專利名稱：反式二苯乙烯衍生物在預(yù)防或治療肝纖維化中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反式二苯乙烯衍生物在預(yù)防或治療與肝纖維化有關(guān)疾病的新用途及含反式二苯乙烯衍生物的藥物組合物。
肝纖維化是肝硬化的早期，是眾多肝病纏綿難愈甚至惡變死亡的主要原因，也是阻止慢性肝病發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在我國導(dǎo)致肝纖維化的主要原因是感染肝炎病毒。據(jù)報(bào)道國內(nèi)乙型肝炎病毒的感染率為42.4～80.77％，最近幾年，由丙型、戊型、庚型等肝炎病毒引起肝炎的病例報(bào)道逐漸增多。由于由肝炎病毒引起的肝臟損傷缺乏有效的根除方法，常會(huì)緩慢發(fā)展成肝纖維化，最后發(fā)生肝硬化。可見由肝炎病毒感染導(dǎo)致肝纖維化的危害性。除肝炎病毒感染外，寄生蟲感染、酒精、營養(yǎng)不良和輻射等均可導(dǎo)致肝纖維化。如在我國有飲白酒的習(xí)慣，酒精性肝纖維化病例比較多見。近幾十年來人們一直在尋找治療和/或預(yù)防肝纖維化的藥物，并已開發(fā)出了一些治療肝纖維化的藥物，化學(xué)藥物有秋水仙堿和氧化苦參堿等；中藥有丹參注射液、軟肝片等；生物制品有干擾素、促肝細(xì)胞生長素等。但這些藥物由于副作用或使用效果不佳等原因，未達(dá)到令人滿意的治療效果。因此，研究和開發(fā)新型抗肝纖維化的藥物十分需要。據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，二苯乙烯類化合物具有抗血小板聚集和抗腫瘤等作用。
本發(fā)明的目的是提供一類新的預(yù)防或治療肝纖維化藥物，其具有優(yōu)良的療效。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛深入的研究，在篩選抗肝損傷的藥物過程中出人意料地發(fā)現(xiàn)反式二苯乙烯衍生物對肝炎病毒和酒精等引起的慢性肝病，尤其是肝纖維化有明顯的預(yù)防和治療作用。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。
本發(fā)明第一個(gè)目的涉及式I的反式三羥基二苯乙烯在制備用于預(yù)防或治療與肝纖維化有關(guān)疾病的藥物中用途。 本發(fā)明的第二個(gè)目的涉及式II新的反式二苯乙烯衍生物。 R1-R5、和R’1-R’7可相同或不同，分別為H、OH和甲氧基(OMe)。條件是R2、R4和R’3不能同時(shí)為OH。
本發(fā)明再一個(gè)目的涉及含式I或式II化合物及藥用載體或賦形劑或添加劑的藥物組合物，該藥物組合物具有抗肝纖維化作用。根據(jù)本發(fā)明，該藥物組合物中可加入有各種藥用賦形劑、添加劑及載體。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的式I或式II化合物或含式I或式II化合物的藥物組合物可用于各種原因引起的肝纖維化。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物可按本領(lǐng)域已知方法配成腸道或非腸道給藥的制劑，如片劑、膠囊、粒劑、注射液等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的式I或式II化合物，主要來自植物，如決明子。其中式II化合物可通過半合成法對式I化合物進(jìn)行化學(xué)修飾或?qū)⑵渥鳛橹虚g體合成得到。
根據(jù)本發(fā)明，反式三羥基二苯乙烯可從豆科植物決明子提取得到，該方法包括決明子先用50％甲醇水溶液提取，過濾后濾液真空干燥，所得醇提液再用乙酸乙脂萃取，有機(jī)相真空干燥后上硅膠柱梯度，洗脫液為氯仿∶甲醇。收集的組份進(jìn)一步用HPLC處理，得到單體反式三羥基二苯乙烯。
下面將通過反式三羥基二苯乙烯(以下簡稱為化合物A)制備、反式二苯乙烯衍生物(2，3，4-三甲氧基二苯乙烯)的制備和在動(dòng)物體內(nèi)的抗纖維化作用來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。實(shí)施例1化合物A的制備決明子1.0kg，粉碎后室溫下用50％甲醇水溶液浸提三次，每次3天。濾液合并過濾后真空干燥，得醇提取物100g，再用乙酸乙脂萃取三次(500ml/次)，有機(jī)相合并后真空干燥后得膏狀物30.0g。膏狀物再經(jīng)硅膠柱層析，梯度洗脫，洗脫液為氯仿∶甲醇(50∶1～10∶1)。得10個(gè)組分，組分5(3.0g)進(jìn)一步用C18柱HPLC分離，得到單體(100mg)。與標(biāo)準(zhǔn)品光譜比較確定為反式三羥基二苯乙烯。實(shí)施例2反式二苯乙烯衍生物(2，3，4-三甲氧基二苯乙烯)的制備反應(yīng)式如下
