專利名稱：將核酸分離成不同群體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離核酸片段的方法。特別地，本發(fā)明涉及一種將已被或可被組分標(biāo)記的核酸從核酸群體中分離出來(lái)的方法，其中的組分可被固定于基質(zhì)上。
大多數(shù)生物技術(shù)的核心是對(duì)DNA的操作和處理。DNA操作一般包括使用可將DNA切割成片段的特異性限制酶進(jìn)行消化，然后純化DNA片段，將所需片段插入克隆載體并將這些載體轉(zhuǎn)移入非自然宿主以便轉(zhuǎn)錄并任選翻譯，從而提供頗有價(jià)值的生物學(xué)信息和/或?qū)⒉迦氲腄NA表達(dá)成產(chǎn)物，如具有治療作用的產(chǎn)物。舉例來(lái)說(shuō)，這種DNA的操作可以實(shí)現(xiàn)真核蛋白在細(xì)菌中的表達(dá)。對(duì)DNA分子的切割和連接是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心。通常，這些DNA片段是經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備的，后者如今已在研究和工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中普遍使用。這種PCR方法可以通過(guò)特異的短核酸引物產(chǎn)生大量的DNA，從而實(shí)現(xiàn)特異DNA分子的擴(kuò)增，而擴(kuò)增后的DNA可以用于進(jìn)一步的操作，例如以上所述的克隆技術(shù)。
使用例如上述限制酶切割或PCR方法獲得的DNA分子進(jìn)行的核酸操作方法通常效率較低，其原因至少部分的由于一些不需要的DNA分子的存在。這些“不需要的”分子包括例如將插入的DNA片段從重組分子中切割，特別是不完全切割時(shí)產(chǎn)生的載體DNA，部分消化的限制性片段或限制酶切割DNA分子產(chǎn)生的其它副產(chǎn)物，過(guò)剩的PCR引物，作為核酸操作副產(chǎn)物的錯(cuò)誤連接的核酸分子，以及由于PCR引物與模板核酸之間錯(cuò)誤的退火而產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。主要終產(chǎn)物DNA的質(zhì)量對(duì)于下游操作如連接和細(xì)菌或真核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。能夠?qū)⒑怂岱肿拥幕旌衔铮鏒NA分子或DNA片段的混合物分離成不同的群體，從而從想要的或目的核酸分子中去除被認(rèn)為是“不需要的”或污染性的群體的能力將會(huì)因此提高用如此所得核酸分子進(jìn)行進(jìn)一步處理或下游步驟的效率。
一系列核酸分子的純化方法已被此行業(yè)所共知。然而可以將核酸分子混合物例如含有幾種不同DNA分子的混合物分離成不同群體的已知方法卻很有限。通常，這些方法依賴于按大小分離核酸分子或片段，例如通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠的電泳，進(jìn)而純化目的分子或片段。這些方法有許多缺點(diǎn)。其中的一個(gè)限制性因素是凝膠自身的容量，它限制了可被分離的DNA的量。一般通過(guò)溴化乙錠染色的方法使凝膠中的DNA可被觀察到。除了對(duì)操作者的毒性外，這一操作可以引起核酸質(zhì)量的降低，從而可以導(dǎo)致其在下游應(yīng)用中的性能變差。回收使用凝膠電泳方法分離的核酸分子同樣效率低下而導(dǎo)致顯著的損失，通常損失至少20％的DNA。凝膠電泳方法還耗費(fèi)時(shí)間。DNA是一種脆性分子，在受到核酸外切和內(nèi)切核酸酶攻擊時(shí)很容易被破壞。在電泳分離相對(duì)較長(zhǎng)的操作過(guò)程中，DNA容易被降解，因而這種操作可以破壞DNA的完整性并且影響下游操作的效率。這類(lèi)分離方法因此是效率低且花費(fèi)大的。因此，亟需一種可以至少部分的將核酸分子分離成不同群體的新方法。本發(fā)明就提供了這樣一種方法。
根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，此項(xiàng)發(fā)明提供了一種可以至少部分的將樣品中的核酸分子分離成各個(gè)群體的方法，其中一個(gè)群體已被或可以被標(biāo)記了能固定于基質(zhì)上的組分，上述方法包括將含有核酸的樣品與基質(zhì)接觸，基質(zhì)借此捕獲標(biāo)記分子從而使其與未標(biāo)記的分子分離。
與前述電泳分離方法比較，這種方法非常簡(jiǎn)單而且快捷。因此這種方法也更加經(jīng)濟(jì)，擁有更大的綜合效率，而且并不受電泳分離方法缺點(diǎn)的影響。
本方法依賴于捕獲標(biāo)記的核酸分子，即將其固定或保留在基質(zhì)上，從而達(dá)到與溶液中剩余的未標(biāo)記分子相互分離的目的。
本發(fā)明方法可以用于將所需未標(biāo)記核酸分子(目的分子)與標(biāo)記后的非所需核酸分子或片段分離開(kāi)來(lái)，此時(shí)基質(zhì)將捕獲非所需核酸分子而目的分子則留在溶液中。這種方法在當(dāng)目的核酸分子將用于下游操作，例如進(jìn)一步的遺傳學(xué)操作技術(shù)時(shí)具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榭梢灾苯舆M(jìn)行進(jìn)一步的步驟而不需要將目的核酸分子從基質(zhì)上洗脫或分離下來(lái)，并且這種方法也可以避免某些情況下必需將標(biāo)記從核酸分子上去除的需要。因此這就構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選方面。而且，此方法也可用于將標(biāo)記的目的核酸分子從未標(biāo)記的非所需核酸片段中分離出來(lái)，此時(shí)基質(zhì)將捕獲所需核酸分子而非所需核酸分子則留在溶液中。除此以外，本方法可用于為不同下游操作目的而收集所有分離后的核酸級(jí)分。
這里使用的“核酸分子”是指任何的核酸分子，包括DNA、RNA、cDNA和雜合復(fù)合物，例如像肽核酸(PNA)這樣的含有核酸和肽的復(fù)合物；在DNA中，包括雙鏈和單鏈分子，以及任何合成DNA或RNA分子和DNA/RNA雜合分子(即一條鏈為DNA而另一條鏈為RNA的分子)?！鞍小被颉澳康摹盌NA是指目的在于使其與其它核酸分子分開(kāi)或分離的那些核酸分子。在本發(fā)明的上下文中“標(biāo)記物”是指一種組分，它可以被核酸分子附著、粘合、摻入、攜帶或作為核酸分子中核苷酸序列的一部分，或以其它方式連接在核酸分子上，這種組分提供了一種從含有以此方式標(biāo)記的某一特定群體和其它未標(biāo)記群體的樣品中捕獲出標(biāo)記的核酸分子群體的方法。憑借這種標(biāo)記通過(guò)基質(zhì)保留步驟可將標(biāo)記分子從未標(biāo)記分子中分離出來(lái)，從而達(dá)到核酸混合物分級(jí)分離的目的。這種標(biāo)記可以結(jié)合到核酸分子中，即作為核酸分子的一部分，例如它可以是一種修飾后的核苷酸并在合成過(guò)程中插入核酸分子中；或者作為分子中核酸序列的一部分，這時(shí)核酸分子本身就是標(biāo)記；或者通過(guò)像加入末端核苷酸這樣的合成后步驟可將此類(lèi)標(biāo)記附著或粘合于核酸分子上；或者將此類(lèi)標(biāo)記結(jié)合到核酸序列中的某個(gè)識(shí)別序列上，此時(shí)沒(méi)有與標(biāo)記結(jié)合的核酸被描述為“可被標(biāo)記”。
本方法可以用于分離或分級(jí)分離前述任何一類(lèi)核酸或其混合物。本發(fā)明的優(yōu)選方面是將樣品中DNA分子或片段通過(guò)本方法至少部分分離成核酸分子的不同群體。這類(lèi)方法有DNA標(biāo)本，如PCR合成的DNA分子或某重組DNA分子，經(jīng)限制酶消化后從中分離出特定的限制酶切片段并且“純化”P(pán)CR反應(yīng)，即去除引物錯(cuò)誤退火而產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。本方法也有其它用途，例如可以在診斷型PCR和體外噬菌體包裝中分離線性和環(huán)形核酸。
根據(jù)本發(fā)明，用于標(biāo)記核酸分子的組分可以是任何能夠標(biāo)記核酸分子并且能夠固定于基質(zhì)上的組分。與基質(zhì)的固定可以通過(guò)直接或間接的相互作用。因此，標(biāo)記物可以單獨(dú)起到固定在基質(zhì)上的作用，或者通過(guò)一個(gè)可與基質(zhì)作用的中間物或連接組分，如所述標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物起作用。
因此另一方面，本發(fā)明提供了一種可以至少部分的將樣品中的核酸分子分離成各個(gè)群體的方法，其中一個(gè)群體已被或可以被標(biāo)記了組分，此組分能直接或通過(guò)標(biāo)記的結(jié)合配對(duì)物而間接固定于基質(zhì)上，所述方法包括將含有核酸的樣品與基質(zhì)接觸，或當(dāng)標(biāo)記物通過(guò)其結(jié)合配對(duì)物與基質(zhì)間接相互作用時(shí)，使標(biāo)記物與其結(jié)合配對(duì)物及與基質(zhì)接觸，從而捕獲標(biāo)記分子并使其與未標(biāo)記的分子分離。
標(biāo)記物的特性至少部分依賴于待分離的分子和所用的基質(zhì)。適合使用的標(biāo)記包括可以插入核酸分子的組分，例如生物素、熒光素等配基，或類(lèi)固醇或類(lèi)固醇樣分子如地高辛配基，或者可用于修飾核酸分子中單個(gè)核苷酸的組分，或者蛋白類(lèi)的組分，例如對(duì)核酸分子中特定結(jié)合位點(diǎn)具親和性的蛋白。因此，可以在核酸分子的合成過(guò)程中通過(guò)例如插入標(biāo)記核苷酸的方法實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，或可以在合成后通過(guò)例如酶反應(yīng)在核酸一端加入標(biāo)記核苷酸的方法實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。根據(jù)使用基質(zhì)的不同，標(biāo)記物可以直接與基質(zhì)作用或者通過(guò)其結(jié)合配對(duì)物間接作用于基質(zhì)，其中結(jié)合配對(duì)物的作用是將標(biāo)記固定于基質(zhì)上，即作為一種連接因子。結(jié)合配對(duì)物本身可以直接作用于基質(zhì)，或者通過(guò)進(jìn)一步的連接因子起作用，此時(shí)標(biāo)記分子可以經(jīng)過(guò)順序或同時(shí)進(jìn)行的結(jié)合步驟而被基質(zhì)捕捉。
在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物可以是一種小分子配基。此時(shí)，被標(biāo)記的核酸分子可以通過(guò)此配基的結(jié)合配對(duì)物固定于本發(fā)明方法中所用的基質(zhì)上，這種結(jié)合配對(duì)物可以其衍生型基質(zhì)的形式本身固定于基質(zhì)上，或者作為一個(gè)獨(dú)立的連接基團(tuán)使標(biāo)記物固定于基質(zhì)上。
在此方法的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸樣品首先在溶液中與配基標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物接觸，此結(jié)合配對(duì)物只與標(biāo)記的核酸分子結(jié)合，此后使用與結(jié)合配對(duì)物有親和性的基質(zhì)提取結(jié)合了結(jié)合配對(duì)物的標(biāo)記核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配對(duì)物首先固定于基質(zhì)上，然后再與核酸樣品接觸，這樣只有標(biāo)記的核酸分子存留在薄膜上。在這個(gè)實(shí)施方案中，采用合適于所選配基和結(jié)合配對(duì)物類(lèi)型的傳統(tǒng)方法將結(jié)合配對(duì)物固定在基質(zhì)上，這些方法包括直接以化學(xué)鍵例如共價(jià)鍵結(jié)合，吸附或通過(guò)親和力結(jié)合。
生物素是一個(gè)可用于本發(fā)明的配基標(biāo)記物的例子。其它類(lèi)似物在此行業(yè)內(nèi)已為人所知。當(dāng)生物素作為配基使用時(shí)，其結(jié)合配對(duì)物應(yīng)為抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，基質(zhì)可以選用那些對(duì)蛋白有親和性的基質(zhì)從而能夠捕獲鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及任何與鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白結(jié)合的分子?？股锼氐鞍缀玩溍箍股锼氐鞍卓梢愿髯宰鳛樯锼氐慕Y(jié)合配對(duì)物，下文中提及的均為細(xì)菌蛋白鏈霉抗生物素蛋白，但應(yīng)說(shuō)明的是也可以使用抗生物素蛋白。生物素可以很容易的插入核苷酸中，甚至生物素化核苷酸已經(jīng)可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得。我們也發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明方法中使用生物素標(biāo)記具有很高的效率。生物素從而代表了本發(fā)明方法中一種優(yōu)選的標(biāo)記。
在一個(gè)以生物素作為配基的實(shí)施方案中，生物素化核酸分子可以首先在溶液中與鏈霉抗生物素蛋白保溫，從而使得作為結(jié)合配對(duì)物的鏈霉抗生物素蛋白與含有生物素的核酸分子結(jié)合并形成結(jié)合復(fù)合物。然后使用能選擇性固定蛋白但至少在所用條件下應(yīng)不能固定核酸分子的基質(zhì)將附著有鏈霉抗生物素蛋白的這些標(biāo)記分子固定，這樣就可以將含有生物素的核酸分子從樣品中分離出來(lái)。
在以生物素作為標(biāo)記物的另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)本身有鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合或附著于其上。此時(shí)，當(dāng)溶液中的核酸樣品與所述基質(zhì)接觸后，生物素標(biāo)記的分子將被保留在基質(zhì)上，而未標(biāo)記的分子則游離在溶液中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物可以是像熒光素或地高辛配基或抗原這樣的配基。這些標(biāo)記物可以通過(guò)結(jié)合其配體而被捕獲在基質(zhì)中，例如結(jié)合配基可以是針對(duì)標(biāo)記物的多克隆或單克隆抗體或其片段。若配基是類(lèi)固醇，捕獲可通過(guò)抗體或其片段，或此類(lèi)固醇的受體或其具有結(jié)合類(lèi)固醇能力的片段實(shí)現(xiàn)。這些捕獲方法可以使用與前述鏈霉抗生物素蛋白相似的方法，并聯(lián)合對(duì)蛋白具親和力的基質(zhì)。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這種標(biāo)記物可以是蛋白，尤以在待標(biāo)記的核酸分子內(nèi)有特定識(shí)別序列的核酸結(jié)合蛋白為優(yōu)選。這些核酸結(jié)合蛋白的實(shí)例包括結(jié)合AP-1識(shí)別序列的轉(zhuǎn)錄因子AP-1，結(jié)合特定短識(shí)別序列的myb蛋白，以及結(jié)合lac操縱子序列的lacI抑制子蛋白。
