm K252a和是基質(zhì)從全體的與…結(jié)合起來給定的特異的粘結(jié)。一看到這個(gè)稀釋12-15％計(jì)數(shù)的是非特定地與蛋白質(zhì)和75-85％這些當(dāng)中計(jì)數(shù)是特定地與結(jié)合起來MLK-3(圖14)結(jié)合起來。全部實(shí)驗(yàn)是履行為2熱軋鋼在4℃。[[3H]K252a/MLK-3配合物收集在GF/C Whatman過濾使用Brandel收獲者，用洗感冒MOPS/NaCl緩沖的和依靠Wallac Microβ計(jì)數(shù)管。飽和粘結(jié)劑實(shí)驗(yàn)是履行到獲得Kd為K252a。實(shí)施例的該由生實(shí)驗(yàn)是顯示(圖14)。卸開式系統(tǒng)的0.89納米(置信界限0.2到1.5納米)是獲得。實(shí)施例30完整細(xì)胞試驗(yàn)Cos 7過表達(dá)系統(tǒng)原料K-252a和衍生物這些當(dāng)中化合物被Kyowa-Hakko Kogyo Co.Ltd.(東京，日本)(Kaneko等人，1997)?；衔锶苡诩?xì)胞培養(yǎng)級別二甲亞砜(DMSO)和將貯存進(jìn)去該黑暗在4℃。全部稀釋的化合物由制造杜皮克氏改良愛哥爾氏培養(yǎng)基(DMEM)含有1％牛血清清蛋白。Hemagluttinin(HA)抗體是購買者從BAbCO(Richmond，CA)。AP-1(c-jun)基質(zhì)是購買者從Promega(Madison，WI)。[y-32P]-ATP(6000ci/mmol)是購買者Amersham(Arlington Heights，IL)。Cos7細(xì)胞培養(yǎng)綠Monkry Kindey Cos7細(xì)胞是從ATCC，Rockville，Maryland(CRL1651)和在面供養(yǎng)DMEM含有10％牛血清，2mM谷氨酸鹽，1mM丙酮酸鹽，50u/ml penicillin/streptomycin在37℃在10％CO2，90％空氣氣氛。Cos7細(xì)胞是超然的為通過由添加0.25％胰蛋白酶。過表達(dá)的MLK家族環(huán)中原子數(shù)和JNK1在Cos7細(xì)胞Cos7細(xì)胞是片在80％80％纏繞和感染與2μg cDNA結(jié)構(gòu)使用脂質(zhì)被該供應(yīng)者(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。A總長cDNA的人MLK-3，MLK-2，或小鼠DLK或部分人MLK-1如上所述，并且總長Hemagluttinin A-緊隨人JNK1，和藹的提供由日記帳Silvio Gutkind(NIH，Bethesda，MD)，是亞克隆進(jìn)入該pcDNA3vector(Invitrogen，圣迭戈，CA)。在A 48高分辨率感染以后，該細(xì)胞是用處理0.025％二甲亞砜或500表明化合物的納米為2高分辨率后面有消散在0.4mL氚核緩沖的(1％氚核字母x-100，50mM氯化鈉，10mM Tris(pH7.6)，0.1％牛血清清蛋白，30μm焦磷酸鈉，50mM氟化鈉，20μg/ml抑肽酶，1mM甲基磺基，1mM釩酸鈉)。JNK活性該溶胞產(chǎn)物被免疫沉淀/激酶試驗(yàn)作為描述在下面試驗(yàn)。免疫沉定反應(yīng)和激酶試驗(yàn)從全部細(xì)胞溶胞產(chǎn)物從cos7細(xì)胞是為替人測量蛋白質(zhì)濃度使用該微過境協(xié)定裝備從穿透(Rockford，IL)和等份的蛋白質(zhì)是免疫沉淀與該嘿抗體為1高分辨率在4℃。免疫沉淀被離心作用在A microfuge離心為20秒球團(tuán)，再懸浮在trition緩沖的，洗滌由離心作用2更時(shí)間，后面有A后期洗滌在激酶緩沖的(20mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸pH7.4，20mM mgcl2，2mM二硫蘇糖醇，0.1mM釩酸鈉)。該免疫沉淀是再懸浮在激酶緩沖的含有1uM ATP和5(CI[(-磷的放射性同位素]-ATP和基質(zhì)(1(g/樣品的通用的-1)和培養(yǎng)為15分鐘在30℃。該激酶反應(yīng)是靠近添加的減少樣品緩沖的(laemmli，屬性1970227；680-685 )。樣品被加熱至80℃為5分鐘和填充量到10％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠之上。蛋白質(zhì)被電泳分開的。凝膠是干燥的和定量的放射性在通用的-1基質(zhì)的在是履行在A分子動態(tài)學(xué)MolecularDynamics Phosphorimager(Sunnyvale，Ca.)。試驗(yàn)?zāi)膫€(gè)MLK-3，MLK-2和dlk CO-被壓榨與嘿-JNK1和在不存在或出席的k-252a的培養(yǎng)是如圖15A和15B所示。相反，對迎角的導(dǎo)數(shù)的該父母親的k-252a復(fù)姓化合物III-3(表4)，哪個(gè)是A更選擇性的激酶抑制劑，沒有沖突與該jnk途徑活化由另一個(gè)MAPKKK上游的JNK MEKK1(圖15C)。全部-細(xì)胞記者試驗(yàn)為MLK活化JNK企圖導(dǎo)數(shù)無性系組成表達(dá)壓榨該MLK家族已經(jīng)不成功的，建議過表達(dá)的該MLK可以影響細(xì)胞生存(Bergeron等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997，231，153-155；Nagata等人EMBOJ..，1998，17，149-158)。所以，在發(fā)展中的全部細(xì)胞試驗(yàn)因?yàn)橛涗涇壽EMLK誘導(dǎo)生物化學(xué)的事件，電解槽系列含有遺傳地工程技術(shù)可歸納的表達(dá)系統(tǒng)的該激酶所考慮的可以需要。例如，A PC-12電解槽系列感染與A四環(huán)素-受約束的生產(chǎn)主體。當(dāng)細(xì)胞更進(jìn)一步被感染與基因所考慮的由該可歸納的促進(jìn)劑tetO驅(qū)動時(shí)，表達(dá)的那些基因被四環(huán)素平均來說(Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6522)。
要測定該活化的MLK的話，一個(gè)能夠調(diào)節(jié)該磷酸化的下游地基質(zhì)比如mek4，jnk或C-jun在多重測定甲酸如上所述。另一個(gè)接近測定該MLK活化完全細(xì)胞將使用記者酶活性比如該C-jun酶商購可利用的穿過該P(yáng)athDetectTM系統(tǒng)(Stratagene，LaJolla，CA)。在這些系統(tǒng)，該四環(huán)素-可歸納的電解槽系列在感染與兩個(gè)質(zhì)體。一個(gè)質(zhì)粒組成表達(dá)融合的該cjun氨基末端感染疇與該酵母GAL4 DNA……(cJun-DBD稠合蛋白質(zhì))。另一個(gè)質(zhì)粒嘉利該譯碼順序?yàn)闊晒庀x熒光素酶由五縱排地重復(fù)的該GAL4結(jié)合部位。在活化的MLK之上，該下游地基質(zhì)的JNK，cjun-DBD融合蛋白質(zhì)，磷酸化，與結(jié)合起來該GAL4結(jié)合位置，并且誘導(dǎo)luciferasw基因轉(zhuǎn)移。酶容易地被試驗(yàn)在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物通過添加它的基質(zhì)(Promega Madison WI)和測量的化合光。實(shí)施例31締合的抑制的MLK家族環(huán)中原子數(shù)與運(yùn)動神經(jīng)原生存生存的大鼠脊髓培養(yǎng)使富足為運(yùn)動神經(jīng)原Sprague-Dawley大鼠胎兒(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)的萌芽的年齡(E)14.5-15。細(xì)胞從僅僅該腹的份該脊髓是離解，并且更進(jìn)一步使富足為motpneurons由離心作用在A 6.5％步驟甲泛葡胺梯度，作為描述預(yù)先(Henderson，等人，1993)，并且是分析為純度由污漬與低級親合性neurotrophin受體抗體(免疫免疫球蛋白G-192，Boehringer-Mannheim)(數(shù)據(jù)不顯示)。細(xì)胞被種子到96-定向井井眼設(shè)計(jì)圖預(yù)先涂有聚1-鳥氨酸和laminin(5μg/ml各)絕對大氣壓密度的6×104細(xì)胞數(shù)/cm2在用化學(xué)定義血清-釋放N2介質(zhì)(Bottenstein，等人，1979，上文)。為了把粘附體從生存隨角異色效應(yīng)中分開，添加的培養(yǎng)的化合物是追隨字首連接時(shí)期如果1-3h。在4D由使用鈣黃綠素是(olecular探頭，Eugene，OR)在熒光的耐久性試驗(yàn)(bozyczko-Coyne，等人，1993，上文)。微觀的計(jì)數(shù)的神經(jīng)原有相互關(guān)系的直接與相對熒光值?？傊?，培養(yǎng)基串聯(lián)稀釋的在二苯亞磺酰胺(Dulbeccos磷酸鹽緩沖鹽水)和最終濃度的μm calein是紙料是然后被加到各96-井。該片是培養(yǎng)為30分鐘在37℃，后面有連續(xù)稀釋塌陷二苯亞磺酰胺。該熒光信號讀者使用A片-讀數(shù)熒光計(jì)從微孔(Cytofluor2350)在刺激＝485納米和散發(fā)＝538納米。分別片，平均背景源出韋爾斯接受鈣黃綠素是，除了不包含細(xì)胞，是減損都值。線性的該熒光信號是核對的為濃度和孕育時(shí)間為該確定的細(xì)胞密度射程這些實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例百分比的生存高于控制的運(yùn)動神經(jīng)原在試驗(yàn)化合物在250納米示于表3面。生存的皮層神經(jīng)元大腦皮質(zhì)是切割的從萌芽的天18大鼠胎兒和酶催消化獲得sigle細(xì)胞懸液。細(xì)胞被種子絕對大氣壓密度的1.56×105/cm2到聚鳥氨酸/laminin涂層96井組織培養(yǎng)片在血清-釋放神經(jīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有B27追加額之上。片用包上的A溶液聚ornithine/laminin(8ug/ml各)磷酸鹽緩沖鹽水為至少兩個(gè)小時(shí)在37c制造。在活體外天5-7，皮層神經(jīng)元暴露于Ab25-35(20uM)耳根前或缺少試驗(yàn)化合物。Ab25-35(Sigma，St.Louis，MO)儲備溶液(1mM)是制備在消電離-蒸餾過的蒸鎦的H2O。親戚二乙基溴乙酰胺生存決意在48熱軋鋼后肽添加使用乳酸脫氫酶(乳酸脫氫酶)釋放作為一指標(biāo)的質(zhì)膜主體/膜耐久性。LDH調(diào)節(jié)使用該細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)裝備(Boehringer-Mannhein，Indianapolis，IN)與該廠家指示一致。數(shù)據(jù)用來表示百分比抑制的DLH釋放與培養(yǎng)用處理AB25-35孤獨(dú)的有關(guān)。
