專利名稱：多肽表達(dá)盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可有效表達(dá)短肽的多肽表達(dá)盒及其構(gòu)建方法，和其在疫苗分子設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。
抗原表位(epitope)是抗原分子中誘生不同免疫應(yīng)答最基本的結(jié)構(gòu)及功能單位。以精心篩選的T、B細(xì)胞抗原表位構(gòu)建免疫分子，既可有目的地誘生各類不同的免疫反應(yīng)，又避免了天然蛋白中抑制性抗原表位引起的免疫抑制現(xiàn)象，是新近預(yù)防及治療性疫苗研究的熱點(diǎn)。然而目前所報(bào)道的用于基因免疫的真核表達(dá)載體均不能表達(dá)短肽及抗原表位。其主要原因是缺乏合適的mRNA高效轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后處理信號，缺乏框內(nèi)轉(zhuǎn)譯起始及終止密碼?？乖砦换蚨屉牡幕蚬こ瘫磉_(dá)及免疫特性研究一直是近年分子免疫學(xué)研究的難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種可以有效表達(dá)抗原表位或短肽的基因工程載體多肽表達(dá)盒(peptide expression cassette，pEC)，并通過以表位為基礎(chǔ)的基因免疫驗(yàn)證這一表達(dá)盒的應(yīng)用意義。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的1、擴(kuò)增及合成pEC中真核表達(dá)調(diào)控元件及翻譯框架分別以PCR及寡核苷酸人工合成技術(shù)擴(kuò)增或合成真核表達(dá)所必須的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄終止信號等，及翻譯框架包括翻譯起始碼、抗原表位克隆位點(diǎn)、翻譯終止碼等。
2、構(gòu)建及鑒定多肽表達(dá)盒(pEC)以pUC19載體(市售)為骨架，分別將上述真核表達(dá)調(diào)控元件及翻譯框架克隆于該骨架中，構(gòu)建一可高效轉(zhuǎn)錄及翻譯抗原短肽的多肽表達(dá)盒pEC。在該pEC中，在HCMVIE1啟動(dòng)子上游插入一～480bp的增強(qiáng)子復(fù)合體(enhancercomplex)，其中含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，可提高mRNA轉(zhuǎn)錄水平及保證增強(qiáng)子作用的高效及廣泛性；在HCMV IE1啟動(dòng)子下游插入一～820bp的內(nèi)含子A，以提供有效的轉(zhuǎn)錄后處理信號，避免mRNA不正確的剪切；以BGH基因3’端序列提供轉(zhuǎn)錄終止信號；內(nèi)含子A下游插入GCCACCATGGAATTCTAATAG序列，分別提供Kozak真核表達(dá)增強(qiáng)序列、框內(nèi)起始密碼、EcoRI克隆位點(diǎn)及雙終止密碼；在pUC19中去除Lac操縱子，提高了整個(gè)質(zhì)粒在宿主菌中的穩(wěn)定性及其復(fù)制水平，為大量制備質(zhì)粒DNA提供了可能。經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶酶切及DNA序列測定，其序列和組成插入方向均正確。
3、pEC在基因免疫中的應(yīng)用及驗(yàn)證3.1 pEC可克隆表達(dá)一B細(xì)胞抗原表位，基因免疫后可誘導(dǎo)特異性抗體應(yīng)答人工合成鴨乙肝病毒B細(xì)胞抗原表位P127-138編碼基因b1(AATTGGGGGA CGATCCACTC CTGGGAAATC AGTCTCTCCT CG)和b2(AATTCGAGGA GAGACTGATT TCCCAGGAGT GGATCGTCC CCG)，退火后克隆于pEC EcoRI位點(diǎn)，是為pEC-B。經(jīng)體外轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，DOT-EIA檢測發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、60、72小時(shí)后，其上清中均檢測出該B細(xì)胞抗原表位。以pEC-B DNA直接基因免疫C57BL/6和Balb/c小鼠，結(jié)果誘生了DHBV特異性抗體應(yīng)答，表明PECK不僅可有效地表達(dá)B細(xì)胞表位多肽，同時(shí)還可以基因免疫的方式誘生特異性免疫應(yīng)答。
