專(zhuān)利名稱(chēng)：重組中國(guó)漢族人源γ－干擾素及生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素及生產(chǎn)方法，更具體地說(shuō)包括中國(guó)漢族人源γ-干擾素cDNA的分離、表達(dá)質(zhì)粒和表達(dá)菌株的構(gòu)建、中國(guó)漢族人源γ-干擾素的生產(chǎn)方法及中國(guó)漢族人源γ-干擾素的生物學(xué)活性鑒定等方面。
干擾素(Interferon，IFN)是由多種細(xì)胞因子組成的異源家族。誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)病毒感染產(chǎn)生抗性是干擾素家族共有的生物學(xué)活性。大多數(shù)的干擾素可歸屬于三個(gè)亞類(lèi)，即α，β和γ干擾素，其中γ-干擾素(γ-干擾素)又稱(chēng)免疫干擾素，它具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒等多種生物學(xué)功能及臨床適應(yīng)癥，具有廣闊的市場(chǎng)和重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。根據(jù)我們發(fā)現(xiàn)的分子進(jìn)化規(guī)律的預(yù)測(cè)，東西方人群間γ-干擾素cDNA存在序列多態(tài)性。隨后我們克隆了中國(guó)漢族人源γ-干擾素cDNA，并證明與Gray等報(bào)導(dǎo)的γ-干擾素cDNA序列存在兩個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異，并導(dǎo)致在蛋白質(zhì)水平上存在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差別。而目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)和使用的γ-干擾素均源于西方人序列，中國(guó)人長(zhǎng)期使用與內(nèi)源性γ-干擾素序列不同的西方人源γ-干擾素將會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生抗體及其它副作用等問(wèn)題。
本發(fā)明的目的在于提供一種中國(guó)漢族人源γ-干擾素，屬于人源γ-干擾素新變異型。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)中國(guó)漢族人源γ-干擾素cDNA的克隆，表達(dá)菌株的構(gòu)建、發(fā)酵、純化及復(fù)性生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素。
本發(fā)明的技術(shù)途徑是從健康中國(guó)漢族人外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離總RNA、通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR克隆中國(guó)漢族人源γ-干擾素cDNA、構(gòu)建高效表達(dá)載體和高效表達(dá)菌株、進(jìn)行工程菌發(fā)酵、包涵體的分離與裂解、蛋白質(zhì)的純化和復(fù)性，最終獲得具有生物學(xué)活性的重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素純品。其特征為1)從中國(guó)漢族人外周血單個(gè)核細(xì)胞中經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR克隆到中國(guó)漢族人源γ-干擾素cDNA。2)中國(guó)漢族人源γ-干擾素具有表1所列的核苷酸序列和氨基酸序。
表1ATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA39M C Y C Q D P Y V K E A E 13AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA78N L K K Y F N A G H S D V 26GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT 117A D N G T L F L G I L K N 39TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA 156F K E E S D R K I M Q S Q542ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AGA AAC TTT AAA195I V S F Y F K L F R N F K 65GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG234D D Q S I Q K S V E T I K 78GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG273E D M N V K F F N S N K K 91AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA312K R D D F E K L T N Y S V 104ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC351T D L N V Q R K A I H E L 117ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA390I Q V M A E L S P A A K T 130GGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA429G K R K R S Q M L F R G R 143AGA GCA TCC CAG TAA 444R A S Q147此序列與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的γ-干擾素核苷酸序列和氨基酸序列有兩個(gè)位點(diǎn)的不同185位A→G(LyS→Arg)，399位A→G(氨基酸未變)。3)構(gòu)建了高效表達(dá)載體pBVIFNγ(圖1)和高效表達(dá)菌株pBVIFNγ/DH5α。