表3Cortical Motoneurons Cos-7 Cos-7Cos-7Cos-7Neurons Cells CellsCellsCellsSurvival Survival ％JNKDLKMLK3 MLK2 MLK1配方％Control ％Control Inhib.@ ％JNK ％JNK％JNK％JNK@250nm@250nM 500nmInhib.@Inhib.@ Inhib.@ Inhib.@500nm 500nm500nm500nmIII146，56 30065 63，73 98，99 89，67 97，96III247，80 31588 36，22，42 94，94 69，44 92，64I3 22，54 17788 20，25 94，93 079，29I4 29，39 16597 58，13 84，92 063，3852，8 901具有化學(xué)式III的化合物，式中Z1，Z2，R1，和R2為H；X為CO2CH3；R為OH。
2具有化學(xué)式III的化合物，式中Z1和Z2為H；X為CO2CH3；R1，和R2為CH2SCH2CH3；而R為OH。
3具有化學(xué)式I的化合物，式中I A1，A2，R1，R3，R5，和R6為H；B1和B2一起表示O；R2為CH2CH2Oac；R4為CH2CH2(2-Pyridyl)；而X為CH2。
4具有化學(xué)式I的化合物，式中A1，A2，R1，R3，R5，和R6為H；B1和B2一起表示O；R2為H；R4為CH2CH2(2-Pyrimidinyl)；而X為CH2。實(shí)施例32免疫沉定反應(yīng)的內(nèi)源的jnk活性從運(yùn)動神經(jīng)原在或出席的吲哚并咔唑或的培養(yǎng)稠合吡咯咔唑純化motorneurons是片絕對大氣壓密度的6字母×104細(xì)胞/cm2在16mm直徑井。在處理之前，細(xì)胞是考慮附加于為2小時(shí)。細(xì)胞是用處理0.0125％二甲亞砜或500納米化合物為2熱軋鋼在N2合成培養(yǎng)基。細(xì)胞然后被用漂掉冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水后面有消散在0.4mL氚核緩沖的如上所述在實(shí)施例30。溶胞產(chǎn)物從運(yùn)動神經(jīng)原培養(yǎng)是正規(guī)化的到檔次編號和免疫沉淀與JNK1抗體(商品目_#sc-474)購買者從圣克魯斯廠生物工藝學(xué)(圣克魯斯廠，CA)。JNK活性從免疫活性是試驗(yàn)在出席的.32p-ATP和C-六月基質(zhì)作為描述以上。抑制活性的縱向分布的該4試驗(yàn)化合物是腫瘤和正常組織細(xì)胞周期的比較在運(yùn)動神經(jīng)原和在cos7細(xì)胞過表達(dá)DLK，MLK-1，MLK-2或MLK-3(Table 3)。
在6×104cells/cm2密度16mm直徑wells中純化motorneuronswere plated.細(xì)胞可容許在2小時(shí)前作附加處置。細(xì)胞或用0.0125％DMSO或用500nM混合溶液在N2中處置。然后細(xì)胞以冰固體磷酸緩沖劑鹽水清洗，隨后在0.4ml三重氫核緩沖劑中如在實(shí)施例30中所描述的消散。Lysate源于motoneuron的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞數(shù)量和免疫反應(yīng)培養(yǎng)with a JNK1 antibody(cat.#sc-474)購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA).JNK活性從免疫活性是試驗(yàn)在出席的.32p-ATP和C-jun基質(zhì)作為描述以上。抑制活性的縱向分布的該4試驗(yàn)化合物是腫瘤和正常組織細(xì)胞周期的比較在運(yùn)動神經(jīng)原和在cos7細(xì)胞過表達(dá)DLK，MLK-1，MLK-2或MLK-3(表3)。實(shí)施例33Cos7細(xì)胞中MLK-3誘導(dǎo)的JNK活性的抑制與原始胚胎培養(yǎng)物中膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性之間的關(guān)系為了測定受這些激酶調(diào)節(jié)的JNK途徑的抑制是否與神經(jīng)營養(yǎng)化合物相關(guān)，我們評價(jià)了化合物對過表達(dá)HA-JNK和MLK3的Cos7細(xì)胞中JNK活性的影響。48小時(shí)轉(zhuǎn)染期之后，將細(xì)胞與500nM的化合物溫育2小時(shí)，然后細(xì)胞溶解。把細(xì)胞裂解液免疫沉淀，并如前述測定激酶活性。將結(jié)果報(bào)道為對照樣品的抑制百分比，其中對照為有DMSO存在下的JNK活性。正如表4所見，脊髓中具有活性和/或基底前腦ChAT活性的大多數(shù)化合物是JNK的MLK-3活化的潛在抑制劑。
表4吲哚并和茚并咔唑?qū)^表達(dá)MLK3的Cos7細(xì)胞中JNK活性的影響
1具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1是NHCONHC2H5；R2是CH2CH2(2-Pyridyl)；和R是OH。
2具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2OCH2OCH2CH3；和R是OH。
3具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；和R是OH。
4具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3和R4是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；和X是CH2。
5具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2Oac；R5是Br；和X是CH2。
6具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2Oac；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；和X是CH2。
7具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；和X是CH2。
8具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2OH；和X是CH2。
9具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；和X是S。
10具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；和X是CH2。
11具有式III的化合物，其中Z1、Z2、R1和R2是H；X是CO2(CH2)4CH3；和R是OH。
12具有式III的化合物，其中Z1、Z2和R1是H；R2是CH2OH；X是CO2CH3；和R是OH。
13具有式III的化合物，其中Z1和Z2一起形成＝O；R1和R2是Br；X是CO2CH3；和R是OH。
14具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；和X是CH2。
15具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是I；X是CO2CH3；和R是OH。
16具有式III的化合物，其中Z1、Z2、R1和R2是H；X是CO2CH3；和R是OH。
17具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2CH2SCH3；X是CO2CH3；和R是OH。
18具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R2、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH2CH2(2-噠嗪基)；和X是CH2。
19具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-噠嗪基)；和X是CH2。
20具有式III的化合物，其中Z1、Z2、R1和R2是H；X是CO2CH3；和R是OCH2。
21具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是(CH2)3-NH-C(＝O)-3，5-二羥基苯基；和X是CH2。
22具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是苯甲?；?；和X是CH2。
23具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R2、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH＝CH-C≡N；和X是CH2。實(shí)施例34MLK活化的凝膠轉(zhuǎn)移分析MLK的活化可導(dǎo)致誘導(dǎo)c-jun轉(zhuǎn)錄，增加c-jun蛋白。c-jun蛋白的增量可通過標(biāo)準(zhǔn)分析來測定，如凝膠轉(zhuǎn)移分析所鑒定。Garner等，Nucleic Acids Res.，1981，9，3047-3060，在此以其全文引作參考。將編碼c-jun DNA結(jié)合位點(diǎn)的放射性標(biāo)記的雙鏈DNA寡聚體與核細(xì)胞抽提物溫育，接著是丙烯酰胺凝膠電泳，并定量分析轉(zhuǎn)移到較低遷移率的放射性標(biāo)記的DNA。這表示與c-jun蛋白結(jié)合的DNA的部分，其與抽提物中c-jun蛋白的量成正比。
