專利名稱：溶血栓藥物重組葡激酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種溶血栓藥物重組葡激酶，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的DNA基因工程，涉及一種用于溶解血栓的藥物重組葡激酶(Sak)基因及其高表達工程菌株，該表達產(chǎn)物對血纖維蛋白具有很高的降解活性。
葡激酶(staphylokinase Sak)是90年代誕生的一種新型生物技術(shù)治療藥物，是金黃色葡萄球菌分泌的一種胞外蛋白質(zhì)，它類似尿激酶(Uk)和鏈激酶(Sk)，具有溶血栓的特性。目前，臨床上治療血栓的藥物主要使用的是尿激酶、鏈激酶等，存在對血栓的溶解速度慢，溶栓效果差，對構(gòu)成血栓骨架的血纖維蛋白專一性差，易造成血液系統(tǒng)中正常纖維蛋白原也被降解，從而激活系統(tǒng)纖溶作用引起出血的缺點。德國文獻M.G.G(1987,210,P258)和中國專利95111222 94112105 97105988 9810213297103921分別報道了第34位核苷酸序列及其對應(yīng)氨基酸為GGT Gly的葡激酶(Sak)。文獻“Nucleic Acid Research”(1983,11(22)P679)介紹了第11位和第34位核苷酸序列及其對應(yīng)氨基酸分別為AAG Lys和GGT Gly的葡激酶(Sak)。比利時文獻Fibrinolysis(1992,6,P226)報道了第11位核苷酸序列及其對應(yīng)氨基酸為AAG Lys的葡激酶(Sak)。據(jù)“國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊”(1998年第19第4期156-158)報道了Sako等從金黃色葡萄球菌SΦ-C基因克隆了Sak基因并確定了其序列，構(gòu)建了PMEX-602Sak重組質(zhì)粒，在tac啟動子和兩個串連的SD序列控制下，在大腸桿菌中獲得高效表達，表達量占菌體的總蛋白10％-15％?！吧锕こ獭?994年12卷2期文章“治療血栓用藥重組葡激酶的高產(chǎn)率生產(chǎn)和純化”介紹了用發(fā)酵罐培養(yǎng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌TG1細(xì)胞產(chǎn)生葡激酶，其表達量占菌體總蛋白的10％-15％，是不適于工業(yè)化生產(chǎn)治療血栓病的葡激酶。
本發(fā)明的目的就是找到一種新葡激酶基因序列，構(gòu)建新的葡激酶基因高表達工程菌株，提高葡激酶基因的表達水平，用于生產(chǎn)人體血栓病治療的溶血栓藥物重組葡激酶。它具有特異地、有選擇地、專一地溶解血纖維蛋白凝塊作用，能減少出血的副作用，安全有效地溶血栓。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)首先篩選出一種葡激酶基因，該基因是由金黃色葡萄球菌的溶原性轉(zhuǎn)換噬菌體α的DNA，經(jīng)PCR擴增獲得的，該基因的核苷酸全序列及其編碼的氨基酸如下序列TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAA TAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTSer Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GATTyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val AspAGT AAA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTSer Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GATGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu AspGCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCAla Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys IleGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCTGlu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe ProATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTIle Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn ProGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA TAAGly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys End本發(fā)明的重組葡激酶基因的高表達工程菌株，由產(chǎn)葡激酶活性高的噬菌體α的DNA為模板，采用引物Ⅰ和引物Ⅱ經(jīng)PCR擴增，得到含有完整的葡激酶基因DNA小片段，該基因DNA片段與pJLA502載體質(zhì)粒，分別以BamHⅠ和NcoⅠ酶切；再將酶切后的上述質(zhì)粒和葡激酶基因DNA小片段，用T4DNA連接酶連接獲得含有Sak基因pJLA502質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入HB101大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建成葡激酶高表達的工程菌株E.coliH15(中國微生物保藏中心保藏號CGMCC0432)。