在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，標(biāo)記物可被看作是一段核酸序列或核酸分子內(nèi)諸如特異性識(shí)別序列等序列。這種序列標(biāo)記物可以對(duì)能結(jié)合基質(zhì)之蛋白具有親和力。這樣的實(shí)例包括前述AP-1識(shí)別序列，其上可以結(jié)合作為結(jié)合配對(duì)物的AP-1從而實(shí)現(xiàn)與蛋白結(jié)合基質(zhì)的結(jié)合。類(lèi)似的，myb蛋白作為結(jié)合配對(duì)物可結(jié)合到作為標(biāo)記物的特異短識(shí)別序列上，而lacI蛋白作為結(jié)合配對(duì)物可結(jié)合到作為標(biāo)記物的lac操縱子序列上。
在本發(fā)明的這種實(shí)施方案中，一種含有包括蛋白識(shí)別序列的核酸分子的樣品可首先在溶液中通過(guò)接觸被其特異序列識(shí)別的蛋白而被進(jìn)一步標(biāo)記，然后此樣品與基質(zhì)接觸從而使被標(biāo)記的分子保留在基質(zhì)上，而未被標(biāo)記的分子即沒(méi)有結(jié)合蛋白的分子則留在溶液中?；蛘?，這種DNA結(jié)合蛋白可被固定在基質(zhì)上，然后通過(guò)與前述使用鏈霉抗生物素蛋白類(lèi)似的方法從溶液中捕獲核酸。
在每一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，捕獲一定群體的核酸分子的過(guò)程都涉及一種或作為標(biāo)記物本身或作為標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物(例如抗體，或鏈霉抗生物素蛋白)的蛋白。這種方法是優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)檫@樣可以將易于接受蛋白的物質(zhì)用作基質(zhì)，尤以至少在所使用的條件下能選擇性的結(jié)合蛋白而不能結(jié)合核酸的物質(zhì)為優(yōu)選的基質(zhì)物質(zhì)，從而可以保證未被標(biāo)記的分子不能被薄膜捕獲或從樣品中去除。這種蛋白可被基質(zhì)捕獲并通過(guò)多種作用方式與基質(zhì)結(jié)合，包括離子作用，疏水相互作用及其親和性結(jié)合。
這種基質(zhì)可以采用任何方便的物理形態(tài)，并且許多已為業(yè)內(nèi)所共知，例如薄層，凝膠，濾膜，膜，纖維，管，微量滴定板，柱，顆粒，而且既可能是微粒狀的也可以是多孔狀的。無(wú)論是濾去非所需的標(biāo)記DNA或是收集所需的標(biāo)記DNA，使用多孔材料如濾膜和薄膜等對(duì)于本發(fā)明分離方法是很方便的。實(shí)例包括以下樣品，其中未標(biāo)記群體將進(jìn)一步處理，而標(biāo)記的核酸群體，即構(gòu)成“非所需”群體的那些，可通過(guò)直接濾膜過(guò)濾而從溶液中捕獲，這是一種有效而快速的捕獲方法，其可同時(shí)將未標(biāo)記的核酸群體分離至濾液中，從而提供一種迅速而有效的捕獲方法并同時(shí)將未被標(biāo)記的核酸分級(jí)分離入濾液中，所以這種方法提供了一種進(jìn)入下一步操作階段的直接途徑。因此，像濾膜這樣的多孔材料構(gòu)成了用于本發(fā)明中的一種優(yōu)選的基質(zhì)。
因此多孔基質(zhì)可方便的用于濾去不需要的被標(biāo)記的核酸分子，或用于收集需要的被標(biāo)記核酸分子。這些基質(zhì)可用作單步或多步分離設(shè)備的組成部分，或作為其它步驟，例如對(duì)DNA或下游反應(yīng)流程中的其它產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)、評(píng)估或定量的步驟中的組成部分。這些多孔基質(zhì)可被合并入例如離心管，微滴定板，套筒或注射器這樣的分離設(shè)備，并且根據(jù)樣品和待操作的下游步驟，可用系列的方式提供一種或多種這樣的設(shè)備。這種設(shè)備可以人工、半自動(dòng)或全自動(dòng)的方式操作。
在一個(gè)實(shí)施方案中可使用NycoCardTM。當(dāng)被標(biāo)記的核酸片段是待側(cè)的序列或分子時(shí)，此片段可通過(guò)結(jié)合到對(duì)所述標(biāo)記物具有親和力的蛋白上，再直接被保留于NycoCardTM設(shè)備中的蛋白結(jié)合膜捕獲。這種設(shè)備應(yīng)包括一張合適的薄膜，其一側(cè)附有吸收性襯墊如纖維素紙以促進(jìn)液體樣品通過(guò)薄膜。在一個(gè)實(shí)施方案中，在膜的另一側(cè)可安放一個(gè)非滲透性的片層并提供一些空洞以允許在多樣品待分析時(shí)在膜上加載樣品。當(dāng)將要去除被標(biāo)記的序列而收集未被標(biāo)記的核酸時(shí)，可以使用一種蛋白結(jié)合濾膜用作預(yù)過(guò)濾膜，其位于安裝在NycoCard設(shè)備上的核酸結(jié)合濾膜上，以便將標(biāo)記的非所需分子存留在預(yù)過(guò)濾膜上，而未標(biāo)記的所需分子則存留在核酸結(jié)合濾膜上。
基質(zhì)可由多種業(yè)內(nèi)已知的用于此目的的材料構(gòu)成，包括聚合材料例如纖維素、聚苯乙烯、瓊脂糖、乳膠，這些材料可以被衍生或修飾以供捕獲標(biāo)記物本身，或捕獲作為標(biāo)記物與基質(zhì)間連接因子的標(biāo)記物之結(jié)合配對(duì)物。所述材料可以用諸如對(duì)標(biāo)記物具有親和力的物質(zhì)、或結(jié)合配對(duì)物、或用于介導(dǎo)標(biāo)記物捕獲的連接因子包被。優(yōu)選地，基質(zhì)對(duì)標(biāo)記物或其結(jié)合配對(duì)物比對(duì)核酸更有特異結(jié)合性，以便未被標(biāo)記的分子不能被基質(zhì)存留。在本發(fā)明一優(yōu)選方面，捕獲過(guò)程涉及蛋白，標(biāo)記物或是蛋白，或是含有可連接該標(biāo)記物與基質(zhì)之蛋白性結(jié)合配對(duì)物的物質(zhì)，從而使所述基質(zhì)具有可接受蛋白的特性。這方面的實(shí)例已為業(yè)內(nèi)所知，包括已知的蛋白結(jié)合基質(zhì)，其至少在所用條件下被對(duì)蛋白有特異親和力的多聚體包被。依照業(yè)內(nèi)已知的方法，這種基質(zhì)可攜帶或被標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物取代，如WO90/04786所述，其包括直接化學(xué)鍵結(jié)合如共價(jià)結(jié)合，吸附或親和結(jié)合。特別優(yōu)選含有蛋白結(jié)合多聚體的膜，如在WO98/23630、EP-0524800和EP-0580305中所述，如Edge Biosystems，USA出售的Centriflex(TM)膜。
在樣品待分級(jí)分離且溶液中未標(biāo)記的核酸分子將被收集并用于下游步驟時(shí)，本發(fā)明的分離方法特別方便。但這種方法同樣可用于待收集以便進(jìn)一步處理的標(biāo)記的核酸分子。當(dāng)標(biāo)記分子是被收集以便進(jìn)一步操作的那些時(shí)，這些分子需要從基質(zhì)上釋放出來(lái)，并且根據(jù)所用捕獲方法，還需從標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物中釋放出來(lái)。所用釋放方法可能依賴于標(biāo)記物的特性，其結(jié)合配對(duì)物，以及它們互相之間結(jié)合力的類(lèi)型和強(qiáng)度。
用于釋放步驟的反應(yīng)條件也是可選擇的，以便防止已釋放的標(biāo)記核酸與基質(zhì)或其結(jié)合配對(duì)物重新結(jié)合。所述方法的實(shí)例已為業(yè)內(nèi)所知。因此，可改變化學(xué)或物理?xiàng)l件以協(xié)助被標(biāo)記的核酸分子從基質(zhì)結(jié)合復(fù)合物中釋放出來(lái)?；瘜W(xué)方法的實(shí)例包括改變離子強(qiáng)度或pH值，加入螯合劑，以及使用競(jìng)爭(zhēng)性游離標(biāo)記分子，或化學(xué)上與之相關(guān)的分子，含有標(biāo)記物或標(biāo)記物樣組分的分子，可改變結(jié)合配對(duì)物的構(gòu)型而減少、消除或修飾標(biāo)記-結(jié)合配對(duì)物間作用的分子或離子，加入去污劑或解離劑，或通過(guò)酶處理。物理方法的實(shí)例包括改變溫度、超聲處理、振動(dòng)。這些物理或化學(xué)方法的任何組合都可以使用。
根據(jù)標(biāo)記物與其結(jié)合配對(duì)物之間相互作用強(qiáng)度的不同，可以通過(guò)如下方法釋放結(jié)合配對(duì)物或基質(zhì)上的標(biāo)記物或已標(biāo)記的分子，即加入過(guò)量標(biāo)記物使其與標(biāo)記DNA競(jìng)爭(zhēng)對(duì)結(jié)合配對(duì)物或?qū)|(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，然后被釋放的標(biāo)記DNA可以簡(jiǎn)單的被洗脫下來(lái)。因此當(dāng)標(biāo)記為熒光素而結(jié)合配對(duì)物為熒光素抗體時(shí)，可以通過(guò)在溶液中加入游離熒光素而從基質(zhì)上釋放熒光素-DNA。但是，當(dāng)標(biāo)記物-結(jié)合配對(duì)物之間的相互作用、結(jié)合配對(duì)物-基質(zhì)之間的相互作用或標(biāo)記物-基質(zhì)之間的相互作用非常強(qiáng)時(shí)，加入游離標(biāo)記物并非總能有效干擾上述相互作用。此時(shí)，可以使用其它方法，如通過(guò)調(diào)節(jié)pH值或用酶降解結(jié)合配對(duì)物從而使其從基質(zhì)和/或標(biāo)記物上釋放下來(lái)。通過(guò)如用化學(xué)試劑干擾基質(zhì)使其變?yōu)椴荒芙Y(jié)合蛋白的形式，從而釋放蛋白-DNA或蛋白-標(biāo)記物-DNA復(fù)合物，或者通過(guò)化學(xué)方法干擾蛋白與基質(zhì)之間的相互作用或影響它們之間的親和性也可以達(dá)到釋放的目的。
生物素-鏈霉抗生物素蛋白之間的結(jié)合配對(duì)存在非常強(qiáng)的相互作用，因此很難通過(guò)加入游離生物素的方法破壞。即當(dāng)標(biāo)記物為生物素，基質(zhì)通過(guò)抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白捕捉標(biāo)記DNA時(shí)，不能通過(guò)加入游離生物素的方法使生物素化DNA從薄膜上釋放下來(lái)。但這種方法可以用于對(duì)鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合親和性比生物素低的生物素衍生物，此時(shí)標(biāo)記DNA可以通過(guò)加入游離生物素的方法從基質(zhì)上釋放下來(lái)。游離生物素將與生物素化DNA競(jìng)爭(zhēng)對(duì)鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，釋放后的生物素化DNA可以簡(jiǎn)單的從基質(zhì)上洗脫下來(lái)。
根據(jù)所用標(biāo)記的不同可能需要插入一個(gè)步驟，使將要用于下游步驟的標(biāo)記DNA從標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物上釋放下來(lái)，此時(shí)結(jié)合配對(duì)物的作用是將標(biāo)記DNA固定于基質(zhì)上。如加入化學(xué)物質(zhì)或離子或應(yīng)用可以減弱標(biāo)記與其結(jié)合配對(duì)物之間結(jié)合力的物理?xiàng)l件，然后收集釋放后的DNA。
本發(fā)明方法可以用于包括分析、制備和診斷等許多不同的應(yīng)用，實(shí)例見(jiàn)下文。其它應(yīng)用對(duì)于熟悉此行業(yè)的人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明的一個(gè)重要的應(yīng)用是切割和連接DNA分子，例如分離特定限制酶消化產(chǎn)物，及從連接反應(yīng)的其它產(chǎn)物中分離已連接的環(huán)狀DNA分子。
因此，本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用是對(duì)限制酶消化的DNA片段的操作，特別是當(dāng)某一特定片段需要進(jìn)一步的操作而因此必需從酶反應(yīng)的其它產(chǎn)物中分離出來(lái)時(shí)。分離方法可以從未標(biāo)記分子中分離出一端或兩端帶有標(biāo)記物的線性DNA分子群體。標(biāo)記分子可以在合成過(guò)程中被標(biāo)記，例如使用像生物素化核苷酸這樣的標(biāo)記核苷酸，如以生物素化引物的形式，或可用業(yè)內(nèi)已知的酶學(xué)末端標(biāo)記方法標(biāo)記DNA分子。
因此另一方面，本發(fā)明提供了一種可以至少部分分離DNA的限制酶消化片段之混合物的方法，其中起始材料是線性DNA分子，其一端或兩端已被或可以被組分標(biāo)記，此組分能固定于基質(zhì)上，所述方法包括使用限制酶消化DNA分子，然后將樣品與基質(zhì)接觸借此使基質(zhì)捕獲來(lái)自起始材料某個(gè)末端的標(biāo)記分子，從而使其與未標(biāo)記的分子分離。
由于合成的操作方式，此方法特別適用于分離PCR所得DNA的消化產(chǎn)物。在使用PCR擴(kuò)增DNA的方法中使用了兩種特異性寡核苷酸引物，其中一個(gè)與編碼鏈的5′端互補(bǔ)并因此雜交而另一個(gè)引物則與非編碼鏈的5′端互補(bǔ)并因此雜交，以致當(dāng)適當(dāng)DNA聚合酶存在時(shí)可以合成靶序列的全長(zhǎng)拷貝。該拷貝在兩條合成DNA鏈中，每條鏈5′端均插入有寡核苷酸引物。這種PCR合成方法經(jīng)常用于為隨后的遺傳學(xué)操作制備特異的DNA分子或片段，其中所需特異性DNA片段可以通過(guò)限制酶切割較長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物獲得。如前所述，由于限制酶切割后的其它產(chǎn)物，例如部分消化產(chǎn)物和未消化的DNA分子的連接混合物存在于隨后的操作中，這些隨后的遺傳學(xué)操作通常效率不高。當(dāng)用于下游步驟的目的產(chǎn)物是全長(zhǎng)PCR的內(nèi)部片段時(shí)，限制酶消化后的“非所需”副產(chǎn)物將至少包括全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的一個(gè)末端，通過(guò)使用像生物素化引物這樣的標(biāo)記引物，本發(fā)明方法可以用于至少部分的從含有末端的片段和未消化分子中分離出所需產(chǎn)物。通過(guò)這樣的方法，可以從核酸樣品中去除標(biāo)記后的核酸分子，存留于樣品溶液中的只有所需內(nèi)部限制片段，因?yàn)樗缓邢馪CR引物這樣的末端因此也就未被標(biāo)記。