MLK的活化也可誘導(dǎo)c-jun磷酸化。其檢測可利用特異識別蛋白磷酸化形式的抗體在檢測系統(tǒng)如蛋白印跡或ELISA中進(jìn)行。實(shí)施例35材料Leibovitz L15培養(yǎng)基、葡萄糖、碳酸氫鈉、胰蛋白酶和抗生素來自Gibco。肌肉抽提物的制備如文獻(xiàn)所述(Henderson等，Nature，1983，302，609-611，以其全文在此引作參考)。所有其他試劑來自Sigma，除非另有所指。細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)下列文獻(xiàn)所述的程序，采用免疫方法分離運(yùn)動神經(jīng)元(胚胎第5.5天)Bloch-Gallego等，Development，1991，111，221-232，在此以其全文引作參考，程序修飾如在Weng等，NeuroReport，1996，7，1077-1081中所述，在此以其全文引作參考。將純化的運(yùn)動神經(jīng)元接種到用聚-DL-鳥氨酸和昆布氨酸(1μg/ml，Upstate Biotech)預(yù)包被的35mm培養(yǎng)皿上(Nunc)。培養(yǎng)基為L15及碳酸氫鈉(22.5mM)、葡萄糖(20mM)、孕酮(2×10-8M)、亞硒酸鈉(3×10-8M)、伴清蛋白(0.1mg/ml)、胰島素(5μg/ml)、青霉素-鏈霉素10％以及10％熱滅活的馬血清。肌肉抽提物以30μg/ml補(bǔ)充?；衔颕II-3以4mM的母液在DMSO中制備并在4℃避光保存。處理的和對照培養(yǎng)物中的DMSO的終濃度為0.125％。
將脊柱旁交感神經(jīng)節(jié)(SG；胚胎第12天(E12))、后根神經(jīng)節(jié)(DRG；E9)和睫狀神經(jīng)節(jié)(CG；E8)從雞胚胎中在所示胚胎天時(shí)解剖，如下列文獻(xiàn)所述Lindsay等，Dev.Biol.，1985，112，319-328，以其全文在此引作參考。在胰蛋白酶化作用和分解后，將神經(jīng)細(xì)胞懸浮液鋪到聚鳥氨酸-昆布氨酸包被的培養(yǎng)皿中，其在Ham’s F14培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有10％的馬血清。在鋪板之后，立即以下列濃度加入存活因子神經(jīng)生長因子(NGF)，20ng/ml；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，10ng/ml。將培養(yǎng)物維持在37℃及5％CO2的潮濕環(huán)境中。細(xì)胞計(jì)數(shù)將神經(jīng)元鋪在帶有格柵的35mm培養(yǎng)皿中(Nunc)。在鋪板之后立即以及48小時(shí)后再次將各個(gè)皿所篩選的面積含有約10％的表面掃描相光細(xì)胞的存在以評價(jià)存活的百分?jǐn)?shù)。細(xì)胞存活由臺盼藍(lán)進(jìn)行必要的染色得到確認(rèn)(未顯示)。完整的DRG將神經(jīng)節(jié)放置在已用不含N2培養(yǎng)基中的聚-1-鳥氨酸和昆布氨酸(各5μg/ml磷酸緩沖的鹽溶液)包被的96孔板中(Bottenstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1979，76，514-517，在此以其全文引作參考)，所述培養(yǎng)基中含有0.05％牛血清白蛋白(BSA)，并在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境中維持48小時(shí)。在鋪板之后2小時(shí)，經(jīng)處理的神經(jīng)節(jié)接受250nM的化合物III-3或20ng/ml的NGF。
化合物III-3以濃度依賴的方式支持雞胚胎外周神經(jīng)元的存活NGF的抽提從分離的培養(yǎng)物E9后根神經(jīng)節(jié)傳感神經(jīng)元(DRG)和E12交感神經(jīng)元(SG)在48小時(shí)內(nèi)誘發(fā)它們進(jìn)行PCD。MLK的活化可導(dǎo)致誘導(dǎo)c-jun轉(zhuǎn)錄，增加c-jun蛋白。c-jun蛋白的增量可通過標(biāo)準(zhǔn)分析來測定，如凝膠轉(zhuǎn)移分析所鑒定。Garner等，Nucleic AcidsRes.，1981，9，3047-3060，在此以其全文引作參考。將編碼c-jun DNA結(jié)合位點(diǎn)的放射性標(biāo)記的雙鏈DNA寡聚體與核細(xì)胞抽提物溫育，接著是丙烯酰胺凝膠電泳，并定量分析轉(zhuǎn)移到較低遷移率的放射性標(biāo)記的DNA。這表示與c-jun蛋白結(jié)合的DNA的部分，其與抽提物中c-jun蛋白的量成正比。MLK的活化也可誘導(dǎo)c-jun磷酸化。其檢測可利用特異識別蛋白磷酸化形式的抗體在檢測系統(tǒng)如蛋白印跡或ELISA中進(jìn)行。在最適條件下，用化合物III-3可將培養(yǎng)物維持一周和更長時(shí)間(數(shù)據(jù)未顯示)?；衔颕II-3以濃度依賴的方式支持雞胚胎運(yùn)動神經(jīng)元的存活將Jurkat細(xì)胞生長于補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。TNF-α來自Promega和抗CD3和抗CD28抗體來自Pharmigen。Jurkat實(shí)驗(yàn)在96孔板中以200μl的量進(jìn)行。IL-2的測定采用購自BoehringerMannheim的ELISA試劑盒進(jìn)行。在加入Jurkat細(xì)胞之前，讓針對CD3和CD28的抗體結(jié)合到96板的塑料中(PNS中18小時(shí))。在加入抗體包被的板之前將細(xì)胞用化合物處理1小時(shí)。把針對CD3和CD28的抗體用于激活T細(xì)胞受體和誘導(dǎo)IL-2。在誘導(dǎo)起始后6和24小時(shí)之間，IL-2從Jurkat細(xì)胞中釋放出來(圖17)。沒有IL-2組成地制備(圖16A)。接著評價(jià)化合物III-3(在誘導(dǎo)前用化合物III-3處理1小時(shí))對IL-2誘導(dǎo)的影響(圖16B)?；衔颕II-3濃度500nM抑制了IL-2誘導(dǎo)80％以上(圖16B)。采用化合物III-3和化合物I-4進(jìn)行更廣泛的劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)，化合物III-3(數(shù)據(jù)未顯示)?；衔颕II-3促進(jìn)神經(jīng)突從完整的后根神經(jīng)節(jié)中生長出來上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物III-3不僅促進(jìn)胚胎神經(jīng)元的存活，根據(jù)下列文獻(xiàn)所述的程序，采用免疫方法分離運(yùn)動神經(jīng)元Bloch-Gallego等，Development，1991，111，221-232，在此以其全文引作參考，程序修飾如在Weng等，NeuroReport，1996，7，1077-1081中所述，在此以其全文引作參考。將純化的運(yùn)動神經(jīng)元接種到用聚-DL-鳥氨酸和昆布氨酸(1μg/ml，Upstate Biotech)預(yù)包被的35mm培養(yǎng)皿上(Nunc)。培養(yǎng)基為L15及碳酸氫鈉(22.5mM)、葡萄糖(20mM)、孕酮(2×10-8M)、亞硒酸鈉(3×10-8M)、伴清蛋白(0.1mg/ml)、胰島素(5μg/ml)、青霉素-鏈霉素10％以及10％熱滅活的馬血清。肌肉抽提物以30μg/ml補(bǔ)充?；衔颕II-3存在下，其似乎稠密以及可能的叢生。實(shí)施例36體內(nèi)處理雞胚胎中發(fā)育調(diào)節(jié)的運(yùn)動神經(jīng)元的死亡本發(fā)明的例子詳細(xì)描述在下列文獻(xiàn)中Glicksman等，J.Neurobiol.，1998，35，361-370，在此以其全文引作參考。在第E6天，制作雞蛋殼的窗口(Spafas，Preston，CT)和將媒介物(5％SolutolTMHS 15，聚乙二醇660羥基硬脂酸酯；BASF Aktiengesellschaft，Ludwigshafen，Germany(磷酸緩沖液中，pH7.2))或媒介物中化合物III-3的具體劑量從E6到E9每天一次直接施用到the vascularized chorioallantoic膜上，如下列文獻(xiàn)所述Oppenheim等，Science，1991，251，1616-1617，在此以其全文引作參考)。胚胎在E10天處死并將他們的脊髓去除，在Carnoy溶液中固定(10％冰醋酸、60％absolute乙醇、30％氯仿)，對系列石蠟切片進(jìn)行處理，并用硫堇染色。根據(jù)前述標(biāo)準(zhǔn)對腰神經(jīng)區(qū)段的每第20切片進(jìn)行計(jì)數(shù)(Clarke等，Methods In Cell BiologyCell Death，1995，Schwart & Osbrone，Eds.，Academic Press，New York，第277-321頁，在此以其全文引作參考)。新生大鼠中的發(fā)育調(diào)節(jié)的運(yùn)動神經(jīng)元死亡不限期的pregenant Sprague-Dawley大鼠是從中獲得哈爾綸聚偏氯乙烯纖維實(shí)驗(yàn)室(印第安納波利斯，IN)。雌性大鼠小狗是注入每日的，皮下地(SC)，在該目標(biāo)上方靶會陰肌肉(perineal muscles)，用化合物III-3in 5％SolutolTMHS 15或cehicle沿著開始出生日子(P1)繼續(xù)的為5天(P5)。在p10或p60，小狗是斬首，血收集在肝素化(利用肝素延長血液凝固時(shí)間)毛細(xì)管，區(qū)域的灌注的之后的該脊髓含有該性雙晶脊髓的核心的該球海綿體肌(SNB)該會陰的區(qū)域含有該球海綿體肌(公元前)提肌自動號碼標(biāo)識(LA)筋肉是切割的該帶有saline/formalin的動物。脊髓的區(qū)域含有該SNB是后綴，嵌入Paraplast，區(qū)段在10(用Cresylecht violet維持(NordeenScience，1985，229，671-673，引入這里供參考)。運(yùn)動神經(jīng)元是計(jì)數(shù)在字母×500在連續(xù)切片從該腰的5要該祭典的1區(qū)域的該脊髓作為描述預(yù)先Nordeensupra)的話。該微觀的列舉是賺錢代碼區(qū)段由一觀察者閃鋅礦到該試驗(yàn)組。運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)是正確的為孔眼大小和截面厚度(Konisgsmark，ContemporaryResearch Methods in Neuroanatomy，Nauta & Ebbesson，Eds.，1970，Springer-Verlag，New York，第315-340頁，在此以其全文引作參考)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是差異的單向分析(ANOVA)。會陰的肌肉系統(tǒng)是后綴，脫鈣的，嵌入Paraplast，區(qū)段在10(用Milligans三色維持)。使用亮現(xiàn)場顯微術(shù)(x250)，BCLA筋肉在標(biāo)準(zhǔn)的femalesiii-3-處理雌性(405animals/group)postively被通過認(rèn)出兩者的它們的位置出席的次級過濾。目錄的肌肉組織是痕跡從交替的區(qū)段使用A投影顯微鏡(62-5)，the橫截面積調(diào)節(jié)使用A數(shù)字化pada以電子計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的形態(tài)測量學(xué)系統(tǒng)(Sigmascan，Jandel Scientific)。肌肉卷通過多嘴的總數(shù)截面的面積校對為百分比結(jié)構(gòu)的樣品而有計(jì)劃的。
