專利名稱：表達人內(nèi)皮細胞抑制素重組益生菌菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有人內(nèi)皮細胞抑制素基因的表達載體構(gòu)建、用該載體轉(zhuǎn)化的重組益生菌菌株及其應(yīng)用。
內(nèi)皮細胞抑制素(Endostatin)是一種抑制血管生成的蛋白質(zhì)，可用于制備抗腫瘤藥物。它含有183個氨基酸殘基，分子量為18494D，是膠原蛋白XVIII的C端片段。內(nèi)皮細胞抑制素具有選擇性地抑制內(nèi)皮細胞分裂增殖和遷移的功能，能抑制新生血管的形成從而抑制原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的生長[Folkman J.et al.Cell，1997；88277-285.]。應(yīng)用內(nèi)皮細胞抑制素治療腫瘤具有無耐藥性和毒副作用少等優(yōu)點，可與放療和化療聯(lián)合使用，加強和鞏固治療效果[Thomas B..Nature，1997；390(6658)404]。
目前國外已經(jīng)開始利用大腸桿菌或酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)內(nèi)皮細胞抑制素，經(jīng)提取純化后皮下或靜脈注射治療腫瘤。但是應(yīng)用體外重組的內(nèi)皮細胞抑制素治療腫瘤存在一些問題1)有效劑量很大，成本高；2)治療周期長，大劑量的長期反復(fù)給藥會引起過敏反應(yīng)等。因此有必要開發(fā)給藥方便、特異性強、作用時間長的治療方法。
我們通過反復(fù)實驗，發(fā)明了在體內(nèi)傳遞有活性的人內(nèi)皮細胞抑制素，并用于治療人體胃腸道和其它實體瘤的方法。
本發(fā)明的方法是首先將人內(nèi)皮細胞抑制素基因克隆到益生菌的表達載體上，用電轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)人內(nèi)皮細胞抑制素基因的重組益生菌。通過蛋白雜交及細胞活性測定，證明得到的重組菌株確實能夠產(chǎn)生有活性的人內(nèi)皮細胞抑制素蛋白。然后通過口服這種重組益生菌，使益生菌在腸道內(nèi)持續(xù)表達人內(nèi)皮細胞抑制素蛋白，抑制人體腸道和其它實體瘤血管的生成，從而達到治療人體實體瘤的目的。
目前國內(nèi)外還沒有利用乳酸菌自身載體在乳酸菌里表達人內(nèi)皮細胞抑制素基因，獲得穩(wěn)定、高效的重組乳酸菌并用于腫瘤治療的報道。本發(fā)明方法包括以下步驟1.構(gòu)建帶有人內(nèi)皮細胞抑制素基因的乳酸菌表達載體。
1)質(zhì)粒pLA136上有colE1和pAMβ1復(fù)制子，在大腸桿菌和乳酸菌中都能復(fù)制，帶有乳球菌P59啟動子和乳球菌Usp45信號肽，將人內(nèi)皮細胞抑制素基因接入啟動子和信號肽后的相應(yīng)酶切位點，構(gòu)建帶有人內(nèi)皮細胞抑制素基因的重組表達載體pLA147，并將之轉(zhuǎn)入到乳酸乳球菌MG1363中，該重組乳酸菌可持續(xù)表達分泌到胞外的人內(nèi)皮細胞抑制素
2)質(zhì)粒pLA133上有colE1和pWV01復(fù)制子，在大腸桿菌和乳酸菌中都能復(fù)制，帶有乳球菌NisA啟動子和乳球菌Usp45信號肽。將人內(nèi)皮細胞抑制素基因接入啟動子和信號肽后的相應(yīng)酶切位點，構(gòu)建帶有人內(nèi)皮細胞抑制素基因的重組表達載體pLA148。該載體在乳酸菌中經(jīng)誘導(dǎo)可表達人內(nèi)皮細胞抑制素基因，生成的人內(nèi)皮細胞抑制素能夠分泌到胞外。
3)質(zhì)粒pLA1512上有colE1和pWV01復(fù)制子，可以在大腸桿菌和乳酸菌中復(fù)制，帶有乳球菌NisA啟動子，在Nisin誘導(dǎo)下可啟動下游基因的表達。將通過PCR方法得到的人內(nèi)皮細胞抑制素基因接入該質(zhì)粒啟動子后的相應(yīng)酶切位點，構(gòu)建出經(jīng)誘導(dǎo)可在乳酸菌細胞內(nèi)表達人內(nèi)皮細胞抑制素基因的重組表達載體pLA175。
4)質(zhì)粒pNuc7上有pAMβ1復(fù)制子，可以在乳酸菌中復(fù)制，帶有P59啟動子和Nuclease信號肽。將通過PCR方法得到的人內(nèi)皮細胞抑制素基因接入該質(zhì)粒啟動子和信號肽后的相應(yīng)酶切位點，構(gòu)建出可在乳酸菌中表達人內(nèi)皮細胞抑制素基因的重組表達載體pLA191。由于所構(gòu)建的重組載體中外源基因前面帶有信號肽，因此表達的人內(nèi)皮細胞抑制素可以分泌到胞外。
5)質(zhì)粒pFUN帶有colE1和pAMβ1復(fù)制子，可在大腸桿菌和乳酸菌中復(fù)制，帶有乳球菌Usp45啟動子和Usp45信號肽，在信號肽后接入人內(nèi)皮細胞抑制素基因，構(gòu)建重組表達載體pLA195。該載體在乳酸菌中可持續(xù)表達人內(nèi)皮細胞抑制素基因，表達的人內(nèi)皮細胞抑制素蛋白可分泌至胞外。2.獲得穩(wěn)定、高效表達人內(nèi)皮細胞抑制素的重組菌株。