以甲氧基鈉為堿，在DMF中經(jīng)化合物B(可從市售獲得)與化合物C(可從市售獲得)反應(yīng)可得到反式三甲氧基二苯乙烯的衍生物。用10ml干燥的DMF溶解B(12mmol)，0℃條件加入到磁力攪拌器攪拌下的0.65g甲醇鈉(溶解于10ml干燥的DMF中)，攪拌30min。用10ml干燥的DMF溶解苯甲醛(10mmol)，在0℃條件加入到上述反應(yīng)體系中。反應(yīng)體系放置于室溫1.5小時(shí)，再在1小時(shí)內(nèi)加熱至95～100℃，在室溫下過夜。反應(yīng)物在碎冰中降溫，沉淀過濾，水洗后干燥，乙酸乙脂-己烷中結(jié)晶，析出2，3，4-三甲氧基二苯乙烯(2.34g)。溶點(diǎn)79-82℃，IR(KBr)cm-13020，3000，2940，2840，1600，1510，1470，1420，1300，1260，1230，1090，1030，1000，980；1H NMR(CDCl3)δ7.60-7.50(m，2H)，7.40-7.20(m，5H)，6.90(d，J＝16.5HZ，1H)，6.70(d，J＝16.5HZ，1H)，3.91(s，3H)，3.90(s，3H)，3.89(s，3H)；CIMSm/z271(MH+，100)，C17H18O3。實(shí)施例3化合物A在動(dòng)物體內(nèi)的抗肝纖維化作用1藥物和動(dòng)物1.1受試藥物藥物名稱反式三羥基二苯乙烯(化合物A)。
配制方法用0.1％羧甲基纖維素鈉混勻懸浮。
保存條件4℃保存。1.2動(dòng)物動(dòng)物來源、品種、合格證采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖的Wistar大鼠，動(dòng)物合格證編號(hào)為醫(yī)動(dòng)字01-3039。
體 重120-140g。
性 別雌雄各半，雌性動(dòng)物無懷孕。
飼養(yǎng)條件共100只大鼠領(lǐng)取動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每籠1只，飼以軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心為大鼠制作的標(biāo)準(zhǔn)飼料，每天上下午定時(shí)飼食一次，自由飲水。實(shí)驗(yàn)室定時(shí)通風(fēng)，光照良好，自然室溫。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件合格證編號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第01-2050。2肝纖維化模型與給藥方案2.1大鼠肝纖維化模型依據(jù)文獻(xiàn)資料，采用復(fù)合因素造模法。造模動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)第1天皮下注射40％CCl4液體石蠟溶液5ml/kg，以后每周兩次皮下注射上述液體3ml/kg。配以高脂低蛋白食物，即以玉米面為飼料，加0.5％膽固醇，加20％的豬油。10％的酒精為飲用水。共6周。將上述造模動(dòng)物分組并給予受試藥物后各組動(dòng)物均給以正常飼料。2.2劑量設(shè)置及分組于造模開始第43天，分別從造模動(dòng)物中隨機(jī)取3只動(dòng)物和正常對照中取3只。觀察血清肝功能指標(biāo)和病理組織學(xué)檢查，確認(rèn)造模動(dòng)物進(jìn)入明顯的肝纖維化狀態(tài)。根據(jù)動(dòng)物的一般狀態(tài)和體重均衡的原則，隨機(jī)分成4組模型對照組、化合物A的三個(gè)劑量組。每組10只動(dòng)物。另設(shè)正常對照組。
根據(jù)預(yù)試驗(yàn)資料，化合物A設(shè)小劑量為10mg/kg，中劑量為30mg/kg，大劑量為90mg/kg。2.3給藥方法和時(shí)間分組后當(dāng)天開始，采用灌服給藥途徑，每100g體重為0.3ml。給藥時(shí)間為30天。3觀測指標(biāo)3.1血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)血清III型前膠原(PCIII)，采用放免試劑盒方法。肝組織羥脯氨酸(Hyp)水平采用氯胺T法檢測。方法簡述如下將稱量后的肝組織剪碎，置于磨口試管中用6mol/L HCl水解(125℃)3小時(shí)后，稀釋到10ml，過濾。