收集的血室溫下離心5分鐘；然后去除血漿并冷凍于-20℃。血清睪酮水平(6-7動物/組)的測定遵循下列文獻(xiàn)中所闡述的程序通過放射性免疫分析進(jìn)行Wingfield等，Steroids，1975，26，311-327，在此以其全文引作參考。成年大鼠中的軸索顯微外科術(shù)誘導(dǎo)的運(yùn)動神經(jīng)元分化左側(cè)舌下神經(jīng)是橫切在成人雌性的頸縮sprague-dawley大鼠(120-180g)在下neumbutol anesthesia，50ul的III-3或它的媒介物(5％solutol同文電報(bào)診斷不明15)被用于一支，未付的碾磨，醫(yī)學(xué)博士)，然后折回該中樞端橫切的精神。在7天以后，該動物是使麻醉灑遍與4％仲甲醛在Sorensons緩沖的，0.07m磷酸酯，pH7.2。腦莖是除去和40-uM-厚的分期連載作品冠狀面是很快向前走A低溫恒溫器(Chiu等，NeuroReport，1994，5，693-696，它被引入供參考)。每一第五區(qū)段是加工為閑談免疫組織化學(xué)作為預(yù)先描述(Chiu等，J.Comp.Neurol.，1993，328，351-363，在此以其全文引作參考)使用1∶350稀釋的一抗閑談單克隆抗體從Chemicon。細(xì)胞三肼基三嗪污漬清楚地在背景是把…計(jì)算在內(nèi)污漬區(qū)段上；列舉細(xì)胞用來表示閑談的比率-免疫細(xì)胞在該霧化側(cè)的該舌下神經(jīng)核對目免疫活性的細(xì)胞在該控制(未受損害的)側(cè)數(shù)目。
化合物III-3援救大鼠胚胎運(yùn)動神經(jīng)元從apoptotic死亡在vitroinhibited信號途徑導(dǎo)致jnk1活化在這些細(xì)胞(Maroney等，J.Neurosci.，1998，18，104-11 1，被引入供參考)。為了確定潛在性活性活體內(nèi)，III-3是估定分為兩部分的模型試驗(yàn)性地調(diào)整可程式化馬達(dá)二乙基溴乙酰胺deathin的模型axotomy-誘導(dǎo)反分化在成人運(yùn)動神經(jīng)元。在小雞，大約50％的該脊髓運(yùn)動神經(jīng)元在E5-10期間經(jīng)歷分區(qū)控制說明符(Hamburger等，J.Neurosci.，1982，1，38-55；Purves等，Body和BrainA Trophic Theory of Neural Connections，1988，HarvardUniversity Press，Cambridge，MA，兩者在此皆以其全文引作參考)?；衔颕II-3要該絨膜尿囊的膜在這期間防止馬達(dá)二乙基溴乙酰胺死亡在劑量給藥-依賴其它方式的話(圖19)。四十百分之該運(yùn)動神經(jīng)元那些世界正規(guī)地印模是援救A最二輥的劑量給藥已校正的(2.3和7μg/day)，25％的該運(yùn)動神經(jīng)元是援救在較低劑量(1.2和1.8μg/天)(圖19)。
在早期的產(chǎn)期的生活的雌性大鼠(更遲的胚期直到產(chǎn)后的天(請注意)4)期間，超過50％的該運(yùn)動神經(jīng)元在snb的在是消除VIA分區(qū)控制說明符(Breedlove，J.Neurobiol.，1986，17，157-176，在此以其全文引作參考)。在雄性，運(yùn)動神經(jīng)元在這些核心里使受神經(jīng)支配有條紋的陰莖筋肉包括I交配的反射。睪丸的分泌的和甾體減少SNB馬達(dá)二乙基溴乙酰胺死亡在雌性和防止許多的和的萎縮LA筋肉使受神經(jīng)支配由該神經(jīng)原。行政的睪丸激素到雌性小狗導(dǎo)致A充分男性脈碼調(diào)制數(shù)snb運(yùn)動神經(jīng)元(Nordeen等，同上)和prevented BC和LA muscle atrophy(Waiman等，Endocrinology，1941，29，955-978，在此以其全文引作參考)。每日的螺釘行政的III-3(PN 1-5)到雌性大鼠顯著地纖細(xì)的馬達(dá)二乙基溴乙酰胺死亡(圖20A).援救的該snb馬達(dá)二乙基溴乙酰胺死亡由III-3發(fā)生在兩劑量給藥(0.5和1mg/kg/天)。在該最大有效劑量的0.51mg/kg/，行政的III-3導(dǎo)致A 70％增強(qiáng)在馬達(dá)二乙基溴乙酰胺生存哪個(gè)等于該隨角異色效應(yīng)的睪丸激素(圖20A)。化合物III-3沒有改變血漿睪丸激素處理雌性的水平。收音機(jī)免疫的測量的血漿睪丸激素水平在該1-mg/kg/每天基團(tuán)導(dǎo)致不顯著差異當(dāng)比擬該車輛控制基團(tuán)(0.016(0.008ng/ml，0.029和0.015ng/ml平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差(S.E.M.)，分別地)。
為了確定化合物III-3處理在長期維持運(yùn)動神經(jīng)存活方面是否有效，用化合物III-3處理雌性動物(0.5和1mg/kg/天)相同的期限PN(1-5)。將一半經(jīng)媒介物處理的動物和兩者皆處理的組在PN 10處死。剩余動物維持不經(jīng)額外的化合物III-3的處理，直到第PN 60處死。如前所觀察(圖20A)，化合物III-3處理導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)存活提高70％(圖20B)。此外，100％這些當(dāng)中援救運(yùn)動神經(jīng)元是可辨認(rèn)的詞法上55天后來上次處理與化合物III-3(圖20B).化合物III-3抑制的馬達(dá)二乙基溴乙酰胺死亡當(dāng)該二乙基溴乙酰胺時(shí)期許可證馬達(dá)二乙基溴乙酰胺生存進(jìn)入成年。
不論該從馬達(dá)二乙基溴乙酰胺損失成人人類疾病比如肌萎縮性側(cè)索硬化成人運(yùn)動神經(jīng)元在最動物模型的馬達(dá)二乙基溴乙酰胺傷害抗的死亡中清除掉說和很好的隨角異色效應(yīng)。然而，axonal傷害做導(dǎo)致形態(tài)(Oppenheimsupra)和生物化學(xué)變化(Oppenheim等，同上；Rende等，J.Comp.Neurol.，1992，319，284-298，以其全文在此引作參考；Chiu等，J.Comp.Neurol.，1993，328，351-363，以其全文在此引作參考)在成人運(yùn)動神經(jīng)元那些許多仿造物退行性病變前面的死亡在害病的在墮落的運(yùn)動神經(jīng)元。一個(gè)實(shí)施例這些當(dāng)中種變化合成的形成axotomy的該舌下神經(jīng)那些使受神經(jīng)支配該舌。單方面的橫切這些當(dāng)中在成人的精神大鼠導(dǎo)致?lián)p失的95％閑談的-免疫活性的舌下的運(yùn)動神經(jīng)元在該同側(cè)的核心在7天(ChiuNeuroReport，1994，5，693-696)(Chiu等，NeuroReport，1994，5，693-696，以其全文在此引作參考)。損失在ChAT疫活性的不永久的。四威克斯跟隨axotomy，100％的該運(yùn)動神經(jīng)元已經(jīng)恢復(fù)的控制點(diǎn)水平的閑談免疫活性的(Borke等，J.Neurocytol.，1993，22，141-153，以其全文在此引作參考)。ChAT免疫反應(yīng)性在該對側(cè)的舌下的運(yùn)動神經(jīng)元不影響(Chiu等，同上)(圖21和表5)。
當(dāng)應(yīng)用Gelfoam TM到hypolossal神經(jīng)，III-3劑量給藥-獨(dú)立地纖細(xì)的該減少閑談免疫反應(yīng)性在同側(cè)的舌下的運(yùn)動神經(jīng)元估定7天postaxotomy。最大有效劑量(50μg)導(dǎo)致40％更ChAT-免疫活性的運(yùn)動神經(jīng)元比擬該axotomized，未經(jīng)治療控制(圖21B和表5)。曾有鐘形的給兩者的服依賴較低和較高劑量導(dǎo)致生存大于該未經(jīng)治療控制，但低于那些完成在50ug。照現(xiàn)在的樣子真實(shí)的與該snb模型，沒有締合了的重量損失，致死，否則總數(shù)組織損傷在這些動物里在任何劑量給藥已校正的。
在三分開的模型的運(yùn)動神經(jīng)元退化活體內(nèi)，化合物III-3證明神經(jīng)保護(hù)活性試驗(yàn)性地-調(diào)整分區(qū)控制說明符的腰的脊髓運(yùn)動神經(jīng)元在萌芽時(shí)期的(圖19)，雄激素-敏感的死亡的產(chǎn)后的snb運(yùn)動神經(jīng)元(圖20)，和axotomy-感應(yīng)損耗的A官能的制造，ChAT，在成人舌下的運(yùn)動神經(jīng)元(圖21和表5)。化合物III-3是有效的當(dāng)sc注入外圍地施加，應(yīng)用局部到該切頭的神經(jīng)，或直接覆蓋在這些小雞胚胎絨膜尿囊。與母體化合物相反K-252a，化合物III-3大約五重的更有力的在居間的生存在運(yùn)動神經(jīng)元-加富培養(yǎng)(數(shù)據(jù)未顯示)和沒有顯示的活性反對trkA酪氨酸激酶和若干絲氨酸蘇氨酸激酶(Maroney等，同上Kaneko等，J.Med.Chem.，1997，40，1863-1869，在此以其全文引作參考)。