4)對(duì)工程菌進(jìn)行低密度發(fā)酵，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為OD600＝0.45，誘導(dǎo)表達(dá)溫度為42℃。5)包涵體裂解劑為含50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸、0.5％巰基乙醇的pH7.0的9摩爾/升尿素溶液。6)采用復(fù)性溶液(10毫摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸緩沖液，pH7.0)通過(guò)稀釋方法進(jìn)行復(fù)性。7)柱層析純化采用在8摩爾/升尿素存在下，經(jīng)AcA44凝膠過(guò)濾柱和CM Sepharose FF離子交換柱兩步柱層析進(jìn)行純化。其流程如圖3。其中AcA44凝膠過(guò)濾柱上樣后用8摩爾/升尿素洗脫，中國(guó)漢族人源γ-干擾素在第二峰中；CM Sepharose FF離子交換柱用8摩爾/升尿素平衡，溶解于8摩爾/升尿素的樣品上樣后，用溶解于8摩爾/升尿素中不同濃度的氯化鈉溶液洗脫，中國(guó)漢族人源γ-干擾素在0.3摩爾/升氯化鈉洗脫峰中。通過(guò)該方法獲得的中國(guó)漢族人源γ-干擾素，其純度為97％，經(jīng)測(cè)定其N(xiāo)末端氨基酸序列為NH2·C-Y-C-Q-D-P-Y-V-K-E-A-E-N-L-K-K…COOH，此序列與依據(jù)其核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列一致；其等電點(diǎn)為8.5，分子量為17323道爾頓；在體外能保護(hù)Hep-2細(xì)胞免遭水泡口炎病毒的攻擊，提示中國(guó)漢族人源γ-干擾素能應(yīng)用于臨床治療病毒性疾病。
本發(fā)明通過(guò)中國(guó)漢族人源γ-干擾素cDNA的克隆，高效表達(dá)菌株的構(gòu)建，建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離與裂解、蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝，最終獲得重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素純品，其在體外能保護(hù)Hep-2細(xì)胞免遭水泡口炎病毒的攻擊，表明中國(guó)漢族人源γ-干擾素有可能是臨床上治療病毒性疾病的有效藥物。重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素在氨基酸序列上與Gray等報(bào)導(dǎo)的西方人源γ-干擾素有差別，重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素生產(chǎn)和使用將有可能避免中國(guó)人因長(zhǎng)期使用與內(nèi)源性γ-干擾素序列不同的西方人源γ-干擾素誘發(fā)產(chǎn)生抗體及其它副作用等問(wèn)題。本發(fā)明中重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素的分離純化過(guò)程全部在有8摩爾/升尿素的變性狀態(tài)下完成，此純化過(guò)程無(wú)需在低溫下進(jìn)行，簡(jiǎn)單、方便、快速，易于放大。
結(jié)合


本發(fā)明的具體實(shí)施方法如下圖1為本發(fā)明pBVIFNγ質(zhì)粒構(gòu)建圖pBV220一種質(zhì)粒pUC19-IFN含γ-干擾素cDNA的質(zhì)粒IFNγcDNAγ-干擾素cDNAEcoR I，Sma I，BamH I，HindIII核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)PRPL啟動(dòng)子ori復(fù)制起點(diǎn)Apr氨芐青霉素抗性基因T4連接酶T4DNA連接酶cIts 857溫度敏感的阻抑物基因pBVIFNγ-干擾素表達(dá)質(zhì)粒圖2為工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的水平的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果從左到右分別為搖瓶發(fā)酵中國(guó)漢族人源γ-干擾素，5L發(fā)酵罐發(fā)酵中國(guó)漢族人源γ-干擾素，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白圖3為本發(fā)明的純化工藝流程4為中國(guó)漢族人源γ-干擾素純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖中從左到右分別為包涵體，純化中國(guó)漢族人源γ-干擾素和標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白圖5為純化中國(guó)漢族人源γ-干擾素N末端的氨基酸序列測(cè)定結(jié)果實(shí)施例一中國(guó)漢族人源γ-干擾素cDNA的克隆本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)步驟1.人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離、刺激和培養(yǎng)從健康漢族人志愿者新鮮全血中按常規(guī)Ficoll法分離出單個(gè)核細(xì)胞(其中內(nèi)含分泌γ-干擾素的T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為3.3×106/毫升)。在含TPA(終濃度為5納克/毫升)的RPMI1640培養(yǎng)液中孵育2小時(shí)，加入TPA(5微克/毫升)及小牛血清(10％)繼續(xù)于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí)。
2.細(xì)胞總RNA的提取按照Promega公司的RNAgentsTM總RNA提取系統(tǒng)操作指南，從培養(yǎng)細(xì)胞中分離總RNA，溶于無(wú)菌水。