將上述含有人內(nèi)皮細胞抑制素基因的相應(yīng)表達載體，通過電轉(zhuǎn)化的方法，分別轉(zhuǎn)入乳球菌、乳桿菌、鏈球菌、腸球菌和葡萄球菌中，收集重組菌菌體及上清液，通過蛋白雜交、細胞生長抑制實驗檢測蛋白表達情況及其生物活性。3.提供了生產(chǎn)帶有人內(nèi)皮細胞抑制素基因的重組乳球菌、乳桿菌、鏈球菌、腸球菌和葡萄球菌的方法及其應(yīng)用。
重組乳球菌和乳桿菌分別用GM17和MRS培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，對帶有NisA啟動子的重組菌株，待其達到生長對數(shù)期O.D.值為0.5左右時，加入誘導(dǎo)劑Nisin，誘導(dǎo)2-3個小時，收獲菌體。對非誘導(dǎo)的重組菌株，待其生長到達平臺期時收獲。得到的細菌可直接制備成口服液或?qū)⒕w凍干制成膠囊。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.采用益生菌自身表達載體，可以穩(wěn)定高效表達外源基因。
2.所用的益生菌如乳球菌和乳桿菌本身無內(nèi)外毒素，對人體很安全。
3.直接口服能夠表達人內(nèi)皮細胞抑制素的基因工程菌，不需經(jīng)過蛋白純化，此產(chǎn)品生產(chǎn)工藝簡單，成本低。
4.乳酸菌可以在人體腸道中，在一定時期內(nèi)持續(xù)表達內(nèi)皮細胞抑制素，直接在腫瘤局部產(chǎn)生抗血管生成介質(zhì)，具有較高的特異性。以下通過實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明

圖1是重組表達載體pLA147的構(gòu)建過程。其中P59為啟動子、SPusp45為信號肽序列。圖2是重組表達載體pLA148的構(gòu)建過程。其中PnisA為啟動子、SPusp45為信號肽序列。圖3是重組表達載體pLA175的構(gòu)建過程。其中PnisA為啟動子。圖4是重組表達載體pLA191的構(gòu)建過程。其中P59為啟動子、SPnuc為信號肽序列。圖5是重組表達載體pLA195的構(gòu)建過程。其中usp45 promoter為啟動子和信號肽序列、usp-Terminator為轉(zhuǎn)錄終止子。
實施例1重組表達載體pLA147的構(gòu)建根據(jù)已發(fā)表的人膠原蛋白XVIII cDNA序列，設(shè)計合成兩段引物上游5’CATATGCATCTCACAGCCACCGCGACTTC 3’(29堿基)下游5’GGCATGCATTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT 3’(32堿基)在兩段引物中分別引入NsiI位點，以人膠原蛋白XVIII cDNA為模板，PCR擴增人內(nèi)皮細胞抑制素。
反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，以下循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，共30個循環(huán)。
將PCR產(chǎn)物平端直接連接入pUC18質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍白斑篩選插入外源片段的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，得到pUC18-Endostatin質(zhì)粒。
用限制性內(nèi)切酶NsiI消化pUC18-Endostatin，將得到的Endostatin片段連接到pLA136質(zhì)粒的NsiI位點，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選紅霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴增及測序，證明Endostatin已插入pLA136，序列正確，重組質(zhì)粒命名為pLA147。
具體過程見圖1實施例2重組表達載體pLA148的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NsiI消化pUC18-endostatin，將得到的Endostatin片段連接到pLA133質(zhì)粒的NsiI位點，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，
經(jīng)酶切鑒定，PCR擴增及測序，證明Endostatin已插入pLA133，序列正確，重組質(zhì)粒命名為pLA148。
具體過程見圖2實施例3重組表達載體pLA175的構(gòu)建根據(jù)人膠原蛋白XVIII cDNA序列，設(shè)計合成兩段引物上游5’CATATGCATCACAGCCACCGCGACTTC 3’(27堿基)下游5’GGCGAATTCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT 3’(32堿基)在兩段引物中分別引入NsiI位點和EcoRI位點，以pUC18-endostatin為模板，PCR擴增Endostatin。