表5化合物III-3對axotomized舌下神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)元中膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶的免疫活性的影響
化合物III-3或媒介物是包括在內(nèi)凝膠泡沫到舌下神經(jīng)的中樞端緊接著跟隨它的橫切。7天后，將動物處死并依次切片through thehypoglossal nucleus，并且用抗ChAT抗體免疫染色每個(gè)第5切片。計(jì)數(shù)的閑談-肯定的神經(jīng)原由制造該同側(cè)的(實(shí)驗(yàn)的)對側(cè)的(控制)核心的側(cè)。
*p＜0.05，與媒介物處理的動物比較統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
MLK-3途徑的抑制劑體內(nèi)顯示功效并封閉MPTP模型中MLK-3的下游的磷酸化作用。
MPTP是使用劑量給藥(40mg/kg)那些生產(chǎn)損失紋狀體的多巴胺能的末端細(xì)胞主體在該黑質(zhì)。酪氨酸羥化酶用作標(biāo)記器為多巴胺能的神經(jīng)線端在該黑質(zhì)。系統(tǒng)給藥化合物III-3纖細(xì)的損失的黑質(zhì)酪氨酸羥化酶免疫活性的神經(jīng)原后來MPTP損害(圖22A；Saporito等，1999)。因?yàn)榛衔颕II-3已知抑制劑的MLK-3，活化的下游地基質(zhì)的MLK-3是按MPTP-處理小鼠。水平的磷酸化MKK4調(diào)節(jié)使用A磷酸MKK4特異抗體(New England Biolabs，Beverly，MA)那些經(jīng)過驗(yàn)證的該單磷酸化由形成MKK4由immunoblot(圖22B)或ELISA(圖22C)。MPTP行政升降機(jī)構(gòu)水平的磷酸化MKK4在黑質(zhì)由高達(dá)5折疊的在控制水平(圖22B)。在行政的MPTP和相符CNS服用水平的MPP+之后，山峰海拔發(fā)生4熱軋鋼。MPTP-居間的MKK4磷酸化被預(yù)處理用1-deprenyl預(yù)處理，表明這次磷酸化事件被MPP+媒介(圖22C)。而且，MKK4磷酸化部分地抑制與化合物III-3預(yù)處理絕對大氣壓劑量給藥(1mg/kg)那些生產(chǎn)對mptp-誘導(dǎo)鼻息下多巴胺能的損失的保護(hù)措施(圖22C)。這些數(shù)據(jù)證明MPTP(MPP+)活化MKK4，下游地基質(zhì)的MLK-3。而且，這些數(shù)據(jù)證明已知的抑制劑的MLK-3抑制活化這些當(dāng)中激酶途徑活體內(nèi)。實(shí)例37炎癥由THP-1細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)IL-1和TNF-α以及吲哚并咔唑和吡咯并咔唑?qū)φT導(dǎo)的影響細(xì)胞的該免疫系統(tǒng)是選擇自后許多激酶涉及到該規(guī)則的數(shù)值免疫學(xué)的官能團(tuán)，例如，該感應(yīng)的該合成的細(xì)胞活素和該感應(yīng)的A細(xì)胞活素生物資源。A recent report(Hambleton等，Pro.Natl.Acid.Sci.USA，1996，93，2774-2778，在此以其全文引作參考)向表明該處理的單核細(xì)胞-派生細(xì)胞系與線性規(guī)劃系統(tǒng)引起A急促的活化的jnk活性。當(dāng)單核細(xì)胞和細(xì)菌的內(nèi)毒素比如脂質(zhì)聚糖(線性規(guī)劃系統(tǒng))它們生產(chǎn)該激動的細(xì)胞活素建立聯(lián)系，IL-1和TNF-a。抑制的生產(chǎn)這些當(dāng)中兩個(gè)細(xì)胞活素可以A有用的處理的某些激動的無序的該免疫系統(tǒng)。這些細(xì)胞活素能夠是容易地調(diào)整商業(yè)的酶聯(lián)免疫吸附測定裝備。我們預(yù)定實(shí)驗(yàn)到確定(1)如果indolo-和稠合吡咯咔唑能夠抑制該合成的IL-1和TNF-α在我們的單核細(xì)胞電解槽系列THP-1，(2)如果JNK是活化由LPS在四氫吡喃-1細(xì)胞和(3)如果活化n的jnk由左骶后能夠是抑制的吲哚并-和融合吡咯并咔唑。實(shí)驗(yàn)程序?qū)HP-1細(xì)胞生長在補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。LSP(大腸桿菌血清型0111.B4，TCA抽提的)購自Sigma并溶于PBS中。分析IL-1和TNF-α的ELISA試劑盒購自Boerhinger-Mannheim，并按照廠商的說明對THP-1培養(yǎng)基進(jìn)行分析。根據(jù)說明得到各個(gè)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)驗(yàn)是履行在12井培養(yǎng)皿與1或2mL的四氫吡喃-1細(xì)胞在4×105cells/ml.IL-1和TNF-α被該添加的線性規(guī)劃系統(tǒng)到該培養(yǎng)基誘導(dǎo)和該介質(zhì)收集在各種的時(shí)間其后為細(xì)胞活素試驗(yàn)。細(xì)胞被離心作用該浮在表面的固定在點(diǎn)上-70℃直到試驗(yàn)除去。想要求最小參數(shù)值費(fèi)用實(shí)驗(yàn)是履行一式兩份培養(yǎng)和該雙份浮在表面的是集資的在離心作用以后。各集資的浮在表面的是試驗(yàn)一式兩份。儲備溶液的indolo-稠合吡咯咔唑在100％二甲亞砜是稀釋的要該想望集中在介質(zhì)含有10％胎兒牛血清或在介質(zhì)含有0.5mg/ml牛血清清蛋白的話。除非另外狀態(tài)，化合物被增加給該四氫吡喃-1細(xì)胞1高分辨率在前小孩他添加的線性規(guī)劃系統(tǒng)。
在免疫沉淀該jnk蛋白質(zhì)從一拔出的細(xì)胞溶解四氫吡喃-1細(xì)胞之后，試驗(yàn)為jnk活性是履行。球團(tuán)四氫吡喃-1細(xì)胞是細(xì)胞溶解準(zhǔn)備就緒的為15分鐘在500ul的壓裂緩沖的(10mM三-HCl，pH7.5，50mMNaCl，30uM焦磷酸鈉，1mg/ml牛血清清蛋白，1％Triton-X-100)。該拔出是離心為10分鐘在14K和5ul的jnk抗體(圣克魯斯廠)被增加給該浮在表面的。該精確是旋轉(zhuǎn)為60分鐘在4℃，75ul的洗滌蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠(20％重量容量比在壓裂推薦拔出旋轉(zhuǎn)另一個(gè)30分鐘置值該抗體配合物到該瓊脂糖凝膠。該蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠是洗滌兩次與壓裂緩沖的，一次與20mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸，pH7.6，20mM mgcl2，2mM二硫蘇糖醇，然后培養(yǎng)為15分鐘在30℃在30ul的激酶緩沖的(20mM hepes，20mM MgCl2，2MM DTT，1μgrecombinant c-jun，和2μM ATP-γ-32P，2μCi。該反應(yīng)被該添加的10ul的4x十二烷基磺酸鈉凝膠裝入緩沖區(qū)停止，加熱為3分鐘在80℃，蛋白質(zhì)是分析在10％十二烷基磺酸鈉凝膠。凝膠是干燥的，暴露于Phosphorimager plate，放射性帶材是分析在Phosphorimager。
由抑制劑實(shí)驗(yàn)表明那些左骶后在2(g/ml引起該最高產(chǎn)量的LPS-1和濃度的線性規(guī)劃系統(tǒng)用于全部實(shí)驗(yàn)之后。在添加的線性規(guī)劃系統(tǒng)為最高產(chǎn)量的該細(xì)胞活素決意由拿介質(zhì)為的等分試樣試驗(yàn)在各種的時(shí)間后來該添加的線性規(guī)劃系統(tǒng)之后，該最小值時(shí)間。第一實(shí)驗(yàn)表明那些既IL-1和TNF-a實(shí)現(xiàn)最高產(chǎn)量在低于5高分辨率后來該添加的LSP后。既然最最早地的收集時(shí)間是2.4高分辨率第一實(shí)驗(yàn)，A第二實(shí)驗(yàn)是履行與收集起始于15分鐘后來該添加的LSP。在該添加的lps.不重要的腫瘤壞死因子-a(是發(fā)現(xiàn)平均來說直到90分鐘后來線性規(guī)劃系統(tǒng)添加之后，實(shí)驗(yàn)的合成的其中僅僅腫瘤壞死因子-a是試驗(yàn)向表明它實(shí)現(xiàn)最高產(chǎn)量在3高分辨率。
該急促的達(dá)到的最高產(chǎn)量表明很緊密規(guī)則的該合成的該2細(xì)胞活素C急促的合成和快速下降調(diào)節(jié)。在該添加的線性規(guī)劃系統(tǒng)與或者更生霉素之前，培養(yǎng)的細(xì)胞是處理為30分鐘，A核糖核酸合成抑制劑，否則酮環(huán)己酰亞胺，蛋白質(zhì)合成抑制劑。介質(zhì)是收集3高分辨率后來該添加的線性規(guī)劃系統(tǒng)和腫瘤壞死因子-a是試驗(yàn)。新的核糖核酸和新的蛋白質(zhì)合成都是需要的腫瘤壞死因子-a感應(yīng)以后也不腫瘤壞死因子-a發(fā)現(xiàn)平均來說的細(xì)胞用處理抑制劑。該下一個(gè)實(shí)驗(yàn)是履行到確定如果化合物III-3將抑制該感應(yīng)的IL-1和TNF-α?；衔颕II-3抑制該感應(yīng)的兩者的IL-1和TNF-α with IC50 values of 267nM和139nM分別。實(shí)驗(yàn)的合成的是獲得與細(xì)胞在介質(zhì)含有10％胎兒牛血清。自…以后該試驗(yàn)與脊髓的女生薄織物和基礎(chǔ)的前腦薄織物為化合物被的神經(jīng)營養(yǎng)性活性履行在血清-游離介質(zhì)(500ug/ml牛血清清蛋白)它對有趣的確定該50％感染濃度喜愛該抑制的左內(nèi)鋒-1和腫瘤壞死因子-a在血清-釋放介質(zhì)。當(dāng)四氫吡喃-1細(xì)胞被用處理III-3在血清-釋放介質(zhì)(500ug/ml牛血清清蛋白)該50％感染濃度是減少10折疊從269納米到23納米時(shí)。除非另有說明全部實(shí)驗(yàn)履行將來被履行在血清-釋放介質(zhì)。該抑制由III-3的該感應(yīng)的左內(nèi)鋒-1和腫瘤壞死因子-a在四氫吡喃-1細(xì)胞建議III-3可以有用的為治療學(xué)在處理病理學(xué)的條件由所引起該生產(chǎn)的正常以上大量這些細(xì)胞活素。膿毒性休克是這樣的A狀態(tài)。膿毒性休克由所引起該生長的革蘭氏陰性細(xì)菌在該循環(huán)哪些依次釋放大量該內(nèi)毒素，線性規(guī)劃系統(tǒng)。該線性規(guī)劃系統(tǒng)然后刺激主要地該單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到生產(chǎn)大量IL-1和腫瘤壞死因子-a，哪個(gè)然后引起大而重的組織損傷和在許多致死。