3.γ-干擾素cDNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR其PCR上游引物為5’CGGAATTCATGTGTTACTGCCAGGAC3’，含EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物5’CGGGATCCTTACTGGGATGCTCTTCG3’，含BamH1酶切位點(diǎn)，其參數(shù)為RT-42℃15min，99℃5min，5℃5min。PCR-94℃3min，48℃1min，60℃1min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后于60℃延伸7min。提取的總RNA經(jīng)RT-PCR，擴(kuò)增出兩條帶，較大的一條與預(yù)期分子量一致，另一條為160bp，為非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。將目的片段切下回收，以此產(chǎn)物為模板再進(jìn)行PCR得到單一的片段。
4.γ-干擾素cDNA的克隆用EcoRI和BamHI分別酶切PCR產(chǎn)物和載體pUC19，按照1∶1的摩爾比連接，以常規(guī)氯化鈣法轉(zhuǎn)化JM109，挑取白色菌落進(jìn)行酶切鑒定。
5.γ-干擾素重組子酶切鑒定和序列分析挑取白色菌落過(guò)夜培養(yǎng)，以常規(guī)快速質(zhì)粒提取法提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和BamHI酶切、電泳鑒定重組片段大小，結(jié)果白色菌落均含γ-干擾素cDNA插入片段。最后用pUC19上下游公用引物以及PCR引物，以Promega公司的Taq TrackSequencing System直接進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙鏈DNA測(cè)序。序列測(cè)定結(jié)果表明，中國(guó)漢族人源γ-干擾素成熟蛋白的cDNA與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)有兩個(gè)位點(diǎn)的不同185位A→G(Lys→Arg)，399位A→G(氨基酸未變)。經(jīng)雙向、不同獨(dú)立克隆及不同人員樣品進(jìn)一步測(cè)序表明，此變異非測(cè)序人為錯(cuò)誤，亦非PCR中的突變。
實(shí)施例二、中國(guó)漢族人源γ-干擾素高效表達(dá)質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)步驟如下從pUC19-IFN上以EcoRI和BamHI雙酶切，切下440bp片段，經(jīng)低融點(diǎn)瓊脂糖法回收，與pBV220經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切回收的3.64kb的大片段以摩爾比3∶1連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以小量快速抽提質(zhì)粒DNA法鑒定陽(yáng)性重組子。以pBV220為陰性對(duì)照，所有陽(yáng)性克隆質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切均能切下γ-干擾素cDNA條帶，其分子量大小正確(質(zhì)粒構(gòu)建見(jiàn)圖1)。克隆細(xì)菌在LB-Ap中30℃培養(yǎng)至A600＝0.45，迅速升溫至42℃，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6小時(shí)，收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，有γ-干擾素特異表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)掃描γ-干擾素占菌體可溶性蛋白的44.4％。
實(shí)施例三中國(guó)漢族人源γ-干擾素的發(fā)酵和純化工藝一、本實(shí)施例的技術(shù)要點(diǎn)1.細(xì)菌發(fā)酵為低密度高表達(dá)2.包涵體裂解劑為尿素3.包涵體裂解后在變性條件下進(jìn)行凝膠過(guò)濾柱層析純化4.在變性條件下進(jìn)行離子交換柱層析純化二、本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)操作步驟(圖3)1.工程菌種工程菌pBVIFNγ/DH5α由本室構(gòu)建。從-20℃保存的工程菌冷凍管中取工程菌接種于5毫升LB培養(yǎng)液試管中(含100微克/毫升氨芐青霉素)，30℃、150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，按5％的接種量接種于搖瓶中(含100微克/毫升氨芐青霉素)，30℃、150轉(zhuǎn)/分在搖床上震蕩培養(yǎng)12小時(shí)后可作為種子液。
2.發(fā)酵以2％的接種量將種子液接種于500毫升LB培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)，待其OD600＝0.4～0.5之間時(shí)，開(kāi)始升溫至42℃，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，結(jié)束培養(yǎng)。離心收集菌體，電泳鑒定目的蛋白的表達(dá)量，光密度掃描結(jié)果為目的蛋白的表達(dá)量占可溶性蛋白的53.4％。5L發(fā)酵罐發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度28℃，誘導(dǎo)溫度42℃，，轉(zhuǎn)速100～300轉(zhuǎn)/分，溶氧20％，空氣流量2升/分，罐壓0.2kg/cm2，用1摩爾/升氫氧化鈉和1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)pH。每次LB培養(yǎng)基投料量為4升，接種量為2％。接種后在28℃培養(yǎng)，待菌體密度達(dá)到0.4～0.5之間，升溫至42℃后誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)停止發(fā)酵。離心收集菌體，電泳鑒定目的蛋白表達(dá)量54.4％。
3.細(xì)菌細(xì)胞的裂解4℃3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄去上清，稱(chēng)量細(xì)菌濕重，按10g菌/100毫升的濃度加裂解液(50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸1摩爾/升EDTA pH8.0，1mg/毫升溶菌酶)，0℃作用30分鐘。然后冰浴超聲30～45秒，間歇2分鐘，共超聲3次。超聲完畢，4℃8000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清，收集沉淀即包涵體。