本發(fā)明涉及PCR方法學(xué)的另一個(gè)方面是所謂的“純化(clean-up)”P(pán)CR反應(yīng)產(chǎn)物，即去除由于引物錯(cuò)誤退火而導(dǎo)致的非所需產(chǎn)物。核酸模板越大，這種問(wèn)題越嚴(yán)重。當(dāng)PCR反應(yīng)欲擴(kuò)增的核酸樣品的末端或接近末端處存在唯一的限制酶位點(diǎn)或其它可切割序列時(shí)可以應(yīng)用本發(fā)明方法。
這一方法包括使用標(biāo)記后的或可被標(biāo)記的PCR引物，此引物與欲擴(kuò)增的序列末端互補(bǔ)因此可以與模板核酸雜交，并且只與每個(gè)唯一限制位點(diǎn)部分重疊。如果使用與模板核酸內(nèi)全長(zhǎng)限制酶識(shí)別序列互補(bǔ)并雜交的引物，無(wú)論引物是否與目的序列退火或者無(wú)論P(yáng)CR產(chǎn)物是否為引物錯(cuò)誤退火的產(chǎn)物，PCR反應(yīng)產(chǎn)生的任何核酸分子都將帶有所述限制酶識(shí)別位點(diǎn)。然而使用只與模板中限制酶識(shí)別位點(diǎn)部分雜交的引物，產(chǎn)物僅限于在限制酶識(shí)別位點(diǎn)按要求退火而的那些。因此通過(guò)使用標(biāo)記后的或可被標(biāo)記的引物，就有可能通過(guò)PCR反應(yīng)操作，然后用特異于上述限制識(shí)別位點(diǎn)的限制酶切割或消化該P(yáng)CR反應(yīng)產(chǎn)物而使之純化。通過(guò)這種限制酶消化，只有正確的PCR產(chǎn)物，即能被切割并去除引物和標(biāo)記的那些，可與不能被切割而仍然留有標(biāo)記物的非所需PCR延伸產(chǎn)物分離開(kāi)來(lái)。
因此從一方面看，本發(fā)明提供了一種至少部分的從PCR引物與模板不正確退火造成的PCR產(chǎn)物中分離出所需正確PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，其中模板核酸分子在其一個(gè)末端或附近含有一個(gè)唯一的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，并且被標(biāo)記的或可被標(biāo)記的PCR引物只與模板上部分延伸至該唯一限制酶位點(diǎn)的序列互補(bǔ)，此方法包括通過(guò)PCR擴(kuò)增模板，使用特異作用于上述唯一限制酶識(shí)別位點(diǎn)的限制酶消化PCR產(chǎn)物，以及將所得產(chǎn)物與可以固定標(biāo)記物的基質(zhì)接觸，從而通過(guò)基質(zhì)捕獲標(biāo)記核酸分子使之與未標(biāo)記分子相分離。
在此文中，唯一限制酶位點(diǎn)是指在模板核酸分子中只有單一識(shí)別位點(diǎn)的限制酶，但也包括在特殊情況下在模板的每一端處或附近有同樣的限制位點(diǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將要用PCR擴(kuò)增的模板核酸分子只在一個(gè)末端出或附近摻入一個(gè)唯一限制位點(diǎn)。當(dāng)用這種酶處理反應(yīng)產(chǎn)物，將產(chǎn)生部分“純化”的PCR產(chǎn)物，“純化”的程度至少部分依賴于與含有這一唯一位點(diǎn)之模板退火的引物可能造成錯(cuò)誤退火的程度。在這個(gè)實(shí)施方案中，只有延伸至所述唯一限制酶位點(diǎn)的引物被標(biāo)記或可被標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將要通過(guò)PCR擴(kuò)增的模板在其每一個(gè)末端或近側(cè)都含有一個(gè)唯一的限制酶位點(diǎn)。這些位點(diǎn)可以是同一種限制酶的位點(diǎn)，即一種限制酶切割模板和PCR產(chǎn)物兩次，每次位于一個(gè)末端，或者這些位點(diǎn)可以是不同限制酶的位點(diǎn)，只要每個(gè)上述限制酶在模板上只有一個(gè)單一識(shí)別位點(diǎn)并且分別在模板的兩端即可。
在這種方法中，每個(gè)唯一限制位點(diǎn)相對(duì)于核酸模板末端的位置至少部分依賴于所使用的特定限制酶，因?yàn)樵谟行拗魄懈顣r(shí)不同的酶對(duì)于其位點(diǎn)與末端的最小距離有不同的要求。這些最適參數(shù)已為業(yè)內(nèi)所共知，且在如限制酶生產(chǎn)商提供的目錄中均有描述?？傮w來(lái)說(shuō)，限制酶位點(diǎn)應(yīng)距末端至少一個(gè)堿基。對(duì)酶及其位置的選擇可由技術(shù)人員根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)常識(shí)并根據(jù)廠家提供的信息很容易地確定?？傮w來(lái)說(shuō)限制位點(diǎn)應(yīng)至少距末端有最小距離以便相應(yīng)酶進(jìn)行有效切割，但位點(diǎn)也可以遠(yuǎn)離所述末端。例如，此最小距離在BamHI為至少距末端一個(gè)堿基，在NdeI為至少距末端6個(gè)堿基。最小距離可參見(jiàn)限制酶生產(chǎn)商出版的目錄，如New England Biolabs Catalogue 1999，和Moreira and Noren，生物技術(shù)，19，56-59(1999)。
因此通過(guò)使用或以業(yè)內(nèi)已知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建在其每一端或近側(cè)含有唯一限制酶位點(diǎn)的模板，就可以去除由于PCR引物與模板非目的位置錯(cuò)誤退火而產(chǎn)生的非所需PCR副產(chǎn)物。當(dāng)一對(duì)引物都被標(biāo)記或可被標(biāo)記時(shí)，所有PCR產(chǎn)物的兩端都可以在最初被標(biāo)記。使用在模板每個(gè)末端都有唯一識(shí)別位點(diǎn)的前述限制酶同時(shí)或順序消化PCR產(chǎn)物，未被切割或只有一端被切割的分子將保留標(biāo)記物，由限制酶切割出的正確PCR產(chǎn)物的雙末端也是如此；它們可與兩個(gè)引物都被去除而因此不再含有標(biāo)記或可被標(biāo)記的組分的目的產(chǎn)物分離開(kāi)來(lái)。這一方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以省卻用于精細(xì)調(diào)整PCR反應(yīng)的大量時(shí)間和材料，而使用凝膠電泳或其它通過(guò)大小分離PCR產(chǎn)物的方法則必需對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)整。如果兩個(gè)PCR引物中只有一個(gè)被標(biāo)記或可被標(biāo)記則仍可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的至少部分“純化”。
標(biāo)記物為生物素時(shí)操作很方便，其中在限制酶消化之前或之后將PCR產(chǎn)物接觸鏈霉抗生物素蛋白，然后可以通過(guò)蛋白結(jié)合基質(zhì)將有鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的標(biāo)記分子與未標(biāo)記分子分離開(kāi)。如前所述，另一種方法是基質(zhì)本身可以帶有鏈霉抗生物素蛋白。
在本發(fā)明的這個(gè)特定實(shí)施方案中，標(biāo)記物可以附加在引物的任何位置，只要引物的3′末端可由PCR聚合酶的延伸。更方便的方法是可在引物的5′末端附加標(biāo)記物，因?yàn)樵谶@一位置添加標(biāo)記不會(huì)導(dǎo)致合成困難。而且一些并非局限于理論的觀點(diǎn)認(rèn)為位于引物5′末端的標(biāo)記物較不可能干擾PCR聚合酶的活性，并且在本文中描述的任何捕獲方法中也更容易被捕獲。
以下表示了一個(gè)實(shí)例
5’-tttactggatcctag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagcc-5’該片段具有兩個(gè)唯一的限制位點(diǎn)，一個(gè)位于“左側(cè)”的BamHI位點(diǎn)(ggatcc)以及一個(gè)位于“右側(cè)”的AsnI位點(diǎn)(attaat)。以一般方式擴(kuò)增這一片段通常需要制備兩個(gè)引物，可任選在其5’末端標(biāo)記生物素，如下所示BamHI引物5’-生物素-tttactggatcctag-3’AsnI引物5’-生物素-ccgattaatgtacgtaa-3’在PCR反應(yīng)中使用這些引物通常將產(chǎn)生許多產(chǎn)物，主要原因是在PCR中引物錯(cuò)誤的退火。
BamHI和AsnI引物在其序列中充分體現(xiàn)了核酸識(shí)別序列。這將使得以這些引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)所產(chǎn)生的每個(gè)DNA片段都含有BamHI和AsnI限制酶識(shí)別位點(diǎn)。所有PCR反應(yīng)所產(chǎn)生的片段，不論正確的(即目的)產(chǎn)物或副產(chǎn)物，都將可以被BamHI和AsnI酶切割。
然而，本發(fā)明實(shí)施方案中使用稍短的引物，可以非常有效的去除所有非所需副產(chǎn)物。
可用的引物實(shí)例如下BamHI短引物5’-生物素-tttactgga-3’AsnI短引物5’-生物素-ccgatt-3’這些引物只與限制酶的識(shí)別位點(diǎn)部分重疊。因此，只有通過(guò)與其目的核酸位點(diǎn)退火才能形成完整的酶識(shí)別位點(diǎn)。其結(jié)果是，只有PCR反應(yīng)產(chǎn)生的正確的(或目的)片段才能被兩種限制酶切割。
使用上述引物可能產(chǎn)生的4組PCR產(chǎn)物如下(B＝生物素標(biāo)記)5’-Btttactggatcctag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagccB-5’(正確片段-2個(gè)限制位點(diǎn))5’-Btttactggtag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgaccatc------aatgcatgtaattagccB-5’(不正確片段-只方1個(gè)限制位點(diǎn)(AsnI))5’-Btttactggatcctag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgttagccB-5’(不正確片段-只有1個(gè)限制位點(diǎn)(BamHI))
5’-Btttactggatag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctatc------aatgcatgttagccB-5’(不正確片段-沒(méi)有限制位點(diǎn))以AsnI和BamHI切割得到如下片段5’-Btttactggatcctag------ttacgtaca ttaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagccB-5’(正確片段-2個(gè)限制位點(diǎn)-2個(gè)生物素都被去除)5’-Btttactggtag------ttacgtaca ttaatcgg-3’3’-aaatgaccatc------aatgcatgtaattagccB-5’(不正確片段-只有1個(gè)限制位點(diǎn)(AsnI)-只有1個(gè)生物素被去除)5’-Btttactggatcctag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgttagccB-5’(不正確片段-只有1個(gè)限制位點(diǎn)(BamHI)-只有1個(gè)生物索被去除)5’-Btttactggatag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctatc------aatgcatgttagccB-5’(不正確片段-沒(méi)有限制位點(diǎn)-由于沒(méi)有限制位點(diǎn)無(wú)一生物素被去除)在所有上述片段的混合物中，只有一種片段即正確的片段將沒(méi)有生物索附著。通過(guò)在片段中加入鏈霉抗生物素蛋白并將反應(yīng)產(chǎn)物與蛋白結(jié)合基質(zhì)接觸，例如通過(guò)一個(gè)Centriflex薄膜，則只有正確的片段將不被捕獲并且在使用Centriflex薄膜這樣的情況下，其可以不受任何阻礙的通過(guò)薄膜。
使用短引物(即不能完全延伸進(jìn)入模板上限制酶位點(diǎn)的引物)和長(zhǎng)引物(摻入了全長(zhǎng)限制酶位點(diǎn))的區(qū)別是顯而易見(jiàn)的，因?yàn)樵谑褂瞄L(zhǎng)引物的情況下，所有的片段甚至錯(cuò)誤的片段也導(dǎo)入了AsnI和BamHI限制酶位點(diǎn)。此時(shí)就無(wú)法區(qū)分正確和錯(cuò)誤的PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
本方法也可以用于分離DNA分子經(jīng)限制酶消化后的產(chǎn)物，這種產(chǎn)物可以是線性的或已經(jīng)被線性化，并且通過(guò)業(yè)內(nèi)已知的末端標(biāo)記方法，例如酶學(xué)方法在一端或兩端進(jìn)行了標(biāo)記。一個(gè)實(shí)例是單獨(dú)使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)或與DNA聚合酶I(Klenow片段)聯(lián)合使用，在線性DNA分子3′末端的游離羥基上加入標(biāo)記的核苷酸，如生物素或熒光素或地高辛配基標(biāo)記的核苷酸。如果用于限制酶消化的線性DNA是平末端或有突出3′的末端則只需TdT就可以標(biāo)記3′末端。然而當(dāng)其5′末端為突出端，3′末端為凹進(jìn)端時(shí)，需另加入Klenow片段等酶填以補(bǔ)凹進(jìn)末端而提高效率。
當(dāng)標(biāo)記物是生物素時(shí)，樣品首先在溶液中與鏈霉抗生物素蛋白接觸，然后將樣品通過(guò)一個(gè)可以結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白的蛋白結(jié)合薄膜，從而存留不需要的、標(biāo)記的核酸分子而溶液中留下目的片段，其形式適于進(jìn)一步操作。
這比現(xiàn)有方法有顯著改進(jìn)，現(xiàn)有方法工作量大，并涉及在瓊脂糖凝膠中分離限制酶消化混合物，通過(guò)溴化乙錠染色使片段可見(jiàn)，切除所需DNA片段并將其從凝膠中純化出來(lái)，這一過(guò)程非常冗長(zhǎng)，且操作過(guò)程中DNA暴露于核酸酶的危險(xiǎn)極大。