對若干種化合物測試了其抑制TNF-α的能力，并與抑制JNK的能力進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示在表6中。
表6
化合物III-3對Jurkat細(xì)胞中的IL-2誘導(dǎo)的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定化合物III-3是否抑制Jurkat細(xì)胞中IL-2的誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)程序?qū)urkat細(xì)胞生長于補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。TNF-α來自Promega和抗CD3和抗CD28抗體來自Pharmigen。Jurkat實(shí)驗(yàn)在96孔板中以200μl的量進(jìn)行。IL-2的測定采用購自BoehringerMannheim的ELISA試劑盒進(jìn)行。在加入Jurkat細(xì)胞之前，讓針對CD3和CD28的抗體結(jié)合到96板的塑料中(PNS中18小時(shí))。在加入抗體包被的板之前將細(xì)胞用化合物處理1小時(shí)。把針對CD3和CD28的抗體用于激活T細(xì)胞受體和誘導(dǎo)IL-2。在誘導(dǎo)起始后6和24小時(shí)之間，IL-2從Jurkat細(xì)胞中釋放出來(圖23A)。沒有IL-2組成地制備(圖23ACNT)。接著評價(jià)化合物III-3(在誘導(dǎo)前用化合物III-3處理1小時(shí))對IL-2誘導(dǎo)的影響(圖23B)。化合物III-3濃度500nM抑制了IL-2誘導(dǎo)80％以上(圖23B)。采用化合物III-3和化合物I-4進(jìn)行更廣泛的劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)，化合物III-3的IC50為139nM，而化合物I-4的IC50為207nM(圖23C)。
需要說明的是本專利文獻(xiàn)中所述的各個(gè)專利、申請、印刷出版物都以其全文在此引作參考。
本領(lǐng)域中的那些專業(yè)技術(shù)人員將意識到，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下，針對本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案可作出眾多的變化和修飾。然而，所有這些變化都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列表序列表<110>賽福倫公司(Cephalon，Inc.)安娜·馬羅尼(Maroney，Anna)凱文·M·沃爾頓(Walton，Kevin M.)克雷格·A·迪翁(Dionne，Craig A.)妮古拉·尼夫(Neff，Nicola)小歐內(nèi)斯特·奈特(Knight，Jr.，Ernest)馬西·A·格利克曼(Glicksman，Marcie A.)<120>調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白(Modulating Multiple Lineage Kinase Proteins)<130>SCT030274-09<150>60/097,980<151>1998-08-26<150>09/376,894<151>1999-08-18<150>09/637,054<151>2000-08-11<150>PCT/US01/24822<151>2001-08-08<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Met Gly Ile Gly Ala Tyr Tyr1 5 10 15Thr<210>2<211>23<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Trp Ala Gly Gly Ala Cys Cys1 5 10 15Ala Ser Ala Cys Arg Thr Cys20<210>3<211>33<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Arg Thr Ile Cys Ala Tyr Met Gly Ile1 5 10 15Gly Ala Tyr Tyr Thr Ile Gly Cys Ile Gly Cys Ile Met Gly Ile Ala20 25 30Ala<210>4<211>30<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Ile Gly Gly Ala Trp Ala Ile1 5 10 15Gly Trp Cys Cys Ala Ile Ala Cys Arg Thr Cys Ile Ser Trp20 25 30<210>5<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Met Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu1 5 10<210>6<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6gtggctgtgc gggcagctcg ccag 24<210>7<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7gagaccctgg atctcgcgct t 21<210>8<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>9<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9cggatccgtg acaccagtcg gaacctt 27<210>10<211>28<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>10ggaattcacc agtaagctcc agcacatc 28<210>11<211>33<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11ataattcgtg ctagcgccag agtctagccg gtg33<210>12<211>39<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>12ataagcttcc tcagtgcaag tggatcgcgc agcccctga 39<210>13<211>8<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>13Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>14<211>69<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>14ataaagcttc cagaggccat ggactacaag gacgacgatg acaaggcctg cctccatgaa60acccgaaca69<210>15<211>18<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>15gacagggcgg ccggctct 18<210>16<211>583<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>16gaattcggca cgagaggact cgcaggtgtc cggcgacgag ggctggtgga ccgggcagct60gaaccagcgg gtgggcatct tccccagcaa ctacgtgacc ccgcgcagcg ccttctccag120ccgctgccag cccggcggcg aggaccccag ttgctacccg cccattcagt tgttagaaat180tgattttgcg gagctcacct tggaagagat tattggcatc gggggctttg ggaaggtcta240tcgtgctttc tggatagggg atgaggttgc tgtgaaagca gctcgccacg accctgatga300ggacatcagc cagaccatag agaatgttcg ccaagaggcc aagctcttcg ccatgctgaa360gcaccccaac atcattgccc taagaggggt atgtctgaag gagcccaacc tctgcttggt420catggagttt gctcgtggag gacctttgaa tagagtgtta tctgggaaaa ggattccccc480agacatcctg gtgaattggg ctgtgcagat tgccagaggg atgaactact tacatgatga540ggcaattgtt cccatcatcc accgcgacct taagtccagc aac 583<210>17<211>194<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>17Asn Ser Ala Arg Glu Asp Ser Gln Val Ser Gly Asp Glu Gly Trp Trp1 5 10 15Thr Gly Gln Leu Asn Gln Arg Val Gly Ile Phe Pro Ser Asn Tyr Val20 25 30Thr Pro Arg Ser Ala Phe Ser Ser Arg Cys Gln Pro Gly Gly Glu Asp35 40 45Pro Ser Cys Tyr Pro