3.2 pEC可克隆表達(dá)一CTL抗原表位，基因免疫后可誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答人工合成乙肝病毒CTL抗原表位C17-28編碼基因C1(AAT TTTTGC CTT CTG ACT TCT TTC CTT CTA TTG)和C2(AAT TCA ATA GAA GGAAAG AAG TCA GAA GGC AAA)，退火后克隆于pEC EcoRI位點(diǎn)，是為pEC-C18。經(jīng)體外轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，DOT-EIA檢測發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、60、72小時(shí)后，其上清中均檢測出該CTL抗原表位。以pEC-18DNA直接基因免疫C57BL/6、C3H和Balb/c小鼠，結(jié)果誘生了DHBV特異性抗體應(yīng)答，表明pEC不僅可有效地表達(dá)CTL表位多肽，同時(shí)還可以基因免疫的方式誘生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明具有如下特點(diǎn)1、本發(fā)明的載體質(zhì)粒是一種可有效表達(dá)抗原多肽的載體質(zhì)粒(pEC)
2、該質(zhì)粒中除含有常規(guī)真核轉(zhuǎn)錄元件如HCMV IE1啟動(dòng)子、增強(qiáng)子復(fù)合體、內(nèi)含子A及BGH基因外，還含有一特定的序列AGATCTGCCACCATGGAATTCTAGTAAGATCT，其中GCCACC為真核表達(dá)增強(qiáng)序列Kozak、ATG為框內(nèi)起始密碼、GAATTC為EcoRI單一克隆位點(diǎn)、TAGTAA為雙終止密碼。同時(shí)該質(zhì)粒還去除了Lac操縱子3、該質(zhì)粒可克隆和有效表達(dá)如鴨乙肝病毒B細(xì)胞表位和乙肝病毒CTL表位等短肽4、克隆于該載體中的各類短肽如B細(xì)胞表位和CTL表位，在基因免疫中可誘生相應(yīng)的特異性免疫應(yīng)答，表明該質(zhì)?？捎糜谝员砦粸榛A(chǔ)的基因免疫
權(quán)利要求
1.一種多肽表達(dá)盒，其特征是含有的載體質(zhì)粒是可有效表達(dá)抗原多肽的載體質(zhì)粒pEC。
2.按權(quán)利要求1所述的多肽表達(dá)盒，其特征是所述的載體質(zhì)粒中除含有常規(guī)真核轉(zhuǎn)錄元件基因外，還含有特定的序列AGATCTGCCACCATGGAATTCTAGTAAGATCT，其中GCCACC為真核表達(dá)增強(qiáng)序列Kozak、ATG為框內(nèi)起始密碼、GAATTC為EcoRI單一克隆位點(diǎn)、TAGTAA為雙終止密碼，所述的載體質(zhì)粒去除了Lac操縱子。
3.按權(quán)利要求1所述的多肽表達(dá)盒，其特征是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)a)分別以PCR及寡核苷酸人工合成技術(shù)擴(kuò)增或合成真核表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄終止信號等，及翻譯框架翻譯起始碼、抗原表位克隆位點(diǎn)、翻譯終止碼等，b)分別將上述真核表達(dá)調(diào)控元件及翻譯框架克隆于pUC19載體骨架中，構(gòu)建可高效轉(zhuǎn)錄及翻譯抗原短肽的多肽表達(dá)盒pEC，其中，在HCMV IE1啟動(dòng)子上游插入～480bp的增強(qiáng)子復(fù)合體；在HCMV IE1啟動(dòng)子下游插入～820bp的內(nèi)含子A，以BGH基因3’端序列提供轉(zhuǎn)錄終止信號；內(nèi)含子A下游插入GCCACCATGGAATTCTAATAG序列，分別提供Kozak真核表達(dá)增強(qiáng)序列、框內(nèi)起始密碼、EcoRI克隆位點(diǎn)及雙終止密碼；在pUC19中去除Lac操縱子，c)進(jìn)行PCR、限制性內(nèi)切酶酶切及DNA序列測定，d)驗(yàn)證多肽表達(dá)盒，pEC克隆表達(dá)一B細(xì)胞抗原表位，基因免疫后誘導(dǎo)特異性抗體應(yīng)答，pEC克隆表達(dá)一CTL抗原表位，基因免疫后誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答。
4.按權(quán)利要求1所述的多肽表達(dá)盒在疫苗分子設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種可有效表達(dá)短肽的多肽表達(dá)盒及其構(gòu)建方法,和其在疫苗分子設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。本發(fā)明含有可有效表達(dá)抗原多肽的載體質(zhì)粒,該質(zhì)粒可克隆和有效表達(dá)如鴨乙肝病毒B細(xì)胞表位和乙肝病毒CTL表位等短肽,克隆于該載體中的各類短肽,在基因免疫中可誘生相應(yīng)的特異性免疫應(yīng)答,可用于以表位為基礎(chǔ)的基因免疫。
文檔編號A61K39/00GK1356391SQ0113223
公開日2002年7月3日 申請日期2001年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月19日
發(fā)明者熊思東, 徐薇, 徐煥賓, 儲(chǔ)以微 申請人:復(fù)旦大學(xué)