本發(fā)明此方面的另一應(yīng)用是在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制酶消化領(lǐng)域。有時(shí)需進(jìn)行部分限制酶消化，即，使用有限量的酶進(jìn)行消化。限制酶制劑經(jīng)常含有少量的內(nèi)切核酸酶，它們可以降解新切割的DNA末端從而降低所需片段的質(zhì)量，并使進(jìn)一步操作，如將DNA連接入表達(dá)載體發(fā)生困難。然而，由于核酸酶污染導(dǎo)致的這類(lèi)問(wèn)題可以通過(guò)使用有限量的限制酶和縮減保溫時(shí)間最小化。但一個(gè)缺點(diǎn)是消化產(chǎn)物將會(huì)含有一些不需要的限制酶消化副產(chǎn)物，例如只部分切割的分子或未被切割的分子。本發(fā)明方法卻可以實(shí)現(xiàn)部分消化，方法是使用標(biāo)記的如生物素化引物DNA通過(guò)PCR合成限制酶消化底物，以便任何至少含有一個(gè)末端的DNA分子或片段(例如未被消化的分子，或部分消化的分子)可以通過(guò)合適的基質(zhì)被去除，而溶液中只富含所需內(nèi)部限制片段。
本發(fā)明基于標(biāo)記的分離方法的另一應(yīng)用涉及診斷型PCR。已知可用PCR檢測(cè)突變，包括僅單個(gè)核苷酸差異的突變，如鐮刀型細(xì)胞貧血癥中出現(xiàn)的情況。有時(shí)，PCR片段的大小可以預(yù)示特定突變的存在或缺失。但通常，診斷型PCR技術(shù)還需在最初PCR后，對(duì)患者樣品實(shí)施其它技術(shù)，以診斷樣品中是否存在突變，如限制酶分析和/或測(cè)序。這些技術(shù)可能花費(fèi)巨大，因?yàn)樗鼈兘?jīng)常需要使用像肽核酸這樣昂貴的化學(xué)制劑并且也相當(dāng)費(fèi)時(shí)，而且導(dǎo)致延緩了對(duì)患者狀況的判斷。使用本發(fā)明的標(biāo)記物-捕獲方法，通過(guò)使用至少一種標(biāo)記的或可被標(biāo)記的PCR引物進(jìn)行PCR可以大大簡(jiǎn)化現(xiàn)有方法。通過(guò)使用標(biāo)記引物就可以不必進(jìn)行上述進(jìn)一步的步驟，即只用PCR擴(kuò)增的步驟就可以檢測(cè)突變的存在。
因此當(dāng)應(yīng)用于診斷型PCR時(shí)，本發(fā)明方法可以代替現(xiàn)有診斷方法中對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的需要。在這個(gè)實(shí)施方案中，與樣品3′末端退火并在其位延伸的引物被標(biāo)記或可被標(biāo)記，所用方式使其保留3′OH基團(tuán)并可因此在PCR反應(yīng)中延伸，而且它對(duì)突變核酸具有特異性；即它可與疾病狀態(tài)下改變了的核酸序列雜交?；蛘撸?′引物可以與正常核酸序列雜交。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法可以用于檢測(cè)單個(gè)堿基突變，此時(shí)引物的3′末端與突變堿基相對(duì)應(yīng)。當(dāng)有多個(gè)堿基突變時(shí)，引物3′末端可以與任何一個(gè)突變堿基相對(duì)應(yīng)。
因此當(dāng)突變已知時(shí)，在此實(shí)施方案中的一種方案中，對(duì)樣品DNA進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)都使用相同的對(duì)樣品5′末端的引物，卻使用不同的3′末端引物，一種3′引物雜交并可以產(chǎn)生一種與“正?！盌NA相對(duì)應(yīng)的延伸產(chǎn)物，而另一個(gè)引物則與突變核酸序列特異互補(bǔ)從而可以產(chǎn)生與該突變序列相對(duì)應(yīng)的延伸產(chǎn)物。在使用適于突變DNA的標(biāo)記引物對(duì)突變的靶序列進(jìn)行PCR時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中將插入標(biāo)記物，而使用“正?！币镞M(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，在引物的3′末端將會(huì)有錯(cuò)配堿基，它們將被PCR聚合酶如Tap聚合酶去除，如果3′堿基被標(biāo)記，則其去除將遠(yuǎn)離其攜有的標(biāo)記物或可被標(biāo)記的組分。PCR產(chǎn)物將因此不含有標(biāo)記。因此僅有突變核酸的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，它們由被標(biāo)記的或可被標(biāo)記的突變引物延伸而成，并可用任何前述方法檢測(cè)。
使用不含待檢測(cè)之特定突變的“正?！盌NA進(jìn)行PCR延伸時(shí)出現(xiàn)相反的情況。此時(shí)，用突變引物可獲得PCR產(chǎn)物，其中引物的3′核苷酸錯(cuò)配并因此連同標(biāo)記物一起被去除，因而在全長(zhǎng)反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)不到，而使用“正?！币锏漠a(chǎn)物中將會(huì)含有標(biāo)記物或可被標(biāo)記的組分，它們可被檢測(cè)。
在這個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物或可被標(biāo)記的組分存在或附著于3′堿基，其方式使3′OH仍能由PCR聚合酶延伸。
因此另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷型PCR的方法，其中待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中如有突變則位于與3′引物互補(bǔ)的序列中，第一PCR反應(yīng)使用與正常靶核酸互補(bǔ)的3′引物而第二PCR反應(yīng)使用與突變的靶核酸互補(bǔ)的3′引物，其中突變引物的3′核苷酸與突變核酸中已突變的核苷酸之一相對(duì)應(yīng)，上述3′引物的任何一個(gè)在其3′核苷酸上都含有一個(gè)標(biāo)記或可以被標(biāo)記，在此方法中檢測(cè)的是PCR反應(yīng)產(chǎn)物中標(biāo)記物的存在或缺失。
在其最簡(jiǎn)單的實(shí)施方案中，3′引物被諸如生物素標(biāo)記，而生物素可以通過(guò)本文所述的任何一種方法檢測(cè)?？梢詸z測(cè)生物素化PCR產(chǎn)物的方法有，加入鏈霉抗生物素蛋白，在蛋白結(jié)合薄膜上濾過(guò)，檢測(cè)存留在薄膜上的DNA，或者加入鏈霉抗生物素蛋白包被的金顆粒，如EP-0564494所述，過(guò)膜，如上述NycoCardTM系統(tǒng)中的硝酸纖維素膜。可任選，但優(yōu)選需要較小PCR片段時(shí)，薄膜可用聚賴氨酸包被以增進(jìn)其DNA結(jié)合容量。在這種檢測(cè)方法中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物將會(huì)全部結(jié)合到薄膜上但只有生物素化反應(yīng)產(chǎn)物有金微粒附著從而發(fā)出可檢測(cè)的信號(hào)。在另一種可選擇的方法中，可以在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入鏈霉抗生物素蛋白并將混合物通過(guò)Centriflex薄膜。如果在通過(guò)薄膜的物質(zhì)中檢測(cè)不到DNA，則說(shuō)明DNA已經(jīng)存留在薄膜上，從而證明其已經(jīng)生物素化了。
在引物本身并未被標(biāo)記但可以被標(biāo)記的情況下，需要在檢測(cè)步驟前加入標(biāo)記物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用特異性針對(duì)正?；蛲蛔冃蛄械臉?biāo)記引物進(jìn)行單次PCR反應(yīng)，根據(jù)引物是特異性針對(duì)正常DNA還是突變DNA，可以通過(guò)PCR產(chǎn)物中標(biāo)記物的存在預(yù)示突變的存在或缺失。即，如果標(biāo)記引物對(duì)正常DNA有特異性，則正常DNA的PCR產(chǎn)物可以被標(biāo)記，同時(shí)突變DNA的PCR產(chǎn)物則不會(huì)被標(biāo)記，如果標(biāo)記引物對(duì)突變DNA有特異性，則正常DNA的PCR產(chǎn)物將不被標(biāo)記，同時(shí)突變DNA的PCR產(chǎn)物可以被標(biāo)記并因此被檢測(cè)到。因此雖然進(jìn)行雙重的PCR反應(yīng)可以給出更加可靠的結(jié)果，單一PCR至少可以給出突變存在或缺失的指征。
因此另一方面，本發(fā)明提供了針對(duì)核酸分子中突變的診斷型PCR方法，應(yīng)用此方法可檢測(cè)核酸樣品中突變的存在或缺失，此方法所用3′引物特異性針對(duì)正常核酸或突變核酸，其中與所述引物互補(bǔ)的核酸區(qū)在正常與突變DNA之間有一個(gè)堿基的差異，而所述引物的3′末端對(duì)應(yīng)于樣品中正常與突變DNA存在差異的位置，所述引物被標(biāo)記或可被標(biāo)記，借此檢測(cè)PCR產(chǎn)物中所述標(biāo)記物的存在或缺失。
使用特異性針對(duì)正常DNA的3′引物也至少可以進(jìn)行初步診斷。
因此本發(fā)明另一方面提供了一種診斷型PCR方法，其中待測(cè)樣品用互補(bǔ)于正常靶DNA的引物進(jìn)行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物與一段其3′端核苷酸在突變體中已突變的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸處或其上帶有標(biāo)記物或可被標(biāo)記，可對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物中所述標(biāo)記物的存在精細(xì)檢測(cè)。
通過(guò)這種方法，產(chǎn)物中可檢測(cè)標(biāo)記的缺失意味著樣品中不含有正常DNA。
檢測(cè)單個(gè)堿基突變的實(shí)例如下所示在這一實(shí)例中，用于延伸樣品3′末端的引物的3′末端與模板上突變的DNA對(duì)應(yīng)。
假定本實(shí)例的目的是確定某患者基因正常還是帶有異常的遺傳突變。
所述基因的正常DNA序列是5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’此患者的DNA似乎是5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’其中存在一個(gè)突變。本檢驗(yàn)并非必需了解患者的DNA情況。只需知道正常狀況以便診斷突變。
為了進(jìn)行PCR需要一對(duì)引物，其中一個(gè)引物在5’末端區(qū)域退火，而另一個(gè)則在3’末端區(qū)域退火。5’端引物對(duì)于有無(wú)突變的患者來(lái)說(shuō)是完全相同的，如下所示1號(hào)引物5’-ccccatg-3’對(duì)于另一個(gè)3’區(qū)域，需要一條與正常狀態(tài)匹配的引物，如下所示2號(hào)正常引物5’-aggtggg-3’如果突變已知，可以按以下所示構(gòu)建引物2號(hào)異常引物5’-aggtggt-3’為了使此方法達(dá)到預(yù)期效果，最后一個(gè)3’末端核苷酸被生物素標(biāo)記，其仍然保留在PCR反應(yīng)中延伸的能力(具有游離的3’端OH)。
所述3’末端引物如下所示2號(hào)正常引物5’-aggtgggB-3’2號(hào)異常引物5’-aggtggtB-3’(B＝生物索)使用這些引物擴(kuò)增正常DNA獲得的PCR產(chǎn)物將會(huì)是
(1號(hào)引物+2號(hào)正常引物)5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’|生物素(1號(hào)引物+2號(hào)異常引物)5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’+生物素只有用2號(hào)正常引物擴(kuò)增正常模板DNA才會(huì)得到生物素化PCR產(chǎn)物。PCR酶會(huì)從2號(hào)異常引物上將生物素去除，從而得到非生物素化產(chǎn)物。
使用以下引物擴(kuò)增異常DNA模板得到的PCR產(chǎn)物將會(huì)是(1號(hào)引物+2號(hào)異常引物)5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’|生物素(1號(hào)引物+2號(hào)正常引物)5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’結(jié)果如上所述，但正好相反。
生物素化產(chǎn)物的存在將可以說(shuō)明患者是否帶有突變。
以下對(duì)單個(gè)堿基突變所致鐮刀形細(xì)胞貧血癥的診斷型PCR實(shí)例在這個(gè)實(shí)例中，引物表示為已經(jīng)被生物素標(biāo)記。這只是可用之標(biāo)記的一個(gè)實(shí)例，并非限于此例；也可以使用其它標(biāo)記物。
正常人血紅素A1中，單元型A1β-球蛋白基因的第1外顯子(編碼部分)的DNA序列如下起始正常DNAatg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列將翻譯成
正常氨基酸序列MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…對(duì)于人類(lèi)鐮刀形細(xì)胞貧血癥，單元型Sβ-球蛋白基因的第1外顯子的DNA序列如下起始鐮刀形細(xì)胞貧血癥DNAatg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列將翻譯成鐮刀形細(xì)胞貧血癥氨基酸序列MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…對(duì)正常DNA和鐮刀形細(xì)胞貧血癥DNA的比較發(fā)現(xiàn)，單個(gè)堿基取代足以將正常血紅素基因轉(zhuǎn)變?yōu)楫惓Ｑt素基因，而后者已知可以引起嚴(yán)重的鐮刀形細(xì)胞貧血癥。Gag密碼子突變?yōu)間tg密碼子導(dǎo)致酸性氨基酸谷氨酸被非極性氨基酸纈氨酸取代。
為檢測(cè)這種突變的存在與否，分離基因組DNA，且必要時(shí)在診斷型PCR之前進(jìn)行傳統(tǒng)形式的PCR擴(kuò)增。
用于擴(kuò)增血紅素β鏈基因一部分的引物是基于EMBEL搜索程序?qū)Κ?dú)特標(biāo)示EMBL-IDHSBETGLOB′搜索后給出的DNA序列而得到的。
血紅素β鏈基因(以下表示為分隔的三聯(lián)體)之前有一個(gè)內(nèi)含子序列(內(nèi)含子1)，之后接以另一個(gè)序列(內(nèi)含子2)，這兩個(gè)內(nèi)含子均以斜體表示如下。
部分內(nèi)含子(下劃線)可用于構(gòu)建引物(見(jiàn)下)。
gcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatg gtg cac ctg act cct gaggag aag tct gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtggat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc aggggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacc...