反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，以下循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，共30個循環(huán)。
將PCR產(chǎn)物與AT載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍白斑篩選插入外源片段的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NsiI和EcoRI消化，將得到的Endostatin片段與同樣酶切的pLA1512質(zhì)粒連接，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴增及測序，證明Endostatin正確插入pLA1512，重組質(zhì)粒命名為pLA175。
具體過程見圖3實施例4重組表達載體pLA191的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NsiI消化pUC18-endostatin，將得到的Endostatin片段連接到pNuc7質(zhì)粒的NsiI位點，電轉(zhuǎn)化乳球菌MG1363，篩選紅霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定及測序，證明Endostatin已插入pNuc7，重組質(zhì)粒命名為pLA191。
具體過程見圖4實施例5重組表達載體p LA195的構(gòu)建用PCR方法擴增乳球菌MG1363的Usp45啟動子、信號肽和終止子。
首先以乳球菌MG1363基因組DNA為模板，根據(jù)已知的Usp45基因啟動子和信號肽序列設(shè)計引物，在上游引物和下游引物中分別引入限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI酶切位點。
上游引物5’GAGAATTCTAATGTATAGTGTCACTCAGCACAGGC 3’(35堿基)下游引物5’AAGGGTACCTCAGCGTAAACACCTGACAACCGGGCTG 3’(37堿基)PCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，以下循環(huán)94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)。擴增得到Usp45啟動子和信號肽片段。再以乳球菌MG1363基因組DNA為模板，根據(jù)已知的Usp45基因終止子序列設(shè)計引物，在上游引物和下游引物中分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI酶切位點。上游引物5’CTGGATCCAAAAAAGTCTTAATAAATAAAAAATAG 3’(35堿基)下游引物5’AGTCTAGATATCATTTTTCCTTATTATTATACCAC 3’(35堿基)反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，以下循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)。擴增得到Usp45終止子片段。先將得到的Usp45啟動子和信號肽片段用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI酶切，與同樣酶切的pUC18連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選帶有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒鑒定，確認(rèn)得到pUC18-usp45質(zhì)粒。將經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI酶切的Endostatin片段，連接到質(zhì)粒pUC18-usp45的相應(yīng)酶切位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選帶有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，確認(rèn)得到質(zhì)粒pUC18-usp45-endostatin。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI將Usp45啟動子和Endostatin片段從質(zhì)粒pUC18-usp45-endostatin上切下，連接入同樣酶切的質(zhì)粒pFUN，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選帶有氨芐抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，確認(rèn)得到pFun-usp-endostatin。將PCR方法得到的Usp45終止子片段用內(nèi)切酶BamHI和XbaI酶切，與同樣酶切的pFun-usp-endostatin連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選帶有氨芐抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，確認(rèn)得到重組質(zhì)粒pFun-usp45 promoter-endostatin-usp45 terminator，命名為pLA195。