4.包涵體的洗滌和純化(1)以50摩爾/升磷酸緩沖液(pH8.0)重懸包涵體(15g/10升)，室溫磁力攪拌1小時(shí)后，8000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄上清。沉淀用50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸(pH8.0)洗滌一次，稱(chēng)重。
(2)用1摩爾/升氯化鈉(50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸pH8.0配制)重懸包涵體(15克/100毫升)，室溫磁力攪拌1小時(shí)后，8000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄上清。沉淀用50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸(pH8.0)洗滌一次，稱(chēng)重。
(3)用0.5％Triton X-100(50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸pH8.0配制)重懸包涵體(15克/100毫升)，室溫磁力攪拌1小時(shí)后，8000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄上清。沉淀用50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸(pH8.0)洗滌一次，稱(chēng)重。
(4)用6摩爾/升尿素(50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸pH8.0配制)重懸包涵體(15克/100毫升)，室溫磁力攪拌1小時(shí)后，8000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄上清。沉淀用50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸(pH8.0)洗滌一次，稱(chēng)重。
5.包涵體的裂解用8摩爾/升尿素裂解已純化的包涵體。8摩爾/升尿素用50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸pH7.0溶液配制。用含0.5％巰基乙醇的8摩爾/升尿素(10克菌/100毫升)重懸包涵體(15克/100毫升)，室溫磁力攪拌過(guò)夜，8000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，上清即為包涵體裂解液，裂解液清亮透明，呈淡黃色。沉淀可用8摩爾/升尿素再萃取一次。
6.Ultrogel AcA44凝膠過(guò)濾柱層析用平衡溶液(溶解于50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸的8摩爾/升尿素，pH7.0)平衡Ultrogel AcA44(Biosepra，F(xiàn)rance)凝膠柱(1.6cm×80cm)，將步驟5中的裂解上清上此凝膠柱，每次上樣量3毫升，上樣完畢用平衡緩沖液洗脫，280nm檢測(cè)洗脫峰，SDS-PAGE檢測(cè)各峰中的蛋白，中國(guó)漢族人源γ-干擾素在第二峰中。
7.CM Sepharose FF離子交換柱層析CM Sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱(1.6cm×15cm)用平衡溶液(溶解于50摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸的8摩爾/升尿素，pH7.0)平衡后，將凝膠過(guò)濾得到的目的蛋白峰直接上樣，上樣完畢，用平衡溶液洗脫后，繼而用溶解于平衡溶液中不同濃度的氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫峰，SDS-PAGE鑒定各峰的蛋白分布。中國(guó)漢族人源γ-干擾素在0.3摩爾/升氯化鈉洗脫峰中。中國(guó)漢族人源γ-干擾素純化產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖4。測(cè)定的N末端氨基酸序列見(jiàn)圖5。純化產(chǎn)物的分子量為17323道爾頓。
8.中國(guó)漢族人源γ-干擾素的復(fù)性采用稀釋方法復(fù)性。將步驟7分離的目的蛋白用復(fù)性緩沖液(10毫摩爾/升三羥甲基胺基甲烷/鹽酸，pH7.0)作10倍稀釋?zhuān)瓜♂尯蟮牡鞍琢勘３衷?0微克/毫升，置4℃冰箱過(guò)夜，次日，置透析袋中對(duì)同樣緩沖液充分透析以去除變性劑。
9.中國(guó)漢族人源γ-干擾素的活性測(cè)定用微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定其活性。喉癌細(xì)胞株Hep-2為測(cè)定細(xì)胞，水泡口炎病毒(VSV)為攻擊病毒，以人白細(xì)胞干擾素效價(jià)測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品校算為國(guó)際單位。重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素的比活性為2.0×107國(guó)際單位/毫克。具體方法如下9.1 Hep-2細(xì)胞在10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，離心細(xì)胞，并將細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)液中，打勻記數(shù)，稀釋到20萬(wàn)/毫升。
9.2取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100微升培養(yǎng)液，A，B排第一孔加入一定稀釋度的γ-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品100微升，并作逐孔倍比稀釋?zhuān)珻，D，E，F(xiàn)各排的第一孔各加一定稀釋度的待測(cè)品γ-干擾素100微升，并作逐孔倍比稀釋。加畢γ-干擾素后，每孔加細(xì)胞懸液100微升，靜置10分鐘，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