此基因編碼序列兩側(cè)為非編碼性的內(nèi)含子；第2內(nèi)含子將上述編碼序列與處于更下游的下一部分編碼序列分開(kāi)。
為擴(kuò)增此基因的第1編碼部分以便隨后進(jìn)行診斷型PCR，可以使用例如分別與第1和第2內(nèi)含子退火的一對(duì)引物。與引物退火的序列如上以下劃線的斜體表示。
引物l5’-ctagcaacctcaaacagacacc-3’引物25’-gtaaccttgataccaacctgcc-3’這一對(duì)引物只用于PCR擴(kuò)增以獲得更多用于診斷型PCR的DNA模板，因此并不需要生物素化或任何形式的修飾。
由于已知突變的特點(diǎn)，即上述外顯子第6密碼子的單個(gè)堿基突變，為進(jìn)行診斷型PCR，設(shè)計(jì)了3個(gè)引物，它們對(duì)應(yīng)于正常和異常(鐮刀形細(xì)胞貧血癥)DNA。
對(duì)應(yīng)于正常血紅素的引物引物N5’-atg gtg cac ctg act cct ga-生物素-OH對(duì)應(yīng)于鐮刀形細(xì)胞貧血癥血紅素的引物引物S5’-atg gtg cac ctg act cct gt-生物素-OH對(duì)應(yīng)于該基因另一末端的引物引物25’-gtaaccttgataccaacctgcc-3’(這個(gè)引物可以與擴(kuò)增步驟所用的引物相同；其不需標(biāo)記或修飾)然后以第1步中的引物和樣品或PCR擴(kuò)增樣品進(jìn)行診斷型測(cè)試。
進(jìn)行了兩個(gè)PCR反應(yīng)a)使用引物N+引物2的PCRb)使用引物S+引物2的PCR然后如上述檢測(cè)PCR反應(yīng)a)和b)所得產(chǎn)物中是否存在生物素。
檢測(cè)兩個(gè)PCR反應(yīng)a)和b)的結(jié)果為以下四種可能之一。
本方法也可以用于診斷多堿基突變，如下所示，同樣以鐮刀形細(xì)胞貧血癥為例在β球蛋白基因的第1外顯子中存在一個(gè)多堿基突變(以粗體下劃線表示)，其DNA序列如下所示atg gtg cac ctg act cctaacgag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列將翻譯成以下氨基酸序列MVHLTPNEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…諸如引物N等上述引物可用于揭示是否存在正常基因。為了檢測(cè)潛在突變的存在需要可以檢測(cè)這種突變的引物。
其中一個(gè)可用的引物對(duì)應(yīng)于突變血紅素如下5′-atggtgcacctgactcctaac-生物素-OH這條引物將會(huì)準(zhǔn)確鑒定出第6密碼子中的′acc′突變。
另一條可用的引物如下5′-atggtgcacctgactccta-生物素-OH這種引物可用來(lái)鑒定第6密碼子中以′a′堿基起始的所有突變。
以正常引物N和一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)于(即互補(bǔ)于)突變序列的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
這一方法可以用于正常基因的任何已知序列，血紅素鐮刀形細(xì)胞突變只是其中一例。當(dāng)群體中常見(jiàn)的突變已知時(shí)，可以使用多種引物以明確查明所存在的突變。
本發(fā)明方法的另一用途是從重組分子中切割并分離所需DNA片段以便進(jìn)一步操作。其中一個(gè)相關(guān)方面是切割并分離載體DNA以便?？寺〖捌渌锛夹g(shù)性方法中需要能獲得高質(zhì)量線性化載體DNA片段的有效方法。正如業(yè)內(nèi)已知的，質(zhì)粒和病毒等載體中除含有調(diào)控復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的相應(yīng)元件外，還含有一或多個(gè)克隆位點(diǎn)以便插入異源性DNA并擴(kuò)增或表達(dá)。正如限制酶可用于將異源片段插入克隆載體以制備重組載體，限制酶也可用于切割異源性片段或載體元件以便進(jìn)一步遺傳學(xué)操作。這類(lèi)載體包含環(huán)狀DNA分子。這些包括一個(gè)填充片段，通常還有一個(gè)多聚接頭以及一個(gè)含前述調(diào)控序列的片段。在一種方法中，插入了異源性DNA片段的重組載體通過(guò)限制酶消化以切割插入的DNA片段，這一過(guò)程將會(huì)產(chǎn)生線性DNA分子的混合物，包括載體本身的填充片段，插入片段和部分切割的重組DNA分子。本發(fā)明方法用于當(dāng)需要切除異源插入片段之重組DNA分子中的填充(或載體)元件包含特異性蛋白識(shí)別序列，如AP-1識(shí)別序列時(shí)。在本發(fā)明方法中，限制酶消化產(chǎn)物在溶液中與此核酸特異性蛋白接觸，此例中應(yīng)為AP-1，然后使溶液通過(guò)蛋白選擇性膜從而捕獲與AP-1結(jié)合的核酸分子，只有那些含有異源性插入DNA因此沒(méi)有AP-1識(shí)別序列的DNA分子存留于溶液中。
在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本方法可用來(lái)分離載體本身的線性化形式，即通過(guò)限制酶消化而線性化并已切除填充片段的載體以便進(jìn)一步操作。這類(lèi)載體片段可隨后用于插入并連接異源性DNA，環(huán)化后又可繼續(xù)使用，如轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
在一實(shí)例中，填充片段是或包含帶有唯一限制酶識(shí)別位點(diǎn)的多聚接頭。該載體用所述酶之一切割而產(chǎn)生線性化分子。然后使用前述酶學(xué)技術(shù)可以在這些線性分子末端進(jìn)行標(biāo)記。為使后續(xù)操作簡(jiǎn)化，優(yōu)選此唯一切割酶是可產(chǎn)生3′突出端的限制酶。此時(shí)，線性載體分子可以通過(guò)加入標(biāo)記的核苷酸如利用TdT加入生物素化核苷酸而進(jìn)行末端標(biāo)記。如果所述酶產(chǎn)生5′突出端，則需要再加入Klenow片段以延伸3′末端。我們發(fā)現(xiàn)這種方法效率較高，特別是當(dāng)使用了大于10μg的較大量DNA時(shí)。在標(biāo)記了線性載體后，進(jìn)一步用一個(gè)或多個(gè)限制酶消化，優(yōu)選在最初切割位點(diǎn)兩側(cè)各有一個(gè)的填充片段中具有唯一切割位點(diǎn)的限制酶。這樣可以對(duì)末端片段進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)本發(fā)明方法從填充片段中分離出未標(biāo)記的所需片段。因此當(dāng)樣品通過(guò)濾膜時(shí)，充分切割的載體將會(huì)通過(guò)薄膜。
在進(jìn)一步的應(yīng)用中，本發(fā)明的方法可用于從連接混合物中去除非復(fù)制型連接產(chǎn)物。使用DNA連接酶對(duì)兩個(gè)DNA片段進(jìn)行共價(jià)連接是生物技術(shù)的中心環(huán)節(jié)。一般來(lái)說(shuō)，連接反應(yīng)包括將小DNA片段或插入片段插入到較大的載體DNA中。確保最終的連接產(chǎn)物被正確的環(huán)化是非常重要的，因?yàn)橹挥羞@樣才能避免其在轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞如細(xì)菌后不被降解。因此，線性連接產(chǎn)物是沒(méi)有用途的，而且在宿主細(xì)菌中也無(wú)法存在。不幸的是，連接酶反應(yīng)的效率并不高，通常只有80％的線性產(chǎn)物可連接。這就降低了大腸桿菌攝取環(huán)狀復(fù)制型連接產(chǎn)物的效率。從這個(gè)角度看，線性產(chǎn)物因此可以看成是連接反應(yīng)的污染物或副產(chǎn)物。如果能夠在轉(zhuǎn)化前從反應(yīng)混合物中去除不需要的線性連接產(chǎn)物，那將會(huì)提高連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率。然而現(xiàn)在沒(méi)有可行的方法。由于環(huán)狀復(fù)制型連接產(chǎn)物的多形性特點(diǎn)，因而其不能通過(guò)切割從凝膠中回收。
因此本發(fā)明另一方面提供了一種將樣品中線性核酸分子與環(huán)狀核酸分子分離的方法，該方法包括在線性核酸分子末端引入標(biāo)記物，該標(biāo)記可通過(guò)直接與基質(zhì)作用或通過(guò)其結(jié)合配對(duì)物間接與基質(zhì)作用而固定于基質(zhì)上，使樣品與基質(zhì)接觸，或當(dāng)所述標(biāo)記物與基質(zhì)是間接相互作用時(shí)，使樣品與該標(biāo)記物的簡(jiǎn)化配對(duì)物以及與基質(zhì)接觸，從而將上述被標(biāo)記的線性核酸分子固定于基質(zhì)上。
本發(fā)明方法可用于此例，因?yàn)檫B接混合物中除目的環(huán)狀分子以外的所有DNA分子都有游離末端，以及暴露的反應(yīng)性磷酸基團(tuán)和羥基。它們可通過(guò)前述酶學(xué)方法使用標(biāo)記的核苷酸如生物素化核苷酸進(jìn)行末端標(biāo)記。環(huán)狀分子由于沒(méi)有反應(yīng)性3′羥基可供標(biāo)記附著因而不能被標(biāo)記。這樣，被標(biāo)記的線性分子可以被基質(zhì)捕獲從而與存留在溶液中的環(huán)化分子分離，這些環(huán)狀分子就可以用于后續(xù)步驟如轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所述方法可用于噬菌體顆粒如λ噬菌體的體外包裝，如在構(gòu)建基因文庫(kù)以及噬菌體展示文庫(kù)時(shí)。噬菌體既可以在體外包裝也可以在細(xì)菌內(nèi)包裝，體外包裝時(shí)將病毒DNA與各種病毒衣殼蛋白成分在體外混合從而引發(fā)病毒裝配，細(xì)菌中包裝時(shí)病毒DNA被引入適當(dāng)細(xì)菌，由細(xì)菌提供病毒裝配所必需的蛋白成分。體外包裝比細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法更快捷，因?yàn)轶w外包裝可以在若干分鐘內(nèi)完成，而細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法則需要1-2天。然而與細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法相比，體外包裝的效率較低，特別是當(dāng)被包裝的噬菌體DNA已經(jīng)被操作過(guò)，例如已經(jīng)插入了異源性DNA的λDNA，有實(shí)驗(yàn)表明與未被修飾的線性λ病毒相比，經(jīng)分子操作后得到的線性DNA的包裝效率可以減少103/μg DNA。這種效率的降低至少部分是由于DNA操作中副產(chǎn)物的存在。因此如果包裝前將這些副產(chǎn)物去除較有利，因?yàn)檫@樣可提高體外包裝的效率，使這種體外包裝方法成為更快捷且更有效的綜合方法從而得以取代細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明方法可通過(guò)使用標(biāo)記系統(tǒng)標(biāo)記不需要的片段并使其從所需連接產(chǎn)物中分離而實(shí)現(xiàn)上述設(shè)想。
本方法得益于噬菌體基因組中存在的cos位點(diǎn)。在λ噬菌體基因組的兩個(gè)末端都有一DNA單鏈互補(bǔ)區(qū)域，當(dāng)線性λDNA插入到細(xì)菌細(xì)胞后，這兩個(gè)區(qū)域相互退火形成一個(gè)環(huán)形基因組，這種環(huán)形基因組可以復(fù)制，并且不象線性DNA那樣易被細(xì)菌核酸內(nèi)切核酸酶降解。
在這個(gè)實(shí)施方案中，在將異源DNA克隆到λ載體之前，首先通過(guò)如加入雙脫氧核苷酸以及適當(dāng)DNA聚合酶如klenow片段來(lái)封閉λ載體的3′末端，klenow片段可以有效的去除3′cos位點(diǎn)的反應(yīng)性O(shè)H而只留下非反應(yīng)性氫，這樣的末端既不能被延伸也不能被標(biāo)記。因此在克隆反應(yīng)結(jié)束后，將DNA分子標(biāo)記上只能加入到3′OH基團(tuán)的標(biāo)記物。這樣，只有正確連接的產(chǎn)物沒(méi)有3′OH基團(tuán)且不能被標(biāo)記；所有其它的DNA分子，包括已切割的載體片段以及將要克隆的片段都有反應(yīng)性3′OH基團(tuán)而可以被標(biāo)記。由于只有正確連接的DNA分子沒(méi)有被標(biāo)記，因而可以使用本文所述的任何方法將這些正確連接的DNA分子很容易地從不需要的副產(chǎn)物中分離出來(lái)。
因此本發(fā)明另一方面提供了一種重組噬菌體體外包裝的方法，其中載體DNA用一個(gè)或多個(gè)限制酶切割，載體DNA的3′OH基團(tuán)被封閉，載體和將被插入的DNA在適合DNA片段連接的條件下相接觸，連接產(chǎn)物用可以附著于反應(yīng)性3′OH基團(tuán)的組分標(biāo)記，隨后分離標(biāo)記和未標(biāo)記的分子。
在本文中，封閉3′OH基團(tuán)是指3′OH基團(tuán)缺失、或被保護(hù)或經(jīng)某些方式被修飾而因此不能進(jìn)一步被延伸。
在一個(gè)方便的實(shí)施方案中，標(biāo)記物是生物素，其可以通過(guò)使用酶學(xué)方法如用klenow片段以生物素化核苷酸的形式加入到反應(yīng)性3′OH基團(tuán)中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，首先使用諸如雙脫氧核苷酸封閉載體的3′末端，然后使用在載體內(nèi)部只有單一識(shí)別位點(diǎn)的酶切割載體，此識(shí)別位點(diǎn)應(yīng)位于克隆所用的兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)之間。EcoRI就是這樣的限制酶的一個(gè)實(shí)例。這個(gè)起始限制酶切割的目的在于通過(guò)標(biāo)記去除所有在隨后的步驟中不被切割的載體DNA分子。然后使用兩個(gè)分別在載體中只有唯一切割位點(diǎn)的酶在兩個(gè)位置切割載體從而形成克隆位點(diǎn)。在產(chǎn)生用于克隆的載體片段以外，也將獲得許多可通過(guò)標(biāo)記(例如當(dāng)標(biāo)記為生物素時(shí)通過(guò)上述鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合)去除的被部分切割的限制酶切產(chǎn)物。然后將用于克隆的DNA片段連接到λ載體DNA中。為了去除所有不需要的反應(yīng)產(chǎn)物，所有暴露的3′末端均使用例如生物素進(jìn)行標(biāo)記。正確的連接產(chǎn)物因沒(méi)有3′OH基團(tuán)而不能被標(biāo)記，從而可以通過(guò)本文所述方法從所有標(biāo)記分子中分離出來(lái)。
現(xiàn)在參考以下非限制性的實(shí)施對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的介紹。
實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)帶有5′突出型DNA末端的限制酶切DNA片段進(jìn)行末端標(biāo)記試劑5μg經(jīng)HindIII切割后的λDNA(Gibco 15612-13)40個(gè)單位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μlDNA聚合酶I，Klenow大片段的緩沖液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)5 nmol dATP (Gibco 10216-018)5 nmol dTTP(Gibco 10219-012)5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)蒸餾水100μl反應(yīng)混合物在25℃保溫45分鐘。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
在Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中加入反應(yīng)混合物并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
在1％瓊脂糖(FMC#50080)凝膠電泳中分析洗脫物，按Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙錠染色。
在凝膠中未見(jiàn)λDNA的痕跡，表明有鏈霉抗生物素蛋白附著的末端帶標(biāo)記的線性分子已存留在薄膜上。
實(shí)施例2有鈍端和3′突出端的DNA片段的末端標(biāo)記試劑
2μg Low DNA MassTM序列梯(Gibco 10068-013)40個(gè)單位末端化雙脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，重組型(Gibco 10533-016)20μl末端化雙脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液，重組型(Gibco)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)蒸餾水100μl反應(yīng)混合物在37℃保溫45分鐘。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
在Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中加入反應(yīng)混合物并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，按Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙錠染色。
在凝膠中未見(jiàn)λDNA的痕跡，表明有鏈霉抗生物素蛋白附著的末端帶標(biāo)記的線性分子已存留在薄膜上。
實(shí)施例3通過(guò)去除填充片段來(lái)制備載體DNA使用Qiagen maxiprep(Qiagen#12166)制備含有待測(cè)插入片段的Cantab5E載體(Pharmacia-Amersham 279401-01)Cantab 5E載體含有SfiI、NotI和BsmI的唯一限制位點(diǎn)，其中SfiI和BsmI位點(diǎn)位于NotI位點(diǎn)的兩側(cè)。
試劑25μg上述的Cantab 5E載體40個(gè)單位的NotI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)的緩沖液用水補(bǔ)平至50μl反應(yīng)混合物在37℃保溫1小時(shí)。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，隨后加入40個(gè)單位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μlDNA聚合酶I，Klenow大片段的緩沖液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)用蒸餾水補(bǔ)平至100μl反應(yīng)混合物在25℃保溫45分鐘。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)。
將反應(yīng)混合物樣品(5μg)稀釋到50μl并加入到一個(gè)Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，按Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙錠染色。
在凝膠中未見(jiàn)載體DNA的痕跡，表明所有DNA均已存留在薄膜上。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，對(duì)每一等分試樣處理如下(1)33μl反應(yīng)混合物置于一個(gè)單獨(dú)的試管(1)中，其中再加入20個(gè)單位的BsmI(Boehringer-Mannheim 1292315)5μl BsmI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1292315)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl反應(yīng)混合物在65℃保溫1小時(shí)。
(2)33μl反應(yīng)混合物置于一個(gè)單獨(dú)的試管(2)中，其中再加入20個(gè)單位的SfiI(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)
用蒸餾水補(bǔ)平至50μl反應(yīng)混合物在50℃保溫1小時(shí)。
(3)33μl反應(yīng)混合物置于一個(gè)單獨(dú)的試管(3)中，其中再加入20個(gè)單位的SfiI(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl反應(yīng)混合物在50℃保溫1小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HRMicroSpin柱，隨后在反應(yīng)混合物中加入以下試劑20個(gè)單位的BsmI(Boehringer-Mannheim 1292315)5μl BsmI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1292315)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl反應(yīng)混合物在65℃保溫1小時(shí)。
上述3種反應(yīng)混合物的每一種分別通過(guò)S400 HR MicroSpin柱純化，在每種混合物中加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將每種反應(yīng)混合物樣品分別加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產(chǎn)商所述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
3種反應(yīng)混合物于1％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
只有來(lái)自于第3個(gè)反應(yīng)樣品中的純化的載體DNA在凝膠中可見(jiàn)，樣品1和2沒(méi)有可檢測(cè)到的DNA痕跡。這表明只有正確限制性切割的載體通過(guò)了薄膜。
實(shí)施例4生物素化PCR片段的限制使用高質(zhì)量生物素化PCR引物擴(kuò)增scFV構(gòu)建體而獲得PCR產(chǎn)物。
上述scFV構(gòu)建體是800堿基對(duì)的片段，其在40和760位堿基處分別有SfiI和NotI的唯一位點(diǎn)。
將1μg的PCR產(chǎn)物與2μg的鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)混合，并在25℃保溫5分鐘。
將反應(yīng)混合物加入到一個(gè)Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
檢測(cè)不到任何PCR產(chǎn)物的痕跡，表明所有的PCR產(chǎn)物均已存留在薄膜上。
然后將各等分試樣處理如下(1)3μg的PCR產(chǎn)物加入到一個(gè)單獨(dú)的試管(1)中，該試管中有20個(gè)單位的NotI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI緩沖液用蒸餾水補(bǔ)平至50μl在37℃保溫1小時(shí)。
(2)3μg的另一份PCR產(chǎn)物加入到一個(gè)單獨(dú)的試管(2)中，該試管中有20個(gè)單位的SfiI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl在50℃保溫1小時(shí)。
(3)3μg的另一份PCR產(chǎn)物加入到一個(gè)單獨(dú)的試管(3)中，該試管中有20個(gè)單位的SfiI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl反應(yīng)混合物在50℃保溫1小時(shí)。
將反應(yīng)混合物通過(guò)S400 MicroSpin柱，再加入以下試劑20個(gè)單位的NotI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1014714)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl并在37℃保溫1小時(shí)。
上述3種反應(yīng)混合物的每一種分別通過(guò)S400 HRMicroSpin柱純化，在每種混合物中加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將每種反應(yīng)混合物樣品分別加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于1％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
只有來(lái)自于第3個(gè)反應(yīng)樣品中的純化的PCR產(chǎn)物在凝膠中可見(jiàn)，樣品1和2沒(méi)有可檢測(cè)到的DNA痕跡。這表明含有末端的片段存留在薄膜上，而內(nèi)部片段通過(guò)了薄膜。
實(shí)施例5非生物素化PCR片段的限制性切割使用高質(zhì)量生物素化PCR引物擴(kuò)增scFV構(gòu)建體而獲得PCR產(chǎn)物。
1μg的PCR產(chǎn)物與2μg的鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)混合，并在25℃保溫5分鐘。
將反應(yīng)混合物加入到一個(gè)Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
在凝膠中檢測(cè)到PCR產(chǎn)物，表明PCR產(chǎn)物并未存留在薄膜上。
在3μgPCR產(chǎn)物中加入以下試劑40個(gè)單位的末端化雙脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，重組型(Gibco 10533-016)20μl末端化雙脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液，重組型(Gibco)5nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)用蒸餾水補(bǔ)平至100μl37℃保溫45分鐘。
將反應(yīng)混合物通過(guò)S200 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將反應(yīng)混合物加入到Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
在凝膠中檢測(cè)不到PCR產(chǎn)物，表明PCR產(chǎn)物已存留在薄膜上。
然后對(duì)3種等分試樣處理如下(1)3μg的PCR產(chǎn)物加入到一個(gè)單獨(dú)的試管(1)中，該試管中有20個(gè)單位的NotI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI緩沖液用蒸餾水補(bǔ)平至50μl并在37℃保溫1小時(shí)。
(2)3μg的另一份PCR產(chǎn)物加入到一個(gè)單獨(dú)的試管(2)中，該試管中有20個(gè)單位的SfiI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl并在50℃保溫1小時(shí)。
(3)3μg的另一份PCR產(chǎn)物加入到一個(gè)單獨(dú)的試管(3)中，該試管中有20個(gè)單位的SfiI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl并在50℃保溫1小時(shí)。
將此種反應(yīng)混合物通過(guò)S400 MicroSpin柱，再加入以下試劑20個(gè)單位的NotI內(nèi)切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1014714)
用蒸餾水補(bǔ)平至50μl并在37℃保溫1小時(shí)。
上述3種反應(yīng)混合物的每一種分別通過(guò)S400 HR MicroSpin柱純化，在每種混合物中加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將每種反應(yīng)混合物樣品分別加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于1％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
只有來(lái)自于第3個(gè)反應(yīng)樣品中的純化的PCR產(chǎn)物在凝膠中可見(jiàn)，樣品1和2沒(méi)有可檢測(cè)到的DNA的痕跡，這表明含有末端的片段存留在薄膜上，而內(nèi)部片段通過(guò)了薄膜。
實(shí)施例6從環(huán)狀和線性DNA分子的群體中去除線性DNA環(huán)狀DNA起始物質(zhì)是pUC19克隆載體，其在多聚接頭克隆位點(diǎn)處有唯一的HindIII位點(diǎn)。
將5μg pUC19載體DNA(New England Biolabs#301-1S)加入40個(gè)單位的HindIII限制酶(New England Biolabs#104S)5μl HindIII緩沖液(New England Biolabs)用蒸餾水補(bǔ)平至50μl并在37℃保溫1小時(shí)。
將反應(yīng)混合物通過(guò)S400 HR MicroSpin柱，然后加入到5μl pUC19載體DNA(New England Biolabs#301-1S)40個(gè)單位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μl DNA聚合酶I，Klenow大片段的緩沖液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 195 18-018)5 nmol dATP(Gibco 10216-018)5 nmol dTTP(Gibco 10219-012)
5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)用蒸餾水補(bǔ)平至100μl反應(yīng)混合物在25℃下保溫45分鐘。
將反應(yīng)混合物通過(guò)S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將反應(yīng)混合物加入到Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產(chǎn)商所描述的方法使其擴(kuò)散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉(zhuǎn)180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于1％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，按Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙錠染色。
凝膠(FMC#50080)上只檢測(cè)到環(huán)狀載體，表明環(huán)狀載體通過(guò)了薄膜，而線性DNA存留在薄膜上。
實(shí)施例7使用預(yù)先切割的λ載體體外包裝λ噬菌體使用預(yù)切割的λ載體Uni-ZAPXR(Stratagene，產(chǎn)品目錄號(hào)236612)。
試劑10μg預(yù)切割的λ載體雙脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸(終濃度為200μM)雙脫氧腺苷三磷酸(終濃度為200μM)Klenow片段(10個(gè)單位)NEB EcoPol緩沖液總體積為30μl反應(yīng)混合物在24℃保溫20分鐘。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱以去除蛋白和核苷酸，純化后的反應(yīng)混合物中加入200ng預(yù)先制備的DNA插入片段T4 DNA連接酶NEB T4連接酶的緩沖液體積為40μl反應(yīng)混合物在16℃保溫48小時(shí)。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱，純化后的反應(yīng)混合物中加入生物素化dCTP(5 nmol)生物素化dATP(5 nmol)dTTP(終濃度為200μM)dGTP(終濃度為200μM)Klenow片段(10個(gè)單位)NEB緩沖液體積為50μl反應(yīng)混合物在24℃保溫20分鐘。
將反應(yīng)混合物通過(guò)S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，并按照實(shí)施例2中的方法在純化的反應(yīng)混合物中加入鏈霉抗生物素蛋白并將反應(yīng)混合物加入到Centriflex柱中。
進(jìn)一步的操作應(yīng)按照Stratagene公司提供的包裝插入片段的操作指導(dǎo)進(jìn)行。對(duì)細(xì)菌板的嗜菌斑計(jì)數(shù)顯示，所述連接比標(biāo)準(zhǔn)方法得到更多的活性噬菌體。
實(shí)施例8使用未切割的λ載體體外包裝λ噬菌體使用含有一個(gè)待測(cè)插入片段的未切割的λ載體Uni-ZAPXR(Stratagene)。
試劑5μg未切割的λ載體雙脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸(終濃度為200μM)雙脫氧腺苷三磷酸(終濃度為200μM)Klenow片段(10個(gè)單位)NEB緩沖液總體積為20μl反應(yīng)混合物在24℃保溫20分鐘。此步驟將封閉載體的3′末端。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱，在純化后的反應(yīng)混合物中加入EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶(20個(gè)單位)
NEB EcoRI緩沖液總體積為30μl。
反應(yīng)混合物在37℃保溫120分鐘。此步驟將載體消化成適當(dāng)?shù)牡乳L(zhǎng)片段。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱，在純化后的反應(yīng)混合物中加入生物素化dATP(5 nmol)dTTP(終濃度為200μM)dCTP(終濃度為200μM)dGTP(終濃度為200μM)Klenow片段(10個(gè)單位)NEB緩沖液體積為40μl反應(yīng)混合物在24℃保溫30分鐘。此反應(yīng)中，生物素將標(biāo)記EcoRI消化的λ載體。