取濾液0.1ml加蒸餾水到1.0ml，充分氧化，加入0.5ml檸檬酸緩沖液和1.0ml氯胺T溶液(0.01mol/L)后6分鐘，用過氯酸終止反應(yīng)。加入10％p-DMAB1.0ml，于80℃水浴中保溫6分鐘，顯色完全后冷卻，最后在波長560nm處比色，測吸光度(A)，用下式計(jì)算Hyp含量肝組織Hyp含量(mg/g)＝(0.5×A樣品/A標(biāo)準(zhǔn))/肝重量。3.2肝組織病理學(xué)檢查肝大體形態(tài)和肝組織HE染色和膠原纖維染色(Masson氏三合染色)后光鏡下檢查。大體觀察內(nèi)容有是否腫大、顏色、表面、邊緣、質(zhì)地等。取三塊肝組織置10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，染色后光鏡下檢查。HE染色后檢查包括肝小葉結(jié)構(gòu)、纖維增生情況以及間隔是否形成和匯管區(qū)是否擴(kuò)大、肝細(xì)胞索排列、肝細(xì)胞變性和壞死、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞再生情況，纖維化程度分級(jí)(0-4級(jí))打分。肝組織內(nèi)膠原纖維定量分析采用Quantimet970圖像分析儀進(jìn)行，測定有單位目標(biāo)面積、面密度和積分光密度。4統(tǒng)計(jì)與分析各組結(jié)果用算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》的有關(guān)新藥藥效研究中統(tǒng)計(jì)處理的指導(dǎo)原則，計(jì)數(shù)資料用Fisher精確檢驗(yàn)，計(jì)量資料選擇方差分析，用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)。5試驗(yàn)結(jié)果5.1肝纖維化模型的形成大鼠皮下注射含40％CCl4的液體石蠟后，喂飼高脂低蛋白食物以及飲含10％酒精的水后，第1周大鼠即出現(xiàn)活動(dòng)減少，食欲減退，表現(xiàn)為所剩飼料和水增多。第2周動(dòng)物體毛失去光澤。第3周體毛蓬松明顯，活動(dòng)少，剩余飼料和水較多，有6只動(dòng)物死亡。第4周死亡動(dòng)物8只。至第6周共有20只大鼠死亡。
從同批正常動(dòng)物和飼以特制飼料的造模型動(dòng)物中各隨機(jī)取3只，肝組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，造模動(dòng)物肝細(xì)胞脂肪變性、腫脹和壞死等明顯，匯管區(qū)有大量纖維組織增生，呈帶狀。結(jié)果表明，造模動(dòng)物已進(jìn)入明顯的肝纖維化狀態(tài)。5.2血清III型前膠原、肝組織羥脯氨酸給藥1月后，用藥組大鼠血清中III型前膠原水平明顯降低，其中以受試藥大劑量組最為顯著(表1)。肝組織中羥脯氨酸水平可反映膠原纖維的代謝狀況。給藥后大鼠肝臟中Hyp水平下降，其中以大劑量組的效果最明顯。
表1灌服化合物A后大鼠PCIII和Hyp水平的變化組 別 PCIII(μg/L) Hyp(mg/g)正常對照組 80.56±15.22### 0.15±0.04###模型對照組 173.61±12.89 0.61±0.13化合物A 10mg/kg 162.00±9.59* 0.57±0.18化合物A 30mg/kg 150.21±7.30*** 0.55±0.09化合物A 90mg/kg 109.20±3.32*** 0.44±0.08**注正常對照組與模型對照組比較，###P＜0.001用藥組與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.0 1，***P＜0.0015.3肝臟膠原纖維的圖象分析為客觀評(píng)價(jià)受試藥對大鼠肝纖維程度的影響，采用計(jì)算機(jī)圖像分析儀器計(jì)算肝組織中膠原纖維所占面積。結(jié)果從表2可見，與模型對照組比較，用藥組大鼠肝組織單位目標(biāo)面積減少，面密度和積分光密度降低，尤其是受試藥大劑量組的積分光密度下降明顯，結(jié)果說明用藥組大鼠肝組織內(nèi)膠原纖維面積減少。