本發(fā)明的高表達工程菌株構(gòu)建過程中所采用的引物Ⅰ，其核苷酸序列為5′ATCCATGGCCATGCTCAAAAGAAGT 3′引物Ⅱ，其核苷酸序列為5′CTTATAGAAAAGAAATAAGGATCCCC 3′本發(fā)明相比已有技術(shù)具有如下優(yōu)點1．本發(fā)明的溶血栓藥物重組葡激酶與德國文獻M.G.G(1987,210,P258)和中國專利95111222 94112105 97105988 98102132 97103921分別報道的葡激酶在第34位核苷酸序列不同。與文獻“Nucleic Acid Research”(1983,11(22)P679)介紹的葡激酶在第11位和第34位核苷酸序列及其對應(yīng)氨基酸不同。與比利時文獻Fibri-nolysis(1992,6,P226)報道葡激酶在第11位核苷酸序列及其對應(yīng)氨基酸不同，所以本發(fā)明的溶血栓藥物重組葡激酶是具有與文獻報道不同的新的葡激酶基因序列，是一種新型基因序列葡激酶。
2．本發(fā)明構(gòu)建的葡激酶高表達工程菌株H15(中國微生物保藏中心保藏號CGMCC0432)，具有高達25％以上的表達量，高于公認(rèn)的10％-15％的表達量，是適于工業(yè)化生產(chǎn)治療血栓病的葡激酶?，F(xiàn)經(jīng)臨床研究表明這種效果特異的新型分子藥物，與尿激酶、鏈激酶的特性相比，其優(yōu)點在于(1)由于其特異地、有選擇地、專一地降解構(gòu)成血栓骨架的血纖維蛋白，減少出血副作用、安全有效。(2)由于其具有較好的纖維蛋白特異性，溶栓能力強。(3)由于葡激酶的分子量只有15.5DK，是鏈激酶的1/3，因而對血栓的穿透力強。實驗表明，在3小時內(nèi)，50％的溶栓作用需葡激酶2μg/ml，而Sk需12μg/ml，組織纖溶原激活劑t-PA需4.45μg/ml。就此看來，葡激酶的溶栓能力是鏈激酶的6倍。在治療血栓過程中，克服了尿激酶(Uk)和鏈激酶(Sk)對血栓骨架的血纖維蛋白不具親和性，臨床治療過程中易造成病人全身出血的缺陷，是當(dāng)今最有前景，最新穎的溶栓藥物。近年我國每年有250萬人死于心腦血管病，高居死亡類疾病的第一位。我國成人中患高血壓病的患者有8,000萬人，急需溶栓藥物治療。因此，高效、安全、價格低廉的溶栓藥物基因重組葡激酶的出現(xiàn)，將會對廣大的心血管疾病患者的治療帶來有益的效果。
附圖簡要說明

圖1本發(fā)明Sak基因初級克隆流程2為抗Amp轉(zhuǎn)化子單菌的葡激酶活性檢測照片中1．大腸桿菌C6002．大腸桿菌轉(zhuǎn)化子-13．大腸桿菌轉(zhuǎn)化子-24．大腸桿菌轉(zhuǎn)化子-3圖3轉(zhuǎn)化子抽取的質(zhì)粒HindⅢ酶切電泳中1．大腸桿菌C600(pBR322+Lα3)2．大腸桿菌C600(pBR322+Lα2)3．大腸桿菌C600(pBR322)4．大腸桿菌C600(pBR322+Lα1)5．αDNA HindⅢ酶切6．αDNA HindⅢ酶切7．λDNA/BamHⅠ,EcoRⅠ圖4本發(fā)明Sak基因次級克隆的構(gòu)建圖5重組葡激酶氨基酸序列圖6熱誘導(dǎo)表達載體構(gòu)建的示意圖本發(fā)明下面將結(jié)合實施例、附圖作進一步的詳細(xì)描述實施例1，本發(fā)明重組葡激酶基因的來源與初級克隆，如圖1所示從收集的179株金葡菌中篩選葡激酶陽性菌株，選取其葡激酶活性強的66號菌株，用絲裂霉素誘導(dǎo)前噬菌體，使其裂碎，從裂解液中分離攜帶葡激酶基因組的溶原轉(zhuǎn)換噬菌體α，抽取噬菌體的DNA，經(jīng)HindⅢ內(nèi)切酶酶切，用鳥槍法和質(zhì)粒pBR322連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EcoliC600構(gòu)建流程如下。篩選得到三株攜帶外源基因的轉(zhuǎn)化子(如圖2所示)。其質(zhì)粒pSak-1經(jīng)酶切電泳，其中一株具有葡激酶產(chǎn)生能力(如圖3所示)。與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，表明含有葡激酶基因約為2.7Kb片段。
實施例2，本發(fā)明重組葡激酶基因次級克隆的構(gòu)建，如圖4所示在初級克隆的基礎(chǔ)上，用EcoRⅠ酶切與質(zhì)粒PUCBM20為載體的連接，得到質(zhì)粒PUC-E，將PUC-E質(zhì)粒用HindⅢ酶切?；厥?.7Kb片段環(huán)化，得到2.1Kb的次級克隆。
實施例3，葡激酶次級克隆基因片段的序列測定次級克隆PUC-E用EcoRⅠ切下約有2100bp一片段，轉(zhuǎn)移到MBmp18噬菌體上用Sanger雙脫氧鏈終止法進行，序列中型號為AppledBiostens373。在此，2001bp的序列中發(fā)現(xiàn)一個讀碼結(jié)構(gòu)(1028-1517)，它編碼一個163個氨基酸的蛋白質(zhì)，其分子量為18.476KD，包含了信號肽及編號136個氨基酸的葡激酶序列(如圖5a、圖5b、圖5c所示)。
實施例4兩端引物設(shè)計根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計合成引物Ⅰ和引物Ⅱ5′ATCCATGGCCATGCTCAAAAGAAGT 3′5′CTTATAGAAAAGAAATAAGGATCCCC 3′實施例5葡激酶表達工程菌株的構(gòu)建引物合成后，從MV1190(PUC-E)菌體中抽取DNA片段作為DNA模板，進行PCR擴增，得到Sak基因。將基因片段通過內(nèi)切酶位點BamHⅠ和NcoⅠ酶切，再與表達載體pJLA502連接(如圖6所示)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，涂布在含Amp的LB平板上挑出Sak活力最強的菌株命名為EcoliH15(中國微生物保藏號CGMCC0432)。