在反應(yīng)混合物中加入NEB 2緩沖液中的Xbal和Xhol限制性內(nèi)切核酸酶(各20個(gè)單位)，總體積為50μl。此反應(yīng)將形成克隆位點(diǎn)。
反應(yīng)混合物在37℃保溫60分鐘。
將反應(yīng)混合物通過(guò)S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，并按照實(shí)施例2中的方法在純化的反應(yīng)混合物中加入鏈霉抗生物素蛋白并加入到Centriflex柱中。此步驟中，鏈霉抗生物素蛋白將結(jié)合未被切割的載體。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱，純化后的反應(yīng)混合物中加入200 ng預(yù)先制備的DNA插入片段T4 DNA連接酶NEB T4連接酶的緩沖液體積為60μl反應(yīng)混合物在16℃保溫48小時(shí)。
將反應(yīng)混合物通過(guò)一個(gè)S400 HR MicroSpin柱，純化后的反應(yīng)混合物中加入生物素化dCTP(5 nmol)生物素化dATP(5 nmol)dTTP(終濃度為200μM)dGTP(終濃度為200μM)Klenow片段(10個(gè)單位)NEB緩沖液體積為70μl反應(yīng)混合物在24℃保溫20分鐘。此反應(yīng)中，所有以前未封閉的暴露的3′OH末端可以被標(biāo)記。
將反應(yīng)混合物通過(guò)S400 HR MicroSpin柱，并按照實(shí)施例2中的方法在純化的反應(yīng)混合物中加入鏈霉抗生物素蛋白并加入到Centriflex柱中。此步驟將標(biāo)記分子從未標(biāo)記分子中分離出來(lái)。
進(jìn)一步的操作應(yīng)按照Stratagene公司提供的包裝插入片段的操作指導(dǎo)進(jìn)行。對(duì)細(xì)菌的嗜菌斑計(jì)數(shù)顯示，所述連接比標(biāo)準(zhǔn)方法得到更多的活性噬菌體。
實(shí)施例9純化再擴(kuò)增的PCR反應(yīng)a)修飾Cantab5E載體(Pharmacia)從而獲得Cantab5EBamHI(1)在100μl的總反應(yīng)體積中加入10個(gè)單位的BamHI和10μl NEBBamHI緩沖液以切割Cantab5E載體(1μg)，體系在37℃保溫1小時(shí)。在1％瓊脂糖凝膠中分離反應(yīng)混合物并用普通凝膠提取方法分離出分子量最大的片段。在分離所得大片段500 ng中加入1 Weiss單位的T4 DNA連接酶和5μl NEB連接酶緩沖液并使總反應(yīng)體積為50μl，體系在24℃保溫1小時(shí)。用電穿孔的方法將連接混合物轉(zhuǎn)化入TGI細(xì)胞中，并將細(xì)菌細(xì)胞在含氨芐青霉素(100μg/ml)的瓊脂板上保溫過(guò)夜。分離形成克隆的細(xì)菌中的DNA并通過(guò)大小和限制性內(nèi)切核酸酶切割驗(yàn)證其只含一個(gè)BamHI限制位點(diǎn)。此DNA命名為Cantab5EBamHI(1)。
b)使用修飾后的載體Cantab5EBamHI(1)為模板進(jìn)行PCR試劑
10μg Cantab5EBamHI(1)載體dNTP混合物(由Finnzyme提供；終濃度為200μM)10μl expand高保真酶的緩沖液(Boehringer-Mannheim AG)30 pmol與唯一的afiIII限制位點(diǎn)部分重疊的引物1和30 pmol與唯一的BamHI限制位點(diǎn)部分重疊的引物2用蒸餾水補(bǔ)平至100μl在加入1μl expand高保真酶(Boehringer-Mannheim AG)之前將PCR反應(yīng)物96℃加熱2分鐘。
在熱循環(huán)僅上對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，條件如下-首先96℃2分鐘，然后按如下方式進(jìn)行20個(gè)循環(huán)-55℃，30秒-72℃，80秒-96℃，30秒。
瓊脂糖凝膠電泳后用溴化乙錠染色的方法鑒定PCR產(chǎn)物。通常可以觀察到不需要的副產(chǎn)物。
將熱循環(huán)反應(yīng)混合物通過(guò)S400 HR MicroSpin柱。
使用限制性內(nèi)切核酸酶AflIII和BamHI以常規(guī)操作對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，隨后加入鏈霉抗生物素蛋白并將反應(yīng)混合物加入到Centriflex柱中(如實(shí)施例2)。在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中只能觀察到正確切割的PCR產(chǎn)物，因?yàn)椴恍枰碾s質(zhì)存留在蛋白結(jié)合基質(zhì)上。
實(shí)施例10在對(duì)鐮刀形細(xì)胞貧血癥的診斷型PCR中使用含生物素的DNA正常人血紅素A1中單元型A1β-球蛋白基因的第1外顯子(編碼部分)以如下所示的DNA序列開(kāi)始正常DNAatg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…上述核酸序列將翻譯成正常氨基酸序列MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…
對(duì)于人類(lèi)鐮刀形細(xì)胞貧血癥，單元型Sβ-球蛋白基因的第1外顯子以如下所示的DNA序列開(kāi)始鐮刀形細(xì)胞貧血癥DNAatg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…上述核酸序列將翻譯成鐮刀形細(xì)胞貧血癥氨基酸序列MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…對(duì)正常DNA和鐮刀形細(xì)胞貧血癥DNA的比較發(fā)現(xiàn)，單個(gè)堿基取代足以將正常血紅素基因轉(zhuǎn)變?yōu)楫惓Ｑt素基因，而后者已知可以引起嚴(yán)重的鐮刀形細(xì)胞貧血癥。Gag密碼子突變?yōu)間tg密碼子導(dǎo)致酸性氨基酸谷氨酸被非極性氨基酸纈氨酸取代。
為檢測(cè)這種突變的存在與否，分離基因組DNA，且必要時(shí)在診斷型PCR之前進(jìn)行傳統(tǒng)形式的PCR擴(kuò)增。
實(shí)施例10(a) 患者DNA的分離用商品化試劑盒(GFX Genomic Blood DNA純化試劑盒；Pharmacia-Amersham #27-9603-01)按照生產(chǎn)商的建議從患者血液樣本中分離基因組DNA。
如果獲得了足夠的DNA，可以直接進(jìn)行實(shí)施例10c中的步驟。如果沒(méi)有獲得足夠的DNA，需擴(kuò)增部分的血紅素β鏈基因(實(shí)施例10b)。
實(shí)施例10(b)擴(kuò)增步驟(可選，材料不足時(shí)必需)將實(shí)施例10a分離得到的DNA擴(kuò)增以增加可用于進(jìn)一步操作的DNA的量，如下所示。
250 ng基因組DNA10μl expand高保真酶的緩沖液20 nmol dNTP各20 pmol的兩種引物(引物1和引物2；見(jiàn)下)用蒸餾水補(bǔ)平至100μl3個(gè)單位的Expand高保真PCR酶混合后，在以下標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行30輪PCR
96℃熱起始56℃退火30秒72℃聚合1分鐘96℃變性30秒用于擴(kuò)增血紅素β鏈基因一部分的引物是基于EMBEL搜索程序?qū)Κ?dú)特標(biāo)示EMBL-IDHSBETGLOB′搜索后給出的DNA序列而得到的。
血紅素β鏈基因(以下表示為分隔的三聯(lián)體)之前有一個(gè)內(nèi)含子序列(內(nèi)含子1)，之后接以另一個(gè)序列(內(nèi)含子2)，這兩個(gè)內(nèi)含子均以斜體表示如下。
部分內(nèi)含子(下劃線)可用于構(gòu)建引物(見(jiàn)下)。
gcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatg gtg cac ctg act cct gaggag aag tct gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtggat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc aggggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacc...
此基因編碼序列兩側(cè)為非編碼性的內(nèi)含子；第2內(nèi)含子將上述編碼序列與處于更下游的下一部分編碼序列分開(kāi)。
為擴(kuò)增此基因的第1編碼部分以便隨后進(jìn)行診斷型PCR，可以使用例如分別與第1和第2內(nèi)含子退火的一對(duì)引物。與引物退火的序列如上以下劃線的斜體表示。
引物15′-ctagcaacctcaaacagacacc-3′引物25′-gtaaccttgataccaacctgcc-3′這一對(duì)引物只用于PCR擴(kuò)增以獲得更多用于診斷型PCR的DNA模板，因此并不需要生物素化或任何形式的修飾。
實(shí)施例10c 診斷型PCR步驟1-引物的構(gòu)建由于已知突變的特點(diǎn)，即上述外顯子第6密碼子的單個(gè)堿基突變，為進(jìn)行診斷型PCR，設(shè)計(jì)了3個(gè)引物，它們對(duì)應(yīng)于正常和異常(鐮刀形細(xì)胞貧血癥)DNA。
對(duì)應(yīng)于正常血紅素的引物
引物N5′-atg gtg cac ctg act cct ga-生物素-OH對(duì)應(yīng)于鐮刀形細(xì)胞貧血癥血紅素的引物引物S5′-atg gtg cac ctg act cct gt-生物素-OH對(duì)應(yīng)于該基因另一末端的引物引物25′-gtaaccttgataccaacctgcc-3′(這個(gè)引物可以與擴(kuò)增步驟所用的引物相同；其不需標(biāo)記或修飾)步驟2-使用步驟1的引物和實(shí)施例10b的PCR產(chǎn)物進(jìn)行診斷型檢測(cè)在與實(shí)施例10b相同的條件下進(jìn)行了兩個(gè)PCR反應(yīng)a)使用引物N+引物2的PCR100 ng實(shí)施例10b的PCR產(chǎn)物DNA10μl expand高保真緩沖液20 nmol dNTP各20 pmol的擴(kuò)增引物(引物N和引物2)3個(gè)單位的Expand高保真PCR酶用水補(bǔ)平至100μlb)使用引物S+引物2的PCR除使用擴(kuò)增引物AB代替引物N外，其它均與PCR反應(yīng)(a)相同。
然后按照實(shí)施例1中所述方法，使用S400HR MicroSpin柱純化由PCR反應(yīng)a)和b)獲得的PCR產(chǎn)物。然后按照實(shí)施例1中所述的方法通過(guò)centriflex薄膜檢測(cè)產(chǎn)物中是否存在生物素。將反應(yīng)混合物分為兩部分。在9/10的反應(yīng)混合物中加入過(guò)量的鏈霉抗生物素蛋白(5μg)，并按照實(shí)施例1中所述方法在25℃下保溫5分鐘，然后加到一張centriflex薄膜上。按照實(shí)施例1中所述的方法，在瓊脂糖凝膠中分析收集到的洗脫物中是否存在DNA產(chǎn)物。另1/10未與鏈霉抗生物素蛋白接觸的反應(yīng)混合物作為對(duì)照樣品于瓊脂糖凝膠中平行電泳。
檢測(cè)兩個(gè)PCR反應(yīng)a)和b)的結(jié)果為以下四種可能之一。
本方法也可以用于診斷多堿基突變，如下所示，同樣以鐮刀形細(xì)胞貧血癥為例實(shí)施例11對(duì)鐮刀形細(xì)胞貧血癥的診斷型PCR(多堿基突變)在β球蛋白基因的第1外顯子中存在一個(gè)多堿基突變(以粗體下劃線表示)，其DNA序列如下所示atg gtg cac ctg act cctaacgag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列將翻譯成以下氨基酸序列MVHLTPNEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…雖然有3個(gè)堿基發(fā)生改變，但可用類(lèi)似于實(shí)施例10的方法檢測(cè)突變。
如實(shí)施例10，用引物N揭示是否存在正?；?。為了檢測(cè)潛在存在的突變構(gòu)建了兩個(gè)引物。
對(duì)應(yīng)于突變的血紅素的引物如下所示引物AB 2a5′-atggtgcacctgactcctaac-生物素-OH該引物將會(huì)準(zhǔn)確鑒定出第6密碼子中的′acc′突變。
第2個(gè)引物為引物AB 2b5′-atggtgcacctgactccta-生物素-OH此引物可鑒定出第6密碼子中以′a′堿基起始的所有突變。
在與實(shí)施例10相同的條件下，以正常引物N和一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)于(即互補(bǔ)于)突變序列的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
這一方法可以用于正?；虻娜魏我阎蛄?，血紅素鐮刀形細(xì)胞突變只是其中一例。當(dāng)群體中常見(jiàn)的突變已知時(shí)，可以使用多種引物以明確查明所存在的突變。
實(shí)施例12-22重復(fù)實(shí)施例1-11，只是用帶有NycoCard的蛋白結(jié)合薄膜代替centriflex柱以去除或分離帶有生物素標(biāo)記并與鏈霉抗生物素蛋白形成復(fù)合體的DNA分子。
序列表<110>Nycomed Pharma ASIhle，OysteinMichaelsen，Terje EinarJohne，BeritGrant，Anne R<120>將核酸分離成不同群體的方法<130>28.69235/001<140>PCT/GB99/03995<141>1999-11-30<150>GB9826247.0<151>1998-11-30<160>26<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述BamHI引物的靶片段<400>1tttactggat cctag 15<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述AsnI引物的靶片段<400>2ttacgtacat taatcgg17<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述AsnI引物的靶片段<400>3ccgattaatg tacgtaa 17<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正確的限制性位點(diǎn)<400>4ttacgtacaa tcgg14<210>5<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正確的限制性位點(diǎn)<400>5tttactggta g 11<210> 6<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正確的限制性位點(diǎn)<400>6tttactggat ag 12<210>7<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中正確的限制性位點(diǎn)(互補(bǔ)鏈)<400>7gatccagtaa a11<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正確的限制性片段(互補(bǔ)鏈)<400>8ttaatgtacg taa 13<210>9<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正確的限制性片段(互補(bǔ)鏈)<400>9ctaccagtaa a11<210>10<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正確的限制性片段(互補(bǔ)鏈)<400>10ccgattgtac gtaa 14<210>11<211>17<212>DNA<213>人<400>11atgacctagg accacct 17<210>12<211>17<212>DNA<213>人<400>12atgacctagg cccacct 17<210>13<211>93<212>DNA<213>人<400>13atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>14<211>30<212>PRT<213>人<400>14Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp1 5 10 15Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>15<211>93<212>DNA<213>人<400>15atggtgcacc tgactcctgt ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>16<211>30<212>PRT<213>人<400>16Met Val His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp15 10 15Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>17<211>306<212>DNA<213>人<400>17gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac aactgtgttc 60actagcaacc tcaaacagac accatggtgc acctgactcc tgaggagaag tctgccgtta 120ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg ggcaggggca 180ggttggtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcatgtggag 240acagagaaga ctcttgggtt tctgataggc actgactctc tctgcctatt ggtctatttt 300cccacc306<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>18ctagcaacct caaacagaca cc 22<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>19gtaaccttga taccaacctg cc 22<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>20atggtgcacc tgactcctga 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>21atggtgcacc tgactcctgt 20<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>22gtaaccttga taccaacctg cc 22<210>23<211>93<212>DNA<213>人<400>23atggtgcacc tgactcctaa cgagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>24<211>30<212>PRT<213>人<400>24Met Val His Leu Thr Pro Asn Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp1510 15Gly Lys Val Asn Val Asp G1u Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>25atggtgcacc tgactcctaa c21<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>26atggtgcacc tgactccta 19