Pro Ile Gln Leu Leu Glu Ile Asp Phe Ala Glu50 55 60Leu Thr Leu Glu Glu Ile Ile Gly Ile Gly Gly Phe Gly Lys Val Tyr65 70 75 80Arg Ala Phe Trp Ile Gly Asp Glu Val Ala Val Lys Ala Ala Arg His85 90 95Asp Pro Asp Glu Asp Ile Ser Gln Thr Ile Glu Asn Val Arg Gln Glu100 105 110Ala Lys Leu Phe Ala Met Leu Lys His Pro Asn Ile Ile Ala Leu Arg115 120 125Gly Val Cys Leu Lys Glu Pro Asn Leu Cys Leu Val Met Glu Phe Ala130 135 140Arg Gly Gly Pro Leu Asn Arg Val Leu Ser Gly Lys Arg Ile Pro Pro145 150 155 160Asp Ile Leu Val Asn Trp Ala Val Gln Ile Ala Arg Gly Met Asn Tyr165 170 175Leu His Asp Glu Ala Ile Val Pro Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Ser180 185 190Ser Asn<210>18<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Asn Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Cys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種鑒別可用于治療艾滋病周圍神經(jīng)病的化合物的方法，其包括用化合物與包含多譜系激酶蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸以測定所用化合物是否減低所接觸的多譜系激酶蛋白的活性。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的多譜系激酶蛋白選自包括多譜系激酶1(MLK1)，多譜系激酶2(MLK2)，多譜系激酶3(MLK3)，亮氨酸拉鏈支撐激酶(LZK)，雙亮氨酸拉鏈支撐激酶(DLK)，和多譜系激酶6(MLK6)的組群。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的蛋白活性通過所述蛋白質(zhì)底物的活性或磷酸化狀態(tài)來測定，其中所述的底物選自包括JNK1，JNK2，JNK3，ERK1，ERK2，p38α，p38β，p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEK1)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELK1，和AEX-3的哺乳動物中同族體。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的蛋白活性通過所述蛋白質(zhì)底物的活性、所述蛋白質(zhì)底物的量、或所述蛋白質(zhì)底物的mRNA編碼來測定。
5.一種治療具艾滋病周圍神經(jīng)病的病人的方法，其包括給上述病人服用能抑制多譜系激酶蛋白的化合物，以藥學(xué)上可接受的鹽或稀釋液的形式。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的化合物具有化學(xué)式(插入化學(xué)式)其中B和F，各自獨(dú)立地，和與之相連的碳原子形成不飽和的6碳芳香環(huán)，其中1-3個(gè)碳原子可被氮原子所替換；或不飽和的5碳芳香環(huán)，其中的1個(gè)碳原子可被氧、氮、或硫原子所替換；或2個(gè)碳原子可被1個(gè)硫原子和1個(gè)氮原子，或1個(gè)氧原子或1個(gè)氮原子所替換；A1和A2一起表示O，B1和B2一起表示O；R1為H、1-4(包括1和4)個(gè)碳的烷基、芳基、芳香烷基、雜環(huán)芳基、和雜環(huán)芳香烷基；COR9，其中R9為1-4(包括1和4)個(gè)碳的烷基、或芳基，優(yōu)選苯基或萘基；-OR10，其中R10為H或1-4(包括1和4)個(gè)碳的烷基；-CONH2，-NR7R8，-(CH2)nNR7R8，其中n為1-4的整數(shù)(包括1和4)；或-O(CH2)nNR7R8；而R7和R8之一獨(dú)立地為H或1-4(包括1和4)個(gè)碳的烷基；或者R7和R8聯(lián)合形成具有一般化學(xué)式-(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1為O、S、或CH2；R2為H、-SO2R9；-CO2R9、1-8(包括1和8)個(gè)碳的烷基，優(yōu)選1-4(包括1和4)個(gè)碳的烷基，1-8(包括1和8)個(gè)碳的烯基，優(yōu)選1-4(包括1和4)個(gè)碳的烯基，或1-8(包括1和8)個(gè)碳的炔基，優(yōu)選1-4(包括1和4)個(gè)碳的炔基；或5-7(包括5和7)個(gè)碳的單糖，其中單糖的每個(gè)羥基或不被取代或被H、1-4(包括1和4)個(gè)碳的烷基、2-5(包括2和5)的烷羰氧基、或1-4(包括1和4)個(gè)碳的烷氧基所替換；又或者1-8(包括1和8)個(gè)碳的烷基、1-8(包括1和8)個(gè)碳的烯基、1-8(包括1和8)個(gè)碳的炔基中的每一個(gè)是未被取代的；或者1-8(包括1和8)個(gè)碳的烷基、1-8(包括1和8)個(gè)碳的烯基、1-8(包括1和8)個(gè)碳的炔基各自獨(dú)立的被1-3個(gè)6-10碳(包括6和10)的芳基所取代，優(yōu)選苯基或萘基；或被雜環(huán)芳基、F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，OH，OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，O-四羥吡喃，NH2，-NR7R8，NR10COR9所取代；或被-NR10CO2R9，-NR10CONR7R8，-NHC(＝NH)NH2，-NR10SO2R9，-S(O)yR11所取代，其中R11為H或1-4碳的烷基，6-10碳的芳基，優(yōu)選苯基或萘基，或雜環(huán)芳基，而y為1或2；或被-SR11，-CO2R9，-CONR7R8，-CHO，COR9，-CH2OR7，-CH＝NNR11R12，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-SO2NR12R13，-PO(OR11)2，或OR14所取代，其中R14為羧基中的羥基移去后的氨基酸殘基；又或者R12和R13獨(dú)立地為H、1-4個(gè)(包括1和4)碳的烷基、6-10個(gè)碳的芳基，優(yōu)選苯基或萘基，或雜環(huán)芳基；或者R12和R13聯(lián)合形成連接基團(tuán)，優(yōu)選為-(CH2)2-X1-(CH2)2；R3，R4，R5和R6，各自獨(dú)立地為H、芳基，優(yōu)選6-10個(gè)(包括6-10)碳的芳基，更優(yōu)選的為苯基或萘基；雜環(huán)芳基；F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，NH2，-CH2OR14，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CONR7R8，-SR11，-S(O)yR11其中y為1或2；-CO2R9，-COR9，-CONR7R8，-CHO，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNR11R12，-(CH2)nSR9，其中n為1-4(包括1和4)的整數(shù)，-(CH2)nS(O)yR9，-CH2SR15其中R15為1-4個(gè)(包括1和4)碳的烷基；-CH2S(O)yR14，-(CH2)nNR7R8，-(CH2)nNHR14，1-8個(gè)(包括1和8)碳的烷基，優(yōu)選1-4個(gè)(包括1和4)碳的烷基；1-8個(gè)(包括1和8)碳的烯基，優(yōu)選1-4個(gè)(包括1和4)碳的烯基；1-8個(gè)(包括1和8)碳的炔基，優(yōu)選1-4個(gè)(包括1和4)碳的炔基；又或者1-8(包括1和8)個(gè)碳的烷基、1-8(包括1和8)個(gè)碳的烯基、1-8(包括1和8)個(gè)碳的炔基中的每一個(gè)是未被取代的；或者1-8(包括1和8)個(gè)碳的烷基、1-8(包括1和8)個(gè)碳的烯基、1-8(包括1和8)個(gè)碳的炔基中的每一個(gè)是如上文d)2)所描述的那樣被取代的；X為，或者不被取代的1-3個(gè)(包括1和3)碳的亞烴基；或者X為可被1個(gè)R2基團(tuán)取代的1-3個(gè)(包括1和3)碳的亞烴基，優(yōu)選OR10，-SR10，R15，其中R15為1-4個(gè)(包括1和4)碳的烷基；或被苯基、萘基、7-14個(gè)(包括7和14)碳的芳烷基所取代，優(yōu)選苯基；或者X為-CH＝CH-，-CH(OH)-CH(OH)-，-O-，-S-，-S(＝O)-，-S(＝O)2-，-CR10)2-，-C(＝O)-，-C(＝NOR11)-，-C(OR11)(R11)-，-C(＝O)CHR15)-，-CHR15)C(＝O)-，-C(＝NOR11)CHR15)-，-CHR15)C(＝NOR11)-，CH2Z-，-Z-CH2-，-CH2ZCH2-，其中Z為C(OR11)(R11)，O，S，C(＝O)，C(＝NOR11)，或NR11；或者A1和A2一起各自獨(dú)立地為H，H；H，-OR11；H，-SR11；H，-NR11)2；或一起表示＝S或＝NR11；B1和dB2一起表示O；而R1，R2，R3，R4，R5，R6和X中的每一個(gè)如上文所定義；或者A1和A2一起表示O，而B1和B2一起各自獨(dú)立地為H，H；H，-OR11，H，-SR11，H，-NR11)2，或一起表示＝S或＝NR11；而R1，R2，R3，R4，R5，R6和X中的每一個(gè)如上文所定義。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6為H；B1和B2一起表示O；R2為CH2CH2OH；X為CH2。