9.3向A，B，C，D，E，F(xiàn)各排及G，H各排的1～6孔各加一定濃度的VSV病毒100微升，G，H排的7～12孔加培養(yǎng)液100微升，37℃繼續(xù)培養(yǎng)16～24小時(shí)。
9.4染色20分鐘(染色液0.2％結(jié)晶紫，5％甲醛，45％乙醇，0.8％氯化鈉)，自來(lái)水沖洗，空干后先用肉眼觀(guān)察活性判定活性單位，再作比色，不脫色直接置酶標(biāo)儀比色，波長(zhǎng)550nm，最后根據(jù)OD值，計(jì)算出活性單位。
計(jì)算方法是先計(jì)算出50％病變時(shí)的OD值(細(xì)胞對(duì)照的OD值加病毒對(duì)照的OD值)，再計(jì)算出各樣品50％病變OD值的稀釋度，即樣品的活性單位，最后用干擾素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品校正為干擾素的國(guó)際單位。
權(quán)利要求
1.一種編碼中國(guó)漢族人源γ-干擾素多肽的核苷酸序列，它的DNA序列為ATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA 39AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA 78GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT117TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA156ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AGA AAC TTT AAA195GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG234GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG273AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA312ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC351ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA390GGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA429AGA GCA TCC CAG TAA444
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，它包括權(quán)利要求1中所列DNA序列的互補(bǔ)鏈，以及能編碼中國(guó)漢族人源γ-干擾素的基因序列和人工合成的DNA序列。
3.一種生產(chǎn)重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素的方法，它包括從健康中國(guó)漢族人外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離總RNA、通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR克隆中國(guó)漢族人源γ-干擾素cDNA、構(gòu)建高效表達(dá)載體和高效表達(dá)菌株、發(fā)酵、包涵體的分離與裂解、蛋白質(zhì)的純化和復(fù)性工藝及表達(dá)產(chǎn)物的生物活性檢測(cè)。其特征為對(duì)工程菌進(jìn)行低密度發(fā)酵，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為細(xì)菌密度OD600＝0.45時(shí)；包涵體裂解劑為用50毫摩爾/升的三羥甲基胺基甲烷/鹽酸緩沖液配制的9摩爾/升的尿素，含0.5％的巰基乙醇，pH7.0；復(fù)性緩沖液為pH7.0的10毫摩爾/升的三羥甲基胺基甲烷/鹽酸緩沖液；重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素的柱層析純化采用8摩爾/升的尿素存在下的柱層析純化，其流程見(jiàn)圖3，其中AcA44凝膠過(guò)濾柱層析上樣后用8摩爾/升的尿素洗脫，重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素在第二個(gè)峰中，CM Sepharose FF離子交換柱用8摩爾/升的尿素平衡，存在于8摩爾/升尿素中的樣品上樣后，用溶解于8摩爾/升尿素中的不同濃度的氯化鈉溶液洗脫，中國(guó)漢族人源γ-干擾素在0.3摩爾/升的氯化鈉洗脫峰中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，生產(chǎn)的重組中國(guó)漢族人源γ-干擾素具有以下特性具有附圖1的氨基酸序列；等電點(diǎn)為8.5，分子量為17323道爾頓；在體外能保護(hù)Hep-2細(xì)胞免遭水泡口炎病毒的攻擊。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程產(chǎn)品及生產(chǎn)方法領(lǐng)域,公開(kāi)了重組中國(guó)漢族人源γ－干擾素的核苷酸序列及生產(chǎn)方法;在獲取中國(guó)漢族人源γ－干擾素cDNA并成功構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上,建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝,以獲取中國(guó)漢族人源γ－干擾素純品;其理化特征為等電點(diǎn)8.5,分子量17323道爾頓;在體外能保護(hù)Hep－2細(xì)胞免遭水泡口炎病毒的攻擊。
文檔編號(hào)C12N15/23GK1257125SQ9812319
公開(kāi)日2000年6月21日 申請(qǐng)日期1998年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月11日
發(fā)明者賀福初, 王清明, 陳惠鵬, 瞿成奎, 魏漢東, 畢建進(jìn), 魚(yú)詠濤, 范國(guó)才, 蔣中華, 胡志遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所