權(quán)利要求
1.一種可以將樣品中的核酸分子至少部分分離成各個(gè)群體的方法，其中一個(gè)群體已被或可以被能固定于基質(zhì)上的組分標(biāo)記，上述方法包括將含有核酸的樣品與基質(zhì)接觸，基質(zhì)借此捕獲標(biāo)記分子從而使其與未標(biāo)記的分子分離。
2.權(quán)利要求1的方法，其中一個(gè)分子群體已被或可以被固定于基質(zhì)上的組分標(biāo)記，所述組分能直接或通過(guò)所述標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物而間接固定于基質(zhì)上，上述方法包括將含有核酸的樣品與基質(zhì)接觸，或當(dāng)所述標(biāo)記物與基質(zhì)是通過(guò)結(jié)合配對(duì)物間接相互作用時(shí)，使含有核酸的樣品與所述標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物以及基質(zhì)接觸，從而由所述基質(zhì)捕獲標(biāo)記分子并使標(biāo)記分子與未標(biāo)記的分子分離。
3.以上任一權(quán)利要求的方法，其中所述標(biāo)記物是可加入核酸分子中的組分或與核酸分子有親和性的組分。
4.以上任一權(quán)利要求的方法，其中所述標(biāo)記物直接與基質(zhì)相互作用。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)記物通過(guò)該標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物間接作用于基質(zhì)。
6.以上任一權(quán)利要求中的方法，其中所述標(biāo)記物是一種配基。
7.權(quán)利要求6中的方法，其中所述配基選自生物素或熒光素。
8.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)記物是類(lèi)固醇或類(lèi)固醇樣分子。
9.權(quán)利要求8中的方法，其中所述類(lèi)固醇是地高辛配基。
10.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)記物是一種抗原。
11.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)記物是一種蛋白。
12.權(quán)利要求11中的方法，其中所述蛋白是一種核酸結(jié)合蛋白。
13.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)記物是一種核酸分子。
14.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)記物是生物素，且所述標(biāo)記物由鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白捕獲。
15.以上任一權(quán)利要求中的方法，其中所述基質(zhì)的形式是薄層，凝膠，濾膜，膜，纖維，管，微量滴定板，柱或顆粒。
16.權(quán)利要求15中的方法，其中所述基質(zhì)是多孔材料。
17.權(quán)利要求16中的方法，其中將所述基質(zhì)加入一種分離設(shè)備，所述設(shè)備選自離心管、微量滴定板、套筒和注射器。
18.權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中在所述多孔材料上放置一吸收墊，在所述吸收墊遠(yuǎn)離所述多孔材料的一面放置一個(gè)不能滲透液體的薄層，而在所述多孔材料遠(yuǎn)離所述吸收墊的一面放置一個(gè)帶有一或多個(gè)空洞的不能滲透液體的薄層，從而待測(cè)樣品可上樣于所述空洞之一并可通過(guò)所述吸收墊的吸收而橫向擴(kuò)散至整個(gè)多孔材料。
19.以上任一權(quán)利要求中的方法，其用于至少部分分離限制酶消化產(chǎn)物，或用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
20.以上任一權(quán)利要求中的方法，其用于至少部分分離DNA之限制酶消化片段混合物的方法，其中起始材料是線性DNA分子，在其一個(gè)末端或兩個(gè)末端處或附近已被或可以被能固定于基質(zhì)上的組分標(biāo)記，所述方法包括用限制酶消化DNA分子，然后使樣品與基質(zhì)接觸，借此使來(lái)自起始材料某個(gè)末端的標(biāo)記分子被基質(zhì)捕獲從而使其與未標(biāo)記的分子分離。
21.以上任一權(quán)利要求中的方法，其用于使所需正確PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與PCR引物與模板不正確退火造成的PCR產(chǎn)物至少部分分離，其中模板核酸分子在其一個(gè)末端處或附近含有一個(gè)唯一的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，已被或可以被標(biāo)記之PCR引物與模板上部分延伸至所述唯一限制酶位點(diǎn)的序列互補(bǔ)，此方法包括通過(guò)PCR擴(kuò)增模板，使用特異作用于上述唯一限制酶識(shí)別位點(diǎn)的限制酶消化PCR產(chǎn)物，以及將所得產(chǎn)物與能固定所述標(biāo)記物的基質(zhì)接觸，以使標(biāo)記的核酸分子被該基質(zhì)捕獲，從而與未標(biāo)記的分子分離。
22.權(quán)利要求21中的方法，其中所述標(biāo)記物附著于引物的5′末端。
23.權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的方法，其用于診斷型PCR。
24.權(quán)利要求23的診斷型PCR方法，該方法中對(duì)待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中如果有突變則該突變應(yīng)位于與3′引物互補(bǔ)的序列中，第一PCR反應(yīng)使用與正常靶核酸互補(bǔ)的3′引物而第二PCR反應(yīng)使用與突變的靶核酸互補(bǔ)的3′引物，其中突變引物的3′核苷酸對(duì)應(yīng)于突變核酸中已突變的核苷酸之一，上述每一3′引物均在其3′核苷酸處攜有標(biāo)記物或可以被標(biāo)記，此方法對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物中標(biāo)記物的存在或缺失進(jìn)行檢測(cè)。
25.權(quán)利要求23中對(duì)核酸分子中的突變實(shí)施診斷型PCR的方法，其中對(duì)核酸樣品中突變的存在或缺失進(jìn)行檢測(cè)，其中使用特異性針對(duì)正常核酸或突變核酸的3′引物，其中所述引物互補(bǔ)于在正常和突變型DNA之間有一個(gè)堿基差異的核酸區(qū)域，所述引物的3′末端對(duì)應(yīng)于樣品中正常型與突變型有差異的位置，所述引物已被或可以被標(biāo)記，該方法對(duì)PCR產(chǎn)物中所述標(biāo)記物的存在或缺失進(jìn)行檢測(cè)。
26.權(quán)利要求23的診斷型PCR方法，其中使用互補(bǔ)于正常靶DNA的引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物與一段其3′端核苷酸在突變體中已突變的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸處或其上攜有標(biāo)記或能被標(biāo)記，該方法對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物中所述標(biāo)記物的存在進(jìn)行檢測(cè)。
27.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其用于使線性DNA分子與環(huán)狀DNA分子分離。
28.權(quán)利要求27中將樣品中的線性核酸分子與環(huán)狀核酸分子分離的方法，所述方法包括在線性核酸分子的末端引入標(biāo)記物，所述標(biāo)記物能通過(guò)直接與基質(zhì)作用或借該標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物間接與基質(zhì)作用而被固定于基質(zhì)上，使樣品與基質(zhì)接觸，或當(dāng)所述標(biāo)記物與基質(zhì)間接作用時(shí)，使樣品與所述標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物以及與基質(zhì)接觸，從而使所述標(biāo)記的線性核酸分子固定于基質(zhì)上。
29.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其用于噬菌體顆粒的體外包裝。
30.權(quán)利要求29的方法，其用于重組噬菌體的體外包裝，其中所述載體DNA用一或多種限制酶切割，該載體DNA的3′OH基團(tuán)被封閉，該載體與待插入的DNA在適于DNA片段連接的條件下相接觸，所得連接產(chǎn)物用能附于反應(yīng)性3′OH基團(tuán)的組分進(jìn)行標(biāo)記，然后使標(biāo)記和未標(biāo)記的分子分離。
31.一種可以將樣品中的核酸分子至少部分分離成各個(gè)群體的方法，其中一個(gè)群體已被或可以被能固定于基質(zhì)上的組分標(biāo)記，此組分直接固定于基質(zhì)上或通過(guò)其結(jié)合配對(duì)物而間接固定，所述方法包括將含有核酸的樣品與基質(zhì)接觸，或當(dāng)所述標(biāo)記物與基質(zhì)為間接相互作用時(shí)使樣品與標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物及與基質(zhì)接觸，從而使標(biāo)記分子由所述基質(zhì)捕獲并因此與未標(biāo)記的分子分離。
32.一種對(duì)DNA的限制酶消化片段的混合物進(jìn)行至少部分分離的方法，其中起始材料是線性DNA分子，在其一個(gè)末端或兩個(gè)末端處或附近已被或可以被能固定于基質(zhì)上的組分標(biāo)記，所述方法包括用限制酶消化DNA分子，然后使樣品與基質(zhì)接觸，借此使來(lái)自起始材料某個(gè)末端的標(biāo)記分子被基質(zhì)捕獲從而使其與未標(biāo)記的分子分離。
33.一種用于使所需正確PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與PCR引物與模板不正確退火造成的PCR產(chǎn)物至少部分分離的方法，其中模板核酸分子在其一個(gè)末端處或附近含有一個(gè)唯一的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，已被或可以被標(biāo)記之PCR引物與模板上部分延伸至所述唯一限制酶位點(diǎn)的序列互補(bǔ)，此方法包括通過(guò)PCR擴(kuò)增模板，使用特異作用于上述唯一限制酶識(shí)別位點(diǎn)的限制酶消化PCR產(chǎn)物，以及將所得產(chǎn)物與能固定所述標(biāo)記物的基質(zhì)接觸，以使標(biāo)記的核酸分子被該基質(zhì)捕獲，從而與未標(biāo)記的分子分離。
34.一種診斷型PCR方法，該方法中對(duì)待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中如果有突變則該突變應(yīng)位于與3′引物互補(bǔ)的序列中，第一PCR反應(yīng)使用與正常靶核酸互補(bǔ)的3′引物而第二PCR反應(yīng)使用與突變的靶核酸互補(bǔ)的3′引物，其中突變引物的3′核苷酸對(duì)應(yīng)于突變核酸中已突變的核苷酸之一，上述每一3′引物均在其3′核苷酸處攜有標(biāo)記物或可以被標(biāo)記，此方法對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物中標(biāo)記物的存在或缺失進(jìn)行檢測(cè)。
35.一種對(duì)核酸分子中的突變實(shí)施診斷型PCR的方法，其中對(duì)核酸樣品中突變的存在或缺失進(jìn)行檢測(cè)，其中使用特異性針對(duì)正常核酸或突變核酸的3′引物，其中所述引物互補(bǔ)于在正常和突變型DNA之間有一個(gè)堿基差異的核酸區(qū)域，所述引物的3′末端對(duì)應(yīng)于樣品中正常型與突變型有差異的位置，所述引物已被或可以被標(biāo)記，該方法對(duì)PCR產(chǎn)物中所述標(biāo)記物的存在或缺失進(jìn)行檢測(cè)。
36.一種診斷型PCR方法，其中使用互補(bǔ)于正常靶DNA的引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物與一段其3′端核苷酸在突變體中已突變的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸處或其上攜有標(biāo)記或能被標(biāo)記，該方法對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物中所述標(biāo)記物的存在進(jìn)行檢測(cè)。
37.一種將樣品中的線性核酸分子與環(huán)狀核酸分子分離的方法，所述方法包括在線性核酸分子的末端引入標(biāo)記物，所述標(biāo)記物能通過(guò)直接與基質(zhì)作用或借該標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物間接與基質(zhì)作用而被固定于基質(zhì)上，使樣品與基質(zhì)接觸，或當(dāng)所述標(biāo)記物與基質(zhì)間接作用時(shí)，使樣品與所述標(biāo)記物的結(jié)合配對(duì)物以及與基質(zhì)接觸，從而使所述標(biāo)記的線性核酸分子固定于基質(zhì)上。
38.一種重組噬菌體體外包裝的方法，其中所述載體DNA用一或多種限制酶切割，該載體DNA的3′OH基團(tuán)被封閉，該載體與待插入的DNA在適于DNA片段連接的條件下相接觸，所得連接產(chǎn)物用能附于反應(yīng)性3′OH基團(tuán)的組分進(jìn)行標(biāo)記，然后使標(biāo)記和未標(biāo)記的分子分離。
全文摘要
一種可以將樣品中的核酸分子至少部分分離成各個(gè)群體的方法,其中一個(gè)群體已被或可以被能固定于基質(zhì)上的組分標(biāo)記,上述方法包括將含有核酸的樣品與基質(zhì)接觸,基質(zhì)借此捕獲標(biāo)記分子從而使其與未標(biāo)記的分子分離。本方法可以用于多種不同的用途,包括分離限制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)物,從環(huán)狀核酸分子中分離出線性核酸分子,噬菌體顆粒的體外包裝,診斷型PCR。
文檔編號(hào)C12QGK1344331SQ9981576
公開(kāi)日2002年4月10日 申請(qǐng)日期1999年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月30日
發(fā)明者奧伊斯坦·伊爾, 特杰·E·邁克爾森, 貝里特·約翰尼 申請(qǐng)人:尼康姆德法爾馬公司