實施例6工程菌株用培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)，并補以營養(yǎng)液，調(diào)整pH并控制溶氧量，保溫一段時間，離心收集菌體。收集到的菌體經(jīng)凍融、加入PBS，離心、兩步柱層析法純化，其純化度可達99％以上。
工程菌構(gòu)建步驟如下1．葡激酶溶原轉(zhuǎn)換噬菌體的分離將實驗室收藏的金黃色葡萄球菌，在經(jīng)56℃熱處理過的人血漿平板37℃培養(yǎng)過夜，篩選具有產(chǎn)生透明圈能力的菌株，篩選到的葡激酶陽性菌株，在液體中培養(yǎng)誘導(dǎo)分離葡激酶溶原轉(zhuǎn)換噬菌體，分離到一株溶原性轉(zhuǎn)換噬菌體。
2．HindⅢ酶切噬菌體DNA，連接到質(zhì)粒pBR322上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌C600，篩選到一株產(chǎn)葡激酶的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，經(jīng)分析，其外源DNA段為2.72Kb，合成其兩端引物，通過PCR擴增，獲得葡激酶基因。
3．再將葡激酶基因連接到載體pJLA502轉(zhuǎn)化入大腸桿菌HB101，從而獲得了熱誘導(dǎo)葡激酶高表達菌株。
生產(chǎn)更多的葡激酶只要將工程菌株經(jīng)振蕩培養(yǎng)→凍融提取→兩步純化工藝重復(fù)循環(huán)即可。
權(quán)利要求
1．一種溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于重組葡激酶基因是由金黃色葡萄球菌的溶原性轉(zhuǎn)換噬菌體α的DNA，經(jīng)PCR擴增獲得的，該基因的核苷酸全序列及其編碼的氨基酸如下序列TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAA TAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTSer Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GATTyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val AspAGT AAA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTSer Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GATGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu AspGCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA ACC GCA AAG ATCAla Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys IleGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCTGlu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe ProATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTIle Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn ProGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA TAAGly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys End
2．根據(jù)權(quán)利1所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于將葡激酶活性高的菌株中分離的噬菌體α的DNA為模板，采用引物Ⅰ和引物Ⅱ經(jīng)PCR擴增，得到含有完整葡激酶基因的DNA小片段，該基因DNA片段與pJLA502載體質(zhì)粒，分別以BamHⅠ和NcoⅠ酶切；再將酶切后的上述質(zhì)粒和葡激酶基因DNA小片段，用T4DNA連接酶連接獲得含有葡激酶基因的pJLA502質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入HB101大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建成葡激酶高表達的工程菌株EcoliH15(中國微生物保藏中心保藏號CGMCC0432)。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于所述的引物Ⅰ，其核苷酸序列為5′ATCCATGGCCATGCTCAAAAGAAGT 3′；引物Ⅱ，其核苷酸序列為5′CTTATAGAAAAGAAATAAGGATCCCC 3′。
全文摘要
溶血栓藥物重組葡激酶,公開了一種葡激酶(Sak)基因及其高表達工程菌株,由金黃色葡萄球菌的溶原性轉(zhuǎn)換噬菌體α的DNA,經(jīng)PCR擴增獲得編碼Sak基因。所構(gòu)建的葡激酶工程菌株,其表達量高達25%以上,適于工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)申請人臨床研究表明,重組葡激酶對血纖維蛋白具有特異性的作用,具有溶栓能力強,出血副作用小的特點,使用安全有效。
文檔編號A61K38/50GK1307136SQ0011267
公開日2001年8月8日 申請日期2000年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月3日
發(fā)明者王家馴 申請人:中國科學(xué)院上海植物生理研究所