表2灌服化合物A后大鼠肝膠原纖維病理圖像分析結(jié)果組 別單位目標(biāo)面積(μm2/個(gè)) 面密度 積分光密度正常對照組26.50±12.47## 0.01342±0.00626###5.15±2.51##模型對照組60.61±25.94 0.04463±0.01639 3.56±9.78化合物A 10mg/kg 41.61±13.68 0.02632±0.00700** 14.78±8.72化合物A 30mg/kg 41.45±20.51 0.02737±0.01308* 13.68±6.96化合物A 90mg/kg 37.55±22.46 0.02547±0.00668***11.89±7.59*注正常對照組與模型對照組比較，##P＜0.01，###P＜0.001用藥組與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0015.4病理組織學(xué)檢查于給藥1月麻醉大鼠取肝臟組織塊，固定和常規(guī)H.E.染色。經(jīng)光鏡觀察并按孫克偉所報(bào)道的肝纖維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(分為0、1、2、3四級(jí))，對各肝臟形態(tài)打分結(jié)果如下正常對照組所有10只動(dòng)物肝臟均未見門脈區(qū)有纖維組織增生。打分結(jié)果雄0、0、0、0、0；雌0、0、0、0、0；平均0分。
模型對照組雌、雄鼠各有1只其門脈區(qū)增生的纖維組織已向邊緣延伸，但尚未在肝小葉周圍尚未形成完整的纖維組織包繞外，其余各鼠均已形成明顯的包繞。打分結(jié)果雄3、3、3、3和2；雌3、3、3、3和2；平均2.8分。
小劑量組雄、雌性鼠各有1只肝小葉周圍尚未形成完整的纖維組織包繞，另1只雄鼠門脈區(qū)增生的纖維組織甚至尚未向小葉周圍延伸，其余各鼠肝小葉周圍均已形成完整的纖維組織包繞。打分結(jié)果雄3、3、3、2和1；雌3、3、3、3和2；平均2.6分。
中劑量組有2只雄鼠及3只雌鼠肝小葉周圍尚未形成完整的纖維組織包繞，另有雌、雄各1只鼠門脈區(qū)增生的纖維組織尚未向肝小葉周圍延伸。其余3只鼠肝小葉周圍已有完整的纖維組織包繞。打分結(jié)果雄3、3、2、2和1；雌3、2、2、2和1；平均2.1分。
大劑量組有2只雄鼠及3只雌鼠肝小葉周圍尚未形成完整的纖維組織包繞，另有雄、雌各1只鼠門脈區(qū)增生的纖維組織尚未向肝小葉周圍延伸，其余3只鼠肝小葉周圍已有完整的纖維組織包繞。打分結(jié)果雄3、3、2、2和1；雌3、2、2、3和1；平均2.1分。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物A各劑量組對治療肝纖維化均有抑制及減輕作用，其中中劑量和大劑量組效果明顯。
表3灌服化合物A后大鼠肝組織纖維化程度組 別 動(dòng)物數(shù) 纖維化程度(分?jǐn)?shù))正常對照組 10 0模型對照組 10 2.8±0.4化合物A 10mg/kg10 2.6±0.7化合物A 30mg/kg10 2.1±0.7*化合物A 90mg/kg10 2.1±0.7*陽性藥組 10 2.2±0.6*注用藥組與模型對照組比較，*P＜0.056結(jié)論上述結(jié)果表明，受試藥化合物A對肝纖維化有明顯的抑制及減輕作用。
權(quán)利要求
1.下式的反式三羥基二苯乙烯在制備用于預(yù)防或治療與肝纖維化有關(guān)疾病的藥物中的用途。
2.下式的反式二苯乙烯衍生物 其中R1-R5、和R’1-R’7可相同或不同，分別為H、OH和甲氧基(OMe)。條件是R2、R4和R’3不能同時(shí)為OH。
3.一種用于預(yù)防或治療與肝纖維化有關(guān)疾病的藥物組合物，其包括作為活性成份的權(quán)利要求1的反式三羥基二苯乙烯或權(quán)利要求2所要求的反式二苯乙烯衍生物及藥用賦形劑或載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中作為活性成份的權(quán)利要求1的反式三羥基二苯乙烯或下式的反式3，4’，5三羥基二苯乙烯。
5.權(quán)利要求2的反式二苯乙烯衍生物在制備用于預(yù)防或治療各種原因引起的肝纖維化疾病的藥物中用途。
6.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述藥物組合物可被制成片劑、膠囊、注射液或其它適宜劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及反式三羥基二苯乙烯在預(yù)防或治療與肝纖維化有關(guān)疾病上的新用途，新的反式二苯乙烯衍生物及含反式三羥基二苯乙烯或新反式二苯乙烯衍生物的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K31/09GK1401316SQ0112456
公開日2003年3月12日 申請日期2001年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月10日
發(fā)明者呂秋軍, 郭紹明, 溫利青, 董俊興 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所