具體過程見圖5實施例6采用電轉(zhuǎn)化法，將上述幾種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入乳球菌中。
將重組表達載體pLA147、pLA191、pLA195分別與乳酸乳球菌MG1363感受態(tài)細胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，電擊，涂到含紅霉素的培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株。乳酸乳球菌NZ9000是將Nisin抗性基因轉(zhuǎn)入MG1363染色體中得到的工程菌，可在Nisin存在的條件下正常生長，將帶有PnisA啟動子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NZ9000中，可加入Nisin誘導(dǎo)質(zhì)粒表達外源基因。分別將重組表達載體pLA148、pLA175與乳酸乳球菌NZ9000感受態(tài)細胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，電擊，涂到含氯霉素的培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株。實施例7采用電轉(zhuǎn)化法，將上述幾種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入乳桿菌中。
將重組表達載體pLA147、pLA191、pLA195分別與干酪乳桿菌感受態(tài)細胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，電擊，涂到含紅霉素的MRS培養(yǎng)基上，在厭氧箱中培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株。
干酪乳桿菌NY1000是將Nisin抗性基因轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌染色體中得到的工程菌，可在Nisin存在的條件下正常生長，將帶有Pnis啟動子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NY1000中，可加入Nisin誘導(dǎo)質(zhì)粒表達外源基因。分別將重組表達載體pLA148、pLA175與干酪乳桿菌NY1000感受態(tài)細胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，電擊，涂到含氯霉素的培養(yǎng)基上，在厭氧箱中培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株。實施例8檢測人內(nèi)皮細胞抑制素基因在重組菌株中的表達將得到的重組乳球菌、乳桿菌分別在含有對應(yīng)抗生素的GM17和MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)。對帶有NisA啟動子的重組菌株，待其達到生長對數(shù)期O.D.值為0.5左右時，加入誘導(dǎo)劑Nisin，誘導(dǎo)2-3個小時，收獲菌體。對非誘導(dǎo)的重組菌株，待其生長到平臺期時收獲。樣品經(jīng)常規(guī)處理后，進行蛋白雜交驗證人內(nèi)皮細胞抑制素的表達首先進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜，與兔抗人內(nèi)皮細胞抑制素抗體雜交。
結(jié)果見圖6。實施例9重組益生菌中表達的人內(nèi)皮細胞抑制素生物活性的測定采用人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)至96孔培養(yǎng)板上，細胞濃度為每毫升25000個細胞，每孔加入1ng VEGF和0.008ug至1ug不同濃度的重組人內(nèi)皮細胞抑制素蛋白，培養(yǎng)3天后通過細胞計數(shù)來測量抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的活性。
結(jié)果見圖7。實施例10重組菌株的應(yīng)用。