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的化合物具有化學(xué)式(插入化學(xué)式)其中B環(huán)和F環(huán)，獨(dú)立地，且各自和與其相連的碳原子在一起，可供選擇的基團(tuán)包括不飽和的6元碳芳香環(huán)其中的1至3個(gè)碳原子可被氮原子所替換；不飽和的5元碳芳香環(huán)；及不飽和的5元碳芳香環(huán)，其中1個(gè)碳原子被氧、氮、或硫原子所替換；2個(gè)碳原子被1個(gè)硫原子和1個(gè)氮原子，1個(gè)氧原子和1個(gè)氮原子、或2個(gè)氮原子所替換；或者3個(gè)碳原子被3個(gè)氮原子所替換；R1可供選擇的基團(tuán)包括H、可被取代或不可被取代的1-4個(gè)碳的烷基、可被取代或不可被取代的芳基、可被取代或不可被取代的芳烷基、可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳基、或可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳烷基；-C(＝O)R9，其中R9可供選擇的基團(tuán)包括烷基、芳基和雜環(huán)芳基；-OR10，其中R10可供選擇的基團(tuán)包括H和1-4個(gè)碳的烷基；-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pOR10，-O(CH2)pOR10和-O(CH2)pNR11R12，其中p為1-4；及其中R11和R12可供各自獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H和1-4個(gè)碳的烷基；或R11和R12一起形成化學(xué)式為-(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1可供選擇的基團(tuán)包括-O-，-S-、和-CH2-；R2可供選擇的基團(tuán)包括H，1-4個(gè)碳的烷基，-OH，1-4個(gè)碳的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pNR11R12，-O(CH2)pOR10，可被取代或不可被取代的6-10個(gè)碳的芳香烷基、及可被取代或不可被取代的雜環(huán)芳香烷基；R3，R4，R5和R6可供各自獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H，芳基，雜環(huán)芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH-，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，--OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pOR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；-CH2OR14，其中R14為其羧基中的羥基移去后的氨基酸殘基；-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pNHR14，或-CH＝NNR2R2A其中R2A與R2相同；-S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9，-CH2S(O)yR14其中y為0、1、或2；1-8個(gè)碳的烷基、2-8個(gè)碳的烯基、2-8個(gè)碳的炔基，其中每一個(gè)烷基、烯基或炔基是不可取代的；或每一個(gè)烷基、烯基或炔基可為1-3個(gè)基團(tuán)所取代的，可供選擇的取代基團(tuán)包括6-10個(gè)碳的芳基、雜環(huán)芳基、芳甲氧基、雜環(huán)烷氧基、羥基烷氧基、alkyloxy-alkoxy，hydroxyalkylthio，alkoxy-alkylthio，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)pNR11R12，-X2(CH2)pC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)yR9，-X2(CH2)pNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-tetrahydropyranyl，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，NR10S(O)2R9，-S(O)yR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，-CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，-OR14，及5-7個(gè)碳的單糖其單糖的每一個(gè)羥基可各自獨(dú)立地不被取代或被H所替換，1-4個(gè)碳的烷基，2-5個(gè)碳的alkylcarbonyloxy，或1-4個(gè)碳的烷氧基；X2為O，S，或NR10；R7和R8可供獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H、1-4個(gè)碳的烷基、1-4個(gè)碳的烷氧基、可替代或不可替代的6-10個(gè)碳的芳烷基、可替代或不可替代的雜環(huán)芳烷基、-(CH2)pOR10，-(CH2)pOC(＝O)NR11R12，和-(CH2)pNR11R12；或R7和R8一起形成化學(xué)式為-CH2-X3-CH2-的連接基團(tuán)，其中X3為X2或鍵；m和n各自獨(dú)立地為0、1、或2；Y可供選擇的基團(tuán)包括-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)-，和-CH2-；Z可供選擇的基團(tuán)包括鍵，-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)-，-N(OR10)-，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)yR9)-，-N(S(O)yNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A與R9相同；R15和R16可供獨(dú)立選擇的基團(tuán)包括H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羥基烷基和-CO2R10；R17可供選擇的基團(tuán)包括H、烷基、芳基、和雜環(huán)芳基；A1和A2可供選擇的基團(tuán)包括H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基團(tuán)其中的A1和A2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；B1和B2可供選擇的基團(tuán)包括H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基團(tuán)其中的B1和B2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；附帶條件是成對的A1和A2，或B1和B2中至少一對形成＝O。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的化合物具有化學(xué)式(插入化學(xué)式)其中Z1為H，Z2為H，或Z1和Z2一起形成＝O；R1可選擇的基團(tuán)包括H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3；(插入化學(xué)式)以及R2可選擇的基團(tuán)包括H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X可選擇的基團(tuán)包括H，CH2OH，CH2NH-SerineH，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-絲氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，CO2(CH2)4CH3；(插入化學(xué)式)以及R可選擇的基團(tuán)包括OH，和OCH3.
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中Z1和Z2為H；X為CO2CH3；而R為OH。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中Z1和Z2為H；X為CO2CH3；R1和R2為CH2SCH2CH3；而R為OH。
12.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的化合物具有化學(xué)式(插入化學(xué)式)其中Z1為H，Z2為H或Z1和Z2一起形成＝O；R1為H或Br；R2為H；R3為H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或(插入化學(xué)式)及R4為H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
全文摘要
本發(fā)明提供了鑒別化合物的方法，該化合物可調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白和促進(jìn)細(xì)胞生存或細(xì)胞死亡，該方法包括使包含多譜系激酶蛋白的細(xì)胞和該化合物相接觸的步驟，測定該化合物是否減低多譜系激酶蛋白的活性，是否促進(jìn)細(xì)胞生存。同時(shí)也提供了鑒別可用于治療神經(jīng)退化紊亂和/或發(fā)炎的化合物的方法。提供了調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性的方法，其用本發(fā)明中的茚并－或吲哚并－化合物接觸蛋白或包含蛋白的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了治療神經(jīng)退化紊亂和/或炎癥的方法。
文檔編號A61P9/10GK1458979SQ01814001
公開日2003年11月26日 申請日期2001年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月11日
發(fā)明者安娜·馬羅尼, 凱文·M·沃爾頓, 克雷格·A·迪翁, 妮古拉·尼夫, 小歐內(nèi)斯特·奈特, 馬西·A·格里克曼 申請人:賽福倫公司