重組乳球菌、乳桿菌分別用GM17和MRS培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液可直接制備口服液；或加入保護劑制成凍干粉，然后制成膠囊或片劑；提供給腫瘤病人，抑制腫瘤的生長。
權(quán)利要求
1.一種用益生菌表達人內(nèi)皮細胞抑制素基因的方法，該方法的特征是將人內(nèi)皮細胞抑制素基因克隆到益生菌自身的表達載體上，然后轉(zhuǎn)入益生菌中獲得穩(wěn)定表達人內(nèi)皮細胞抑制素的重組益生菌菌株。
2.權(quán)利要求1中所述益生菌，其中包括葡萄球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬。
3.權(quán)利要求2中所述的乳球菌屬，其中包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
4.權(quán)利要求2中所述的乳桿菌屬，其中包括干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。
5.權(quán)利要求1中所述的表達載體，其中全部或部分地包括下列從5’到3’連接的組成部分a.啟動子b.信號肽c.人內(nèi)皮細胞抑制素基因d.轉(zhuǎn)錄終止子e.復(fù)制起始子
6.權(quán)利要求5所述啟動子，其中包括選自乳球菌NisA基因、乳球菌P59或乳球菌Usp45啟動子。
7.權(quán)利要求5所述信號肽，其中包括選自鏈球菌核酸酶(Nuclease)基因或乳球菌Usp45基因的信號肽。
8.權(quán)利要求5所述終止子，其中包括選自人乳頭瘤病毒E7基因或乳球菌Usp45基因的終止子。
9.權(quán)利要求5所述復(fù)制起始子，其中包括選自乳酸菌pWV01或pAMβ1復(fù)制起始子。
10.權(quán)利要求1中所述的表達載體，其中包括質(zhì)粒pLA147，pLA148，pLA175，pLA191，和pLA195。
11.權(quán)利要求10中所述質(zhì)粒pLA147，其特征為包括下列組成部分a.P59啟動子b.Usp45信號肽c.人內(nèi)皮細胞抑制素基因d.乳酸菌復(fù)制子pAMβ1
12.權(quán)利要求10所述質(zhì)粒pLA148，其特征為包括下列組成部分a.NisA啟動子b.Usp45信號肽c.人內(nèi)皮細胞抑制素基因d.乳酸菌復(fù)制子pWV01
13.權(quán)利要求10中所述質(zhì)粒pLA175，其特征為包括下列組成部分a.NisA啟動子b.人內(nèi)皮細胞抑制素基因c.乳酸菌復(fù)制子pWV01d.E7轉(zhuǎn)錄終止子
14.權(quán)利要求10中所述質(zhì)粒pLA191，其特征為包括下列組成部分a.P59啟動子b.Nuclease信號肽c.人內(nèi)皮細胞抑制素基因d.乳酸菌復(fù)制子pAMβ1e.Nuclease轉(zhuǎn)錄終止子
15.權(quán)利要求10中所述質(zhì)粒pLA195，其特征為包括下列組成部分a.Usp45啟動子b.Usp45信號肽c.人內(nèi)皮細胞抑制素基因d.乳酸菌復(fù)制子pAMβ1e.Usp45轉(zhuǎn)錄終止子
16.用權(quán)利要求1所述方法獲得的重組益生菌菌株，其中包括CGMCC NO.0614、CGMCC NO.0615、CGMCC NO.0616、CGMCC NO.0617、CGMCC NO.0618。
17.權(quán)利要求16中所述的一種或多種益生菌經(jīng)發(fā)酵處理后，可作為口服制劑，通過口服，在體內(nèi)表達有活性的人內(nèi)皮細胞抑制素，用于作為抗胃腸道及其它實體瘤血管生成的藥物，可以抑制腫瘤血管的生長。
全文摘要
本發(fā)明闡述用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含有人內(nèi)皮細胞抑制素(Endostatin)基因的表達載體,并通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入益生菌中,得到穩(wěn)定表達人內(nèi)皮細胞抑制素基因的重組益生菌菌株。一種或多種重組菌株經(jīng)發(fā)酵處理后作為口服制劑,通過口服,在體內(nèi)表達有活性的人內(nèi)皮細胞抑制素。所表達的人內(nèi)皮細胞抑制素能夠抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖,從而抑制腫瘤血管的生長,可用于發(fā)展抗胃腸道及其它實體瘤血管生成的藥物。
文檔編號A61P35/00GK1361286SQ0113083
公開日2002年7月31日 申請日期2001年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月15日
發(fā)明者王春香, 胡放, 孫克菲, GRUSS) 亞歷山德拉·顧麗絲(Alexandra, LANGELLA) 菲力普·郎日拉(Philippe 申請人:北京金賽獅生物制藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司